森林土壌中の巨大ウイルス様粒子の驚くべき構造多様性

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森林土壌中の巨大ウイルス様粒子の驚くべき構造多様性

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.06.30.546935v1.full

View ORCID ProfileMatthias G. Fischer, Ulrike Mersdorf, View ORCID ProfileJeffrey L. Blanchard
doi: https://doi.org/10.1101/2023.06.30.546935
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000000219
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要旨
ヌクレオサイトウイルス門の大型DNAウイルスは、原生生物からヒトまで多様な真核生物の宿主に感染し、水生生態系や陸上生態系に重大な影響を及ぼす。ヌクレオサイトウイルスはメタゲノム中で非常に多様であることが知られているが、そのキャプシド構造に関する知識は、特徴的な代表的な数種類に限られている。ここでは、透過型電子顕微鏡を用いて、環境中の巨大なウイルス様粒子（VLP、直径0.2μm以上）を直接可視化した。その結果、ハーバード・フォレストの土壌には、これまでに分離されたすべての巨大ウイルスを合わせたよりも多様な巨大VLPの形態が含まれていることがわかった。これらには、20面体のカプシド対称性を持つVLP、パンドラウイルスに似た卵形、新規ウイルスを示すと思われるバチルス形などが含まれる。私たちは、管状付属物、改変された頂点、尾部、多層または内部チャネルからなるキャプシドなど、これまでに報告されていない構造改変を持つ巨大な正20面体キャプシドを発見した。多くの巨大VLPは、様々な長さ、太さ、密度、末端構造の繊維で覆われていた。これらの発見は、巨大ウイルスが宿主細胞と相互作用するために、現在知られているよりもはるかに広範なカプシド構造やメカニズムを採用していることを示唆している。また、多様な尾を持つバクテリオファージや糸状VLP、さらに超小細胞も発見された。本研究は、土壌中の未知のウイルス構造の膨大な多様性を初めて垣間見るものであり、透過型電子顕微鏡による環境微生物学の基礎的発見の可能性を補強するものである。
はじめに
1930年代にRuskaとKnollが最初の「Übermikroskop」を構築して以来1-4、電子顕微鏡はウイルス学分野の発展に欠かせないものとなってきた。これにより研究者は、それまで「超可視」であったウイルスの体細胞性を研究し、1970年代まで普及していた形態学に基づくウイルス分類システムを開発することができた5, 6。それから20年後、電子顕微鏡は、ウイルスがさまざまな水生環境に豊富に存在し、活動していることを実証するのに使われ7, 8、微生物に感染するウイルスが生態学や進化の重要な担い手であることを認識するのに役立った9-13。ウィルスの粒子構造や細胞内感染サイクルを特徴付ける方法として、電子顕微鏡が依然として選択されているが、非常に巨大なウィルスの中には光学顕微鏡で観察できるものもある。
主に単細胞真核生物に感染する、いわゆる「巨大ウイルス」は、およそ0.2μmから1.5μmの大きさの粒子を持ち、長さ250万塩基対のDNAゲノムを持つ14-16。単細胞藻類の大型DNAウイルスは何十年も前から研究されていたが17、アカントアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルスの発見が概念的なブレークスルーをもたらした18-20。ミミウイルス粒子は繊維の密な層で覆われており、グラム陽性に染色されたため、球菌と誤認されたが、電子顕微鏡によってウイルスに典型的な正20面体のキャプシド形状が明らかになった21。カプシドの直径が0.5µmで、ゲノムが1メガ塩基を超えるミミウイルスや、その後に分離された他の多くの巨大ウイルスは、ウイルスと細胞の境界を曖昧にした。その結果、水試料を孔径0.2μmのフィルターでろ過してウイルスと細胞微生物を分離するという標準的な方法は、それ以降、ウイルス門全体を除外することが知られるようになった。しかし、環境中の巨大ウイルスはどれほど多様なのだろうか？メタゲノミクスのような培養に依存しない手法によって、何千もの新たな巨大ウイルスゲノムが発見され、巨大ウイルスが様々な水生・陸生生態系に存在していることが証明されている22-24。また、メタゲノムで構築されたゲノム（MAG）の解析により、巨大ウイルスをヌクレオサイトウイルス門（Nucleocytoviricota、以前はNucleocytoplasmic Large DNA Viruses、NCLDVs）25-28のいくつかの目や科に分類することが容易になった。この門には、ミミウイルス（Imitervirales目）、パンドラウイルス、クロロウイルス（Algavirales目）、ポックスウイルス（Chitovirales目）などが含まれる。
しかし、ウイルスのMAGは不完全であることが多く、宿主範囲、感染様式、ウイルス粒子の構造や組成などの重要な生物学的特性に関する情報はほとんど、あるいは全く含まれていない。これらの特性は、制御された実験室条件下で増殖可能なウイルス-宿主系で研究するのが最適である。しかし、巨大ウイルスの単離株は数種類のモデル系に限られており、アカントアメーバ属を餌生物としてうまく利用しているため、アメーバ感染ウイルスに大きく偏っている29。メタゲノム配列決定のペースが速いことと、巨大ウイルス培養の進歩が遅いことが相まって、十分に解明されていない豊富なウイルスMAGと、十分に特性化されたウイルス宿主系の不足との間に、ますます矛盾が生じるようになった。
この不均衡を解消するための最初の試みとして、我々はメタゲノム解析的アプローチをイメージング手法で補完し、環境サンプルから巨大ウイルスの形態学的多様性を直接調査することを試みた。土壌には、多様なウイルス群集を含む複雑な微生物群集が存在することが知られているためである30-32。地球上に存在する≈5E+31個のウイルス粒子の97％は堆積物や土壌に存在すると推定されているが33、土壌に生息するバクテリオファージのうち、より詳細に研究されているのは一部のグループのみである34。土壌中の巨大ウイルスに焦点を当てた数少ない研究のひとつは、ハーバードフォレストで行われた土壌温暖化実験から得られたサンプル中の細胞とウイルスの複雑さを軽減するために、蛍光活性化セルソーティングを用いたものである。このミニメタゲノミクスアプローチにより、2.4メガベース対のゲノムを持つミミウイルス科の一種を含む、NCLDVの16の新しいMAGが発見された23。ハーバード・フォレストの土壌からこれらの巨大ウイルスゲノムが発見されたことをきっかけに、私たちは同じ場所から採取したウイルス粒子の形態学的多様性を研究することにした。
本研究では、高品質のネガティブ染色透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、未培養ウイルスの超微細構造を明らかにすることで、天然の土壌ウイルス群を特徴付けることができることを示す。その結果、0.22 µm～1.2 µmサイズの巨大ウイルス様粒子の多様性が明らかになり、これまで知られていなかったウイルスの形態が明らかになった。特に興味深いのは、二重キャプシド、チャネル、ポータル、尾部、ファイバー、その他のタイプの付属物など、ユニークな構造変化を持つ正20面体粒子である。また、様々なバクテリオファージの形態や、パンドラウイルス、糸状ウイルス、超小型原核生物に似た土壌ナノ粒子についても述べる。我々の研究は、ほとんどの水生環境よりも高いことが知られている土壌ウイルスのメタゲノム多様性に、視覚的な対応を提供する32。
材料と方法
土壌サンプルの採取と処理
土壌コアは、巨大ウイルスに関する以前のメタゲノム研究が実施されたBarre Woods（座標42.48, -72.18）長期温暖化実験に隣接する場所23と、米国マサチューセッツ州ピーターシャムのハーバード森林のProspect Hill（座標42.54, -72.18）長期温暖化実験に隣接する場所から、2019年8月28日に採取された。土壌と場所の特徴については、以前に詳述されている35, 36。簡単に説明すると、土壌は広葉樹混交林の粗くローム質のインセプシゾルであり、優占樹種はペーパーバーチとブラックバーチ（Betula papyriferaとB. lenta）、レッドメープル（Acer rubrum）、ブラックオークとレッドオーク（Quercus velutinaとrubra）、アメリカブナ（Fagus grandifolia）である。有機層（土壌コアの上部約5cm）と鉱物層（土壌コアの5cm以下）を明確に区分することで、手作業による分離が可能となった。土壌サンプルはその後、マサチューセッツ大学アマースト校で4℃で保管された。2019年9月2日、共同体指令2008/61/EGに基づきRegierungspräsidium Karlsruhe（植物保護局）から承認を得た後、サンプルのサブセットをドイツ、ハイデルベルクのマックス・プランク医学研究所に発送した。
オートクレーブ滅菌し、0.22 µmフィルターでろ過したミネラルウォーター（Volvic, Danone Germany GmbH）500ミリリットルを土壌100 gに加え、15分間振とう攪拌した。懸濁液をザルに通して根や石を取り除き、500xg、20℃で5分間遠心分離した。上清を、孔径20 µm（NY-20）、5 µm（TMTP）、1.2 µm（RTTP）の直径47 mmのフィルター（Millipore、ドイツ）で順次ろ過した。これらのフィルターに保持された物質は廃棄され、1.2 µm濾液はさらに0.22 µm（GTTP）フィルターに通された。0.22 µmフィルターを滅菌済み50 mlプラスチックチューブに移し、ろ液側が内側になるようにした。5mlの滅菌ミネラルウォーターを加え、チューブを2時間揺すってフィルターから粒子を回収し、その後4℃で保存した。得られた懸濁液中の粒子を、Optima XE-90超遠心機（ドイツ、ベックマン社製）のSW40ローターを用いて、100,000xg、30分間、18℃で遠心分離することにより濃縮した。上清を捨て、ペレットを残りの上清約50 µlに懸濁した。
電子顕微鏡観察
再懸濁したペレットを0.5%パラホルムアルデヒドと混合し、20-25℃で30分間インキュベートした。固定したウイルスサンプルの10マイクロリットルを、ホルムバー/カーボンでコートしグロー放電させた銅製EMグリッドにピペッティングし、10分間インキュベートした。グリッドの上清をろ紙でブロットして除去し、グリッドを二重蒸留水で3回洗浄しブロットした。0.5%酢酸ウラニル1滴をグリッドに加え、30秒間インキュベートした後、ブロットして乾燥させた。加速電圧 200 kV で動作する FEI Tecnai G2 T20 TWIN 透過電子顕微鏡（FEI, Eindhoven, The Netherlands）を用いて試料を観察した。電子顕微鏡写真はFEI Eagle 4k HS, 200 kV CCDカメラで記録した。最高の分解能とコントラストを得るために、電子顕微鏡の最適化された基本アライメントと毎日のルーチンアライメントを行った。フォーカス設定と非点収差補正は、各画像ごとに最適化した。
画像処理
TEM画像をAdobe Photoshop 24.2.1で開き、"Preserve details 2.0, 0% noise reduction "のリサンプリングオプションを使用して、96 dpiのネイティブ解像度で希望の寸法に拡大縮小した（画像サイズメニュー）。その後、リサイズした画像を合成画像ファイル（300 dpi）にコピーし、図の各画像について個別にレベルを調整した。スケールバーは手作業で再トレースしてフォーマットし、自動生成されたスケールバーは最終画像から切り取った。図3jの尾を引いたVLPは、より高い解像度を得るために2つの画像を合成した。粒子の測定はImageJ V1.53tで行った。
ウイルス様粒子（VLP）の分類基準
本研究では、原生生物の巨大ウイルスと類似した特徴を持つVLPに焦点を当て、森林土壌中のVLPの多様性を調査した。発表されているウイルス構造と類似しているように見えても、陰性染色TEMだけで分析した粒子のウイルス性を証明することはできないことを強調しておく。しかし、環境試料から得られたVLPについては、これまでに報告されたウイルス、微生物、その他のナノ粒子の標本に基づいて、さまざまな信頼度を割り当てることができる（補足図1）。最も認識しやすいウイルスの構造は、頭部と尾部を持つバクテリオファージであり、それゆえ、頭部が等角形または多角形で、尾部が細く管状であるVLPは、おそらくCaudoviricetesクラスのウイルスに相当すると確信している。遺伝子導入体（viriforms）はサイホウイルスに似た外見をしているが、その頭部の直径は通常40nm以下であり、従ってほとんどの尾部型バクテリオファージよりも小さい37-39。
多くのウイルス粒子は正二十面体の底面対称性を持ち、その結果、正六角形または正五角形／十角形の平面投影が生じる。このようなウイルス粒子は、ウイルスの種類、EMグリッド上の向き、試料調製時の染色や脱水の影響にもよるが、しばしば5回または6回の対称性を示す。したがって、特に規則的な表面パターンがカプソマーの存在を示している場合、五角形または六角形の断面を持つ粒子がウイルスカプシドであると確信している。しかし、カプセルリンやカルボキシソームのようなカプシド様構造体が細胞から放出され、電子顕微鏡写真でVLPと間違われる可能性があることは認める40-42。さらに、正20面体対称の非常に大きなカプシドが、正規のカプソマーベースの構造から逸脱し、繰り返し表面構造を欠いている可能性も否定できない。また、大きなVLPは、小さなVLPよりもサンプル調製中に損傷や変形を起こしやすく、分類に支障をきたす可能性がある。
繰り返しサブユニットから構成されている場合でも、糸状、卵状、桿状粒子の性質を解釈する際には、一般的に慎重になりました。これらの多くはビリオンである可能性が高いが、糸状ウイルスと剥離した細胞構造体や壊れたバクテリオファージの尾部との区別は難しい。同様に、パンドラウイルス、ピトウイルス、その他の真核ウイルスで、等質でない大きな粒子を持つものも、これらの土壌サンプルに含まれていると思われるが、これらすべてをウイルスと分類することは、規則的な表面構造を持つ小さな原核細胞などの偽陽性を含むことになる。パンドラウイルスやピト ウイルスは過去に細胞性微生物と間違われたことがあり43-45、これらのウイルス群の分離数が少ないため、明確な形態学的同定基準を定めることは困難である。
我々の信頼尺度の一番下には、既知のウイルスや細胞の形態に帰することができない50-2000 nmのサイズの粒子がある。これらの中には、損傷したウイルス・キャプシドの新しいウイルス形態を示すものもあるが、多くは小さな細胞、小胞、有機鱗片、細胞片、無機粒子などの非ウイルス体であろう。さらに、どのVLPも特定の宿主について主張するものではないが、caudoviriceteのような形態を持つVLPは細菌や古細菌に感染し、正20面体や卵形の形態を持つ大きな（>200 nm）VLPは真核生物の宿主に感染する可能性が高いと推測される。
参照サンプル
ネガティブ染色TEMは、ウイルス粒子の形状、表面、サイズなどの超微細構造の特徴を調べるためのシンプルかつ効果的な方法です。しかし、サンプル調製時の脱水により粒子が収縮することがあります。環境VLPと培養ウイルスをよりよく比較するため、また、公表されている巨大ウイルスの電子顕微鏡写真のサンプル調製と画質がかなり異なるため、ピトーウイルス、モリウイルス、パンドラウイルス、マルセイユウイルスの代表的なウイルスを分析した（すべてL. Bertaux and C. Abergel, Univ. Aix-Marseille）、Cafeteria roenbergensis virus（CroV）とそのvirophage mavirusを土壌サンプルに適用したのと同じネガティブ染色TEMプロトコルを用いて分析した。
結果
参照原生生物ウイルスの粒子構造
土壌VLPとこれまでに報告されている巨大ウイルスの構造を比較するために、6種類の巨大ウイルスと1種類のウイルスファージの参照画像を記録した（図1）。私たちが選択したウイルス分離株には、既知の原生生物ウイルスの中で最も大きいものから最も小さいものまで含まれており（図1aとgを比較）、環境サンプル中の巨大ウイルスの形態学的多様性を調べるための良い出発点となる。ピトウィルス・シベリカム粒子は卵形粒子で、長さは最大2.5 µmと報告されている46。我々は長さ900 nmから1550 nm、幅550 nmから720 nmを測定した。筋状のコルク構造を持つ先端孔は、いくつかの粒子で確認できた（図1a、上）。いくつかの粒子は厚さ20 nmの繊維層で覆われていた。全体として、これらの測定値はこれまでの報告の範囲内であるが、Cryo-EM47で解析したピトウイルス粒子よりはわずかに小さい。パンドラウイルスのネオカレドニア48粒子は卵形で、長さは925-1135 nm、幅は660-785 nmであった。他のパンドラウイルスで報告されている大きさ（0.8-1.2 µm x 0.5 µm）14と比べると、P. neocaledoniaのビリオンはわずかに幅が広いようである。オスティオールとも呼ばれる独特の先端孔は、ほとんどの粒子ではっきりと確認でき（図1b）、このグループのウイルスを区別する特徴となっている。Mollivirus sibericumのほぼ球形のビリオンは直径500-600 nmで、毛状の被膜で覆われている49。我々が分析した粒子はやや大きく、平均直径は681±28 nm、外部繊維層の厚さは60-85 nmであった（図1c）。ビリオンの向きにもよるが、長さ720-750 nm、幅560-620 nmのやや卵形の粒子もあった。
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図1.培養した原生生物ウイルスの参考ネガティブ染色電子顕微鏡写真。
a) Pithovirus sibericum. b) Pandoravirus neocaledonia. c) Mollivirus sibericum. d) Acanthamoeba polyphaga mimivirus. e) Cafeteria roenbergensis virus. f) Melbournevirus. g) virophage mavirus. スケールバーはすべて100nm。
アカントアメーバ・ポリファーガ・ミミウイルスのカプシドは20面体底対称で、直径は400nm（TEM21）〜500nm（低温電子顕微鏡50）と報告されている。頂点の1つはスターゲート51と呼ばれるゲノムの出口であり、ヒトデ複合体52と呼ばれるタンパク質構造で覆われている。我々のネガティブ染色プロトコールで、ミミウイルスのキャプシドの平均頂点間直径を測定したところ、459±33 nmであった。ヒトデ構造はすべての粒子ではないが、多くの粒子で確認できた（図1d、上）。ミミウイルスのキャプシドは、その外側を長さ125 nmにもなるフィブリルの密な層で覆われている50, 53。ここでは、ほとんどのビリオンが2つの異なるファイバー層、すなわち、平均ファイバー長84±18 nmの内側の高密度ファイバー層と、100±21 nmの追加距離にわたって突出した単繊維を持つ外側の低密度ファイバー層を備えていることに気づいた（図1d、4a）。CroVの最初の発表では、直径230-300 nmの六角形の粒子が言及されており54、その後の低温電子顕微鏡による研究では、幅300 nmの粒子が報告されている55。本研究では、288±12 nmの平均キャプシド直径を測定した（図1e）。メルボルンウイルスはオーストラリアのメルボルンの淡水池から分離され、薄切片TEM56では200 nm幅の正20面体粒子であり、低温電子顕微鏡57では≈230 nm幅のキャプシドであった。平均カプシド直径は220±11 nmであった（図1f）。ウイロファージ・マウイルスのキャプシドは、平均頂点間直径76±4 nmの正20面体であった（図1g）。
ハーバードの森のマイクロギャラリー
次に、米国マサチューセッツ州ピーターシャムにあるハーバード フォレストの2カ所で、長期的な実験的加温圃場の近くにある、有機層と鉱物層の土壌の0.22～1.2 µmサイズの画分に含まれるVLPを分析した。プロスペクト・ヒルから426枚、バール・ウッズから258枚を含む、巨大なVLPを優先した684枚のTEM画像を収集した。これらの画像のうち、565枚は有機土壌層から、119枚は鉱物層から得られたものであった（補図2a）。全体として、VLPと細胞様粒子の多様性は、有機物層の方が鉱物層よりもはるかに高かった。さらに、0.22 µmより小さいサイズ画分からの濃縮物をプールして12枚の画像を撮影した。VLPとして≈350個の粒子を分類し、その中には≈300個の等尺性VLP、≈30個の卵形VLP、≈20個の糸状VLPが含まれていた。細胞または細胞様粒子を含む約110の画像が収集され、残りの≈220の画像は確信を持って分類できない粒子を示した（補足図2b）。
正20面体対称のウイルス様粒子
幅広いサイズの正20面体粒子を発見した（図2）。このカテゴリーに属するVLPの大部分は、識別可能な表面修飾を持たない、プレーンなキャプシドのようであった。しかしながら、多くの粒子は、カプシドに付着した構造として明確に識別できない、様々な性質の繊維に囲まれていた。さらに、壊れやすいカプシド付属物がサンプルの取り扱い中に外れた可能性もある。
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図2.平たい正20面体のカプシドを持つウイルス様粒子。
カプシドの直径が50 nmから635 nmのVLPの一部を示す。スケールバーはすべて100 nm。
プレーンな正20面体キャプシドの平均頂点間直径は50 nmから635 nmの範囲であった。最も小さいものはウイロファージのカプシドサイズ（50-90 nm、図2a,b）であったが、マルセイユウイルスやCroVに似たものもあった（図2f,g）。50-350 nmのサイズ範囲では均等な分布が見られたが、350 nm以上の正20面体キャプシドは比較的まれであった（補図2c）。200nmより小さいVLPの多くが、この研究でVLPを回収した0.22μmフィルターを通過した可能性があるため、実際のサイズ分布はさらに小さい粒子に偏っている可能性がある。
不思議なことに、数個の巨大なVLPは等角あるいは丸い形をしており、孔のような外観を持つ、より濃く染色されたスポットの明瞭なクラスターを持っていることがわかった（補足図3）。これらの孔のような構造は平均直径5.6±0.7 nmで、キャプシドのある特定の領域に3～7個のスポットからなるグループで配列していることもあったが（補足図3a-n）、他のVLPはより広く分布したスポットパターンを持っていた（図2i、補足図3o+p）。直径が200 nmより小さく、このようなスポットを持つVLPは観察されなかった。これらの特徴は、例えばカプソマーの欠落や窪みによるカプシド層の孔や穴とは必ずしも一致しないかもしれないが、単にそこに位置するタンパク質の酢酸ウラニルに対する結合親和性が高いことを反映し、陽性染色につながるのかもしれない。このような場所にあるタンパク質やカプソマーは、足場タンパク質や脂質膜のようなビリオンの内部構造のアンカーポイントとして機能する可能性がある。
未知のカプシド修飾を持つ巨大VLP
驚いたことに、私たちは多くのカプシドがこれまで報告されていない構造変化を示すことを発見した。直径200 nmを超えるアイソメトリックVLPは、しばしば尾部、修飾された頂点、二重キャプシド層、管状の付属物や内部構造を特徴とした（図3、補足図4,5）。これらの新しい形態のうち、1つはミミウイルスの一般的な外観に似ており、幅≈430 nmのカプシドが100-150 nmの繊維の密な層で覆われていた（図3a）。しかしながら、ミミウイルスとは対照的に、スターゲートポータルは見られず、いくつかの巨大VLPは2つの入れ子構造のキャプシドから構成されているようで、内側のキャプシドは直径≈350 nmであった（図3a）。外側のカプシド層を持たない他の粒子の直径は315-370 nmで、厚さ80-100 nmのファイバー層があった（補足図4a+b）。
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図3.ハーバードの森の土壌から得られた、ユニークな構造的特徴を持つ巨大ウイルス様粒子の形態型。
a)「ミミのような」形態型 b)「超新星」形態型 c)「ヘアカット」形態型 d)「タートル」形態型 e)「配管工」形態型 f)「クリスマス・スター」形態型 g)「フラコン」形態型 h)「ゴルゴン」形態型 i)-k)尾部構造を持つ大型VLP。
超新星」形態型は、直径490 nmの球状の外側キャプシド層と、直径380 nmの等角的な内側キャプシドを有していた（図3b）。外側カプシド層の厚さは≈35 nmで、幅≈23 nmの規則正しく並んだ多量体カプソマーから構成されていた。内側カプシドのカプソマーはより小さく、より密に配列していた。外側の≈135 nmの長繊維が外側のカプソマーと結合していた。外側のカプシド径が400 nmと485 nmの低品質の同様のVLPを記録した（補足図4c+d）。いくつかの粒子のコア内部には、幅15-25 nm、長さ最大80 nm、周期8-11 nmのらせん状と思われるコイル状の円筒構造が1つまたは2つ観察された（図3a、補足図3k、4c）。これらの構造は、ミミウイルスのらせん状ゲノム繊維59よりもはるかに小さいが、ウイルス核酸を含んでいる可能性もある。
ヘアカット」は、280-325 nmの大きなキャプシドと、様々な長さ、太さ、密度の非対称に分布した外側のファイバーを持ついくつかのVLPから構成されていた（図3c、補足図4g-i）。カメ」の形態型は、幅≈380 nmのキャプシドから突出したローブ状の付属体が特徴であった（図3d、補足図4e）。各葉は長さ約150 nm、幅約140 nmで、規則正しく並んだサブユニットから構成されていた。粒子1個あたりの接着点とローブの数は明確ではないが、各ローブがカプシドの頂点から伸びているという仮説を立てた。変形した頂点は「配管工」形態型にも見られたが、これらの構造は幅340-400 nmのキャプシドの内部に入り込んでいた（図3e、補図4f）。
各頂点は内径15-20 nmの孔構造を含み、キャプシド層を貫通するチャネルを作っていた。ある例では、頂点はキャプシド内チャネルのネットワークによって互いに接続されていた（図3e）。
ハーバード・フォレストの土壌で繰り返し発見された巨大VLP形態型の1つは「クリスマス・スター」で、直径285 nmの電子密度の高い内側カプシドが、幅385 nmの電子密度の低い外側カプシドの中に入れ子状に存在する二重構造の殻から構成されていた（図3f、補足図4j-l）。内側キャプシドの頂点は常に外側キャプシドの面と一致しており、内側キャプシドは10-13 nmの厚い壁構造を有していた。しかしながら、これまでに報告されている正20面体VLPで最も厚いカプシド壁は、「flacon」形態型に見られた。その幅420-470 nmのカプシドは、35-70 nmの厚い外壁で強化され、頂点の1つを除くすべてが丸みを帯びたわずかに隆起した構造で覆われていた（図3g、補足図5g+h）。残りの頂点は、長さ≈150 nmの円錐ノズルに変化し、その底部の幅は≈160 nmで、末端は内径25-50 nmの開口部になっていた（補足図5i）。ある「フラコン」VLPは、より円筒形の頂点延長部を持ち、そこに細い糸状の物質が付着していた（補足図5h+j）。この構造は、ビリオンのゲノム出口を表しているのかもしれない。
最も珍しい巨大VLPの中には、長い管状の付属物を持つ「ゴルゴン」形態型があった（図3h、補足図5a-f）。カプシドの直径は410±20 nmで、壁の厚さは≈20 nmであった。各粒子には8-11個の管状突起があり、長さは500-650 nm、幅は30-65 nmであった。管状伸長部は直線状で、遠位端に開口部を持つ中空と推定され、≈4.5 nmの周期性を持つ規則正しく配列したサブユニットで構成されていた（補足図5e）。近位端では、カプシドの頂点に付着していた（補足図5f）。ゲノム放出用のユニークな頂点を除いて、各頂点には1つの付属体があったと考えられる。
最後に、多様な尾部構造を持つ幅260-450 nmのVLPがいくつか見つかった。ある尾は長く太く（図3i: 560×210 nm、補足図5k: 660×160 nm）、ある尾は繊維で覆われており（図3j: 750×90 nmの尾、25 nmの長繊維）、また別の尾は長さ1.4 µm、幅30-50 nmであった（図3k）。
巨大VLPは多様な繊維構造で覆われている
次に、巨大VLP上の繊維構造の多様性をより詳細に分析した。NCLDVのカプシド関連線維は、PBCV-160のように短くて散発的なものから、アカントアメーバ感染巨大ウイルスであるメドゥサウイルスの260 nm幅のカプシドのように高密度なものまであり、球状の末端構造を持つ14 nmの長繊維で覆われている61。ミミウイルスの長く密な繊維層はグリコスライスタンパク質からなり、細菌のペプチドグリカンを模倣し、アメーバ宿主をだまして貪食させるためにビリオンの直径を大きくしていると考えられている。ミミウイルスの繊維は長さ120-140 nm、幅1.4 nmで、遠位端は球状構造で終わっている62-64。私たちのネガティブ染色TEM解析では、ミミウイルス線維は2つの異なる層、すなわち、厚さ60-110 nmのカプシド壁に近い高密度の層と、第1層より≈120 nm上に伸びる単繊維を持つ薄い外側の層として現れた（図1d、4a）。どちらの層でも、繊維は小さな球状の頭部で終わっていた。
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図4.正20面体対称性を持つ大型ウイルス様粒子におけるキャプシド線維の多様性。
a) ミミウイルスの参照。 b) 「ミミ様」形態型。 c) 「超新星」形態型。 d) 三角形の末端構造を持つ細長い繊維。 e) 球状の末端構造を持つ細長い巻き毛繊維。 f) 末端構造が明らかでない細長い繊維。 g) 短く細い繊維が部分的にキャプシドを覆う「ヘアカット」形態型。 h) 短く細い繊維がキャプシド全体を覆うVLP。 i) 長く太い付属物を持つ「ゴルゴン」形態型。a)のスケールバーはすべての画像に適用されている。
ハーバードの森のサンプルでは、キャプシド表面に多様なタイプの繊維が付着した巨大VLPが観察された（図4）。mimi-like "形態型では、外側の繊維はmimivirusほど密ではなく、長さ≈120 nm、幅≈4 nmで、≈7 nm幅の球状構造で覆われていた（図4b）。超新星」形態型のキャプシドを取り囲む繊維は、長さ≈115 nm、幅≈6 nmで、直径≈7-8 nmの球状の先端もあった（図4c）。長さ100-200 nm、細さ3 nmの無秩序な繊維のまばらな層で覆われ、≈12 nm幅の三角形の頭部を持つVLPを1つ発見した（図4d）。別のVLPは、カールした幅≈4 nmの繊維の厚さ100-200 nmの密な層で覆われており、その個々の長さを測定するのは困難であったが、小さな球状の先端で終わっていた（図4e）。いくつかのVLPは、数十本の幅≈4 nm、長さ≈700 nmの繊維を特徴とし、明らかな末端構造は見られなかった（図4f）。
ヘアカット」カテゴリーには、図3c+4gでVLPの≈15%を覆っていた幅≈4 nm、長さ≈18 nmの繊維や、Suppl. 図4h。他の粒子には、長さ≈26 nm、幅≈2.5 nmの周繊維があった（図4h）。上記の例とは対照的に、"ゴルゴン "付属物はキャプシドの頂点から伸びる管状構造で、異なる機能を果たすと思われる（図3h、4i、補足図5a-f）。
卵形をした巨大VLP
ヌクレオサイトウイルス門の多くのウイルスは正20面体対称のカプシドを持つが、卵型形態はポックスウイルス、アスコウイルス、パンドラウイルス、ピトウイルスによく見られる。我々はハーバード・フォレストの土壌から様々な卵形ナノ粒子を発見し（図5）、規則的な表面パターンを持つものだけを巨大VLPとみなしたが、その一部は細胞性である可能性も否定できない。パンドラウイルスとピトー/セドラウイルスには、それぞれVLPと同定するのに役立つユニークな特徴、すなわち先端孔と1つまたは2つの先端コルク構造がある（図1a+b）。
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図5.ハーバードフォレストの土壌から得られた卵形粒子。
a) 幅≈80 nmの孔を持つ630×330 nmの粒子で、先端が球状の≈40 nmの長繊維で部分的に覆われている。b) a)のVLPの高倍率図。 c) 460×200 nmの粒子で、規則的な表面パターンと≈50 nm幅の孔を持つ。 d) 355×275 nmの粒子で、≈60 nm幅の孔を持ち、10-15 nmの長繊維の密な層と50-200 nmの長繊維のあまり密でない層で覆われている。f) 1170×730 nmの粒子。≈11 nmの大きな表面サブユニットを持ち、≈15 nmの長さのY字型アンテナで覆われている。 h) 470×290 nmの粒子。≈4 nm幅のサブユニットが規則的に配列している。） j) 規則的な表面パターンを持つ265×140 nm粒子。k) j)のVLPの高倍率図。l) 280×125 nmの粒子で、≈5 nm間隔のカプソマー様サブユニットを持つ。
我々のデータセットでは、いくつかのVLPが頂端孔を示したが（図5a-e）、パンドラウイルス分離株ほど大きなものはなかった。最大のものは長さ530-630 nm、幅≈330 nmで、孔の直径は60-80 nmであった（図5a）。それに比べ、P. neocaledoniaの細孔構造は直径60-75 nmであった。パンドラウイルスとは異なり、これらの土壌VLPは≈2 nmの細く≈40 nmの長さの繊維で不均一に覆われており、4-6 nm幅の球状の頭部を持っていた（図5b）。このカテゴリーに属する他のVLPは、長さ310-460 nm、幅180-275 nm、孔径50-75 nmであった（図5c-e）。コルク構造を持つ粒子は見つからなかったが、1 µm範囲のVLPの中には、ピトウィルスを思わせる規則的な表面パターンを持つものがあった（図5f+g）。
糸状粒子
棒状や糸状のウイルス形態は、生命のあらゆる領域で宿主と関連している。例えば、アルファフレキシウイルス科の植物ウイルスは、長さ400-800 nm、直径10-15 nmの柔軟な糸状ビリオンを持つ。イノウイルス科の細菌ウイルスは、幅6〜10nm、長さ600〜2500nmの柔軟な粒子を持つ。古細菌ウイルスの中には、長さ600-900 nm、幅23 nmの硬いロッド状のルディウイルス、長さ410-2200 nm、幅24-38 nmの柔軟なリポトリックスウイルスフィラメント、400×32 nmのエンベロープ状のトリストロマウイルス、143×16 nmの硬いロッド状のクラウイルスなど、さまざまな糸状ウイルスが見られる65。原核生物の糸状ウイルスの多くは、粒子末端にキャップ、ファイバー、スパイク、クローなどのユニークな構造を持ち、これがさらなる同定基準となる。
私たちはハーバード・フォレストの土壌から、長さ380-600 nm、直径20-50 nmの硬い棒状粒子（図6a-e）や、長く柔軟なVLP（図6f）など、おそらくビリオンを示すと思われる糸状粒子をいくつか発見した（図6補足）。それらの多くは、らせん構造を示唆する規則的な間隔のサブユニットから構成されていた。頭部構造を持つ、これまで報告されていない形態の糸状粒子も存在した（補足図6g）。
尾部型バクテリオファージ
したがって、尾部型バクテリオファージは、0.22～1.2 µmの土壌分画で遭遇したVLPの中で最も顕著なグループであった。しかし、私たちは巨大VLPに主に関心があったため、記録したのはその一部だけであった。合計で、長く収縮性の尾を持つ65個の推定ミオウイルス（補足図7）、長く非収縮性の尾を持つ27個のシホウイルス（補足図8）、短く非収縮性の尾を持つ22個のポドウイルス（補足図9）を画像化した。これらのうち最大のものは、ジャンボバクテリオファージに相当すると思われる。ジャンボバクテリオファージは、ゲノムの長さが200kbpを超え、頭部の直径が約100nmより大きく、尾部の長さが約100-500nmの粒子で定義される66。ミオ様VLPの頭部はほとんどが等尺性で直径55-150 nm（99±25 nm、補図2d））、シッポ様VLPの頭部は等尺性（n=15）で直径51-143 nm（79±27 nm）または長さ77-392 nm、幅30-70 nmの多角形（n=12）、ポド様VLPの頭部は等尺性で直径59-116 nm（73±15 nm）であった。
文献67では、ミオウイルスの尾部は長さ80-455 nm、太さ16-20 nm、サイホウイルスの尾部は長さ65-570 nm、太さ7-10 nm、ポドウイルスの尾部は長さ約20 nm、太さ8 nmと記載されている。ハーバードフォレストの土壌サンプルでは、長さ63-234 nm（126±36 nm）、太さ14-27 nm（20±4 nm、収縮した尾部を除く）の尾部を持つミオ様VLPを同定した（補足図2d）。ほとんどのサイフォ様VLPの尾部は、長さ67-551 nm（245±106 nm）、太さ6-19 nm（11±3 nm）であったが、長さ1.05 µmの尾部を持つ1個のサイフォウイルスが特筆すべき例外であった（補足図8b）。ポド様VLPの尾部は長さ9-67 nm（21±13 nm）、太さ5-31 nm（13±5 nm）であった。
新規ウイルス形態の可能性
VLP信頼性尺度（補足図1）の最下位には、文献に類似例が見当たらないが、ビリオンの可能性がある土壌ナノ粒子があった。しかし、これらは細胞性微生物、細胞断片、またはその他の非ウイルス体を表している可能性もある。このような構造の一部を図6に示す。入れ子状になった層を持つ球状粒子（図6a）や外繊維（図6b）、長さ9nmの歯を持つジッパー状の構造でつながった2つのサブユニットからなる粒子（図6c）などである。また、キャップソマー様の表面パターンが見られず、しばしば長手方向に沿って異なる染色を示す液滴型や卵型の粒子（図6d-f）や、400-700 nmサイズのドーム型粒子（図6g-i）も見つかった。最後に、角が丸く、内部が対称に配置された正三角形のような、幅200-650 nmの粒子がいくつか見られた（図6j-l）。
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図6：未分類の土壌ナノ粒子。
円形、卵形、ドーム形、三角形の形態を持つ粒子のうち、新しいウイルス形態、超小型微生物、または細胞内構造を表すと思われるもの。a) 外径330 nm、内球径180 nmの多層粒子。b) 直径280 nm、球状の頭部を持つ長さ20-35 nmの外繊維を持つ小胞粒子。c) 470×430 nmの大きなサブユニットと240×100 nmの小さなサブユニットからなる粒子。e) 卵形粒子、565×380 nm f) 卵形粒子、635×415 nm g) 直径390 nmのドーム型粒子 h) ドーム型粒子、690×580 nm i) ドーム型粒子、480×390 nm。j) 隅から隅までの距離が200 nmの三角形粒子。 k) 隅から隅までの距離が425 nmの三角形粒子。 l) 隅から隅までの距離が650 nmの三角形粒子。
細胞性微生物
陰性染色TEMでは細菌と古細菌の区別がつかなかったが、原核生物のような外観の粒子を複数撮像した（補図10）。これらの細胞の一部には、表面にVLPが付着していた（補足図11）。予備濾過の手順により、ほとんどの細胞様粒子は、少なくとも一次元が1 µm以下であった。最も小さいものは100×200 nm、細胞質体積0.001 µm3で、≈50 nm厚の細胞外マトリックスに囲まれていた（補足図12）。これらの形態学的特徴は、Candidate Phyla Radiation（CPR）の超小型細菌と一致している。CPRは、ほとんどが未培養の細菌で構成される多様なクレードであり、小さな流線型のゲノムを持ち、共生生活を営んでいると推定される68, 69。ハーバード・フォレストの土壌には、TM6グループやパテシバクテリウム門70に一致する配列を含む、CPRバクテリアのメタゲノム・シグネチャーが見つかっている（Blanchard、未発表）。また、今回のデータセットに含まれる小さな細胞の中には、DPANN古細菌71である可能性も否定できない。明らかな原生生物細胞は見つからなかったので、土壌原生生物のほとんどは孔径1.2 µmの濾過ステップで除去されたと考えられる。
考察
ハーバード・フォレストの有機・鉱物層土壌を透過型電子顕微鏡で観察した結果、ウイルス様粒子の驚くべき多様性が明らかになった。特に興味深いのは、二十面体の大きなキャプシド構造の様々な付属物やその他の修飾である。これらには、管状の突起、様々な長さや太さの繊維、内部チャネル、二重キャプシド、ユニークな頂点構造、尾部などが含まれる。電子顕微鏡観察だけでは、観察されたナノ粒子の性質を明確に立証するには不十分であるが、私たちは、修飾されたカプシドを持つ大型の正20面体VLPは、最も象徴的なウイルスの形態型であるバクテリオファージに典型的な頭部と尾部の形態型よりも、さらに高い信頼性をもって「ウイルス粒子」と呼ぶことができると主張する（補足図1）。というのも、遺伝子導入剤は視覚的に尾を持つバクテリオファージと間違われる可能性があるからである。一方、正20面体を基本とする対称性を持つ、大きな付属体を持つキャプシドに似た非ウイルス粒子を我々は知らない。
驚くべきことに、数百グラムの森林土壌には、これまでに分離されたすべての巨大ウイルスを合わせたよりも多様なキャプシド形態が含まれていた。これらの土壌サンプルに存在するウイルスの多様性のごく一部を画像化したに過ぎないことを考えると、この観察はさらに驚異的である。森林土壌中のウイルス量は、乾燥重量1グラム当たり108個から109個以上と報告されている32。ビリオンは鉱物や有機土壌粒子に付着することが知られているため72。特殊な緩衝液の使用、密度勾配分画、またはより厳密な機械的処理73, 74によって、少なくとも特定のウイルス群のウイルス回収率を向上させることができる。われわれの目標は、ウイルス収量を最大化することよりも、無傷のVLPの高画質画像を得ることであり、その代償として追加のバイアスを導入したり、抽出手順中にVLPを損傷したりすることではなかった。このため、また巨大なVLPを優先的に記録し、尾を持つ多くのバクテリオファージを無視したため、ハーバード・フォレストの土壌で見つかったウイルスの形態型について定量的な結論を出すことは控える。しかし、土壌ウイルスの多様性32を考えると、いくつかの巨大ウイルス形態型に複数回遭遇したという事実は、これらのサンプルにそれらが豊富に含まれていたことを示唆している（例えば、「クリスマス・スター」と「ゴルゴン」形態型、補図4+5）。
同じ場所の土壌のメタゲノム解析の結果、16種類の新規巨大ウイルスのゲノムアセンブリが得られた23。その中には、ピトウイルス、ツパンウイルス、クロナウイルスの近縁種が含まれており、それぞれ、大型卵形、尾状正20面体、平板状または繊維状正20面体粒子という、VLPの型が一致する可能性が見つかった。現時点では、メタゲノムで組み立てられたゲノムと、ここで説明した形態型のいずれかを結びつけることはできないが、巨大VLPの形態学的多様性は、ハーバード・フォレストの土壌に存在する巨大ウイルスのメタゲノム的多様性を明らかに上回っていることが示された。
このようにウイルスの多様性を視覚的に示すことで、他の研究者が電子顕微鏡を使ってさまざまなマイクロコズムを探索し、より多くのウイルス-宿主系を分離して詳細な特徴を明らかにするきっかけになればと願っている。巨大ウイルスのキャプシド付属物の機能と進化的起源を解明するためには、新しいモデル系が必要である。いくつかの構造は、細胞性のものと類似あるいは相同であるかもしれない。例えば、"Gorgon "型の管状付属物は、超好熱古細菌Pyrodictium abyssi75の細胞外管に似ている。
我々の研究は、ウイルスの形態型の異常な多様性が土壌生態系に典型的なものなのか、それとも付属器を持つ巨大VLPが水生環境でも一般的なものなのかという疑問を提起している。電子顕微鏡を用いた環境調査、特に0.2 µm以上のサイズ分画に関する調査が不足しているため30, 76、この問題は今のところ未解決のままである。例えば、Tara Oceans Expeditionで収集された海水サンプルのTEM研究では、VLPの50～90%は平均直径50 nmの無尾状で、残りのVLPは尾状のバクテリオファージに似ていると報告されている77。一方、南氷洋78, 79、北太平洋80、北海81では、尾部構造を持つ大型の正20面体キャプシドが見つかっており、尾部やその他のキャプシド修飾を持つ巨大ウイルスが海洋環境に広く存在している可能性が示唆された。
我々は、0.2µmから1.2µmのサイズ画分において、土壌VLPの予想外の多様性を発見した。ハーバード・フォレストで発見されたウイルスの多様な形態型は、ウイルス球とその構造的不均一性に関する我々の現在の理解に疑問を投げかけている。土壌ウイルスの複雑な世界に対するこの興味深い窓は、巨大ウイルスの高い遺伝的多様性が、多様で以前は想像もできなかった粒子構造と一致しており、その起源と機能はまだ研究されていないことを疑う余地はない。
著者の貢献
マティアス・G・フィッシャー 概念化、形式分析、調査、資料、執筆-原案、執筆-校閲・編集、視覚化、監修。ウルリケ・メルスドルフ 方法論、調査、形式分析、執筆-校閲・編集。ジェフリー・ブランチャード 概念化、形式分析、調査、執筆-校閲・編集。
補足図
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補足図1：50-2000 nmサイズのナノ粒子をVLPとして分類するための考察。
TEMデータから潜在的なウイルス粒子を同定するのは容易ではなく、粒子のサイズ、形状、超微細構造、既知の構造との類似性、画質、技術的限界や潜在的なアーチファクトに関する知識、研究者の経験や経歴など、いくつかの要因に左右される。図に、ウイルス関連ナノ粒子のさまざまなカテゴリーとその可能な解釈をまとめた。
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補足図2：電子顕微鏡データの概要、カプシドの直径、およびミオウイルスの頭部と尾部の測定。
a)サンプルごとのTEM画像の数。 b)カテゴリーごとのTEM画像の数。 c)平たい正20面体の外観を持つVLP間のカプシド直径の分布。200 nmより小さいキャプシドは青で、巨大VLPに相当するものは赤で示した。d) 尾状ミオウイルス様粒子（A1形態型）のサイズ分布。カプシドの直径（オレンジ）と尾の長さ（緑）が別々に表示されている。尾部の長さを線形回帰すると、ミオウイルスの尾部は平均してカプシドの幅より20-40 nm長いことがわかる。
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補足図3:巨大VLP上のクラスター化したスポット。
各概要画像には、同じ粒子の高倍率図が添えられており、濃く染色された孔のような特徴の配列が示されている。
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補足図4:「ミミのような」(a+b)、「超新星」(c+d)、「亀」(e)、「配管工」(f)、「散髪」(g-i)、「クリスマス・スター」(j-l)のカテゴリーにおける巨大VLPの追加例。
スケールバーはすべて100 nm。
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補足図5：形態型「Gorgon」（a-d）、「flacon」（g+h）、および尾状巨大VLP（k）に属する巨大VLPの追加例。
e)の細管はd)の粒子の拡大図、f)は図3hの拡大図、i)はg)の粒子の拡大図、j)のノズル構造はh)の拡大図。
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補足図6：糸状ウイルス様構造体。
a) 棒状、380×20 nm。b) 棒状、572×49 nm。c) 480×36 nmのロッド。 d) 425×29 nmのロッドで、幅8 nmの電子密度の高い内筒を持つ。 e) 606×38 nmのロッド。 f) 長さ1070 nm、幅15 nmのVLPまたは剥離した細胞構造体。g) 幅165 nmの頭部構造を持つ1270×54 nmの柔軟なVLP。
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補足図7:ミオウイルスに典型的な長い収縮性尾部を持つバクテリオファージVLP。
a)頭部の直径：150 nm、尾の長さ：210 nm。 b)頭部の直径：120 nm、168 nmの長い尾には、ジャンボコリファージphAPEC683によく似た「ひげ状」繊維が見られる。d) 頭部直径：75 nm、尾の長さ：125 nm. e) 頭部直径：120 nm、尾の長さ：145 nm. f) 頭部直径：122 nm、尾の長さ：149 nm. g) 頭部直径：135 nm、尾の長さ：150 nm： i) 頭部寸法： 105×57 nm、尾の長さ（収縮時）：108 nm： j) 頭部寸法： 170×75 nm、尾の長さ：100 nm。a)-h)のVLPはA1形態型、i)-j)のVLPはA3形態型に相当する（Ackermann84による）。
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補足図8:サイホウイルスに典型的な長く非収縮性の尾部を持つバクテリオファージVLP。
a) 頭部の直径：71 nm、尾部の長さ：410 nm。c) 頭部直径：77 nm、尾の長さ：176 nm d) 頭部直径：140 nm、尾の長さ：268 nm e) 頭部直径：138 nm、尾の長さ：277 nm f) 頭部寸法： 104×62 nm、尾の長さ：252 nm： 111×71 nm、尾の長さ：190 nm： h) 頭部寸法：78×55 nm、尾長：205 nm： i) 頭部寸法：95×54 nm、尾長：65 nm j) 頭部寸法：387×55 nm、尾長：190 nm j) 頭部寸法：387×55 nm、尾長：348 nm： 176×44 nm、尾の長さ：314 nm： 228×56 nm、尾の長さ：272 nm。a)-e)のVLPはB1形態型、f)-i)のVLPはB2形態型、j)-l)のVLPはB3形態型に相当する（Ackermann84による）。
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補足図9：ポドウイルスに典型的な短い尾を持つバクテリオファージVLP。
a)頭部の直径：62 nm、尾の長さ：11 nm。 b)頭部の直径：65 nm、尾の長さ：13 nm。 c)頭部の直径：62 nm、尾の長さ：17 nm。 d)頭部の直径：85 nm、尾の長さ：24 nm。 e)頭部の直径：72 nm、尾の長さ：22 nm。 f)頭部の直径：115 nm、尾の長さ：35 nm。 g)頭部の直径：83 nm、尾の長さ：32 nm。尾端から糸状の物質（おそらく核酸）が突き出ている。 h) 頭部の直径：107 nm、尾部の長さ：67 nm。
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補足図10：ハーバード・フォレスト有機土壌の0.22 µm～1.2 µmサイズ画分に見られる原核生物様粒子の例。
a) 940×550 nm b) 830×540 nm、長さ500 nmまでの毛。c) 1.8×1.0 µm、長さ200 nmの繊毛。d) 1.5×0.4 µm、長さ2 µmの一対の硬い鞭毛様構造を持つ細胞。e) 長さ1.45µm、幅280nmの分裂細胞で、細胞表面と相互作用する複数の30-90nmの大きな小胞様構造を持つ。
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補足図11：VLPが付着した細胞。
a)-b)細菌細胞表面に収縮した尾を持つミオウイルス。 c)-d)細胞表面に頭から付着したミオウイルス。 e)-f)直径≈60 nmの複数のVLPが細胞に付着している。尾の構造は見えないが、これらのVLPはポドファージかもしれない。
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補足図12：厚い表面層を持つ超小細胞。
a)とb)に分裂中の細胞を示すが、c)にもある可能性がある。a) 450×180 nm、表層：25-65 nm。 b) 770×300 nm、表層：47-67 nm： c) 675×260 nm、表面層： d) 300×180 nm、表面層：17-40 nm： e) 175×120 nm、表面層：17-40 nm： f) 200×100 nm, 表面層: 20-45 nm. g) 225×100 nm, 表面層: 30-60 nm： h) 215×135 nm、表面層：20-45 nm。スケールバーはすべて100 nm。
謝辞
この研究は、電子顕微鏡法とバクテリオファージの分類学のパイオニアであるHans-Wolfgang Ackermann（1936-2017）の思い出に捧げられる。彼はこのウイルスの多様性の展示を楽しんだと思われ、その画質が彼の賛同を得られたことを願っている82。アメーバ巨大ウイルスの純粋なサンプルを提供してくれたLionel BertauxとChantal Abergel（エクス・マルセイユ大学）に感謝する。Reinhard Rachelには貴重なフィードバックを、Rob Lavigne、Andrew Kropinski、Alexander Probstをはじめとする多くの方々には議論をしていただいた。電子顕微鏡の専門知識と情熱を分かち合ってくれたKarsten Richter（DKFZ Heidelberg）に特に感謝する。マックス・プランク協会は、資金援助とインフラストラクチャー支援を通じて本研究を可能にした。
参考文献
1.↵
Nagler, F. P. & Rake, G. The use of electron microscope in diagnosis of variola, vaccinia and varicella. J. Bacteriol. 55, 45-51 (1948).
全文無料Google Scholar
2.
Ruska, H., von Borries, B. & Ruska, E. Die Bedeutung der Übermikroskopie für die Virusforschung. Arch. Gesamte Virusforsch. 1, 155-169 (1939).
CrossRefGoogle Scholar
3.
Die Sichtbarmachung von pflanzlichem Virus im Übermikroskop. Naturwissenschaften 27, 292-299 (1939).
CrossRefGoogle Scholar
4.↵
スイス・アルビノマウスで増殖したランシング株ポリオ髄炎ウイルスの電子顕微鏡による形態学的観察。Tex. Biol. Med. 10 2, 425-428 (1952).
PubMedGoogle Scholar
5.↵
形態学に基づくウイルス粒子の分類。Can. Med. 89, 787-798 (1963).
PubMedGoogle Scholar
6.↵
Ruska, H. Versuch zu einer Ordnung der Virusarten. Arch. Virol. 2, 480-498 (1943).
Google Scholar
7.↵
Proctor, L. M. & Fuhrman, J. A. 海洋細菌およびシアノバクテリアのウイルスによる死滅。Nature 343, 60-62 (1990).
CrossRefWeb of ScienceGoogle Scholar
8.↵
水生環境に存在する高濃度のウイルス。Nature 340, 467-468 (1989).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
9.↵
海洋ウイルス--地球生態系における主要なプレーヤー。Nat Rev Microbiol 5, 801-812 (2007).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
10.
海の中のウイルス。Nature 437, 356-361 (2005).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
11.
海洋ウイルスとその生物地球化学的・生態学的影響。Nature 399, 541-548 (1999).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
12.
Zimmerman, A. E. et al. 水生生態系におけるウイルス感染の代謝および生物地球化学的影響。Nat. Rev. Microbiol. 18, 21-34 (2020).
CrossRefGoogle Scholar
13.↵
Koonin, E. V., Senkevich, T. G. & Dolja, V. V. 古代ウイルスの世界と細胞の進化。Biol Direct 1, 29 (2006).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
14.↵
Abergel, C., Legendre, M. & Claverie, J.-M. 急速に拡大する巨大ウイルスの世界： Mimivirus, Pandoravirus, Pithovirus and Mollivirus. FEMS Microbiol. Rev. 39, 779-796 (2015).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
15.
Fischer, M. G. Giant Viruses come of age. Curr. Opin. Microbiol. 31, 50-57 (2016).
CrossRefGoogle Scholar
16.↵
巨大ウイルスの肩の上に立つ：小型真核生物に感染する大型ウイルスとそれが生み出す機会について学んだ5つの教訓。PLoS Pathog. 12, e1005752 (2016).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
17.↵
藻類に感染する巨大ウイルス。Annu Rev Microbiol 53, 447-494 (1999).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
18.↵
ミミウイルスの1.2メガバースのゲノム配列。Science 306, 1344-50 (2004).
要旨/全文無料Google Scholar
19.
ミミウイルスと「巨大」ウイルスの出現。Virus Res. 117, 133-44 (2006).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
20.↵
ウイルスの再定義：ミミウイルスからの教訓。Nat. Rev. Microbiol. 6, 315-319 (2008).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
21.↵
アメーバ内の巨大ウイルス。Science 299, 2033 (2003).
全文無料Google Scholar
22.↵
海洋巨大ウイルスの生物地理学から明らかになった真核生物との相互作用と生態機能。Nat. Nat. Ecol. Evol. 4, 1639-1649 (2020).
Google Scholar
23.↵
土壌巨大ウイルスの隠れた多様性。Nat. Commun. 9, 4881 (2018).
CrossRefGoogle Scholar
24.↵
Schulz, F. et al. グローバルメタゲノミクスによる巨大ウイルスの多様性と宿主との相互作用。Nature 578, 432-436 (2020).
CrossRefGoogle Scholar
25.↵
Koonin, E. V. et al. ウイルス世界のグローバルな組織化とメガタクソノミーの提案。Microbiol. Mol. Biol. Rev. 84, 1-33 (2020).
Google Scholar
26.
Aylward, F. O., Moniruzzaman, M., Ha, A. D. & Koonin, E. V. A phylogenomic framework for charting the diversity and evolution of giant viruses. PLOS Biol.
CrossRefPubMedGoogle Scholar
27.
Iyer、L. M., Balaji、S., Koonin、E. V. & Aravind、L. 核-細胞質性巨大DNAウイルスの進化ゲノミクス。Virus Res. 117, 156-184 (2006).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
28.↵
Iyer, L. M., Aravind, L. & Koonin, E. V. 大型真核生物DNAウイルスの4つの多様なファミリーの共通起源。J. Virol. 75, 11720-11734 (2001).
要旨/全文無料Google Scholar
29.↵
Pagnier, I. et al. アメーバからのミミウイルス科およびマルセイユウイルス科分離における改良の10年。Intervirology 56, 354-363 (2013).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
30.↵
Swanson, M. M. et al. 土壌中のウイルス： 根圏における形態学的多様性と存在量。Ann. 155, 51-60 (2009).
CrossRefGoogle Scholar
31.
Trubl, G., et al. Soil viruses are underexplored players in ecosystem carbon processing. mSystems 3, (2018).
Google Scholar
32.↵
Williamson, K. E., Fuhrmann, J. J., Wommack, K. E. & Radosevich, M. Viruses in soil ecosystems: an unknown quantity within an un unexplored territory. Annu. Rev. Virol. 4, 201-219 (2017).
Google Scholar
33.↵
Cobián Güemes, A. G., et al. Viruses as winners in the game of life. Annu. Rev. Virol. 3, 197-214 (2016).
Google Scholar
34.↵
高度にモザイク化したマイコバクテリオファージゲノムの起源。Cell 113, 171-182 (2003).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
35.↵
土壌の温暖化と気候系への炭素循環フィードバック。Science 298, 2173-2176 (2002).
要旨/全文無料Google Scholar
36.↵
土壌の温暖化、炭素と窒素の相互作用、森林の炭素収支。Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 9508-9512 (2011).
要旨/全文無料Google Scholar
37.↵
Lang, A. S., Zhaxybayeva, O. & Beatty, J. T. 遺伝子転移因子：遺伝子交換のファージ様要素。Nat. Rev. Microbiol. 10, 472-82 (2012).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
38.
Kuhn, J. H. & Koonin, E. V. Viriforms - a new category of classifiable virus-derived genetic elements. Biomolecules 13, 1-8 (2023).
Google Scholar
39.↵
Bárdy, P. et al. 遺伝子導入剤のDNAデリバリーの構造とメカニズム。Nat. Commun. 11, 1-13 (2020).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
40.↵
Ladenstein、R., Fischer, M. & Bacher, A. ルマジン合成酵素／リボフラビン合成酵素複合体：非常に多様な酵素系の形と機能。FEBS J. 280, 2537-2563 (2013).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
41.
Yeates, T. O., Kerfeld, C. A., Heinhorst, S., Cannon, G. C. & Shively, J. M. 細菌におけるタンパク質ベースのオルガネラ： カルボキシソームと関連マイクロコンパートメント。Nat. Rev. Microbiol. 6, 681-691 (2008).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
42.↵
Nichols, R. J., Cassidy-Amstutz, C., Chaijarasphong, T. & Savage, D. F. カプセル：殻の分子生物学。Crit. Rev. Biochem. Biochem. Biol. 52, 583-594 (2017).
CrossRefGoogle Scholar
43.↵
Claverie, J.-M. & Abergel, C. From extraordinary endocytobionts to Pandoraviruses. Scheid et al： いくつかの秘密が明らかになった： Parasitol. Parasitol. Res. 114, 1625-1627 (2015).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
44.
Scheid, P., Hauröder, B. & Michel, R. Investigations of an extraordinary endocytobiont in Acanthamoeba sp.: development and replication. Parasitol. Res. 106, 1371-7 (2010).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
45.↵
エンドサイトビオントKC5/2は、宿主アカントアメーバsp.のゾル様細胞質への形質転換を誘導し、自らの発育の基質とする。Parasitol. 90, 52-56 (2003).
PubMedGoogle Scholar
46.↵
パンドラウイルスの形態を持つ巨大正20面体DNAウイルスの3万年前の遠縁種。Proc Natl Acad Sci U S A 111, 4274-9 (2014).
要旨/全文無料Google Scholar
47.↵
高電圧電子線トモグラフィーとエネルギーフィルター電子線凍結顕微鏡による巨大ピト ウイルス・シベリカム粒子の構造多様性と複雑性の解明。Sci. Rep. 7, 13291 (2017).
CrossRefGoogle Scholar
48.↵
新興パンドラウイルス科の多様性と進化。Nat. Commun. 9, 2285 (2018).
CrossRefGoogle Scholar
49.↵
アカントアメーバに感染する3万年前の新しい巨大ウイルス、Mollivirus sibericumの詳細な研究。Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E5327-E5335 (2015).
アブストラクト/全文無料Google Scholar
50.↵
巨大ミミウイルスの低温電子顕微鏡観察。J. Mol. 353, 493- 496 (2005).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
51.↵
Zauberman, N. et al. ウイルスAcanthamoeba polyphaga mimivirusにおけるDNAの出口とパッケージングの入り口。PLoS Biol.
CrossRefPubMedGoogle Scholar
52.↵
Schrad、J.R.、Abrahão、J.S.、Cortines、J.R.& Parent、K.N. 巨大ウイルス感染開始の構造とプロテオミクス的特徴づけ。Cell 181, 1-16 (2020).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
53.↵
Arslan, D., Legendre, M., Seltzer, V., Abergel, C. & Claverie, J.-M. より大きなゲノムを持つミミウイルスの遠い親戚がメガウイルス科の基本的特徴を浮き彫りにした。Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 17486-91 (2011).
要旨/全文無料Google Scholar
54.↵
海洋従属栄養性ナノ鞭毛藻（Bodo sp）の溶菌を引き起こす大型二本鎖DNAウイルスは、天然の海洋ウイルス群集に存在する。Aquat. Microb. Ecol. 9, 203-210 (1995).
CrossRefWeb of ScienceGoogle Scholar
55.↵
Xiao, C. et al. Cafeteria roenbergensisウイルスのキャプシドの低温電子顕微鏡による再構築は、巨大ウイルスの新しい組み立て経路を示唆している。Sci. Rep. 7, 5484 (2017).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
56.↵
Doutre, G., Philippe, N., Abergel, C. & Claverie, J.-M. オーストラリア産マルセイユウイルス科最初の代表的ウイルスのゲノム解析から、その遺伝子のほとんどがウイルスのフィットネスに寄与していることが示された。J Virol 88, 14340-9 (2014).
要旨/全文無料Google Scholar
57.↵
マルセイユウイルス科ウイルス粒子の低温電子顕微鏡構造から、大きな内部ミクロ集合体が明らかになった。Virology 516, 239-245 (2018).
Google Scholar
58.↵
Fischer, M. G. & Hackl, T. 宿主ゲノム統合と巨大ウイルスによるウイルスファージ・マウイルスの再活性化。Nature 540, 288-291 (2016).
CrossRefGoogle Scholar
59.↵
巨大ミミウイルス1.2 Mbゲノムは、直径30 nmのヘリカルタンパク質シールドにエレガントに組織化されている。Elife 11, 1-22 (2022).
CrossRefGoogle Scholar
60.↵
巨大ウイルスParamecium bursaria chlorella virus 1のほぼ原子レベルの非二十面体平均構造。Nat. Commun. 13, 6476 (2022).
Google Scholar
61.↵
温泉水から発見された新規大型DNAウイルスMedusavirus. J. Virol. 93, 1-3 (2019).
CrossRefGoogle Scholar
62.↵
Xiao, C. et al. 巨大ミミウイルスの構造研究。PLoS Biol.7, e1000092 (2009).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
63.
ミミウイルスの立体構造。Intervirology 53, 268- 273 (2010).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
64.↵
Kuznetsov, Y. G. et al. 原子間力顕微鏡による巨大ミミウイルスの研究。Virology 404, 127-137 (2010).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
65.↵
Prangishvili, D. et al. 謎の古細菌ウイルス球。Nat. Rev. Microbiol. 15, 724-739 (2017).
CrossRefGoogle Scholar
66.↵
ジャンボバクテリオファージ： 概要。Front. Microbiol. 8, 1-9 (2017).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
67.↵
King, A. M. Q., Adams, M. J., Carstens, E. B. & Lefkowitz, E. J. Virus Taxonomy. ウイルスの分類に関する国際委員会の第9回報告書。(Elsevier Academic, 2011）。
Google Scholar
68.↵
Brown、C. T. et al. ドメインバクテリアの15％以上を占めるグループにおける特異な生物学。Nature 523, 208-211 (2015).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
69.↵
Luef, B. et al. 地下水中の多様な未培養超小型細菌細胞。Nat. Commun. 6, 6372 (2015).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
70.↵
Alteio, L. V. et al. 相補的なメタゲノム・アプローチにより、森林土壌の微生物多様性の再構築が改善された。
Google Scholar
71.↵
Dombrowski, N., Lee, J., Williams, T. A., Offre, P. & Spang, A. Genomic diversity, lifestyles and evolutionary origins of DPANN archaea. FEMS Microbiol. Lett. 366, 1- 12 (2019).
CrossRefGoogle Scholar
72.↵
土壌中のウイルス： 微生物の生命、生物地球化学的回転、生態系機能のナノスケールのアンデッドドライバー。Soil Biol. Biochem. 127, 305-317 (2018).
Google Scholar
73.↵
Trubl, G. et al. Towards optimized viral metagenomes for double-stranded and single-stranded DNA viruses from challenging soil. PeerJ 7, e7265 (2019).
CrossRefGoogle Scholar
74.↵
Williamson, K. E., Wommack, K. E. & Radosevich, M. Sampling natural viral communities from soil for culture-independent analyses. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6628-33 (2003).
要旨/全文無料Google Scholar
75.↵
Rieger, G., Rachel, R., Hermann, R. & Stetter, K. O. 超好熱古細菌Pyrodictium abyssiの超微細構造。J. Struct. 生物 115, 78-87 (1995).
CrossRefWeb of ScienceGoogle Scholar
76.↵
デラウェア州の6つの土壌におけるウイルスの存在量と多様性。Appl. Environ. Microbiol. 71, 3119-3125 (2005).
抄録／全文無料Google Scholar
77.↵
海洋ウイルスのグローバルな形態学的解析から、最小限の地域変異と非尾部ウイルスの優位性が示された。ISME J. 7, 1738-1751 (2013).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
78.↵
ロス海晩秋の流氷生息域における大型ウイルス。Mar Ecol Prog Ser 241, 1-11 (2002).
Google Scholar
79.↵
ロス海夏季流氷生息域における大型ウイルスと感染微小真核生物。Mar. Biol. 142, 1029-1040 (2003).
Google Scholar
80.↵
褐虫藻放散虫の液胞およびその他の海洋サンプルから得られた大型ウイルス様粒子。Mar. Ecol. Prog. Ser. 101, 33-43 (1993).
CrossRefGoogle Scholar
81.↵
Bratbak, G., Haslund, O., Heldal, M., Naess, A. & Roeggen, T. 巨大海洋ウイルス？Mar Ecol Prog Ser 85, 201-202 (1992).
CrossRefWeb of ScienceGoogle Scholar
82.↵
ファージ電子顕微鏡の悲しい現状。メッセンジャーを撃ってください。Microorganisms 2, 1-10 (2014).
Google Scholar
83.↵
Wagemans, J. et al. ジャンボコリファージphAPEC6の構造解析。Int. J. Mol. Sci. 21, 1-13 (2020).
CrossRefPubMedGoogle Scholar
84.↵
Ackermann, H.-W. 2000年における形態学的ファージ記述の頻度 Brief Review. Arch Virol 146, 843-857 (2001).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
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