上皮内リンパ球のCD177+好中球の制御異常は、微生物叢由来のDMFの減少を介して腸の炎症を悪化させる

上皮内リンパ球のCD177+好中球の制御異常は、微生物叢由来のDMFの減少を介して腸の炎症を悪化させる
Huimin ChenORCID Icon,Xiaohan Wu,Ruicong Sun,Huiying Lu,Ritian Lin,Xiang Gao, show all
論文 2172668｜Received 2022年11月09日, Accepted 2023年1月18日, Published online: 2023年02月02日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2172668
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概要
好中球は、腸管上皮内リンパ球（IEL）と相乗効果を発揮し、腸管の第一線防御機構として腸管の恒常性を維持している。しかし、好中球がIELを制御して腸の炎症を抑制するメカニズムはまだ完全には解明されていない。我々は、好中球（特にCD177+サブセット）の枯渇が、デキストラン硫酸ナトリウム曝露やCitrobacter rodentium感染による結腸原性TCRγδ+CD8α+ IELの拡大、腸内炎症の増加、腸内細菌の異常増殖を引き起こすことを明らかにした。 scRNA seq解析により、結腸原性Cd177-/-マウス由来のTCRγδ+CD8α+ IELにおいてパイロプシス関連遺伝子シグネチャーとマイクロバイオータに対する過剰応答性の存在を見いだした。大腸菌Cd177-/-マウスの糞便中には、微生物叢由来のフマル酸およびその誘導体であるジメチルフマル酸（DMF）、ならびにフマル酸産生微生物が減少していた。抗生物質投与または同居処置によりディスバイオーシスを除去し、DMFを補充すると、TCRγδ+CD8α+IELの活性化が抑制された。また、DMFはガスデルミンD（GSDMD）誘発のTCRγδ+CD8α+IELのパイロプトーシスを抑制し、マウスの腸管粘膜炎症を有意に軽減させることがわかった。したがって、我々のデータは、好中球が微生物叢由来のDMFを促進することにより、GSDMDを介したパイロプトーシス依存的にTCRγδ+CD8α+ IELの活性化を制御して腸の炎症を抑制すること、およびDMFが腸の炎症管理のための治療ターゲットとなる可能性を明らかにするものであった。

図解抄録
keywords: 好中球 上皮内リンパ球 CD177 フマル酸ジメチル 腸管 炎症
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はじめに
好中球は、炎症シグナルに対する初期反応体であり、免疫調節、病原体の除去、消化管における免疫細胞の動員において重要である1,2 。CD177（NB1またはPRV1）は、好中球、好中球性メタミエル球、骨髄球にのみ発現するグリコシルホスファチジルイノシトール結合型糖タンパク質で、血小板内皮細胞接着分子-1に結合して好中球移動を調節する機能を有しています。これまでの研究で、CD177+好中球は、IL-22産生の増加や殺菌活性を通じて、炎症性腸疾患（IBD）の病態を保護する役割を担っていることが明らかになっています4。

腸の恒常性維持に寄与する免疫細胞のうち、上皮内リンパ球（IEL）は、粘膜バリアを無傷に保ち、上皮層をパトロールし、駆けつけた好中球と相乗して外来病原体に対する一次防御を適時に開始する重要な役割を担っています5。特に、TCRγδ+ IELは、抗菌エフェクター（RegIIIγ）を介して常在菌の上皮侵入を制限するために不可欠です。RegIIIγ）を介して、常在細菌の上皮への侵入を抑制しています。このシグナルは、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発粘膜損傷後の腸管上皮細胞（IEC）内在性のMyD88シグナルに依存しており、急性粘膜炎症後の宿主-微生物相の恒常性維持にTCRγδ+ IELが正常に機能していることが重要であることを示しています6, 7 。

好中球とIELの最適な空間的相互作用と連携は、病原体の侵入に対する腸管粘膜免疫の恒常性維持に不可欠である。好中球とIELの繊細な免疫制御の喪失は、腸管バリアの完全性を損ない、好中球減少性腸炎、感染症、IBDなどの腸管における一連の病原性障害を引き起こす8,9。特に、活性化CD8+ IELの蓄積はセリアック病の病因と密接に関連し、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に感染したコロナウイルス病2019（COVID-19）患者に見られる消化管症状と相関することが分かっています10,11。しかしながら、好中球がIELを制御し腸の恒常性状態を総合的に保持する基本的なメカニズムはまだ十分には分かっていません。今回、我々は、好中球が微生物の代謝産物であるジメチルフマレート（DMF）を介してIELの機能を制御し、腸管粘膜の炎症を抑制するという予想外のメカニズムを報告し、炎症性腸疾患（IBD）などの腸管炎症性疾患患者の治療アプローチとして、DMFによるIEL活性化操作に関する新しい知見を提供することに成功した。

材料と方法
実験動物
Cd177-/-マウスは、University of California (Davis, California, USA) のKOMPから購入し、Tongji University School of Medicineの動物施設で繁殖、維持された。DSS誘発大腸炎モデルの確立に使用したC57BL/B6野生型（WT）マウス（6〜8週）は、Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.（中国・上海）から購入し、Cd177-/-マウスと交配してCd177+/-マウスを作製し、Cd177-/-マウスのWT同腹子として微生物叢解析に使用した。同居実験では、3週齢のCd177-/-マウスとWT同腹子を少なくとも4週間同居させるか（co-housing）、依然として別々に飼育した12。これらのマウスは、12時間の光周期で特定の病原体を含まない条件で独立した換気ケージを用いて飼育し、餌と水はオートクレーブで滅菌したものを与えた。雄マウスは8-10週齢で体重20-25gのものを使用した。本研究におけるすべての動物実験は、同済大学上海十人病院動物研究機関審査委員会（SHDSYY-2018-3912）の審査・承認を受けた。

マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎モデル
マウスのDSS誘発大腸炎モデルは、以前に記載されたように確立された13。簡潔には、WTおよびCd177-/-マウスは、飲料水中の2％DSSで7日間処理し、その後さらに3日間滅菌水に交換された。10 日目にすべてのマウスを犠牲にした。大腸炎の重症度は、体重、下痢、血便、生存率などの標準的なパラメータを記録することにより、毎日採点した。大腸組織を摘出し、10％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）で染色した。組織学的スコアは、固有層の炎症の程度（0-なし、1-軽度、2-中等度、3-重度）、杯細胞消失（0-なし、1-軽度/中等度、2-重度）、陰窩の破壊（0-正常、1-過形成、2-軽度）、6つのパラメータそれぞれのスコアを組み合わせることで算出された。1-hyperplastic、2-disorganization、3-crypt loss）、陰窩膿瘍の存在（0-absent、1-present）、粘膜侵食（0-absent、1-present）、粘膜下潰瘍の広がりから経粘膜侵襲（0-none、1-submucosal、2-transmural）、最大スコア12となった。最も悪い部位を3～4箇所選び、採点し、平均して最終スコアを決定した。

腸管IELおよび粘膜固有単核球の単離
前述したように、腸は腸間膜から慎重に洗浄し、糞便内容物を洗い流した。腸を縦に開き、0.5-1.0 cmに切断し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、糞便内容物を除去した。1mM EDTA in PBSで37℃、2×20分間消化した後、上清に初代IELを回収し、40%および75% Percoll-Roswell Park Memorial Institute（RPMI）溶液による密度勾配遠心分離でさらに精製した。その後、大腸組織をコラゲナーゼA（1mg/mL；Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA）により37℃で30分間消化した。単細胞懸濁液を回収し、40％および75％Percoll-RPMI溶液による密度勾配遠心分離でさらに精製した。その後、界面から前庭部単核細胞（LPMC）を回収し、10％ウシ胎児血清（FBS）-RPMI培地に懸濁した。

フローサイトメトリー解析
細胞表面の染色は、Cd177-／-マウスおよびWT同腹子からIELおよびLPMCを得、まずFc Block（BD Biosciences）とインキュベートした後、TCRγ／δ、TCRβ、CD4、CD8aおよびCD8bに対する蛍光色素結合mAbで染色した2, 同時に、Live/Dead Fixable Dead Cell stain kits (Invitrogen, Eugene, OR) を用いて、死細胞を除外した。細胞内サイトカイン染色のために、IELは、最後の3時間のブレフェルジンA（3 μg/mL; eBioscience）の刺激とともに、37℃で5時間、フォルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA、50 ng/mL; Sigma-Aldrich） とイオノマイシン（750 ng/mL; Sigma-Aldrich） で処理された。その後、これらの細胞を採取し、表面染色に処理した後、4℃で30分間固定化および透過処理を行った。3回の洗浄後、細胞内染色を、フルオロクロム結合抗IFN-γ、抗IL-17A、抗TNF-α、および抗IL-10 mAbsで実施した。染色されたすべてのサンプルは、BD FACS Canto IIフローサイトメーターで分析された。すべてのデータはFlowJoソフトウェア（Version 10.0.7, Tree Star; Ashland, Oregon, USA）を用いて処理された。

インビボでの好中球の枯渇
好中球を削除するために、DSS投与の前の0、3、6および9日目に、PBS中の抗マウスLy6G抗体（クローン1A8、Bio X Cell；米国ニューハンプシャー州ウエストレバノン）100μgをマウスに腹腔内注射した。アイソタイプコントロールとして、Rat IgG2a (clone 2A3, Bio X cell)を使用した16。

マウスの細菌感染
Citrobacter rodentium (CR) strain DBS100 (ATCC51459; American Type Culture Collection, Rockefeller, Maryland, USA) は Youcun Qian 博士 (The Key Laboratory of Stem Cell Biology, Institute of Health Sciences, Institutes for Biological Sciences, Shanghai, Chinese Academy of Sciences, Shanghai) から無償で提供されたものである。CRは、Luria-Bertaniブロス中で、37℃で一晩穏やかに菌を振盪することにより調製した。細菌培養物を段階的に希釈し、MacConkey寒天培地プレートにプレーティングして、投与されるCFUの最適な負荷を得た。感染実験のために，マウスを8時間絶食させた後，2×109CFUのCRをマウス1匹あたり100μlの総量で経口接種した。感染期間中，毎日死亡率をモニターした。また，感染開始時および感染後2日ごとに体重の変化を評価した17．

抗生物質の投与
SPFマウスの腸内細菌を枯渇させるため、アンピシリン（1 g/L、シグマアルドリッチ）、メトロニダゾール（1 g/L、シグマアルドリッチ）、ネオマイシン（1 g/L、シグマアルドリッチ）、バンコマイシン（0.5 g/L、和光）を含む4種の抗生物質を滅菌飲料水に混ぜ、前述のように4週間与えた（注18）。

DMF処理
DSS投与0日から10日まで、0.6%メトセルのエマルジョンでDMF（100 mg/kg）を毎日経口投与した。対照として、同量の0.6%メトセル乳剤を与えた。

単細胞RNA配列決定（scRNA-seq）解析
マウス大腸上皮層からCD45+免疫磁気ビーズのポジティブセレクションにより単細胞懸濁液を分離し、細胞生存率の検出を行った。生存率>85%のサンプルは、NovaSeq6000プラットフォームに基づくscRNA-seq解析に利用でき、配列決定ライブラリは、以前に記載したようにBD Resolveシステムから適応したBD Rhapsodyプロトコルによって作成した19。簡単に言うと、細胞溶解前に細胞バーコードと固有の分子識別子バーコードを持つ>200,000マイクロウェルに単一細胞を取り込み、ポリAのライゲーションを介してmRNAを捕捉した。単一細胞間の関係記述には、PCA および tSNE 分析を使用した。細胞のクラスタリングには Graphcluster と K-mean を、マーカー遺伝子の解析には Wilcox rank-sum test を用いた。遺伝子オントロジー（GO）解析は、NCBI、UniProt、Gene Ontologyからアノテーションを行った。有意なGOカテゴリの同定にはフィッシャーの正確検定を適用し、p値の補正にはFDRを使用した。

統計解析
すべてのデータは平均値±SEM で表し、GraphPad Prism 8 を用いて解析した。2群間比較は、Studentのt-testを使用して行った。複数標本の比較は、Mann-Whitney検定を用いて行った。異なる処理によるデータの2群間比較を分析し、Tukeyの多重比較検定を用いた2元配置ANOVAを用いて行った。*p < .05, **p < .01, ***p < .001 and ****p < .0001は、統計的に有意であるとみなされた。

結果
好中球は腸管炎症時にIELの特性を調節する
IEL反応の調節における好中球の役割を調べるため、まずWTマウスに2%DSSで誘導する急性大腸炎の実験モデルを確立し、抗Ly6G抗体を腹腔内投与して生体内の好中球を枯渇させた（補図S1a）。好中球枯渇マウスは、有意な体重減少、組織学的病変の悪化、粘膜バリア機能の低下、および結腸組織における炎症性サイトカイン（例えば、IL-1β、IL-17A、IFN-γおよびTNF-α）の発現を特徴とする対照よりも重度の大腸炎を生じた（補足図S1b-f）。好中球の枯渇は、定常状態における大腸から分離したIELの組成に影響を与えなかった（図1a,bおよび補足図S1g）。しかし、大腸マウスの大腸ではTCRγδ+CD8αα+ IELが増加し、好中球を枯渇させた大腸マウスではコントロールと比較してさらに増加することを見出した（図1a）。TCRγδ+CD8αα+ IELは慢性炎症時に大きく疲弊し、主に腸管粘膜のガードとされ、病原体の制限や自然免疫反応と適応免疫反応の厳密な制御に寄与している20。高い腸管ホーミングインテグリン（CD103とα4β7）を発現するTCRγδ+細胞は、養子移入後にTh1/Th17細胞分化が促進されることから「炎症性」細胞と考えられている21。大腸炎時のTCRγδ+CD8α+IELの特性を調べるために、フローサイトメトリーにより様々な炎症性サイトカインの発現を調べた。好中球減少マウスでは、大腸炎が重症化するのに伴い、IFN-γ、IL-17A、TNF-αを発現するTCRγδ+CD8α+ IELがWTコントロールと比較して高い割合で検出された（図1c）。一方、TCRαβ+CD4+-IELは、DSS誘発急性大腸炎中に好中球減少マウスの結腸で減少し（図1b）、低レベルのIL-10を産生することが分かった（図1c）。さらに、TCRαβ+CD8α+およびTCRαβ+CD8αβ+ IELの割合と数には、これらのグループ間で一貫した変化が見られなかった（補足図S1g）。これらのデータを総合すると、好中球枯渇後に拡張したTCRγδ+CD8αα+ IELが炎症促進特性を発現することが明らかになり、腸粘膜炎症時に好中球がIEL機能を調節して腸の恒常性を維持することが示唆された。

図1. 好中球の除去は、マウスの重症大腸炎と炎症性TCRγδ+CD8α+IELsの拡大を引き起こす。WTマウス（各群n = 6）に飲料水中の2%DSSにより急性大腸炎を誘発し、抗マウスLy6G抗体（αLy6G）およびラットIgG2a（100μg/マウス）でそれぞれ3日ごとに腹腔内処理した。(a、b）TCRγδ+CD8αα+IELのフローサイトメトリー解析（a）およびTCRαβ+CD4+IELのフローサイトメトリー解析（b、ゲートTCRαβ+IELの解析。TCRαβ+CD4+ IELの割合は、10日目に示された群の結腸におけるTCRαβ-CD4二重陽性IEL）の割合を計算することによって得られる。棒グラフは、示されたIELsの割合及び絶対数を示した。(c）示されたWTマウス（各群n＝6）の結腸から単離したIFN-γ-、IL-17A-、TNF-α-およびIL-10-発現TCRγδ＋CD8α＋IELおよびTCRαβ＋CD4＋IELの頻度をフローサイトメトリにより検出し、統計表に集計した。(d-h）WTおよびCd177-/-マウス（1群あたりn＝6）に、飲料水中の2％DSSによって急性大腸炎を誘発し、αLy6G抗体およびラットIgG2a（100μg/マウス）でそれぞれ3日ごとに腹腔内処理した。(d) DSS刺激後10日間の観察を通して、ラットIgG2aまたはαLy6G抗体で処理したWTおよびCd177-/-マウスの結腸組織の代表的なH&E染色を示す。スケールバー、100μm。組織学的スコアを示した（各群n = 6）。(e）各群のFITC-dextran（4 kD、600 mg/kg）の血清レベル。(f、g）各群の結腸におけるTCRγδ+CD8α+IEL（f）およびTCRαβ+CD4+IEL（g、ゲートTCRαβ+IELs）のフローサイトメトリー解析。棒グラフは、示されたIELの割合および絶対数を示した。(h）ラットIgG2aまたはαLy6G抗体で処理した結腸WTおよびCd177-/-マウスの結腸から分離したIFN-γ-、IL-17A-、TNF-α-およびIL-10発現TCRγδ+CD8αα+IELの頻度（群あたりn＝6）をフローサイトメーターで評価して統計表に集計した。データは3つの独立した実験の代表的なものである。*p < .05; **p < .01; ***p < .001; and ****p < .0001 and ns, no significant difference.

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大腸菌Cd177-/-マウスではTCRγδ+CD8α+IELが拡大する
CD177+好中球は、高い殺菌力を持ち、IL-22やTGF-βの発現が増加し、IFN-γ、IL-6、IL-17Aなどの炎症性メディエーターの放出が減少した活性化された好中球のサブセットとして機能することが我々の以前の研究で示されている22。そこで、CD177+好中球が炎症条件下でTCRγδ+CD8α+IELsの拡大を優位に調節している可能性を検討した。そこで、Cd177-/-およびWTマウスに黄砂による急性大腸炎を誘発し、同時に抗Ly6G抗体で好中球を腹腔内より枯渇させた。その結果、Cd177-/-マウスの腸管では、WTマウスに比べ粘膜障害や構造的歪みが悪化し、組織病変の悪化や粘膜バリアの損傷によって明らかになった（図1d,e）。我々の以前の研究では、定常状態あるいは炎症状態において、LPMCの免疫細胞（CD4+, CD8+ T細胞、B細胞など）にCd177-/-とWTマウスの間で差がないことを示した4。さらに、定常状態で大腸から分離したIELの組成に大きな変化は見られなかった（補図S2a）。興味深いことに、大腸炎Cd177-/-マウスの大腸では、TCRγδ+CD8αα+IELも増加し、TCRαβ+CD4+-IELは減少していた（図1f,g）。Cd177-/-マウスの大腸のTCRγδ+CD8αα+IELもWTコントロールに比べてIFN-γ,-IL-17A,TNF-αを多く生産していた（図1h）。しかし、抗Ly6G抗体を用いて総好中球を枯渇させても、頻度やサイトカイン産生にそれ以上の影響はなかった（例：, IFN-γ、-IL-17A、およびTNF-α）は、コントロールのIgG2a処理Cd177-/-マウスと比較して、大腸炎Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+ IELsの頻度に影響を与えず、CD177+好中球が主に大腸炎中のTCRγδ+CD8α+ IELsを制御することが示された（補図S2b、c、図1f）。

補完的アプローチとして、WTおよびCd177-/-マウスにCitrobacter rodentium（CR、2×109 CFUs/マウス）を経口感染させたところ、Cd177-/-マウスはCR感染後にWTコントロールよりも体重減少、上皮バリア完全性の障害を伴う重度の大腸炎を発症した（補足図S3a-c）。DSS誘発大腸炎の結果と一致して、CR感染への曝露もまた、WTコントロールと比較して、Cd177-/-マウスの大腸においてTCRγδ+CD8α+IELの増加を引き起こしたが、TCRαβ+CD4+IELの減少をもたらした（補足図S3d,e）。これらのデータから、CD177+好中球が大腸炎時のTCRγδ+CD8α+IELの拡大を制御していることが示された。

TCRγδ+CD8αα+IELの炎症性表現型と微生物叢への反応性亢進の発現
腸炎時のTCRγδ+CD8αα+IELの機能特性を明らかにするため、DSS処理した大腸炎Cd177-/-マウスとWT同腹子から分離したIELのシングルセルRNAシークエンス（scRNA-seq）解析を行って、IELの異なる発現遺伝子（DEG）プロファイルを読み解くことに成功した。DSS処理した大腸菌Cd177-/-マウスとWT同腹子の大腸粘膜上皮から合計14,301個の単一細胞を分離し、CD45+免疫磁気ビーズソーティングを行い、遺伝子発現プロファイルで特徴付けられる13個のt-SNE教師なしクラスタ（0-12）に割り当てた（補図S4a）。全免疫細胞クラスタの中からIELを段階的に獲得し、特定のマーカー遺伝子（Cd3e、Ccl5、Gzma、Gzmbなど）が濃縮されている点から、クラスタ7がIELと同定された（補足図S4b）。IELのプロファイリングの結果、7つのクラスター（C0-6）が得られ、それらは4つのIELカテゴリーに再割り当てされた（すなわち。TCRγδ+CD8α+、TCRαβ+CD8α+、TCRαβ+CD8αβ+、およびTCRαβ+CD4+-IELs）であり、Cd177-/-マウスにTCRγδ+CD8α+ IELsが蓄積していることが確認された（図2b）。IELクラスターを重点的に再解析した結果、特異的な遺伝子プロファイルが明らかになり、異なるクラスターの明確な特徴が示唆された。大腸のTCRαβ+CD8α+IELの大部分（補足図S1gおよび図S2b）に関しては、遺伝子発現シグネチャーに従って、さらに4つのサブクラスター（すなわち、C0、C1、C3およびC6）に分類した（補足図S5a、b）。TCRαβ+CD8α+ IEL-1（C0）は、小胞体ストレスに応答する内在性アポトーシスシグナル伝達経路（例えば、Cebpb）、細胞内シグナル伝達（例えば、Irak2）、転写の制御（例えば、Tcf7、Ifnar1）に関連する遺伝子を選択的に発現していることがわかった。TCRαβ+CD8α+ IEL-2（C1）と小クラスター（TCRαβ+CD8α+ IEL-4、C6）は、Mcm2、Mcm5、Cdx4、Lgals3、Cldn7などの細胞のアポトーシスや増殖に関わる遺伝子を共通して発現していることが確認された。興味深いことに、TCRαβ+CD8α+IEL-3（C3）ではNfkbid、Klf6、Smad4が高発現しており、T細胞受容体シグナルやサイトカインを介したシグナル伝達との関連性が示唆された。

図2. TCRγδ+CD8αα+IELにおける遺伝子発現シグネチャーから、炎症性パターンと微生物叢への過敏な反応が特定された。CD45+免疫磁気ビーズソーティングにより、DSS処理Cd177-/-マウスおよびWT同腹子の結腸の粘膜上皮から合計14,301個の単一細胞を分離した（各群n = 3）。(a) IELサブクラスターの教師なしt-SNE解析。(b）DSS処理Cd177-/-マウスおよびWT同腹子からのIELサブクラスターの教師なしt-SNE分析。(c）TCRγδ+CD8αα+-IELの同定（C2）。(d) TCRγδ+CD8α+-IELsからのアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた差次発現遺伝子のGene Ontology (GO) 解析。(e) 各クラスタにおける選択された遺伝子の発現を、各クラスタにおける各遺伝子の平均発現で色分けし、全クラスタに渡ってスケーリングしたドットプロット。赤丸はCd177-/-マウス、青丸はWTマウスをそれぞれ表す。色の濃さは遺伝子発現のレベルを示す。ドットの大きさは、各クラスタにおけるそれぞれの遺伝子を発現している細胞の割合を示している。

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注目すべきは、ユニークなマーカー遺伝子発現（例えば、Trgc1、Trdc、Cd8a）によって、C2をTCRγδ+CD8α+ IELとして同定したことである（図2c）。TCRγδ+CD8αα+IELの転写シグネチャーは、炎症反応、自然免疫反応の活性化、好中球走化性、パイロプトーシスに関連する遺伝子が有意に濃縮し、T細胞の恒常性の調節に関わる遺伝子のダウンレギュレーションを伴っていることが示された。このことは、Cd177-/-マウスの粘膜炎症の悪化とTCRγδ+CD8α+IELsの割合の増加と一致していた（図2d）。DEG解析の結果、炎症性メディエーターをコードする遺伝子（Gzma、Gzmb、S100a8、S100a9、Fasl、Klrb1bなど）が高発現し、TCRγδ+CD8α+IELに深い細胞障害性と抗菌性が付与されていることが明らかになった（図2e）。したがって、これらのデータは、好中球の機能不全が、腸管粘膜のホメオスタシスや微生物の異常繁殖を伴う腸管炎症中のTCRγδ+CD8α+IELの機能変化の引き金になることを証明した。

好中球減少時のTCRγδ+CD8α+ IELの変化に微生物叢が関連しているかどうかを評価するため、TCRγδ+CD8α+ IELの微生物応答に関連するscRNA-seqデータを解析した。その結果、大腸菌Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+ IELにおいて、上皮細胞への細菌侵入に優先的に関与する明確な遺伝子発現プロファイルを観察した（Rhog、Arpc1aなど74遺伝子、Pik3c1, Rac1, Pik3cb, Arpc2 など 74 遺伝子）、グラム陰性菌に対する防御反応（Lypd8, Gsdmd, Naip5 など 122 遺伝子）、細菌に対する反応（Mlh1, Acod1, Saa3, Slfn4, Saa1, Trf など 257 遺伝子）などに優先的に関与していた（図 2d,e）。*2. これらの知見は、微生物応答の変化が、大腸菌Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+IEL活性化や粘膜炎症の増悪に寄与している可能性を示唆している。

TCRγδ+CD8α+IELの拡大に寄与する微生物叢のディスバイオーシス
そこで、好中球が減少した大腸炎時に、腸内細菌叢がTCRγδ+CD8α+IELsを制御しているかどうかを検討した。DSS投与期間中の0日目と10日目のCd177-/-マウスとWTマウスの糞便中の微生物組成を分析したところ、Cd177-/-マウスの糞便中の微生物組成は、Cd177-/-マウスとWTマウスの糞便中の微生物組成とほぼ同じであった。図3aは、16S rDNA遺伝子アンプリコンシークエンスによって捉えられた大腸菌Cd177-/-マウスおよびWT同腹子のそれぞれの固有の細菌スペクトルを示している。主座標分析（PCoA）の結果を比較するためにβ多様性分析を行ったところ、WT同腹子と比較して大腸Cd177-/-マウスに異質性が認められた（図3b）。門と属の両カテゴリーで細菌の成分比が異なり、多様性が低下していることから、大腸菌Cd177-/-マウスの腸内細菌叢のディスバイオーシスが示唆された（図3c、d）。さらに、マイクロバイオーム組成の解析により、保護的な細菌（例えば、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Rikenella、Roseburia）が大幅に減少していた24-27が、炎症性細菌（例えば、, の相対的な存在量は、WT同腹子よりも減少した（図3e、f）28-31。

図3. DSS誘発大腸菌Cd177-/-マウスにおける微生物ディスバイオーシス。(a) DSS投与前および投与後のCd177-/-マウスとWTマウスにおける微生物相のOTUの差違。(b) Cd177-/-およびWTマウス糞便中のDSS曝露前後の細菌群集（16S rRNA遺伝子アンプリコン）のPCoAプロット（各群n = 3）。(c, d) 動物門レベル（c）および属レベル（d）で示されたグループの細菌多様性の相対的存在量。(e) DSS曝露後のCd177-/-マウスの糞便中のアップレギュレーションされた細菌。(f) DSS曝露後のCd177-/-マウスの糞便中の細菌が減少している。*p < .05; **p < .01; ***p < .001; and ****p < .0001.

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TCRγδ+CD8α+IELsの好中球制御における腸内細菌叢の変化の役割を明らかにするために、Cd177-/-マウスとWT同腹子の間の細菌成分の分岐をなくすために抗生物質処理および同居処置を行った（補図S6a）。抗生物質カクテル（アンピシリン、メトロニダゾール、ネオマイシン、バンコマイシンを含む）を飲料水で処理すると、DSS曝露後の大腸炎が改善され、軽度の体重減少、組織学的スコアの低下、粘膜バリアの軽度障害、炎症性サイトカインの発現低下（ex.。IL-1β、IL-6、IL-17A、およびIFN-γ）の発現が減少した（補足図S6b-f）。また、抗生物質投与Cd177-/-マウスとWTマウスでは、DSS刺激後のTCRγδ+CD8αα+IELsの頻度に差はなかった（補足図S7a）。さらに、抗生物質処理した大腸菌Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+ IELにおいて、炎症性サイトカイン（例えば、IL-17A、IFN-γ、TNF-α）の発現低下が認められた（補足図 S7b）。一貫して、WT同腹子と同居するCd177-/-マウスも、単独で同居するCd177-/-マウスと比較してDSS曝露後の粘膜炎症の緩和を示し、これは、軽い体重減少および組織学的病変、腸管バリアの障害軽減、ならびに炎症性サイトカイン（例えば、, IL-1β、IL-6、IL-17A、IFN-γ）の発現が低下していた（補足図S6b-f）。また、TCRγδ+CD8αα+IELの頻度には、同飼育のCd177-/-マウスとWT同腹子の間に差はなかった（補足図S7a）。また、抗生物質投与に伴い、Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+ IELは、IL-17A、IFN-γ、TNF-αの発現量が減少した（補足図S7b）。これらの結果から、Cd177-/-マウスの大腸炎時のTCRγδ+CD8α+IELの拡大および機能の調節には、微生物のディスバイオーシスが重要な役割を担っていることが示唆された。

大腸炎Cd177-/-マウスでは微生物叢の代謝物DMFが減少する
腸内細菌叢の代謝産物が免疫調節作用に深く影響することを踏まえ、TCRγδ+CD8α+IELの制御に重要な微生物叢の代謝産物を明らかにするために、Cd177-/-マウスとWT同腹子から集めた糞を黄砂障害前後で非標的メタボローム解析を実施した。その結果、DSS処理後のCd177-/-マウスとWTマウスで29種類、DSS処理前のCd177-/-マウスとWTマウスで117種類、DSS処理前後のWTマウスで219種類、DSS処理前後のCd177-/-マウスで146種類の重複代謝物が見つかった（図4a）。これらのデータは、部分最小二乗法による判別分析 (PLS-DA) でより良く整列し、大腸菌Cd177-/-マウスのメタボロームの著しい不均質性が示されました (図4b)。特定のメタボロームシグネチャーを決定するために、発現量の異なる代謝物をスクリーニングしました（大腸菌Cd177-/-マウスで発現量が増加した代謝物58種類、発現量が減少した代謝物104種類）（図4c）。これらの発現量の異なる代謝物の中から機能解析を行った結果、17種類のアップレギュレーション代謝物（例：14,15-ロイコトリエンE4、トロンボキサンB2、プロスタグランジンD2、α-ピロリジノノナンフェノン、L-フェニルアラニン）は炎症促進性を刻印しており、22種類のダウンレギュレーション代謝物（例：インドール酢酸、キサンタンガム）は炎症促進性のあることが判明しました。インドール酢酸、キサントフモール、3,4-ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、α-ゼアラノール、4-ヒドロキシベンズアルデヒド、アナカルジン酸、1-メチルニコチンアミド、ニコチン酸、シチシン）は免疫調節に関連していた（図4d）。

図4. Cd177-/- マウスにおける糞便メタボロームの変化。DSS処理したCd177-/-マウスとWT同腹子の糞便サンプルを0日目と10日目に採取し、不偏メタボローム解析を行った（各群n = 4）。(a) ベン図は、各群で検出された発現量の異なる代謝物の数を示す。(b）DSS処理したCd177-/-マウスとWT同腹子の偏最小二乗判別分析（PLS-DA）。(c）ボルケーノ図は、DSS処理Cd177-/-マウスとWT同腹子との間で発現量の異なる全ての代謝物を表す。(d）DSS処理Cd177-/-マウス（KO）とWT同腹子との間で発現量の異なる免疫調節代謝産物のヒートマップである。(e）指示群の糞便サンプル中のDMFのレベル。(f）大腸菌Cd177-/-マウスの糞便中のフマル酸産生微生物叢（青）およびフマル酸消費微生物叢（赤）の大腸菌WTマウスと比較したFold変化量。*p < .05.

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シングルセルシーケンスデータからIELの変化とGSDMDによるパイロプトーシスの関連を明らかにした後、微生物メタボロミクスデータから差分代謝物を網羅的に解析し、パイロプトーシスの制御に関連する差分発現代謝物をスクリーニングして、その根本的なメカニズムを明らかにすることを目的としています。これらの代謝物のうち、コハク酸デヒドロゲナーゼという酵素によってコハク酸から変換されるトリカルボン酸（TCA）サイクルの代謝中間体であるフマル酸誘導体のDMFは、大腸菌Cd177-/-マウスの糞便サンプルで顕著に減少していました（図4d、e）。DMF は、好中球、樹状細胞、マクロファージ、NK、B、T 細胞などの様々な免疫細胞に対して幅広い抗炎症作用を示し、すでに多発性硬化症や乾癬の患者の治療に用いられている32。さらに、DMFの投与は、DNBS誘発マウス大腸炎モデルにおける粘膜炎症を緩和することが証明されています34。DMFによるタンパク質サクシネーションは、creaved-gasdermin D (GSDMD) を介したパイロプトシスを抑制します35。大腸炎Cd177-/-マウスの糞便中のDMF濃度が低下したことと一致して、フマル酸産生菌（Akkermansia、Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae、Peptostreptococcusなど）は減少し36,37、フマル酸消費菌（Bacteroides、Clostridium、Acinetobacter、Vibrio、Propionibacterなど）も減少していた。Vibrio, Propionibacterium, Prevotella, Clostridiales, Ruminococcus, Geobacter, Desulfovibrio, Pseudomonas など）が増加した（図 4f）38-44 ことは、これらの Cd177-/- マウスの糞便サンプルにおける DMF の減少は、腸内細菌叢の変化が関与していると示唆された。これらのデータを総合すると、微生物代謝物であるDMFはIELの機能調節や腸管粘膜の恒常性維持に関与しており、DMFの欠乏は腸管粘膜炎症を誘発し、病原性TCRγδ+CD8α+IELの基本的な活性化を誘導する可能性がある、という仮説が導き出された。

DMFの補給はTCRγδ+CD8α+IELのパイロプトーシスを抑制し、腸管粘膜の炎症を改善する
次に、DMFの補充が、結腸原性TCRγδ+CD8α+IELの拡大や腸の炎症を抑制するかどうかを調べた。Cd177-/-およびWTマウスにDMFを経口投与し、DSSで大腸炎を誘発させた（補足図S8a）。DMFの投与は、Cd177-/-マウスの大腸炎発症を大幅に改善し、軽度の体重減少、組織学的損傷の低下、および上皮バリアの完全性の維持を特徴とした（補足図S8bおよび図5a,b）。炎症性サイトカイン（例えば、IL-1β、IL-6、IL-17A、およびTNF-α）は、DMF処理した大腸Cd177-／-マウスの炎症性大腸において、コントロールと比較して減少した（補足図S8c，d）。さらに、DMFの投与は、大腸Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+ IELの拡大、およびTCRγδ+CD8α+ IELの炎症性サイトカインの発現を著しく抑制した（図5c,d）。

図5. DMFの投与は、Cd177-/-マウスのDSS誘発大腸炎を改善する。WTマウス（n = 8）およびCd177-/-マウス（n = 8）に飲料水中の2％DSSにより急性大腸炎を誘発し、10日間の観察期間中、毎日メトセル（MC）またはDMF（100 mg/kg）を経口投与した。(a）10日目にこれらのマウスから結腸組織の代表的なH＆E染色を得た。スケールバー、100μm。組織学的スコアは、示された通りであった。(b）各群におけるFITC-デキストランの血清レベル。(c）10日目の各群の結腸におけるTCRγδ＋CD8αα＋IELのフローサイトメトリー解析。棒グラフは、示されたIELの割合及び絶対数を示した。(d）MCまたはDMFで処理した結腸WTマウスおよびCd177-/-マウスの結腸から分離したIFN-γ-、IL-17A-、TNF-α-およびIL-10-発現TCRγδ+CD8αα+IELs（1群あたりn＝6）の頻度をフローサイトメトリにより評価し、統計表にカウントして示したものである。(e）示した群のフローソーティングされたTCRγδ＋CD8α＋IELにおける全長GSDMDおよびGSDMD-Nを、ウェスタンブロットにより決定した。棒グラフは、GSDMDおよびGSDMD-Nの相対発現量を示した。 f）フローソーティングしたTCRγδ+CD8α+IELにおけるパイロプシス関連サイトカインのmRNAレベル（各群n = 6）。データは3つの独立した実験の代表値である。*p < .05; **p < .01; ***p < .001; and ****p < .0001 and ns, no significant difference.

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GSDMDの発現は、scRNA-seq解析によりIBD患者の炎症粘膜で増加することが示されている45。特に、大腸菌Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+IELにおいて、WTコントロールと比較してGsdmd発現が有意に増加していることが観察された(図2e)。大腸菌Cd177-/-マウスのTCRγδ+CD8α+ IELでは、孔形成性GSDMD-Nが顕著に増加し、IL-1βとIL-18の発現も有意に高かった（図5e、f）ことから、Cd177-/- TCRγδ+CD8α+ IELはパイロプティック細胞死を起こしやすくなっていることが推測された。しかし、DMFの投与は、GSDMD-N、IL-1βおよびIL-18の発現の減少によって証明されるように、TCRγδ+CD8α+IELパイロプトーシスから保護した（図5e,f）。これらの知見と一致して、GSDMD-Nの高レベルは、DSS刺激後のCd177-/-マウスのIECおよび結腸組織でも検出されたが、DMFによって同時にブロックされた（補足図S8f）。これらのデータから、腸内細菌叢における好中球の免疫調節異常による微生物代謝物DMFの減少が、TCRγδ+CD8α+IELの拡大を引き起こすことが示唆された。

考察
腸管内常在のIELとダイナミックに循環する好中球は、早期反応と強力な細胞傷害性により、腸管病原体に対する強力な宿主防御因子である。好中球の不適切な機能状態は、IBDなどの腸管炎症性疾患と関連している9,46。新たな証拠は、逆説的にIBDにおける腸管炎症の悪化と腸粘膜の炎症分解に関連するヤヌス顔性調節因子として、IBDの病因における好中球の重要な役割を立証するものである46。しかし、好中球がIBDの病態においてどのようにIELの機能を制御しているのか、また、大量かつ多様な微生物叢の状況下で好中球がIELを制御する基礎的メカニズムは、まだ十分に定義されていない。私たちの以前の研究では、CD177+好中球が殺菌活性とIL-22産生の増加を通じてIBDを保護する役割を果たすことが示されました。4 しかし、大腸炎Cd177-/-マウスとWT同腹子の間で大腸からのIL-22レベルに有意差が認められなかったことから、IL-22がIELの活性化と拡大に影響を与えていないと推定されました。本研究により、好中球が腸内細菌叢とその代謝物であるDMFを調節することでIELの機能を制御し、大腸原性TCRγδ+CD8α+IELの拡大を制御する未知のメカニズムが明らかとなった。TCRγδ+CD8αα+IELは、腸管炎症時にGSDMDを介したパイロプトーシスが増加するという包括的な統合特徴を持つ炎症性機能異質性である。抗菌ペプチド（例：s100a8、s100a9、Reg3b）の増加とともに、防御反応関連遺伝子（例：, Gzma, Gzmb, Klrb1b, Faslなど）が増加し、TCRγδ+CD8αα+IELは適切な活性化状態では殺菌力や免疫調節力を発揮するが、過剰活性化すると粘膜恒常性の低下や炎症反応の悪化を招き、腸粘膜の組織障害が重篤化することが分かっている。

腸内細菌叢は、TCRγδ+-IELの活性化およびサイトカイン相互作用に関連し、IELコンパートメントの形成に重要であることが分かっている47。本研究により、好中球の制御下で微生物の恒常性が保たれると、TCRγδ+CD8α+IELの防御特性と病原特性の微妙なバランスが微調整できることが示され、微生物の代謝物、特にDMFの減少の変化を介して好中球がIEL免疫反応を調節する方法の新知見を提供できることが判明した。また、Cd177-/-マウスにDMFを添加すると、実験的大腸炎が明らかに緩和され、TCRγδ+CD8α+IELの過剰活性化が抑制された。さらに、好中球の欠失は腸内細菌叢の異常につながり、侵入した微生物叢の過剰増殖は、バリアを越えて上皮細胞や免疫細胞と直接接触し、TCRγδ+CD8α+IELsを活性化する可能性もある。より広い観点からは、DMFはIEC、さらには腸組織全体のパイロプトーシスを防ぐことができ、これは腸組織内の免疫細胞に対する免疫調節作用のみに限定されない34。腸の恒常性維持には複数の免疫細胞の相乗効果が必要であることから、IECとIELの相互作用も腸粘膜における免疫恒常性と炎症反応の維持に重要な役割を果たすと考えられる。したがって、これらの知見は、腸の炎症を制御し、腸管免疫の恒常性を維持する上で、DMFが重要な役割を担っていることを物語っている。現在、FDAはDMF（例：Tecfidera）を多発性硬化症や乾癬の治療に承認しているが、DMFはリンパ球減少を誘発し、リンパ球の解糖を制限する可能性もある48。したがって、IBD患者の治療における有効性と副作用を評価するためにDMFの臨床試験が必要であろう。しかし、中国ではまだDMFは販売されておらず、今後、IBDにおけるDMFの臨床試験を実施する機会があることを期待しています。

好中球による外来病原体に対する迅速かつ効果的な反応が失われた現在、腸内に侵入した病原体に対する早期防御には、腸管免疫の自然免疫細胞の活躍が必要とされています。粘液、免疫細胞、共生細菌叢が相互に作用する複雑で繊細な腸管免疫ネットワークにおいて、微生物叢が代謝産物を介して免疫細胞を制御する方法は画期的なものである。好中球減少症で発熱、感染症、下痢、消化管粘膜の恒常性低下などの合併症を起こす患者が多いことを踏まえ、好中球がない場合の免疫反応と自己制御システムの理解を深めることが必要である。腸管免疫病患者の場合、腹痛、下痢、血便はQOLを著しく低下させる。したがって、好中球減少の発症時に腸管免疫を把握し、改善することが重要であると考えられています。腸管免疫系の最初の防御線であるIELも、好中球減少の過程で影響を受け、変化することが分かっている。我々は、微生物代謝産物由来のDMFがIELを制御することを見出し、腸管免疫の恒常性維持のための新たな手がかりを提供した。本研究は、全身性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデスなど）、消化管の免疫関連疾患、免疫抑制剤（アザチオプリンなど）を投与されている患者における好中球減少症に対する有望な治療法を探る上で、何らかの光明を見出したと言える。したがって、腸内細菌叢由来の代謝物を回復させる、あるいはTCRγδ+CD8αα+IELの過剰活性化を制限する、このような戦略は、先進的な治療の可能性を提供することになる。

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謝辞
IBD研究センターの皆様には、本原稿についてご教示いただくとともに、ご批判をいただきました。

情報開示
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

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本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2172668 からオンラインでアクセスできます。

データの利用可能性に関する声明
この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文および/または補足資料に含まれている。また、オリジナルのデータセットも、ご要望に応じて対応する著者から入手可能です。

追加情報
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金会（91942312, 81630017）の助成を受けた。
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