Fusobacterium nucleatumはマイクロサテライト安定大腸癌における抗PD-1療法を促進する
Fusobacterium nucleatumはマイクロサテライト安定大腸癌における抗PD-1療法を促進する
https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(24)00318-0
Xueliang Wang∙Yi Fang∙Wei Liang∙... ∙Bing Liao∙Joseph J.Y. Sung∙Jun Yu... Show more
ハイライト
マイクロサテライト安定大腸癌（MSS CRC）に対する抗PD-1効果をnが高める
nはCD8+TILs上のPD-1発現を抑制し、そのエフェクター機能を再活性化する。
n-由来酪酸はHDAC3/8-TBX21軸を介してCD8+TILのPD-1をダウンレギュレートする。
腫瘍内Fn量の多さは、MSS CRCにおける良好な奏効と相関する。
要旨
クロスサテライト安定（MSS）大腸癌（CRC）は、抗プログラム死-1（PD-1）療法に抵抗性であることが多い。今回我々は、CRCの病原体であるFusobacterium nucleatum（Fn）が、逆説的にMSS CRCを抗PD-1に対して感作することを示した。Fn高値のMSS CRC患者から、MSS CRCを有する無菌マウスへのecal microbiota移植（FMT）は、Fn低値の患者からのFMTと比較して、抗PD-1に対する感受性を付与する。また、Fnの単独投与は、MSS CRCを有するマウス移植片およびCD34+ヒト化マウスにおける抗PD-1効果を増強した。メカニズム的には、腫瘍内Fnが豊富な酪酸を生成し、CD8+T細胞でヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）3/8を阻害し、Tbx21プロモーターのH3K27アセチル化と発現を誘導することを示した。BX21はPD-1を転写抑制し、CD8+T細胞の疲弊を緩和し、エフェクター機能を促進する。この考えを裏付けるように、Fnの酪酸産生遺伝子をノックアウトすると、抗PD-1増強作用が消失する。MSSのCRC患者において、腫瘍内Fnの高値は抗PD-1療法に対する良好な奏効を予測し、FnがMSS CRCにおける免疫療法奏効のバイオマーカーとなる可能性を示している。
抄録
キーワード
はじめに
プログラム死-1(PD-1)を標的とするペムブロリズマブは、マイクロサテライト不安定性(MSI)を有する大腸癌(CRC)患者のサブセットに対する第一選択薬として承認されている。ICB療法が奏効する可能性のあるMSS CRC患者を層別化することは依然として困難であり、ICB療法の有効性を改善することも急務である。
腸内細菌叢は宿主の免疫系に多大な影響を及ぼす4。したがって、腸内細菌叢の組成が、さまざまなタイプのがんにおけるICB療法の奏効5,6,7,8だけでなく、ICB療法に関連する副作用にも重要な役割を果たしていることは驚くべきことではない。グラム陰性の嫌気性細菌であるウソバクテリウム・ヌクレアタム（Fn）は、CRCの原因病原体と考えられている。特に、CRC患者1,041人を対象としたある研究では、Fnの存在量はMSI CRCでは腫瘍浸潤リンパ球（TIL）と負の相関を示したが、MSS CRCではTILと正の相関を示した13。このことは、Fnがマイクロサテライトの状態によってCRCの腫瘍免疫微小環境（TIME）に異なる影響を及ぼす可能性を示唆している。これまで、FnがMSS CRCにおいてICB療法の反応を調節するかどうか、またどのように調節するかについては、ほとんど未解明であった。
今回我々は、MSS CRCにおける抗PD-1モノクローナル抗体（mAb）免疫療法反応を調節するFnの潜在的な機能と、その根底にある分子メカニズムを明らかにした。その結果、MSS CRC患者において、Fnの発現量はPD-1の発現量と負の相関を示した。ヒト化MSS CRCモデルマウスにFnを投与すると、TIMEにおけるCD8+T細胞の消耗を抑制することにより、抗PD-1療法の有効性が高まる。このような効果は、無菌ヒト化マウスにおけるFnの単独コロニー形成によって再現された。その結果、Fn由来の代謝産物である酪酸がヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤として働き、Tbx21プロモーターのH3K27acを増加させ、TBX21シグナルを活性化してPD-1の発現とCD8+TILの疲弊を抑制することが明らかになった。酪酸の生合成を欠損させた変異型Fnは、CD8+ TILsと抗PD-1効果に対して同等の効果を引き出せなかった。このことから、FnはMSS CRCの抗PD-1療法への感作に関与し、CRCにおける抗PD-1療法の有効性を予測するバイオマーカーとなることが明らかになった。
結果
高いFn量は、MSS CRC患者および同所性MSS CRCを有する無胚葉マウスにおける抗PD-1免疫療法の良好な奏効を予測する
MSS CRC患者における抗PD-1効果の調節におけるFnの役割を検討するため、抗PD-1療法を受けたMSS CRC患者25人をリクルートし（表S1）、治療前の糞便中または腫瘍内Fn量をqPCRで測定した。n量は、抗PD-1治療を受けたMSS CRC患者の無増悪生存期間および全生存期間と正の相関があった（図1A）。これと一致して、Fnの蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）アッセイにより、腫瘍内Fnが高い患者は抗PD-1治療後の予後が良好であることが明らかになった（図1A）。コンピューター断層撮影では、Fnが濃縮された患者のCRCの肝転移において、Fnが欠乏した患者と比較して高い抗PD-1治療効果が示された（図1B）。これらの所見を総合すると、FnはMSS CRC患者の抗PD-1療法の治療成績を改善する可能性が示唆される。
図1 腸内Fn濃度が高いことは、MSS CRC患者における抗PD-1に対する良好な反応を予測し、Fn濃度が高いCRC便を用いた糞便微生物叢移植は、同所性MSS CRC同腹仔移植を行った無菌マウスにおいて抗PD-1効果を促進する。
我々は、Fnに富むMSS CRCマイクロバイオームが抗PD-1効果を増強するかどうかを検討した。この目的のために、我々は社内のCRCコホート（N= 96）を分析し、MSS CRC患者から高Fn（n= 6）、中Fn（n= 6）、低Fn（n= 6）の存在量の便を選択した（図S1A-S1D）。次に、無菌マウスに同所性CT26移植片を樹立し、その後、高／中／低Fnの患者個体からの便を用いたFMT（1患者あたりn= 2-3マウス）と抗PD-1治療を行った（図1C）。高Fn患者からのFMTを受けたマウスだけが抗PD-1に有意に反応し、PBS+IgGと比較して腫瘍重量と腫瘍体積が減少した（いずれもp< 0.0001）が、低Fnまたは中Fn患者からのPBSまたはFMTは抗PD-1との併用において腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった（図1D）。従って、高Fn+抗PD-1群では、他の全群と比較して、腫瘍細胞はよりアポトーシス的であったが、増殖は少なかった（図1Eおよび1F）。高Fn+抗PD-1治療は、PD-1+CD8+TILの減少と腫瘍壊死因子α（TNF-α）+、グランザイムB（GZMB）+、インターフェロン-γ（IFN-γ）+CD8+TILの増加によって証明されるように、CD8+TILを調節した（図1G）。mmunohistochemistry（IHC）により、高Fn＋抗PD-1はPD-1を阻害したが、TNF-α、GZMB、およびIFN-γの発現を増加させたことが検証された（図1H）。ISHアッセイにより、高FnFMT後の腫瘍では他のグループと比較してFnが濃縮されていることが確認された（図1I）。さらに、高FnMSS CRC患者の便を無菌マウスにコロニー形成させると、中Fnまたは低Fn患者の便を投与した場合と比較して、抗PD-1効果が増強された。
nは、PD-1+CD8+ TILsを抑制することにより、同所性MSS CRCのヒト化マウスモデルおよびマウス免疫モデルにおける抗PD-1反応を促進する
抗PD-1 mAbに反応しないMSS CRCにおいて、Fnが抗PD-1 mAbの効果を促進するかどうかを検討した。ヒトの免疫応答を模倣するため、まずCD34+ヒト化NODscidγマウスに同所性HT29異種移植片を移植した（図2A）。hCD45+細胞が循環リンパ球の25％以上を占め、生着が成功したことが確認された（図2B）。これらのマウスは抗生物質で腸内細菌を除去した後、FnまたはPBS（コントロール）を、抗PD-1 mAb（αPD-1）と一緒に、あるいは抗PD-1 mAb（αPD-1）なしで投与された（図2A）。nの経口投与は同所性HT29腫瘍の増殖を促進し、CRCを促進する役割の報告と一致した（図2C）。nti-PD-1単独ではPBS投与マウスの腫瘍増殖抑制に効果がなく、これはMSS CRCが抗PD-1療法に抵抗性であるという考え方と一致している（図2C）。逆説的に、Fnは抗PD-1療法の有効性を増強し、PBS（腫瘍重量、p<0.05；体積、p<0.001）、Fn（いずれもp<0.0001）、PBS+抗PD-1（腫瘍重量、p<0.05；体積、p<0.01）群と比較して腫瘍の縮小をもたらした（図2C）。腫瘍溶解液からの生きたFn培養（図2D）およびFISH（図2E）によって証明されるように、nは結腸腫瘍にうまくコロニー形成した。nti-PD-1は腫瘍組織におけるFnの存在量を減少させたが（図2E）、隣接する正常結腸組織では減少させなかった（図S1E-S1H）ことから、抗PD-1は腫瘍内のFnを障害することが示唆された。Fnが介在する抗PD-1効力の増強と一致して、TdT-mediated dUTP nick-end labeling+（TUNEL+）アポトーシス細胞は、PCNAおよびKi67染色（図2G）によって決定される細胞増殖の低下とともに、他のすべての群と比較して、Fn+抗PD-1群で誘導された（図2F）。腫瘍浸潤免疫細胞の解析から、Fn+抗PD-1はCD8+TILを増加させた（図2H、S1I、S1J）。nは、特に抗PD-1との併用でPD-1+CD8+TILを減少させた（図2I、S1I、S1J）。さらに、Fn+抗PD-1はIFN-γ+、TNF-α+、GZMB+ CD8+TILを増加させた（図2I、S1I、S1J）。HCは、Fn+抗PD-1がPD-1の発現を阻害したが、GZMBとTNF-αの発現を増加させたことを検証した（図2J）。これらのデータは、FnがCD8+ TILの疲弊を緩和し、抗PD-1との併用で細胞傷害性CD8+ TILを再活性化し、MSS CRCのヒト化モデルにおいて腫瘍細胞の殺傷を媒介することを示している。
図2Fnは同所性MSS CRC異種移植片を有するSPF免疫ヒト化マウスにおいて抗PD-1効果を増強する。
我々の観察結果を検証するため、特定病原体フリー（SPF）野生型（WT）マウスにMSS CRCの同所性CT26合生モデルを構築した（図S1K-1R）。内因性腸内細菌叢を抗生物質で枯渇させた後、マウスを無作為に割り付け、Fn、UA159（細菌コントロール、Streptococcus mutans株）、またはPBSを投与し、抗PD-1またはコントロールIgGで処理した（図S1K）。nはUA159およびPBSと比較してCT26移植片の成長を促進した（いずれもp＜0.0001）（図S1L）。nti-PD-1はPBS-またはUA159-処置マウスにおいて腫瘍増殖を抑制できなかった。対照的に、抗PD-1+Fnは、PBS+IgG（いずれもp<0.0001）、Fn+IgG（いずれもp<0.0001）、PBS+抗PD-1（いずれもp<0.01）、UA159+抗PD-1（重量、p<0.01；体積、p<0.001）と比較して、腫瘍重量および体積を有意に減少させた（図S1L）。同様に、Fn+抗PD-1群では、他の全群と比較して腫瘍細胞の増殖が少なく、アポトーシスが多かった（図S1MおよびS1N）。nは腫瘍で検出され（図S1O）、総CD8+ TILの増加によって証明されるように、CD8+TILを調節した（図S1P）。nはまた、PD-1+CD8+ TILsを減少させる一方で、GZMB+、IFN-γ+、およびTNF-α+ CD8+TILsを増加させた（図S1QおよびS1R）。これらの結果は、UA159ではなくFnがマウスMSS CRCにおける抗PD-1効果を促進することを示している。同様に、Fnは抗PD-1と相乗的に、皮下および同所性のMC38移植片の増殖を阻止した（図S2A-S2M）。以上の結果から、FnはCD8+ TILを活性化することにより、ヒト化およびマウスCRCモデルにおける抗PD-1効果を高めることが示された。
無菌CD34+ヒト化マウスにおけるFnのモノコロニーゼーションは、全身性のCD8+ T細胞を介した抗腫瘍免疫を促進する。
Fn単独で全身性のCD8+ T細胞応答を誘発できるかどうかを調べるため、無菌CD34+ヒト化マウスを開発し、Fn、U159Aコントロール、またはPBSコントロールで単コロニー化し、HT29異種移植片を皮下に移植した（図3A）。hCD45+細胞は循環リンパ球の約30％を占めた（図3B）。n経口投与によりHT29異種移植片の増殖が抑制され、UA159またはPBSと比較して腫瘍重量（p＜0.01）および体積（p＜0.01）が減少した（図3C）。Fn群における細胞増殖およびアポトーシス誘導の抑制は、それぞれKi-67/PCNAおよびTUNELアッセイによって確認された（図3D）。さらに、Fnは、CD 8+ TILにおけるPD-1の発現を抑制し（図3E、3F、S2N、およびS2O）、一方で、フローサイトメトリーおよびIHCによって証明されるように、他のすべての群と比較して、CD8+TIL数、IFN-γ+、TNF-α+、およびGZMB+発現を増加させた（図3F、S2N、S2O、およびS2P）。その上、Fnの経口投与は腸のバリア機能を破壊し、Fn分泌物の全身分布を促進する可能性があった（図S2QおよびS2R）。これらの結果は、Fnの単コロニー化がCD8+ TILの全身的活性化を誘導することによって抗腫瘍免疫を高めることを示している。
図3Fnは、MSS CRC異種移植片を皮下移植した無菌免疫ヒト化マウスおよび同所性MSS CRC同種移植片を皮下移植したSPFマウスにおいて、CD8+ TILを全身的に活性化することにより抗PD-1効果を促進する。
nはPD-1の発現を低下させ、その代謝産物である酪酸を介してCD8+T細胞を再活性化する
FnはFap2やFadAなどの病原性因子を発現し、CRCへのコロニー形成と腫瘍増殖の促進を可能にする14,15。しかし、TIMEにおける免疫細胞との相互作用は不明である。Fn分泌分子が抗PD-1効果の増強に関与しているかどうかを評価するために、同所性および皮下CT26移植片を樹立した。同所性CT26移植において、マウスを無作為に割り付け、Fn条件培地（CM）、UA159 CM、またはブロスコントロールを投与し、抗PD-1またはコントロールIgGで処理した（図3G）。nCMはUA159 CM群と比較して、腫瘍重量（p＜0.01）および体積（p＜0.05）の両方でCT26移植片の増殖を抑制した（図3H）。nti-PD-1は、ブロスコントロールまたはUA159 CM処置マウスにおいて腫瘍増殖を抑制できなかった。対照的に、抗PD-1+FnCMはコントロール+抗PD-1（いずれもp<0.0001）、UA159+抗PD-1（いずれもp<0.0001）、Fn+IgG（重量、p<0.001；体積、p<0.01）と比較して腫瘍重量と体積を減少させた（図3H）。同様に、FnCM+抗PD-1群では、他の全群と比較して腫瘍細胞の増殖が少なく、アポトーシスが多かった（図S3A）。nCMはTILを活性化し、PD-1+CD8+ TILは減少したが、GZMB+、IFN-γ+、およびTNF-α+ CD8+TILは、特に抗PD-1との併用で増加した（図3I、S3B、およびS3C）。これらの結果は、マウスMSS CRCにおいて、UA159 CMではなくFnCMが抗PD-1効果を促進することを示している。皮下CT26移植片モデルでも同様の結果が得られた（図S3D）。抗PD-1単独ではCT26移植片の増殖抑制に効果がなかったが、FnCMは抗PD-1単独およびコントロールと比較して腫瘍重量および体積が減少したことから明らかなように、抗PD-1効果を増強した（図S3D）。また、FnCMと抗PD-1の併用は、腫瘍の細胞増殖（Ki67とPCNA）を抑制し、アポトーシスを促進した（図S3E）。nCM＋抗PD-1は、フローサイトメトリー（図S3F）およびIHC（図S3G）により決定されたように、CD8＋TILおよびGZMB＋、TNF-α＋、IFN-γ＋CD8＋T細胞を増加させたが、PD-1＋CD8＋T細胞の割合を減少させた。以上の結果から、FnセクレトームがMSS CRCにおける抗PD-1効果を高めることが示唆された。
Fn分泌体がin vivoで抗PD-1効果を増強しうるということで、次に、Fn分泌体がCD8+TILsに直接作用するかどうかを検討した。この仮説を検証するため、脾臓CD8+ T細胞をFnCMとインキュベートし、疲弊と活性化のマーカーを測定した（図S4A）。短期間（18時間）のFnCMとの共培養は、CD8+T細胞上のPD-1発現を用量依存的に減少させたが、IFN-γ+、TNF-α+、およびGZMB+ CD8+T細胞の割合は有意差を示さなかった（図S4A）。しかし、FnCMとの共培養期間を延長（2日間）すると、CD8+T細胞のIFN-γ+、TNF-α+、GZMB+が有意に増加し（図S4B）、培養上清中にIFN-γ、TNF-α、GZMBが分泌された（図S4B）。FnCMの活性成分を明らかにするため、FnCMを分子サイズ（<3 kDa、10-100 kDa、3-10 kDa、>100 kDa）ごとに分画したところ、<3 kDa画分がCD8+T細胞のPD-1レベルを抑制し、細胞傷害機能を高めるのに最も効果的であることが明らかになった（図4AおよびS4C）。ロテイナーゼK処理はFnCMによるPD-1の調節に影響を与えなかったことから（図4A）、FnCMによるPD-1の抑制には低分子代謝物が関与していることが示唆された。
図4Fnはその低分子代謝産物を介してCD8+T細胞のPD-1発現を低下させる
次に、関与する代謝物を同定するために一連の実験を計画した（図4B）。FnCM（<3 kDa）対ブランク培地、およびFn経口投与マウス対PBS経口投与無菌マウスの糞便のntargeted metabolomicsから、Fnによって代謝物プロファイルが変化することが明らかになった（図4C）。in vitroと in vivoの Fn富化代謝物の比較から、37の富化代謝物が同定され（図4D）、中でも酪酸が富化候補のトップであった（図4DおよびS4D）。または検証のため、短鎖脂肪酸（SCFA）の標的分析を行った。図4EおよびS4Eに示すように、酪酸、酢酸、プロピオン酸、吉草酸などのSCFAは、Fnを経口投与した無菌マウスのFnCMおよび糞便に濃縮されていた。Fnに濃縮された代謝産物がCD8+ T細胞を修飾するかどうかを調べるため、脾臓CD8+ T細胞を用いた共培養試験を行った。酪酸のみがPD-1の発現を低下させる一方、脾臓CD8+T細胞においてIFN-γ、TNF-αおよびGZMBを用量依存的に誘導した（図4F、S4FおよびS4G）。Fnを濃縮した代謝産物は影響を及ぼさなかった（図S4HおよびS4I）。同様に、FnCMまたは酪酸はともにCT26移植片腫瘍からのCD8+TILの活性化を刺激した（図4G、S5A、およびS5B）。これらの所見は、FnがCD8+Tの疲弊を逆転させ、酪酸を産生することによって細胞傷害機能を高めることを示している。Fn、FnCMあるいは酪酸は、ヒトCRC細胞におけるPD-1の発現を減少させた（図S5C）。また、CD8+ T細胞では、酪酸はCD4+T細胞におけるPD-1発現を低下させる一方で、in vitroおよびin vivoでのGZMB、IFN-γ、およびTNF-αの発現を上昇させた（図S5DおよびS5E）。これらの結果から、Fnは in vitro、マウスおよびMSS CRC患者において、CD8+およびCD4+T細胞のPD-1発現を低下させることが示された。
酪酸生合成を欠損したFnは、in vitroでCD8+T細胞および抗PD-1反応を活性化しない。
前述の観察から、Fnによる酪酸産生がCD8+T細胞の再活性化に必要であるという仮説を立てた。そこで我々は、酪酸発酵に必須な酵素であるエノイル-CoAヒドラターゼ（FN0271）に変異を持つFn株を作製した（図5A）。N0271変異型Fn株は、ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）により決定されたように、酪酸生合成が欠損している（図5A）。WTFnCMまたは酪酸と比較して、FN0271変異FnCMは、PD-1+CD8+ T細胞を減少させる効果が有意に低く（図5B、S6A、およびS6B）、GZMB+、TNF-α+、およびIFN-γ+ CD8+T細胞を誘導できなかった（図5BおよびS6A〜S6C）。また、CD8+ T細胞のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルアッセイを行ったところ、WTFnCMまたは酪酸はCD8+T細胞の増殖を誘導したが、FN0271変異体FnCMは効果を示さなかった（図5C）。抗PD-1療法をin vitroでモデル化するために、CT26腫瘍を有するマウスからCD8+ TILを濃縮し、FnCMまたはFN0271変異FnCMで、抗PD-1の有無にかかわらず共培養を行った（図5D）。その結果、WTFnCMは、CD8+T細胞上のPD-1発現を阻害する抗PD-1の効果を増強し、細胞傷害性マーカー（GZMBおよびIFN-γ）の相乗的誘導をもたらしたが、FN0271変異Fnは効果がなかった（図5E、S6D、およびS6E）。このデータから、FnのCD8+T細胞ブースト機能が酪酸の産生に依存していることが確認された。
図5Fnはその代謝産物である酪酸を介して抗PD-1療法に対する反応を高める。
Fnは酪酸の生合成を通じて、自家CD8+T細胞と共培養したMSS CRC患者由来オルガノイドにおける抗PD-1効果を高める
Fnがヒト免疫系において酪酸を介して抗PD-1効果を高めることができるかどうかを調べるために、同じ患者から採取した自己末梢血単核球（PBMC）由来のCD8+T細胞と共培養した初代CRCオルガノイドを樹立し（図6Aおよび表S2）、続いて、抗PD-1を添加した、または添加せずに、FnCM、FN0271変異FnCM、または酪酸を添加した（図6A）。腫瘍細胞の死滅を評価するために、カスパーゼ-3/-7緑色プローブでCRCオルガノイドを標識した。図6Bに示すように、FN 0271変異FnCM+抗PD-1ではなく、FnCM+抗PD-1または酪酸+抗PD-1の組み合わせは、CRCオルガノイドのアポトーシスを有意に誘発した。抗cleaved caspase-3/-7プローブで染色した後、ローサイトメトリー解析を行ったところ、一貫した結果が得られた（図6C）。これらの知見と一致して、WTFnCMは抗PD-1で増強され、CD8+T細胞においてPD-1を抑制し、GZMBとIFN-γの発現を促進したが、FN0271変異FnCMは効果を示さなかった（図6D）。さらに、前述の結果は、自家腸間膜リンパ節由来T細胞と共培養したMSS CRCオルガノイドの別の症例でも確認された（図S7A、S7B、および表S2）。したがって、Fnとその代謝産物である酪酸は、CRCオルガノイドとPBMC由来CD8+T細胞の自家共培養で例示されるように、ヒトMSS CRCにおける抗PD-1反応性を増強した。
図6 MSS CRC患者由来の腫瘍オルガノイドとPBMCの自己共培養系において、Fnはその代謝産物である酪酸を介して抗PD-1 mAbの殺腫瘍効果を増強する。
CRC患者における我々の所見を裏付けるために、抗PD-1療法を受けていないMSS CR患者80人のスライドを用いて、PD-1のIHC（図S7C）とFnのFISH（図S7D）を行った。その結果、FnレベルとPD-1レベルはMSS CRC患者において負の相関を示した（r = -0.302、p= 0.0065）（図S7D）。大腸菌FISHプローブも一般細菌（16S）FISHプローブもPD-1発現との有意な相関を示さなかった（図S7EおよびS7F）。
酪酸はMSS CRCin vivoにおいてCD8+ TILを介した抗腫瘍免疫応答を促進する
CD8+TILの活性化を通じて抗PD-1療法を増強する重要なFn由来代謝産物として酪酸を検証するため、CT26移植片において、抗CD8α mAbを用いたCD8+細胞の枯渇の有無にかかわらず、酪酸、抗PD-1、またはそれらの併用療法の有効性を比較した（図7A）。酪酸単独はコントロールと比較して腫瘍増殖を抑制し、抗PD-1を加えることでその有効性が改善した（図7Bおよび7C）。予想通り、酪酸＋抗PD-1はアポトーシスを誘導し、腫瘍の細胞増殖を抑える最も強い効果を示した（図7Dおよび7E）。さらに、酪酸はCD8+TILを増加させ（図7F、7G、S7G、およびS7H）、PD-1+CD8+TILを減少させた（図7H、S7G、およびS7H）が、同時に細胞傷害性マーカーを増加させた（図7I、S7G、およびS7H）。驚くべきことに、抗CD8α mAbによるCD8+の枯渇は、CT26移植片の成長を阻害する酪酸＋抗PD-1の効果をほとんど消失させた（図7A-7G、S7G、S7H）。したがって、Fn-酪酸軸はCD8+ TILの消耗を緩和し、細胞傷害機能を再活性化することにより、CD8+T細胞依存的にMSS CRCにおける抗PD-1免疫療法を促進する。
図7Fn由来の酪酸はCD8+ T細胞依存的にMSS CRCにおける抗PD-1療法を促進する。
細菌由来の酪酸が抗PD-1効果を高めることを検証するために、我々は既知の酪酸産生菌であるFaecalibacterium prausnitzii（Fp）（Firmicutes門に属する）を選択し、CT26同所移植において抗PD-1効果に対するその効果を試験した（図S8A）。Fnと同様に、Fpを投与したマウスはCT26同所移植片を抗PD-1に感作し、抗PD-1単独と比較して腫瘍重量および腫瘍体積が減少した（いずれもp＜0.0001）（図S8B）。同様に、Fpと抗PD-1は相乗的にアポトーシスを促進し、腫瘍の細胞増殖を阻害した（図S8C）。p＋抗PD-1は、PD-1の減少およびTNF-α、GZMB、およびIFN-γ発現の増加によって証明されるように、CD8＋TILを協同的に再活性化した（図S8DおよびS8E）。Fnとは対照的に、Fpは4 kDa FITC-デキストラン透過性アッセイによって決定される腸のバリア機能に有意な影響を与えなかった（図S8F）。これらの結果は、CD8+TILの活性化を介したFnおよびFpの抗PD-1増強作用の根底にある共通のメカニズムが、上皮性炎症やリーキーガットではなく、酪酸であることを示唆している。
nとその代謝産物である酪酸は、TBX21をアップレギュレートすることによりCD8+T細胞の転写プログラムを制御する
FnがPD-1の発現を抑制するメカニズムを明らかにするために、FnCM、FN0271KOFnCM、およびブランク培地（Ctrl）処理したCD8+ T細胞をRNAシークエンシングで解析した（図8A、S9A、およびS9B）。nCMはCD8+ T細胞の遺伝子発現プロファイルを顕著に変化させたが、FN0271KOFnCMは主成分分析によりコントロールと分離した（図8A）。Ctrlと比較して、FnCMは3,616遺伝子をアップレギュレートし、1,112遺伝子をダウンレギュレートしたが、FN0271KOFnCMによって変化した遺伝子はより少なかった（図S9A）。ene Ontology解析により、FnCMはサイトカイン産生の正の制御を含むサイトカイン産生に属する遺伝子を濃縮することが明らかになった（図S9B）。さらに、FnCMはGzmb、Gzmc、Ifng、Tnfを含む複数のエフェクターT細胞関連遺伝子を誘導したが、Pdcd1（PD-1）はFN0271変異FnCMまたはCtrlと比較して発現が低下した（図8A）。活性化T細胞に発現する重要な転写因子であるbx21は、FnCMによって特異的に発現が上昇した（図8A）。酪酸はTbx21、Ifng、Tnf、Gzmbの発現を促進するというFnCMの効果を再現し、CD8+T細胞におけるFn誘導シグナル伝達におけるその役割を強調した（図8A）。
図8Fn代謝産物である酪酸は、TBX21（T-bet）のアップレギュレーションにつながるエピジェネティックなメカニズムを通してCD8+T細胞を制御する。
Tbx21がT細胞の活性化に重要であることから、Fnとその代謝物である酪酸がTbx21を介してCD8+T細胞を調節しているのではないかという仮説を立てた（図8B）。この考えを検証するため、CD8+ T細胞でTbx21ノックアウト（KO）を行ったところ（図8B）、Tbx 21のKOはPD-1タンパク質の発現を増加させ（図8B、上）、PD-1+CD8+ T細胞を抑制するFnCMまたは酪酸の効果を消失させ、CD8 +T細胞の活性化を阻止することがわかった（図8B、下）。
nおよびその代謝産物である酪酸は、H3K27アセチル化を通じてTBX21の転写を促進する
酪酸はGタンパク質共役型受容体（GPR41/43/109）を介して、あるいはHDACを阻害することによってシグナル伝達を調節する可能性がある17,18。我々はまず、FITC標識トレーサーを用いてCD8+ T細胞における酪酸の局在を追跡し、CD8+ T細胞の核に蓄積していることを明らかにした（図8C）。さらに、GPR阻害剤や活性化剤は、CD8+ T細胞におけるFnCMや酪酸を介したPD-1抑制に影響を及ぼさなかったことから（図S9C-S9E、表S3）、酪酸-GPR受容体の相互作用はCD8+ T細胞の疲弊を緩和できないことが示唆された。そこで、酪酸がHDACを阻害することによってCD8+ T細胞を制御する可能性があるかどうかを検討した19。汎HDAC活性アッセイでは、FnCMまたは酪酸がHDAC活性を低下させることが示されたが、FN0271変異体FnCMは効果を示さなかった（図8D）。HDAC阻害がCD8+T細胞におけるPD-1発現を調節するかどうかを調べるため、汎HDAC阻害剤およびHDACクラスI-、II-、III-、IV特異的阻害剤を用いてCD8+T細胞を処理したところ、汎またはクラスIのHDAC阻害剤がPD-1発現を抑制することが明らかになった（図8D、S9F、および表S3）。逆に、HDACアゴニストITSA-1はPD-1+CD8+ T細胞を増加させた（図S9G）。個々のクラスI HDAC（1/2/3/8）を遮断したところ、HDAC3i RGFP966またはHDAC8i PCI-3405lは用量依存的にPD-1+CD8+ T細胞を減少させた（図8EおよびS9H、表S3）ことから、HDAC3/8がPD-1の発現制御に関与していることが示唆された。また、FnCMまたは酪酸（FN0271変異FnCMは含まない）はHDAC3/8を抑制した（図8F）。これらのデータは、Fnまたは酪酸がCD8+T細胞のHDAC3/8を抑制し、PD-1の発現を調節していることを示唆している。
以前の研究で、HDAC3とHDAC8がCD8+ T細胞においてH3K27acを選択的に標的にして転写抑制を媒介すること20,21と、HDAC8の阻害がCD8+T細胞の細胞傷害機能を増強することが示された22。そこで、CD8+ T細胞においてFnCMまたは酪酸処理後にクロマチン免疫沈降（ChIP）qPCRを行い、Tbx21プロモーターにおけるH3K27acの濃縮を検出した（図8G）。FnCMと酪酸のいずれもTbx21プロモーターにおけるH3K27acを増加させ（図8G）、PD-1と負の相関を示すTBX21タンパク質発現を上昇させた（図8H）。これらの効果は変異型FN0271 Fnでは消失した（図8Gおよび8H）。これらの結果を総合すると、Fnとその代謝産物である酪酸はHDAC3/8を阻害してCD8+ TILのTbx21プロモーターにおけるH3K27acを濃縮し、TBX21の発現を上昇させ、続いてPD-1をダウンレギュレートし、MSS CRCにおけるCD8+TILの疲弊を緩和することが示唆される（図8I）。
nは酪酸依存的なHDAC3/8の遮断を介してMSS CRCにおける抗PD-1効果を増強する
Fn-酪酸-HDAC3/8-TBX21軸がin vivoで抗PD-1効果を増強する機能を包括的に示すために、HT29皮下腫瘍を有するCD34+ヒト化マウスを用いた。腫瘍にFnCM、FN0271変異FnCM、またはHDAC3&8阻害剤（HDAC3&8i）を抗PD-1とともに腫瘍内に注射した（図8JおよびS9I-S9K）。FnCMおよびHDAC3&8iのいずれも、コントロール群および抗PD-1群と比較して腫瘍重量および腫瘍体積の減少によって示されるように、抗PD-1効果を増強した（図8J）。対照的に、FN0271変異FnCMは抗PD-1効力に有益な効果を示さなかった（図8J）。表現型の観察と同様に、FnCM+抗PD-1およびHDAC3&8i+抗PD-1は腫瘍細胞の増殖（Ki-67およびPCNA）を阻害した（図S9I）。下流のシグナル伝達を調べるために、H3K27ac、TBX21、PD-1のIHCを行い、FnCM+抗PD-1およびHDAC3&8i+抗PD-1がH3K27acとTBX21タンパク質の発現を誘導し、同時にPD-1レベルを阻害することを示した（図S9J）。さらに、FnCM+抗PD-1およびHDAC3&8i+抗PD-1は、CD8+ TILの疲弊を逆転させ、細胞傷害機能を活性化した（図S9K）。酪酸を欠損させたN0271変異型FnCMは、これらのシグナル伝達効果のいずれも引き出すことができなかった（図S9I-S9K）。したがって、Fn由来の酪酸は、in vivoでのMSS CRCにおけるFnの抗PD-1増強機能に不可欠であり、この効果は、HDAC3およびHDAC8の薬理学的阻害によって表現される。
考察
Fnは、CRCの進行、転移、および化学療法抵抗性を促進する、確立された病原性細菌である。我々は、Fnが酪酸を生合成し、TBX21（T-bet）転写因子のエピジェネティックな活性化を通じてCD8+ TILのPD-1発現を抑制することで、細胞傷害性CD8+ TILを増加させ、抗PD-1療法と連動して腫瘍細胞を死滅させることを明らかにした。免疫学的に冷淡なMSS CRCにおいてFnの存在量が高いことは、抗PD-1療法に対する良好な反応を予測する可能性がある。
nはCRCにおいてしばしば濃縮される。今回我々は、MSS「免疫学的にコールド」CRCのヒト化マウスモデルにおいて、Fnのコロニー形成は単独では腫瘍形成を促進するが、その存在は逆説的に抗PD-1に対する治療反応を誘発し、腫瘍抑制につながることを示した。興味深いことに、これらのモデルでは抗PD-1も腸内常在菌との併用も、有効性は認められなかった。さらに免疫学的評価から、Fnのコロニー形成がCD8+ TILsのPD-1発現を抑制し、その結果、腫瘍内細胞傷害性CD8+ TILsが再活性化して腫瘍細胞を死滅させることが明らかになった。従って、反応性が乏しいためにαPD-1療法が不適格なCRC患者の主要なサブセットであるMSS CRCにおいて、抗PD-1療法の治療成績の改善におけるFnの別の役割が明らかになった。今回の知見は、メラノーマ、非小細胞肺癌、MSI-H CRCなどの「免疫ホット」腫瘍において、腸内細菌が抗PD-1治療に対する反応性に影響を及ぼすことを示す研究の蓄積に追加されるものである6,8,25,26。興味深いことに、別のCRC関連病原体である腸内毒素原性バクテロイデス・フラジリスもまた、MSI-H CRCにおいて免疫療法の効果を高めることが示されている27。したがって、Fnのような病原性細菌は、MSS CRCにおいて腫瘍形成と免疫療法効果に相反する影響を及ぼす可能性がある。
ut微生物は、受容体タンパク質を介した直接的な細胞間相互作用や代謝産物や毒素の生成など、多くのメカニズムを通じて宿主大腸上皮とクロストークする。自家T細胞とCRCオルガノイドの共培養系を傾けることにより、FnCMがPD-1の発現を抑制することでCD8+TILの疲弊を緩和する一方、IFN-γ+、TNF-α+、GZMB+ CD8+T細胞を増加させることを示した。我々の仮説を裏付けるように、酪酸合成を欠損させたFn変異株はCD8+T細胞を調節できなかった。さらに、酪酸の投与はCD8+TILsに対するFnの効果を逆転させた。従って、Fnまたは酪酸は、Fn変異体ではなく、MSS CRCのヒト化マウスおよびシンジェニックマウスモデルにおいて、抗PD-1効果を高める全身性の抗腫瘍免疫を誘発することができる。しかしながら、Fnはギ酸やコハク酸のような代謝産物を生成することが知られている31,32。従って、FnはCRC微生物叢に頻繁に濃縮されていることから、我々の研究はFnをMSS CRCにおける酪酸の潜在的供給源として同定した。この知見は、酪酸が抗腫瘍免疫力を高めるために有益な腸内微生物の代謝産物であることを示した、我々33や 他の研究者19,34の過去の報告からも支持された。酪酸は、ID2、19TLR5、33あるいはT細胞受容体34のシグナル伝達を活性化することによって、がんにおけるCD8+T細胞のエフェクター機能を増強することが示されている。今回われわれは、PD-1の発現を抑制することによってCD8+T細胞の疲弊を緩和するという、酪酸のさらなる効果を明らかにした。FnはCRC常在菌であるため、酪酸の補給よりも、この代謝産物を長期間にわたって安定したレベルで供給できる利点があるかもしれない。
PD-1は、T細胞の増殖、細胞の生存、エフェクター機能を阻害する免疫抑制シグナルを伝達し、腫瘍特異的免疫応答を抑制する38,39。特に、PD-1を高発現しているエフェクターT細胞（PD-1high）は、抗PD-1遮断療法だけでは回復しないことが多く、その結果、有効性が低下する。e.は、Fnとその代謝産物である酪酸がCD8+ TILのPD-1を抑制する分子メカニズムを明らかにした。酪酸はHDAC3/8に対する阻害作用によって、Tbx21のプロモーターにおけるH3K27acの濃縮を引き起こし、PD-1だけでなく他の阻害性T細胞受容体の転写抑制因子であるTBX21の発現を増加させる40,41。Tbx21KO CD8+T細胞では、Fnと酪酸はPD-1の発現を低下させることができず、TBX21依存的にPD-1の発現を調節していることが検証された。われわれの観察と同様に、他の研究者たちも、食事42や遺伝的因子43によるPD-1のダウンレギュレーションが、T細胞の疲弊を防ぎ、抗PD-1と協同して腫瘍の成長を阻害することを明らかにしている。おそらく、Fnとその代謝産物である酪酸によるCD8+TILのPD-1発現抑制は、実質的にMSS CRCを "コールド "腫瘍から "ホット "腫瘍へと変化させ、抗PD-1療法に対する反応を増強しているのであろう。
我々の実験結果を裏付けるように、MSS CRC患者80人のコホートにおいて、Fnの存在量はPD-1タンパク質の発現量と負の相関があることが示された。Fnが抗PD-1効果を促進するという我々の考えを裏付けるように、他の研究でも、FnがMSS CRC TIME13におけるT細胞の存在量や、CRC患者コホート（n= 27）におけるPD-1遮断に対する反応性と正の相関があることが示されている44。Fnの免疫抑制的役割を支持するものとして、ヒトCRC腫瘍の空間解析から、Fnに関連する腫瘍ニッチはCD3+T細胞を排除するが、炎症を促進する好中球やマクロファージが豊富であることが明らかにされている45。
最近、2つの研究32,44が、FnとCRC免疫療法の相互作用について、相反する結果を明らかにした。ne44は、Fnの腫瘍内注射がcGAS-STINGシグナルを活性化することによってCRC細胞のPD-L1発現を誘導し、MSS CRCマウスモデルにおける抗PD-L1の有効性を高めることを報告した。一方、別の研究32は、Fnの経口投与が別のFn代謝産物であるコハク酸を介して抗PD-1 mAbに対する感受性を低下させることを見出した。それにもかかわらず、我々の代謝プロファイリングでは、Fnを経口投与された無菌マウスのFnCMおよび糞便中に高レベルの酪酸が検出されたが、コハク酸は検出されなかった。これは、FnCM中の酪酸がコハク酸の少なくとも14倍高いことを示したDahlstrandら46の所見と同じである。さらに、両研究とも皮下合成腫瘍モデルを用いており、CRCのTIMEを正確に反映することはできない。我々は、Fnとその代謝物である酪酸が、MSS CRCにおける抗PD-1効果を促進するのに有効であることを示すために、同所移植されたMSS CRC、ヒトMSS CRC同所移植または皮下腫瘍を有するSPFマウスおよび無菌CD34+ヒト化マウスなど、生理学的に適切な多くのモデルを使用した。CRCにおける抗PD-1反応に対するFnの矛盾した効果に対処するためには、鉱石を用いた研究が必要である。
要約すると、Fnは、酪酸-HDAC3/8-TBX21軸を介してCD8+TILのPD-1過剰発現を抑制し、抗腫瘍免疫の再活性化を導くことにより、MSS CRCにおける抗PD-1効果を増強する上で重要な役割を果たしている。本研究はまた、Fn量がMSS CRCにおけるαPD-1治療を予測するバイオマーカーとなる可能性を示唆し、大腸酪酸を上昇させることがMSS CRC患者における抗PD-1免疫療法に対する臨床効果を改善する戦略となる可能性を示唆している。
研究の限界
本研究にはいくつかの限界がある。まず、機能的および機序的研究はマウス腫瘍モデルで行われた。MSSのCRC患者における抗PD-1の有効性に対するFnの影響を確認するためには、さらなる調査が必要である。第二に、CD34+ヒト化マウスはヒトのすべての免疫細胞系列を完全に再構成できない可能性があり、免疫応答の有効性を阻害する可能性がある。第三に、CRC47で優勢なFnクレード（FnaC2）が最近同定されたことから、Fnの株特異的な違いが示唆されるが、本研究では検討しなかった。
リソースの利用可能性
連絡先
リソースおよび試薬に関するさらなる情報およびリクエストは、リードコンタクトであるJun Yu(junyu@cuhk.edu.hk)までお願いします。
試薬の入手可能性
本研究では新たなユニークな試薬は作成していない。本研究で作製されたN0271変異型Fusobacterium nucleatum株は、要望があれば研究責任者が共有する。
ATAおよびコードの利用可能性
本論文で報告したCD8+T細胞のNA配列データは、Genome Sequence Archive (GSA)にアクセッション番号で寄託されている： RA017632。on-targetedメタボロームデータセットおよびSCFA-targetedメタボロームデータセットは、China National GeneBank (CNGB)にアクセッション番号で寄託されている： NP0006072。
本論文はオリジナルコードを報告していない。
本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報については、要望があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
このプロジェクトは、中国の国家重点研究開発プログラム（No. 020YFA0509200/2020YFA0509203）、深圳-香港-マカオ科学技術プログラム（カテゴリーC）深圳（SGDX20210823103535016）、広東省基礎応用基礎研究基金会（2022B1515120031）、 esearch人材ハブ-革新技術基金香港（ITS/177/21FP）、RGC研究インパクト基金香港（R4032-21F）、RGC共同研究基金（C4039-19GF）。
著者貢献
概念化、X.W.およびJ.Y.、方法論、X.W.、Y.Z.、X.L.およびL.X.、調査、X.W.、Y.F.、W.L.、H.Q、 .G.、M.L.、L.S.、Y.Z.、M.F.、W.S.、C.L.、H.C.-H.L.、J.W.、N.W.、T.Y.、M.M.、X.Z.、J.F.；視覚化、X.W、 .F.、L.S.、B.L.；資金獲得、J.J.Y.S.、J.Y.；プロジェクト管理、J.Y.；監督、J.Y.；執筆-原案、X.W.、C.C.W.、J.Y.；執筆-査読および編集、X.W.、C.C.W.、J.Y.
利害関係
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
TAR★方法
EYリソース表
EAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER
抗体
Alexa Fluor 647 抗ヒトCD8 Abcam Cat#: ab305048; RRID: AB_3552231
lexa Fluor 488 抗ウサギ IgG H&L Abcam Cat#: ab150077; RRID: AB_2630356
精製抗ヒト IgG Fc 抗体 BioLegend Cat#: 410701; RRID: AB_2565624
精製抗マウス CD16/32 抗体 BioLegend Cat#: 101301; RRID: AB_312800
rilliant Violet 510™ 抗ヒト CD45 BioLegend Cat#: 368526; RRID: AB_2687377
PC-Cy™7 マウス抗ヒト CD3 BD Cat#: 557832; RRID: AB_396890
B515 マウス抗ヒト CD4 BD Cat#: 564419; RRID: AB_2744419
PC マウス抗ヒト CD8 BD Cat#: 566852; RRID: AB_2869906
B700 マウス抗ヒト PD-1 BD Cat#: 566460; RRID: AB_2744348
E 抗ヒト/マウス グランザイム B BioLegend Cat#: 372208; RRID: AB_2687032
lexa Fluor® 700 抗ヒト TNF-α BioLegend Cat#: 502928; RRID: AB_2561315
V605 マウス抗ヒト IFN-γ BD Cat#: 562974; RRID: AB_2737926
ITC ラット抗マウス CD45 BD Cat#: 561088; RRID: AB_10562038
PC-Cy™7 ハムスター抗マウス CD3 BD Cat#: 557596; RRID: AB_396759
erCP-Cy™5.5 ラット抗マウス CD4 BD Cat#: 550954; RRID: AB_393977
PC-R700 ラット抗マウス CD8 BD Cat#: 564983; RRID: AB_2739032
rilliant Violet 421™ 抗マウス PD-1 BioLegend Cat#: 135218; RRID: AB_2561447
V711 ラット抗マウス TNF-α BD Cat#: 563944; RRID: AB_2738499
E-Cy™7 ラット抗マウス IFN-γ BD Cat#: 557649; RRID: AB_396766
CNA CST Cat#: 13110; RRID: AB_2636979
i-67 CST Cat#: 34330; RRID: AB_2942026
FN-γ アフィニティ Cat#: AF5183; RRID: AB_2837669
NF-α Abcam Cat#: ab205587; RRID: AB_2889389
ZMB Abcam Cat#: ab255598; RRID: AB_2860567
3K27ac Abcam Cat#: ab4729; RRID: AB_2118291
BX21 Abcam Cat#: ab307193; RRID: AB_2938873
D-1 CST Cat#: 84651; RRID: AB_2800041
istone H3 Abcam Cat#: ab309551; RRID: AB_3552232
APDH Abcam Cat#: ab8245; RRID: AB_2107448
抗ヒトCD8 Abcam Cat#: ab209775; RRID: AB_2860566
抗ヒトCD8 Abcam Cat#: ab245118; RRID: AB_3068617
抗ヒト PD-1 Abcam Cat#: ab214421; RRID: AB_2941806
抗ヒト PD-1 Abcam Cat#: ab237728; RRID: AB_3073606
抗ヒト IFN-γ CST Cat#: 8455; RRID: AB_2797644
抗ヒト TNF-α Abcam Cat#: ab9579; RRID: AB_296503
抗ヒト GZMB Abcam Cat#: ab134933; RRID: AB_2889221
-カドヘリン CST Cat#: 14472; RRID: AB_2728770
ラウディン3 Abcam Cat#: ab15102; RRID: AB_301648
抗ヒト PD-1 モノクローナル抗体 Bio X Cell Cat#: BE0188; RRID: AB_10950318
抗ヒト PD-1 モノクローナル抗体アイソタイプコントロール IgG Bio X Cell Cat#: BE0083; RRID: AB_1107784
抗マウス PD-1 モノクローナル抗体 Bio X Cell Cat#: BP0146; RRID: AB_10949053
nti マウス PD-1 モノクローナル抗体 アイソタイプコントロール IgG Bio X Cell Cat#: BP0089; RRID: AB_1107769
nVivoMAb 抗マウス CD8α Bio X Cell Cat#: BE0004-1; RRID: AB_1107671
nVivoMAb 抗マウス CD8α アイソタイプコントロール IgG Bio X Cell Cat#: BE0089; RRID: AB_1107769
細菌およびウイルス株
ウソバクテリウム・ヌクレアタム ATCC Cat#: ATCC 25586
トレプトコッカス・ミュータンスUA159 ATCC Cat#: ATCC 700610
aecalibacterium prausnitzii DSMZ Cat#: DSM107840
N0271 変異型 Fusobacterium nucleatum 本紙 N/A
微生物学的サンプル
ヒト糞便 上海第十人民病院；表S1 参照 該当なし
ヒト組織 孫中山大学第一付属病院;表S1および表S2 参照 N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
VS510 BD Cat#: 564406
VS620 BD Cat#: 564996
-ヒドロキシ酪酸 MCE Cat#: HY-113378
LPG0974 MCE Cat#: HY-12940
臭化エペンゾレート MCE Cat#: HY-17585
R420626 MCE Cat#: HY-116522
UG-1375 MCE Cat#: HY-112813
SK256073 MCE Cat#: HY-119222
ウイシノスタット MCE Cat#: HY-13322
イメリックジフェニルアミド106 MCE Cat#: HY-19348
C1568 MCE Cat#: HY-16914
イコチンアミド MCE Cat#: HY-B0150
IS17 MCE Cat#: HY-128918
-ヒドロキシオクタデカン酸 MCE Cat#: HY-N11692
AY-10683 MCE Cat#: HY-N0931
GFP966 MCE Cat#: HY-13909
CI-34051 MCE Cat#: HY-15224
TSA-1 MCE Cat#: HY-100508
酪酸 TCI Cat#: S0519
ITC-酪酸 XI'AN QIYUE BIOLOGY N/A
過塩素酸 iD MCE Cat#: HY-D1028
API MCE Cat#: HY-K1048
FSE BD Cat#: 565082
市販アッセイ
ycoAlert® マイコプラズマ検出キット Lonza Bioscience Cat#: LT07-318
CA タンパク質アッセイキット Epizyme Biomedical Technology Cat#: ZJ101
UNELアッセイキット KeyGen Biotech Cat#: KGA1400-100
ISH アッセイキット FOCO Biology Cat#: D-0015
inute™ 全タンパク質抽出キット Invent Biotechnologies Cat#: SD-001
mni-ECL™ Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biomedical Technology Cat#: SQ201
uick-DNA ミニプレップキット Zymo Research Cat#: D3025
B Green Premix Ex Taq キット Takara Cat#: RR42LR
asySepTM マウス CD8+T 細胞分離キット StemCell Technologies Cat#: 19853
umor 解離キット Miltenyi Biotec Cat#: 130-096-730
マウス腫瘍浸潤リンパ球分離キット Solarbio Cat#: P9000
マウス IFN-γクォンティカイン ELISA キット R&D Systems Cat#: MIF00-1
マウス TNF-α 定量 ELISA キット R&D Systems Cat#: MTA00B
マウスグランザイム B ELISA キット Abcam Cat#: ab238265
uick-RNA ミニプレップキット Zymo Research Cat#: R1055
rimeScriptTM II 1stストランド cDNA 合成キット Takara Cat#: 6110A
高感度 ChIP キット Abcam Cat#: ab185913
iaquick PCR 精製キット QIAGEN Cat#: 28104
lcian blue 染色キット Sbj bio Cat#: BP-DL242
帰属データ
NA配列（CD8+T細胞） 本論文 GSA： RA017632
on-targetedおよびSCFAsターゲットメタボロームデータ（条件培地およびマウス便） 本論文 CNGB: CNP0006072
実験モデル エルライン
ヒト：HT29 ATCC HTB-38
ヒト：HCT116 ATCC CCL-247
マウス T26 ATCC CRL-2638
マウス C38 Merck SCC172
実験モデル 器官/系統
ouse： PF-NODscidgamma Vital River Laboratories Cat#: 408
ouse： erm-free BALB/c 孫中山大学第一付属病院 N/A
マウス erm-free NODscidgamma GemPharmatech Cat#: T050405
ouse： ALB/c GemPharmatech Cat#: N000020
ouse： 57BL/6J GemPharmatech Cat#: N000013
リゴヌクレオチド
ウソバクテリウム・ヌクレアタム
AGGTAACAGCTCACCAAGC
ATCCGGATAACGCTCGTGAC Sangon N/A
6Sユニバーサルプライマー
R: CTACGGCTACGCTACGCTCAG
CTACGGCTACCTTGTTACGA Sangon N/A
usobacterium nucleatumFISHプローブ
Cy3付き ′-CTTGTAGTTCCGCYTACCTC-3′ Thermo Fisher N/A
bx21
AAATGCAGGACTTACGTAGTT
ATACCAACCGGTGTCTGTGT Sangon N/A
zmb
R: GGACAGTAGT
GGACAGTAGTTCGTGCCGT Sangon N/A
fng
TGGAGCATTGTTGAGCCT
TGGCTATGGGTGCAGACTTG サンゴン N/A
nf
GAGGTAGGATGTTGCTGC
TCTCTTTGCGGAGGCCTAAAG Sangon N/A
ctb
gtgacgttgacatccgtaaaga
GCCGGACTCATCGTACTCC Sangon N/A
bx21
ロモーター-F: AAATGCAGGACTTACCGTA
TT
プロモーター-R TACCAACCGGTGTCTGTGT Sangon N/A
N0271
p-F/R
CTTAGAGTCGACCTGCAGCAG
TATGTATTTTGTTAAG
tcccctttggcctcctttcaatac
自身のF/R
CTTATTTATTATTATTATCTTCTC
TATC
GTTGAATTCGGAGAGCTCAGG
CCTAATTCACCC Sangon N/A
エコンビナントDNA
プラスミド: pDS132 Hangzhou Forhigh Biotech N/A
bx21gRNAコード配列
′-GCTCTACCCAGGGCCGCGCG-3′ Sangon N/A
ソフトウェアおよびアルゴリズム
lowJo FlowJo LLChttps://www.flowjo.com
GraphPad Prism グラフパッドhttps://www.graphpad.com
mageJ 米国国立衛生研究所https://imagej.nih.gov/ij
実験モデルおよび研究参加者の詳細
マウスモデル
PFおよび無菌免疫ヒト化マウスモデル
SPF免疫ヒト化マウスモデルでは、雌雄ともに8週齢のNODscidガンママウス（408, Vital River Laboratories, China）に、亜致死量の全身ガンマ線照射（1.5Gy/匹）を行った後、尾静脈から1×105個のヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞（CB008F-C, ORICELLS, China）を注入した。または無菌免疫ヒト化マウスモデルとして、8週齢の雄性無菌NODscidガンママウス（T050405 GemPharmatech、中国）に、1×105個のヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞を、密封した滅菌プラスチック缶に入れ、亜致死量の全身ガンマ線照射（マウス1匹あたり1.5Gy）を行った後、尾静脈から投与した。CD34+ヒト化マウスにおけるヒト免疫細胞の生着は、移植後14週目にフローサイトメトリーでモニターされた（hCD45+/全CD45+細胞>25%で再構成されたマウスがさらなる実験に使用された）。無菌NODscidγマウスは、孫中山大学第一付属病院の無菌マウス研究施設で飼育された。erm-Freeマウスの便はメタボローム解析のために採取した。動物実験は、中山大学第一付属病院動物実験倫理委員会の承認を得た。
PFおよび無菌同所性・皮下大腸移植片および異種移植片
ヒトMSS CRC（HT29）細胞株またはマウスCRC（CT26、MC38）細胞株を、それぞれ免疫ヒト化雌性NODscidgammaマウス、SPF雄性または雌性BALB/cマウス、無菌雄性BALB/cマウス、雄性C57BL/6Jマウスの直腸に定位移植した（50μL PBS中2×105細胞）。または皮下モデルマウスでは、HT29、CT26、またはMC38細胞を、それぞれ免疫ヒト化雄性NODscidγマウス、雄性BALB/cマウス、または雌性C57BL/6Jマウスの脇の下に皮下注射した（50μL PBS中1×105細胞）。ここで、生殖細胞欠損マウスを作製するために、マウスに抗生物質のカクテル（1g/Lアンピシリン、1g/Lネオマイシン、1g/Lメトロニダゾール、0.5g/Lバンコマイシン）を2週間飲水投与した。
試験参加者の詳細
または抗PD-1免疫療法を受けたMSS CRC患者（n= 21）から便を採取し、患者は病理学的および臨床的にMSS CRC進行がんと診断された。患者は、抗PD-1 mAbと他の薬剤を併用した治療を少なくとも1コース受け、治療前にFn相対量を検出するために便を採取した。すべての患者から書面によるインフォームド・コンセントを得、本研究は上海第十人民病院倫理委員会（ID番号：SHSY-IEC-4.1/19-180/02）の承認を受け、中国臨床試験登録（ID番号：ChiCTR1900028063）に登録された。患者情報は表S1に示した。
または抗PD-1免疫療法を受けたMSS CRC患者（n= 4）から腫瘍組織を採取し、患者は病理学的および臨床的にMSS CRC進行がんと診断された。抗PD-1 mAbと他の薬剤を少なくとも1コース併用したSS CRC患者を、治療前のFn相対量検出のために選択した。すべての患者に対してインフォームド・コンセントを取得し、この研究は孫中山大学第一付属病院の倫理委員会によって承認された。患者情報は表S1に示した。
またはFMT便の選択について、我々は社内のCRCコホート（n= 96）を分析し、MSS CRC患者からFn存在量の多い便（n= 6）、中程度の便（n= 6）、およびFn存在量の少ない便（n= 6）を選択した。FMT用の便サンプルは、嫌気性グローブボックス内で滅菌PBSに懸濁し、懸濁液をFMTに使用した。
CRC組織と自家PBMC、または外科的切除後の腸間膜リンパ節を採取し、新鮮なCRC組織を用いてオルガノイドを培養し、TILを分離した。すべての患者についてインフォームド・コンセントを取得し、この研究は孫中山大学第一付属病院倫理委員会の承認を得た。患者情報を表S2に示す。
放線菌
nおよびFpは、それぞれAmerican Type Culture Collection（ATCC 25586、米国）およびDSMZ（DSM107840、ドイツ）から購入した。nは、嫌気性ジャー（C-31、三菱ガス化学、日本）内の流動性チオグリコレート培地（HB5191、Hopebio、中国）で培養した。嫌気条件は、アネロパックアネロ（C-35、三菱ガス化学、日本）により作製した。pは改良YCFA培地で嫌気培養した。Fnのコントロールとして、非病原性ヒト口腔常在菌Streptococcus mutansUA159（UA159）を用いた。A159はBrain Heart Infusion (BHI) broth (024053, Huankai Microbial, China)を用い、好気的条件下で培養した。
細胞株
ヒトCRC細胞株HT29およびHCT116（American Type Culture Collectionより購入）、マウスCRC細胞株CT26（American Type Culture Collectionより購入）およびMC38（Merckより購入）を、10％ウシ胎児血清（FBS）添加ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、37℃、5％CO2加湿インキュベーターで培養した。ll細胞株は、ショートタンデムリピートプロファイリングによって認証され、MycoAlert Mycoplasma Detection Kit（Lonza Bioscience, Basel, Switzerland）を用いて、受領時にマイコプラズマによる汚染について検査された。
方法の詳細
マウス処理
n、UA159、FnCM、FN0271変異FnCM、流動チオグリコレート培地、またはPBSを、経口投与または多点腫瘍内注射により投与した。放線菌は1×108CFUを週3回経口投与した。nCM、FN0271変異FnCM、HDAC3&8i（5μM RGFP966および10μM PCI-34051、MedChemExpress、USA）、または流動チオグリコレート培地を週3回投与した。酪酸オジウム（NaB）（S0519、TCI、日本）は飲料水（14 mM）に混ぜて投与し、実験期間中は毎週リフレッシュした。ermフリーマウスには、個々のFn高/中/低患者からのFMT（1患者あたりn = 2-3マウス）を週1回投与し、さらに抗PD-1治療を行った。抗ヒトPD-1モノクローナル抗体（BE0188、クローン：J116、Bio X Cell、USA）またはアイソタイプコントロールIgG（BE0083、クローン：MOPC-21、Bio X Cell、USA）を、週2回腹腔内注射によりマウスに投与した（マウス1匹あたり200μg）。nti-マウスPD-1モノクローナル抗体（BP0146、クローン：RMP1-14、米国Bio X Cell社製）またはアイソタイプコントロールIgG（BP0089、クローン：2A3、米国Bio X Cell社製）を週2回マウスに腹腔内注射した（マウス1匹あたり200μg）。またはCD8+T細胞枯渇実験では、200μgのInVivoMAb抗マウスCD8α（BE0004-1、クローン：53-6.7、Bio X Cell、USA）またはアイソタイプコントロールIgG（BE0089、クローン：2A3、Bio X Cell、USA）を週2回腹腔内注射した。
NAの単離とFn相対量のqPCR解析
MSS CRCの便および腫瘍組織からQuick-DNA Miniprep Kit (D3025, Zymo Research, USA)を用いてNAを抽出し、TB Green Premix Ex Taq Kit (RR42LR, Takara, Tokyo)を用いてqPCRを行った。nの相対存在量レベルは、総菌数に対して正規化した。このアッセイに使用されたリマーは主要リソース表に記載されている。
生態調査およびサンプル採取
終末期にマウスをペントバルビタール腹腔内注射で麻酔した。腫瘍組織を迅速に摘出し、腫瘍重量とサイズを記録した。腫瘍体積は、デジタルノギスを用いて長さ（a）と幅（b）を測定し、腫瘍体積＝ab2/2として計算した。腫瘍組織を採取し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、IHC、TUNEL、FISHアッセイのためにパラフィン包埋した。新鮮な腫瘍組織の一部（約300mg）を切り刻み、フローサイトメトリー検出のための単一細胞解離のためにMACS Tissue Storage Solution（130-100-008、Miltenyi Biotec、ドイツ）に保存した。残りの組織サンプルは液体窒素でスナップ凍結し、分析まで-80℃で保存した。
HCおよび免疫蛍光染色
パラフィン包埋腫瘍組織のHCを用いて、増殖細胞核抗原（PCNA）、Ki-67、CD8、PD-1、IFN-γ、TNF-α、GZMB、H3K27ac、TBX21を検出した。脱パラフィン後、スライドをクエン酸ナトリウム中でオートクレーブして抗原除去を行い、次いで1％過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させ、2％ヤギ血清でブロッキングした。スライドを一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。LiquidDAB+基質発色剤（Dako, USA）で発火させた。陽性細胞の割合は、各サンプルについて無作為に5つの顕微鏡視野で少なくとも1,000個の細胞を数えることによって決定した。mmunofluorescence染色は、パラフィン包埋標本を用いて以下のように行った。スライドをAlexa Fluor 647抗ヒトCD8抗体で24時間、次いで抗ヒトPD-1抗体で24時間、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG H&Lで2時間、室温の暗室でインキュベートした。その後、スライドを滅菌二重蒸留水で洗浄し、暗所で風乾した後、DAPI（ab104139, Abcam, UK）でマウントした。D8とPD-1の共免疫蛍光染色は、蛍光顕微鏡（BX63F、オリンパス、日本）を用いて行い、定量分析を行った。IHCおよび免疫蛍光染色で使用した抗体情報はkey resources tableに記載した。
UNELアッセイ
TUNEL Assay Kit（KGA1400-100, KeyGen Biotech, China）を用いて、パラフィン包埋腫瘍切片でUNELアッセイを行った。ellアポトーシス指標は、腫瘍組織中のTUNEL+細胞の総数で決定した。
ISHアッセイ
アラフィン包埋腫瘍切片を、bacterial DNA FISH Assay Kit（D-0015, FOCO Biology, China）を用いたFISHアッセイに用いた。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションバッファー中10μg/mLのFnプローブ（5′-CTTGTAGTTCCGCYTACCTC-3′、Cy3標識）を用いて37℃で2日間行った。その後、スライドを滅菌したddH2Oですすぎ、暗所で風乾し、DAPI入りMounting Medium（ab104139, Abcam, UK）でマウントした。蛍光顕微鏡（BX63F、オリンパス）を用いて画像を撮影した。
新鮮組織の菌培養と検証
腫瘍性結腸組織または腫瘍組織を無菌条件下でホモジナイズし、5％脱脂ヒツジ血液を添加または無添加したコロンビア寒天培地プレートにプレーティングした。培地を37℃の嫌気チャンバーで3日間培養した後、PCR検証（Fnプライマー、F：5′-AGGTAACAGCTCACCAAGGC-3'、R：5′-ATCCGGATAACGCTC GTGAC-3′）およびサンガー配列決定のために細菌コロニーを摘出した。
免疫細胞のulticolorフローサイトメトリー分析
脾臓および腫瘍からの免疫細胞組成を、T細胞についてフローサイトメトリーで分析した。脾臓および腫瘍からの免疫細胞組成をフローサイトメトリーで解析し、T細胞については、Tumor Dissociation Kits（マウス用130-096-730およびヒト用130-095-929、Miltenyi Biotec社、米国）を用いて、製造者の指示に従って腫瘍からingle細胞を調製した。消化された腫瘍は70μmのセルストレーナーで濾過し、500gで5分間遠心した。または細胞表面染色では、細胞をFcブロッキング抗体で30分間インキュベートし、細胞表面マーカー（CD45、CD3、CD8、PD-1）のフルオロクロム標識モノクローナル抗体で染色した。さらに、FVS620またはFVS510を用いて細胞生存率を評価した。または細胞内染色では、細胞を細胞内染色固定用緩衝液（420801、Biolegend、米国）で固定・透過処理し、細胞内サイトカインIFN-γ、TNF-α、GZMB抗体で染色した。使用した抗体はkey resources tableに記載した。
ウエスタンブロット
ell サンプルは Minute Total Protein Extraction Kit for Animal Cultured Cells/Tissues (SD-001, Invent Biotechnologies, USA) で溶解し、BCA Protein Assay Kit (ZJ101, Shanghai Epizyme Biomedical Technology, China) を用いてタンパク質濃度を測定した。ロテインを10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜（SEQ85R, Merck Millipore, USA）に転写した。膜はそれぞれの一次抗体と4℃で一晩インキュベートした後、二次抗体と室温で1時間インキュベートした。ロテインはOmni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit (SQ201, Shanghai Epizyme Biomedical Technology, China)で可視化した。-総タンパク質負荷対照としてアクチンを用いた。使用したntibodiesはkey resources tableに記載した。
ut透過性アッセイ
アラフィン包埋結腸切片をAlcian blue Stain Kit (S0134, Bioss, China)を用いて染色した。E-カドヘリンおよびクローディン3の検出には、パラフィン包埋結腸組織のHCを用いた。またはin vivoでの腸管透過性については、マウスを一晩絶食させた後、4 kDa FITC-デキストラン（46944、Sigma-Aldrich、米国）を経口投与した。投与後4時間目に眼窩から血液サンプルを採取した。血漿中のITC-デキストランを分光光度計（Varioskan LUX, Thermo Scientific, USA）で測定した。使用した抗体は主要リソース表に記載した。
D8+T細胞の単離とin vitroアッセイ
CT26 腫瘍を有するBALB/cマウスの脾臓から、EasySep Mouse CD8+T cell Isolation Kit (19853, StemCell Technologies, Canada)を用いてD8+ T細胞を単離した。D8+TILは、CT26同所移植を受けたBALB/cマウスの腫瘍組織から単離した。イングル細胞は、Tumor Dissociation Kit（130-096-730、Miltenyi Biotec、米国）を用いて、製造業者の指示に従って腫瘍から調製した。ILをMouse Tumor-infiltrating Lymphocytes Separation Kit（P9000、Solarbio、中国）を用いて濃縮し、FVS510、FITC-CD45、APC-Cy7-CD3、およびAPC-R700-CD8で標識し、BD FACSymphony S6を用いて選別した。プレニックCD8+ TまたはCD8+ TILを、2.5μg/mLプレート結合抗CD3抗体（05112-25、BioGems、USA）および1.5μg/mL可溶性抗CD28抗体（10312-25、BioGems、USA）と共にRPMI1640中で培養した。ellsをFn、FnCM、FN0271変異FnCM、NaB、Gタンパク質共役型受容体またはHDACの阻害剤またはアゴニストで処理し、フローサイトメトリーまたはELISAアッセイを用いて評価した。いくつかの実験では、FnCMをプロテイナーゼK（V900887、Sigma-Aldrich、USA）または遠心濃縮器を用いて100 kDa、10 kDa、3 kDaのMWカットオフで調製し、CMを様々な分子量の画分に分けた。この研究で使用した阻害剤とアゴニストを表S3に示す。
LISAアッセイ
CT26腫瘍を有するBALB/cマウスの脾臓からD8+ T細胞を抽出し、そして2.5μg/mLおよび1.5μg/mLの抗CD28抗体を含むRPMI1640を含む96ウェルプレート（1ウェル当たり2×105細胞）に播種した。培養液上清中のIFN-γ（Mouse IFN-gamma Quantikine ELISA Kit, MIF00-1, R&D Systems, USA）、TNF-α（Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit, MTA00B, R&D Systems, USA）、GZMB（Mouse Granzyme B ELISA Kit, ab238265, Abcam, UK）をELISA法で測定した。
エタボローム解析
ermフリーマウスの便、細菌CM、マウス腫瘍組織を採取し、非標的または標的メタボローム解析を行った。アンターゲットメタボローム解析またはアンターゲットメタボローム解析では、記載された方法で抽出を行った49。糞便または細菌培養液には冷メタノール（80%）を使用した。抽出したサンプルを 1,5000×g で 15 分間、4℃で遠心分離し、上清を回収して 14,000g で 30 分間、4℃で遠心分離した後、0.22 μm のフィルターに通した。上清を LC-MS/MS 分析に供した。オンターゲットメタボローム解析は、中国Biotree社のQ Exactive Orbitrap Mass Spectrometers（Thermo Fisher社、米国）を用いて行った。または SCFAs 標的メタボローム解析では、SCFAs を以下のように抽出し測定した。簡単に説明すると、200 mg の糞便または 20 mg のマウス腫瘍組織を 1 mL のH2Oでホモジナイズし、14,000 g で 10 分間遠心した。上清を25%メタリン酸と1:1の容量比でホモジナイズし、室温で4時間インキュベートした後、12,000 gで15分間遠心分離した。またはSCFAsをターゲットとした細菌CMのメタボローム解析では、100μLのCM上清も25%メタリン酸と1:1の容量比で混合し、室温で4時間インキュベートした後、12,000 gで15分間遠心した。上清を0.22μmのフィルターでろ過し、ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）（7890A-5975C、Agilent、USA）を用いて中国Biotree社で分析した。
アルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）アッセイ
mM CFSEストック（565082, BD Biosciences, USA）を解凍し、DPBSで希釈した。またはin vitro増殖アッセイでは、CT26同所性腫瘍を有するBALB/cマウスの脾臓から単離したCD8+ T細胞を2μM CFSEとともに37℃、暗所で15分間インキュベートした。脾臓CD8+ T細胞を2回洗浄し、2.5μg/mLのプレート結合抗CD3抗体および1.5μg/mLの可溶性抗CD28抗体とともに、5%FnCM、5%FN0271変異FnCM、または0.7mM NaBで48時間培養した。細胞増殖は、フローサイトメトリーを用いてCFSE希釈率により調べた。
エノイル-CoAヒドラターゼ欠損Fn株の増殖
セチル-CoAは嫌気的条件下での酪酸産生の主要な基質であり、この反応はEnoyl-CoA hydrataseによって触媒される16。タンパク質配列BLASTにより、Fn 株にFN0271サブユニットがアノテーションされていた。Fnはチオグリコール酸培地で培養した。標的遺伝子FN0271の上流および下流約500bpの領域を、プライマー対Up-F/R（F：CTCTAGAGTCGACCTGCAGCAGGTATGTATTCTTTTGGTATAAG；R： CCC CTTTGGCCTCCTTTCAATATAC）およびDown-F/R（F: CTTATTTATTTTATCTTCTTATC; R: GTGGAATTCCCGGGAGCTCAGGTCCTAATTCACCC）を用いた。NA断片をcatP遺伝子と融合し、pDS132プラスミドにクローニングした。結合したプラスミドをエンドヌクレアーゼで消化して直鎖化断片を得、WTFnにエレクトロポレーションし、脱脂ヤギ血液入りチオグリコール寒天培地（TX0020、Solarbio、中国）でチアンフェニコールを使って選択した。ingleクローンを選択し、コロニーPCRと全長16S rRNA配列決定により標的遺伝子の変異を検証した。FN0271変異型Fnの酪酸産生能はGC-MSで評価した。
PBMCまたは腸間膜リンパ節由来T細胞とMSS CRC患者由来の腫瘍オルガノイドとの同種共培養
MSS CRC患者の切片を、氷上でペニシリン-ストレプトマイシンを含む5mLのPBSに採取した。組織サンプルを穏やかに洗浄し、約2mm3の断片にミンチした後、10 mLの穏やかな細胞溶解試薬（07174、STEMCELL、カナダ）を用いて、氷上で30分間ロッキングプラットフォーム上で消化した。解離した細胞は100μmのセルストレイナーに通し、ペレット化して氷冷PBSに懸濁した。遠心した細胞を、成長因子を減少させたマトリゲル（356231、コーニング、米国）に再懸濁し、24ウェルの平底細胞培養プレートに播種した。37℃、5％CO2インキュベーターで1時間固化させた後、Y27632（72304、STEMCELL、カナダ）を添加したヒトIntestiCult Organoid増殖培地（06010、STEMCELL、カナダ）500μLを加えた。または継代し、氷冷したPBSでオルガノイドを回収し、1mLピペットで機械的な力でピペッティングして解離させた（1ウェルあたり60回）。解離したオルガノイドはペレット化し、氷冷 PBS で洗浄した。SS CRC オルガノイド（赤色）を CellTrace Far Red (C34564, Thermo Fisher, USA)で標識した。その後、2×104個の解離細胞を自家PMBCまたは腸間膜リンパ節由来T細胞（2×105/well）と混合した。細胞はCellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent (C10423, Thermo Fisher, USA)で標識した。1日間共培養した後、5％FnCM、5％FN0271変異FnCM、または0.7mM NaBを添加し、さらに2日間共培養した。最後に、10μgの抗ヒトPD-1モノクローナル抗体（BE0188、クローン：J116、米国Bio X Cell社製）またはアイソタイプコントロールIgG（BE0083、クローン：MOPC-21、米国Bio X Cell社製）を細胞培養プレートに添加し、混合物を12時間培養した。腫瘍オルガノイドの殺傷効率の代表的な画像を撮影し、フローサイトメトリーにより抗PD-1療法の免疫評価を行った。
D8+T細胞のRNA配列決定とデータ解析
CD8+T細胞の全RNAをトランスクリプトームシークエンシングに供した。ellsをFnCM、FN0271変異FnCM、またはコントロールとして流動チオグリコレート培地で処理した。TRIzol Reagent (15596018, Invitrogen, USA)を用いて組織から全RNAを抽出し、DNase I (11284932001, Sigma-Aldrich, USA)を用いてゲノムDNAを除去した。2100バイオアナライザー(Agilent, USA)を用いてRNAの質を測定し、ナノドロップ(Nano Drop one C, Thermo Fisher, USA)を用いて定量した。高品質のRNAサンプルを用いてシーケンスライブラリーを構築し、RNAライブラリーシーケンスをIllumina HiseqTM 2500/4000 (GeneDenovoBiotechnology, China)で行った。リーンリードはマウスリファレンスゲノムデータベース（v109）にマッピングした。各遺伝子のクリーンリード数を算出し、100万リードあたりのキロ塩基あたりのリード数で正規化した。また、GeneDenovoBiotechnology社によりata解析が行われた。
NAの単離と定量的リアルタイムPCR
マウス脾臓CD8+ T細胞からのNAをQuick-RNA Miniprep Kit (R1055, Zymo Research, USA)を用いて精製し、PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (6110A, Takara, Japan)を用いてcDNAを作成した。mRNA転写産物はStep One Plus Real-Time PCR SystemとSYBR Green Master Mix (Yeasen, China)を用いて定量した。bx21、Ifng、Tnf、Gzmbの発現量はActbの発現量に対して正規化した。このアッセイで使用したリマーはkey resources tableに記載した。
クロマチン免疫沈降（ChIP）-qPCRアッセイ
hIPアッセイはHigh-Sensitivity ChIP Kit (ab185913, Abcam, UK)を用いて行った。簡単に説明すると、3×106個の細胞を1％ホルムアルデヒドで37℃、10分間固定し、125mMグリシンで10分間クエンチした。固定化した細胞を氷上で15分間グラインディングロッドで溶解し、Bioruptor Plus CHIP Sonicator (UCD300, Diagenode, Belgium)で超音波処理して500 bp断片を生成した。超音波処理したDNAをインプットコントロールとして用いた。抗ヒストンH3K27ac抗体（ab4729, Abcam, UK）またはウサギIgG（A7016, Beyotime, China）を用いてmmunoprecipitationを行った後、マグナChIPプロテインA磁気ビーズでプルダウンした。その後、1% SDSを含むTris-EDTAを加え、65℃で逆架橋した。プロテイナーゼK消化後、DNAをQiaquick PCR purification Kit (28104, QIAGEN, Germany)で精製し、以下のqPCR解析を行った： bx21プロモーター（F：5′-AAATGCAGGACTTACCGTAGTT-3′およびR：5′-ATACCAACCGGTGTCTGTGT-3′）およびGapdhプロモーター（F：GCAA GGAGCCAAGACTAGATTおよびR：AGCTCAAGAGCCTATTGCTAAG）。
レンチウイルス導入によるCD8+T細胞におけるRISPR-Cas9を介したTbx21遺伝子のKO
lentiGuide-PuroのgRNA発現カセットをpLKO.3Gバックボーンにサブクローニングし、レンチウイルスgRNAプラスミドベクターpLKO-gRNAを構築した。以下のgRNAコード配列を使用して、不活性化のために示された遺伝子を標的とするレンチウイルスを作製した： bx21、5′-GCTCTACCCAGGGCCGCGCG-3'。D8+T細胞のトランスダクションは、以前に記載されたように行った21。簡単に述べると、3×106個の脾臓CD8+ T細胞を、2.5μg/mLのプレート結合抗CD3抗体および1.5μg/mLの可溶性抗CD28抗体とともにRPMI1640中で24時間培養した後、37℃で12時間、レンチウイルスでトランスフェクションした（感染多重度＝20）。導入後48時間培養した。その後、Tbx21遺伝子の不活化効率を評価するために、H3K27ac、TBX21、PD-1、ヒストンH3レベルを検出するためにウェスタンブロットを行った。さらに、WT CD8+T細胞およびTbx21KO CD8+T細胞の活性化に対する5%FnCMおよび0.7 mM NaBの影響を、48時間の共培養後にフローサイトメトリーで評価した。
定量化と統計解析
各図中、nは独立した生物学的複製数を示す。o検体または動物は解析から除外した。適切な場合には、linded proceduresを適用した。統計解析はGraphPad Prism 9 (v9.5.0, GraphPad, USA)を用いて行った。2つの変数間の相関を特徴付けるために、imple線形回帰分析を行った。データは平均値±標準偏差（SD）で表した。複数のグループ間の差を比較するために、一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。相関係数rはGoodness of Fit testを用いて算出した。実験の統計的詳細は、図中の凡例を参照されたい。
補足情報 (2)
S1. 図S1-S9および表S1-S3
資料S2. 論文＋補足情報
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e, Y. ∙ Fu, L. ∙ Li, Y. ...
ut微生物代謝産物は、細胞傷害性CD8+ T細胞免疫を調節することにより、抗がん治療の効果を促進する。
ell Metabol. 021;33:988-1000.e7
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コパス (0)
ユーブメッド
オーグル・スカラー
eintzman, N.D. ∙ Hon, G.C. ∙ Hawkins, R.D. ...
ヒトのエンハンサーにおけるアイソトーン修飾は、グローバルな細胞型特異的遺伝子発現を反映する
ature. 009;459:108-112
ay, R.E. ∙ Olawoyin, O. ∙ Cejas, P. ...
dac3はCD8 T細胞における細胞傷害性プログラムのエピジェネティック阻害因子である
. xp. J. Exp. 020;217, e20191453
Zhou, J. ....
選択的HDAC8阻害剤は、肝細胞癌における抗腫瘍免疫と免疫チェックポイント阻害の有効性を増強する。
ci. ransl. ed. 021;13, eaaz6804
u, T. ∙ Guo, F. ∙ Yu, Y. ...
ユソバクテリウム・ヌクレアタムは オートファジーを調節することにより大腸癌の化学療法抵抗性を促進する。
ell. 017;170:548-563.e16
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コパス (1383)
ユーブメッド
オーグル・スカラー
hen,S.・Zhang,L.・Li,M. ....
ウソバクテリウム・ヌクレアタムは METTL3を介したm6A修飾を減少させ、大腸がん転移に寄与する
at. ommun. 022;13:1248
Culloch, J.A. ∙ Davar, D. ∙ Rodrigues, R.R. ...
抗PD-1治療を受けたメラノーマ患者における臨床反応と免疫関連有害事象の腸内細菌叢シグネチャー
at. ed. 022;28:545-556
ivan, A. ∙ Corrales, L. ∙ Hubert, N. ...
ビフィズス菌は 抗腫瘍免疫を促進し、抗PD-L1効果を促進する。
cience. 015;350:1084-1089
Shields, C.E. ∙ White, J.R. ∙ Chung, L. ...
活性主導性の炎症と変異型BRAF発現の組み合わせは、免疫チェックポイント療法に感受性を示すマウス結腸腫瘍形成を促進する
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ager, L.F. ∙ Burkhard, R. ∙ Pett, N. ...
微生物由来のイノシンはチェックポイント阻害剤免疫療法に対する反応を調節する
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Ong, C.C. ∙ Yu, J.
大腸癌の発生と治療における腸内細菌叢
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Kegami, A. ∙ Chung, P. ∙ Han, Y.W.
Fusobacterium nucleatumにおけるfadA変異の 導入により、表面に露出したアドヘシンが細胞浸潤と胎盤コロニー形成を促進することが明らかになった。
nfect. mmun. 009;77:3075-3079
ernes, D. ∙ Tsenkova, M. ∙ Pozdeev, V.I. ...
腸内微生物の代謝産物であるギ酸は大腸がんの進行を悪化させる
at. etab. 022;4:458-475
iang, S.-S. Xie, Y.-L. Xiao, X.-Y. ..
Usobacterium nucleatum由来のコハク酸は、大腸癌の免疫療法に対する腫瘍抵抗性を誘導する。
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全文 (PDF)
コパス (67)
ユーブメッド
オーグル・スカラー
ang、X. ∙ Liu、C. ∙ Ding、Y. ...
oseburia intestinalis 生成酪酸エステルは、細胞傷害性CD8 + T細胞を 活性化することにより、大腸癌における抗PD-1効果を高める。
ut. 023;72:2112-2122
hu, X. ∙ Li, K. ∙ Liu, G. ...
酪酸菌代謝物は細胞傷害性CD8 T細胞のT細胞受容体シグナルを調節することにより抗PD-1抗腫瘍効果を促進する。
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iller, A.A. ∙ Kurschel, E. ∙ Osieka, R. ...
急性白血病患者における酪酸ナトリウムの臨床薬理学的研究
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医学雑誌
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ナトリウムおよびアルギニン酪酸塩としてin vivoで投与酪酸の有害動態試験
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寛容と免疫におけるD-1とそのリガンド
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PD-1シグナル伝達の強さはT細胞のエフェクター機能に異なる影響を与える
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リコーゲン合成酵素キナーゼ3の不活性化がT-betを介した共受容体PD-1のダウンレギュレーションを促進し、CD8+ 細胞溶解性T細胞応答を増強する。
mmunity. 016;44:274-286
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ao, C. ∙ Oestreich, K.J. ∙ Paley, M.A. ...
転写因子T-betは抑制性受容体PD-1の発現を抑制し、 慢性感染時のウイルス特異的CD8+ T細胞応答を維持する
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izvi, Z.A. ∙ Dalal, R. ∙ Sadhu, S. ...
高塩分食は強力な腫瘍免疫を誘導するためにNK細胞と腸内細菌叢の間の相互作用を媒介する
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hou, X.A. ∙ Zhou, J. ∙ Zhao, L. ...
LHL22はPD-1の恒常性を維持し、過剰なT細胞抑制を防ぐ
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ウソバクテリウム・ヌクレアタムが大腸がんにおけるPD-L1遮断の有効性を高める
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癌の空間的および細胞的不均一性に対する腫瘍内微生物叢の影響
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Fusobacterium nucleatumが放出する短鎖脂肪酸は遊離脂肪酸受容体2（FFAR2）を介して作用する好中球化学誘引物質である。
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Epeda-Rivera, M. ∙ Minot, S.S. ∙ Bouzek, H. ...
フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum） クレードが大腸がんニッチを支配している。
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Ite, N. ∙ Klinger, A. ∙ Hellmers, L. ...
ヒト大腸癌の原発性腫瘍増殖と自然転移に最適な同所性マウスモデル
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液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によるヒト糞便中の短鎖脂肪酸定量用の同位体標識化学誘導体化法
ナール。彼。cta. 015;854:86-94
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