細菌はユビキチン様タンパク質と結合し、ファージの集合を妨害する

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  • 公開日： 2024年7月17日

細菌はユビキチン様タンパク質と結合し、ファージの集合を妨害する



ネイチャー誌631巻850-856ページ（2024年）この記事を引用する

概要

ヒトのいくつかの免疫経路は、抗ウイルス防御の手段として、ユビキチン様タンパク質をウイルスや宿主分子に結合させている1,2,3,4,5。我々は、ユビキチン様タンパク質、ユビキチン結合酵素E1およびE2、脱ユビキチナーゼからなる細菌の抗ファージ防御系について研究した。我々は、ファージ感染中、このシステムがユビキチン様タンパク質をファージ中心尾部繊維に特異的に結合させることを明らかにした。このタンパク質は尾部の先端にあり、尾部の集合と標的宿主レセプターの認識に必須である。感染後、この防御システムをコードする細胞は、部分的に集合した尾のないファージ粒子と、完全に集合したファージの混合物を放出するが、その際、尾の中心線維は共有結合したユビキチン様タンパク質によって阻害される。これらのファージは感染性が著しく損なわれており、防御システムがどのようにしてファージ感染の拡大から細菌集団を守っているかを説明している。我々の発見は、ユビキチン様タンパク質の結合が、生命樹全体で保存されている抗ウイルス戦略であることを示している。

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データの利用可能性

質量分析プロテオミクスデータは、PRIDEパートナーリポジトリ61を利用してProteomeXchange Consortiumにデータセット識別子PXD044622で寄託されている。RNA-seqデータはNCBIのGene ExpressionOmnibus62に寄託されており、Gene Expression Omnibusシリーズのアクセッション番号GSE262579からアクセスできる。使用したコンストラクトのプラスミドインサートは、補足表5に掲載されている。すべての図のゲルとブロットの切り抜きなし画像を補足図1に示す。ソースデータは本論文に添付されている。

参考文献

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謝辞

本論文の以前のバージョンについてコメントをくれたSorek研究室のメンバーに感謝する。ワイツマン研究所De Botton Protein Profiling InstituteのA. SavidorとM. Kupervaser、およびRudolf Virchow CenterのS. Lamerには質量分析データの作成と解析を手伝ってもらった。E. Katzowitzschによる技術サポートとRNA-seqデータ作成については、ヴュルツブルク大学のCore Unit SysMedに感謝する。この研究は、Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Würzburg（プロジェクト番号Z-6）の一部支援を受けた。また、困難な時期に助けてくれたJ. VogelとHelmholtz Institute for RNA-based Infection Researchに感謝する。J.H.はDeutsche Forschungsgemeinschaft（DFG、ドイツ研究財団）の助成金（助成番号466645764）およびCouncil for Higher Education and Israel Academy of Science and Humanities (CHE/IASH)のExcellence Fellowship Program for International Postdoctoral Researchersの助成を受けた。R.S.は、European Research Council（助成金番号ERC-AdG GA 101018520）、イスラエル科学財団（MAPATS助成金番号2720/22）、Deutsche Forschungsgemeinschaft（SPP 2330、助成金番号464312965）、Ernest and Bonnie Beutler Research Program of Excellence in Genomic Medicine、Dr. Barry Sherman Institute for Medicinal Chemistry、M. de Botton、Andre Deloro Prize、Knell Family Center for Microbiologyから一部支援を受けた。

著者情報

著者ノート

  1. イェンス・ヘア
    現職： ヘルムホルツRNAベース感染研究所（HIRI）、ヘルムホルツ感染研究センター（HZI）、ヴュルツブルク、ドイツ

著者および所属

  1. イスラエル、レホボット、ワイツマン科学研究所、分子遺伝学部門
    イェンス・ヘア＆ロテム・ソレク

  2. ワイツマン科学研究所化学研究支援部、レホボット、イスラエル
    シャロン・G・ウルフ

貢献

J.H.とR.S.は本研究の構想および設計を行った。J.H.は実験を行った。S.G.W.は電子顕微鏡観察を行った。J.H.とR.S.がデータを解析した。J.H.はデータを可視化した。R.S.は研究資金を獲得した。J.H.とR.S.は原稿を執筆した。著者全員が原稿を確認・編集し、結論を支持した。

責任著者

Rotem Sorekまで。

倫理申告

競合利益

R.S.はBiomXとEcophageの共同設立者であり、顧問である。その他の著者は、競合する利益はないと宣言している。

査読

査読情報

本論文の査読にご協力いただいたEdze Westra氏と他の匿名の査読者に感謝する。

その他の情報

出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

図表

Extended Data 図1 Bil UblとE1/E2酵素の相互作用。

a, ヒトユビキチンと5つのBilA Ublホモログの多重配列アラインメント。太字と黄色でハイライトされた残基は、0.7以上のグローバル類似性スコアを持っている。太字と赤でハイライトした残基は完全に保存されている。ESPript56を用いて可視化した。b, 図1dに示したプラークアッセイのPFU定量。Ubl G163L変異体を除くデータは13. c,Ubl結合経路の酵素反応。E1タンパク質の活性部位システインはUblのC末端グリシンとチオエステルを形成し、それがE2の活性部位システインに移動して別のチオエステルを形成する。その後、E2はUblを標的タンパク質のリジン残基に転移する。脱ユビキチン化酵素(DUB)は、標的タンパク質からUblを切り離すことにより、結合を逆転させることができる。d, タグの付いたE1を持つBilシステムを発現する細菌の全細胞溶解液のウェスタンブロット。E1の2つのバンドが見られる。上の〜70 kDaのバンドはDTTによって減少し、E1とUblの間のチオエステル結合を示している。同じブロットでGroELをローディングコントロールとして用いた。OD600が0.8の細胞をファージSECphi27で感染させた。e,Ubl免疫沈降実験で観察された〜70kDaのバンドの質量分析では、Ubl〜E1複合体が含まれていることが確認された（図1eに関連）。検出された各タンパク質について、野生型Bil系と変異型Bil系から得られたラベルフリー定量（LFQ）強度値の合計のlog10を、Bil系のLFQ強度対変異型Bil系のLFQ強度のlog2比に対してプロットした。f, UblとE1間の相互作用のAlphaFold-Multimer19予測。信頼度の高い構造（モデル信頼度0.94、全体的に低い予測アラインメント誤差、パネルの右側）は、UblのG163（球で示す）がE1のヌクレオチド結合ループ（G217、G219、G222；球で示す）に位置することを示している。g, Ubl免疫沈降実験で観察された〜50 kDaのバンドの質量分析により、E1タンパク質が確認された（図1eに関連）。h,タグ付きE2を持つBil系を発現する細菌の全細胞溶解液のウェスタンブロット。E2の共有結合複合体は観察されなかった。同じブロットでGroELをローディングコントロールとして用いた。OD600が0.8の細胞はファージSECphi27に感染している。i,Ubl免疫沈降実験（図1eに関連）で観察された約80kDaのバンドの質量分析。MaeBはこのバンドで同定されるが、MaeBの分子量は82 kDaであるため、非特異的に引き下げられ、Ublに結合していない可能性が高い。

出典データ

Extended Data 図2 Bilシステムは、生理的条件に適した発現レベルでの防御を提供する。

a, テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で、p15Aオリジンを持つプラスミドからBilシステムを発現する大腸菌（細胞あたり推定〜10コピー）に感染した異なるファージのPFU定量。4つの異なる濃度のインデューサー（アンヒドロテトラサイクリン、aTc）を用いた。b,25ng/mlのaTcを用いて発現誘導したBil発現大腸菌のRNA配列決定データ（aを参照）。データは、3つの生物学的複製における10以上の平均生リードを持つ各遺伝子のキロベース百万あたりの平均対数2転写産物（TPM）を示し、それらの対数2 TPM値でソートされている。青はプラスミドにコードされたBil系転写産物（bilA、bilB、bilC、bilD）、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（kanR）。緑色は、DefenseFinder60を用いて予測された大腸菌MG1655の染色体にコードされた防御系： RMタイプI（hsdM、hsdR、hsdS）、RMタイプIV（mcrA、mcrB、mcrC、mrr）、Lit（lit）、RnlAB（rnlA、rnlB）、Hachiman（abpA、abpB）、DruantiaタイプIII（yjiT）。CRISPR遺伝子はわかりやすくするために示していない。c,Caulobacter sp. Root343の指示された成長段階におけるRNA配列決定データ。データは、3生物学的複製における10以上の平均生リードを持つ各遺伝子の平均対数2転写産物/キロベースミリオン（TPM）を、対数2 TPM値でソートして示す。水色は、DefenseFinder60を用いて予測されたCaulobacter sp. Root343の染色体にコードされた防御システム：Bilシステム（bilA、bilB、bilC、bilD）、RMタイプII（MTase、REase）、SanaTA（sanaA、sanaT）、RosmerTA（rmrA、rmrT）、AbiZ（abiZ）。

出典データ

Extended Data 図3 ファージの粒子径測定。

a-d,ナノ粒子追跡分析により測定した、示した系を発現する細菌から単離したファージの粒子径分布。棒グラフは3生物学的複製の平均。各グラフの破線部分は、各グラフの右側に拡大表示されている。e,a -dに示した粒度分布の重ね描き。

出典データ

Extended Data 図4 ファージ中央尾部繊維はBilシステムの標的である。

a, BilシステムのUblにHAタグを付加してもファージの防御を妨げないことを示すプラークアッセイ。b, Bilシステムを発現しているバクテリアから単離したSECphi27からHAタグを付加したUblタンパク質を免疫沈降し、ウェスタンブロッティングで解析した。CsCl勾配の低密度バンドと高密度バンドからのファージを別々に免疫沈降させた。c, ウェスタンブロッティングで検出されたCTFの総量に対するUbl結合CTFの割合の定量化（図3cに関連）。棒グラフは、個々のデータポイントを重ねた3生物学的複製の平均を表す。

出典データ

Extended Data 図5 Bilシステムはファージ尾部の先端を修飾する。

HA-Ubl Bilシステムを発現するバクテリアから単離したSECphi27ファージの免疫金標識透過電子顕微鏡像（Fig.） 白矢印はHA-Ublの金標識。スケールバーは50 nmを表す。

Extended Data Fig. 6 中央尾部繊維はBilシステムが標的とする保存された構造である。

a, 変異型HA-Ubl Bilシステムを発現する細菌から単離したSECphi27ファージの代表的免疫金標識透過電子顕微鏡像。ファージに金標識は観察されなかった。スケールバーは100 nmを表す。b, 野生型または変異型Bilシステム上で増殖させたファージを用いた感染中心アッセイの効率。野生型大腸菌細胞をMOI = 1で感染させ（ファージ粒子の数はNTAで測定）、30分間吸着させた。洗浄後、ファージを吸着した細菌を連続希釈し、野生型大腸菌の芝生上に滴下した。翌日、感染中心をカウントした。棒グラフは4生物学的反復の平均を表し、個々のデータ点はオーバーレイされている。

出典データ

Extended Data 図7 中央尾部線維はBilシステムによって標的とされる保存構造である。

a,SECphi4に対するBil系の防御表現型を示すプラークアッセイ。データは3つの生物学的反復の代表値であり、3つの反復の定量を右側に示す（定量データは13から引用）。同じブロットでGroELをローディングコントロールとして用いた。c, SECphi27(NCBI ID: YP_009965952.1)とSECphi4(NCBI ID: QJI52569.1)の中心尾部線維の構造のAlphaFold216による予測。SECphi4中央テールファイバーの予測構造を、以下のドメインを用いてSECphi27中央テールファイバーに重ね合わせた： 残基 1-251（RMSD=0.91Å）、残基 252-628（RMSD=1.30Å）、残基 629-736（RMSD=1.11Å）、残基 737-829（RMSD=1.10Å）、残基 830-1139（RMSD=2.69Å）。

ソースデータ

Extended Data 図8 異なるファージの尾部構造タンパク質は構造的に類似したドメインを含む。

a, T5 pb3の低温電子顕微鏡構造（PDB:7ZQB31; RMSD = 2.01 Å）に重ねたSECphi27中央尾部線維の残基250-614のAlphaFold 216予測（Extended Data Fig. 7c)をT4 gp27の結晶構造(PDB:1K2863; RMSD = 3.64Å)に重ねた。d)SECphi27の中央テールファイバー(CTF)、T6のベースプレートハブタンパク質gp27、T6の大遠位テールファイバーサブユニットタンパク質gp37、またはT6のベースプレートウェッジサブユニットgp7のいずれかとBil系を共発現させ、ウェスタンブロットで解析した。同じブロットでGroELをローディングコントロールとして用いた。つの生物学的複製の代表的な画像を示す。

Extended Data 図9 DUBはBilシステムの機能に必須であり、Ubl融合タンパク質を切断することができる。

a, Bilシステム変異体とUbl、変異UblまたはRFPコントロールを共発現する大腸菌細胞に感染した異なるファージのPFU定量。b,Ubl-GFP融合タンパク質とBil系のDUBを共発現している細菌の全細胞溶解液のウェスタンブロット。GFPはDUBによってUbl-GFP融合タンパク質から切断される。GroELは同じブロットのローディングコントロールとして使用した。c,発現誘導剤を添加しない場合（左）と添加した場合（右）のBil系変異体を発現する大腸菌の成長曲線。DUB E32*変異体は、DUBタンパク質の32位のアミノ酸を停止コドンに置き換えた一塩基変異体である。データは3生物学的複製の平均。エラーバーは平均とs.d.を示す。

出典データ

補足情報

補足図1

メインデータおよびExtended Dataの図から切り出したゲルとイムノブロットの画像。メインおよびExtended Dataの各図に示されている各ゲルまたはイムノブロット画像について、トリミング前の画像を示す。イムノブロット画像については、左側に膜に転写された分子量マーカーを可視化するための通常の写真を示す。右側には対応するイムノブロットを示し、使用した一次抗体を示し、切り取った領域を破線で示した。すべての画像について、使用した分子量マーカーのサイズが示されている。

報告概要

補足表1

SECphi27免疫沈降の質量分析解析。

補足表2

SECphi4免疫沈降の質量分析。

補足表 3

SECphi27とSECphi4のプロテオーム比較。

補足表 4

本研究で使用した細菌株とファージ。

補足表 5

本研究で使用したプラスミド。

補足表6

BilA Ublホモログ。

補足表7

本研究で使用したプライマー。

ソースデータ

ソースデータ Fig.

ソースデータ Fig.

ソースデータ Fig.

ソースデータ 拡張データ Fig.

ソースデータ 拡張データ 図2

ソースデータ拡張データ Fig.

ソースデータ拡張データ Fig.

ソースデータ拡張データ Fig.

ソースデータ拡張データ Fig.

ソースデータ拡張データ 図9

権利と許諾

シュプリンガー・ネイチャー社またはそのライセンサー（学会やその他のパートナーなど）は、著者またはその他の権利者との出版契約に基づき、本論文の独占的権利を保有している。

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引用

Hör, J., Wolf, S.G. & Sorek, R. 細菌はユビキチン様タンパク質と結合し、ファージの集合を妨害する。Nature 631, 850-856 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07616-5

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  • 2023年8月24日受領

  • 受理2024年5月28日

  • 2024年7月17日発行

  • 発行日2024年7月25日

  • DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07616-5

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ネイチャー (Nature)ISSN 1476-4687 (online) ISSN 0028-0836 (print)

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