難消化性スタキオースは小腸上皮の膜型HSP90βと結合し、エクソソームmiRNAを制御する： 新たな機能とメカニズム
論文オンライン公開中2024年11月18日オープンアクセス
難消化性スタキオースは小腸上皮の膜型HSP90βと結合し、エクソソームmiRNAを制御する： 新たな機能とメカニズム
Ting Li1,5,6 tingli@snnu.edu.cn∙Yueyue Liu1,5∙Tianchi Duan1,5∙ ... ∙Lin Shi1∙Honglei Tian1∙Xingbin Yang1xbyang@snnu.edu.cn... Show more
ハイライト
難消化性スタキオースは、小型IECの膜性HSP90βと直接相互作用する。
SP90βノックアウトにより、スタキオースによる腸管外分泌miRNAの制御が阻害される
スタキオースによって変化した腸内miRNAは大腸内腔に放出され、腸内細菌叢を形成する。
タキオースにより制御されたmiR-30a-5pはラクトバチルス・ロイテリの増殖を抑制する
概要
リゴ糖は従来、小腸における「通過者」として認識されてきた。しかし、我々の研究は、小腸上皮細胞上の膜性HSP90βの疎水性残基と結合し、エクソソームmiRNAプロファイルを再プログラムするオリゴ糖スタキオースの新たな機能を明らかにすることで、この理解を覆した。RISPR-Cas9を介したHSP90βノックアウトにより、スタキオースの細胞膜への蓄積と、これらのmiRNAに対する制御作用が消失した。このことは、偽生殖細胞を持たないマウスにおいて、スタキオースによって変化した糞便中のmiRNAが観察されたことからも明らかである。これらのスタキオースが変化したmiRNAは、さらに大腸マイクロバイオームを形成し、特にマウスでは乳酸菌を保有していた。その結果、スタキオース処理後のマウスとヒトの糞便の両方で、miR-30a-5pがダウンレギュレート（Log2FC < -2）され、ラクトバチルス・ロイテリの増殖を特異的に抑制することがわかった。これらの知見は、スタキオース-腸内miRNA-腸内細菌叢という新たな制御軸を構築し、膜性HSP90βを介してオリゴ糖が腸上皮と直接「会話」する、これまで知られていなかったメカニズムを明らかにした。
要旨
キーワード
はじめに
機能性オリゴ糖（FOs）は2〜10個の単糖からなる低分子糖質である。ヒトの消化酵素による加水分解を受けにくい単糖の結合型（α-1,6-グリコシド結合など）を含むため、FOは長い間、上部消化管（GI）を通過して直接遠位結腸に到達し、乳酸菌や ビフィズス菌などのプロバイオティクスによって発酵される難消化性であると考えられてきた1,2,3。伝統的なプレバイオティクスの役割を持つFOは、小腸との相互作用がないことはよく知られている。しかし、いくつかの先行研究では、フラクトオリゴ糖、イヌリン、ガラクトオリゴ糖、ヤギ乳オリゴ糖などのFOが腸管上皮細胞（IEC）に直接作用して腸管バリアを改善し、免疫応答を刺激する可能性があることが示されている4,5,6,7,8。2分子のα-ガラクトースがα-1,6-グリコシド結合を介してスクロースのグルコース側に結合した構造のタキオースは、野菜、豆類、植物に天然に豊富に含まれる四糖類である。今回我々は、スタキオースが小型IECのいくつかの主要な膜タンパク質と結合し、小型IECから分泌されるエクソソームのmiRNAプロファイルを変化させることを予想外に発見した。
エクソソームは、様々な種類の生きた細胞から放出されるナノサイズの微小小胞で、タンパク質、脂質、mRNA、miRNAなどの積荷を運んでいる。iRNAは、標的mRNAの3′UTRと相補的に対合することで、mRNAの発現や翻訳を抑制する低分子ノンコーディングRNAの一種である13。特にLiuらは、糞便中に宿主由来および腸内細菌由来のエクソソームmiRNAが存在し、それらの宿主由来エクソソームmiRNAは主にIECsおよびHopx陽性細胞由来であることを明らかにしている15。さらに、これらの宿主由来の糞便中miRNAは、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）や大腸菌（Escherichia coli）の重要な遺伝子の発現を直接標的にして、その増殖に影響を与えることができ、宿主が糞便中miRNAを介して腸内細菌叢を操作する選択的制御方法を照明している。また、多発性硬化症患者の糞便中に多く含まれるmiR-30dを経口投与すると、アッケマンシア・ムチニフィラのβ-ガラクトシダーゼの発現が促進され、その後、その増殖が促進される16。デキストラン硫酸ナトリウムチャレンジで回復したマウスの糞便中miR-142a-3pは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lr）の増殖を刺激することにより、大腸炎を予防する17。
これらの知見から、我々は、（1）難消化性スタキオースが小型IECから放出されるエクソソームmiRNAのプロフィールをどのように変化させるのか、（2）これらのスタキオースによって変化したエクソソームmiRNAが腸内細菌叢を形成するのか、についてさらに深く調べることになった。すなわち、スタキオースは、エクソソームの分泌と組成の重要な制御因子である膜タンパク質HSP90βと直接結合し、小型IECが放出するエクソソームmiRNAを制御する。これらのスタキオースによって変化した腸内miRNAは、さらに腸内細菌叢を形成し、特に乳酸菌を豊富にする。興味深いことに、スタキオース改変糞便miRNAによって形成された腸内細菌叢が、乳酸菌の増殖を相互に阻害するという負のフィードバックループに到達した。この発見は、スタキオース-腸内miRNA-腸内微生物の制御回路を提起し、オリゴ糖が腸上皮とどのようにコミュニケーションし、腸内細菌と宿主のクロストークを制御するのか、その分子メカニズムを探る道を開くものである。
結果
タキオースは小型IECの膜性HSP90βと直接相互作用する
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）アッセイをMODE-K細胞（正常マウス小型IECの表現型および機能的特性を示す細胞タイプ）とRAW264.7マクロファージで行うことにより、スタキオースの難消化性を検証した（図S1A）。MODE-K細胞へのスタキオース処理の時間や濃度にかかわらず、細胞質中のスタキオース含量はほぼ一定で、0.3μg/mLを下回った（図S1A）。では、スタキオースのようなFOはIECにどのように作用するのだろうか？スタキオースは小型IECの膜上に蓄積するのだろうか？そこで次に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識スタキオースの局在を、MODE-K細胞とC57BL/6マウスの両方で検出した。共焦点顕微鏡で観察したところ、スタキオースは明らかに腸管細胞の膜上に集積していた。このことは、FITC-スタキオースで処理した後のMODE-K細胞およびマウスの小腸組織では、FITCとは対照的に蛍光強度がはるかに強いことからも明らかである（p< 0.05、図1A）。MODE-K細胞の膜外縁の蛍光シグナルは4時間保持された（図S1B）。in vitroの結果と一致して、スタキオースもC57BL/6マウスの小型IECの膜上に集まった（図S1C）。コントロールとして、FITC標識マルトヘキサオースはMODE-K細胞の膜上に蓄積しなかった（図S1D）。このことから、スタキオースが小型IECの膜と直接相互作用することは、スタキオースが健康効果を発揮する新たな方法である可能性が推測される。
図1 スタキオースはマウス小腸上皮細胞の膜に存在するHSP90βと直接相互作用する。
スタキオースが細胞膜上の主要タンパク質と相互作用できるかどうかをさらに調べるため、MODE-K細胞から膜タンパク質を単離し、ビオチン-スタキオースを用いたアフィニティープルダウンアッセイを行い、スタキオースの潜在的標的タンパク質を濃縮した。その結果、スタキオースは、ビメンチン（スコア＝59.85）、熱ショックタンパク質（HSP）90β（スコア＝33.14）、熱ショックコグネイト（スコア＝28.87）など、特定の同定タンパク質と結合能を示した（図1 B；Table S1 ）。SP90βは細胞外小胞（EV）の細胞内放出に重要な調節因子であり、ウェスタンブロッティングアッセイによりスタキオース結合膜タンパク質の一つであることが確認された（図1B）。分子ドッキングは、受容体タンパク質に対するリガンドの結合親和性や結合配向を予測するために広く用いられている計算技術である。Autodock Vinaを使用したところ、スタキオースとHSP90βの直接的な結合相互作用が観察されたが、結合ドメインを持たないビメンチンはスタキオースとの相互作用を示さなかった。特に、スタキオースはHSP90βタンパク質（PDB:1UYM ）の疎水性ポケットにフィットし、TYR-139とASN-51残基と水素結合を形成し、自由結合エネルギーは-7.34 kcal/molであった（図1C）。次に、ドッキング解析から得られたHSP90β-スタキオース複合体の最良のコンフォメーションを、分子動力学シミュレーションの初期コンフォメーションとして設定した。その結果、背骨の二乗平均平方根偏差は、受容体HSP90βでは0.484Åから2.792Å、リガンドであるスタキオースでは0.110Åから1.867Åの範囲で変動し（図1D）、HSP90β-スタキオース複合体の安定性が高いことが示された。従って、スタキオースはマウス小型IEC上の膜に位置するHSP90βと直接結合することができる。
タキオースは膜に存在するHSP90βと相互作用することで、MODE-K細胞から放出されたエクソソームのmiRNAプロファイルを変化させる
HSP90が多胞体と細胞膜の融合を促進し、エクソソームの放出と組成に影響を与えることが知られている19,20ことを考慮し、次にMODE-K細胞から分泌されるエクソソーム（MODE-K Exos）の量に対するスタキオースの影響を評価した。まず、超遠心分離を行って、MODE-K細胞からEVを分離した（図S2A）。このEVは、スタキオースを2 mMまたは4 mMの非細胞毒性用量で48時間処理したものである。透過型電子顕微鏡（TEM）とナノ粒子追跡分析（NTA）により、単離された粒子は直径40～150 nmのエクソソーム様小胞であることが明らかになった（図2A、2B、S2B）。エクソソーム特異的タンパク質マーカーであるCD63およびTSG101のウエスタンブロット分析により、MODE-Kエクソソームの単離が成功したことがさらに確認された（図2C）。総タンパク質量として定量すると、MODE-Kエクソソームの量はスタキオース処理に応答して有意差を示さなかった（図S2C）。
図2 MODE-K細胞におけるHSP90βのノックアウトは、細胞膜へのスタキオースの蓄積を排除し、エクソソームmiRNA発現に対するスタキオースの制御効果を排除した。
次に、スタキオースがMODE-Kエクソソームの組成を変化させるかどうかを検討した。エクソソーム中の様々な活性成分の中で、miRNAは新しいタイプの細胞間メッセンジャーとして機能し、異なる生理的条件下で異なる発現を示す。MODE-K ExosにおけるmiRNAの発現プロファイルを特徴付けるために、小分子RNA配列決定を行ったところ、miRNAプロファイルはスタキオースによって用量依存的に変化することが判明した（図2Dおよび2E）。スタキオースによって制御される可能性のある候補miRNAの同定を最大化するため、最初の幅広いスクリーニング段階では、比較的緩やかなスクリーニング基準（｜Log2Fold Change (FC)｜>1,p< 0.1）を採用した。ボルケーノプロットに描かれているように、有意に変化したmiRNAのほとんどはダウンレギュレートされていた（図2E）。検出された304個のマウスmiRNAをすべて解析したところ、相対発現量＞203.3（全miRNAの平均相対発現量）の56個の高発現miRNAが観察され、MODE-K Exos中のmiRNA全体の87.34％を占めた（図2F）。これらのうち、15個のmiRNA（miR-21a-3p、miR-186-5p、miR-199b-5pなど）がアップレギュレートされ、26個のmiRNA（miR-30a-5p、miR-191-5p、miR-181a-5pなど）がダウンレギュレートされた（図S2D）。
続いて、スタキオースを介したMODE-K ExosのmiRNAプロファイルの制御が、HSP90βとの相互作用を介して起こるかどうかを検証した。siRNAとCRISPR-Cas9システムは、遺伝子特異的サイレンシングに広く用いられている効率的なツールである。まず、siRNAを介した遺伝子サイレンシング技術を用いて、HSP90βのダウンレギュレーションが、MODE-K細胞におけるmiR-351-5p、miR-651-3p、miR-125a-5p、およびmiR-214-3pのレベルに対するスタキオースの制御効果を減少させることを見出した（図S2E-S2G）。そこで、さらにCRISPR-Cas9システムを用いてHSP90βノックアウト（KO）MODE-K細胞株を構築した。PCRとゲノムDNAの塩基配列決定の結果に示されるように、組換えCas9とHSP90βのエクソン領域を標的とする2つの設計されたシングルガイドRNA（sgRNA）の導入により、58bpの欠失が生じ、HSP90β遺伝子にフレームシフト変異を誘導することに成功した（図S2H）。当然のことながら、MODE-K細胞におけるHSP90βのノックアウトは、細胞膜へのスタキオースの蓄積を阻害した（図2G）。スタキオースに応答して有意に発現低下するいくつかの典型的なmiRNA（miR-30-5p、miR-191-5p、miR-124-3p、miR-351-3pなど）に対するスタキオースの影響を、野生型（WT）で比較した。 野生型（WT）およびHSP90β-KO MODE-K細胞において、HSP90βをノックアウトすると、MODE-K ExosのmiRNAプロファイルに対するスタキオースの制御作用がなくなることを検証した（図2H）。これらの所見を総合すると、スタキオースは膜に位置するHSP90βを標的とすることで、MODE-K細胞のエクソソームmiRNAプロファイルを変化させることが示唆される。
タキオースはマウスおよびヒトの糞便中の宿主IEC由来miRNAのプロファイルを再構成する
これらの結果にヒントを得て、次にスタキオースがin vivoにおける宿主IEC由来のエクソソームのmiRNAプロファイルに与える影響を調べた。IECから放出されたエクソソームmiRNAのほとんどは、腸内容物中に安定的に存在することが確認されている。その結果、スタキオースによって小腸組織で発現が変化した40種類のマウスmiRNA（miR-133b-3p、miR-3068-5p、miR-382-5p、miR-133a-3pなど）は、糞便中にも大きく発現が変化していることがわかった（図S3AおよびS3B）。このことから、スタキオースによって変化した小腸エキソソームmiRNAは、腸管内容物中に運搬される可能性があることが示された（図S3AおよびS3B）。
予想通り、糞便中のmiRNAプロファイルは、スタキオースの投与量が異なるマウス（200、400、800 mg/kg-bw）間で顕著に異なり、用量依存的に発現量の異なるmiRNAの数が増加した（図S3C-S3E）。糞便中に検出されたすべてのマウス由来miRNA（107個）のうち、93個のmiRNAがMODE-K Exos中にも存在した（図S5E）。miRNA発現＞156.3（全miRNAの相対発現の平均値）という基準に基づき、糞便中で高発現している47のmiRNAを同定した（図3A）。これらの高発現miRNAの時間的発現パターンをさらに同定するために、短時間時系列発現マイニング（STEM）クラスタリングを行ったところ、31個（miR-145a-5p、miR-30a-5p、miR-191-5p、miR-21a-5pなど）がクラスタ6および7と同じ傾向を示した（図S3F）。y FC (|Log2FC|>1)と発現変動(2つのグループ間の相対発現レベルの絶対差、miRNA発現変動>50と定義)を制限すると、miR-191-5p、miR-30a-5p、miR-21a-5pがスタキオース介入に応答して強くダウンレギュレートされることが同定された(図3Bと3C)。
図3 スタキオースはマウスとヒトの糞便中miRNAプロファイルを再構成する。
スタキオースがマウスの糞便中miRNAプロファイルを変化させることから、次に、5g/日のスタキオース（基準1日摂取量、マウスでは400mg/kgに相当）を4週間投与する無作為化二重盲検プラセボ対照ヒトパイロット試験（NCT05392348）を行った（図3D）。mall RNAシークエンシングの結果、スタキオースがヒト糞便のmiRNAプロファイリングを再プログラムしたことが明らかになった（図3E）。検出された138個のヒトmiRNAのうち28個が、50TPM以上のmiRNA発現という基準で高発現しており、そのうちhsa-miR-1246、hsa-miR-1290、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-375-3pが最も明らかな倍率変化を示した（図3F）。マウスとヒトの糞便中に検出されたすべてのmiRNAを比較したところ、23の高発現miRNAが両種に共通していることがわかった（図S3G）。スタキオースによって影響を受ける特徴的な糞便中miRNAを探索するために、UpSetR解析を採用し、アップレギュレートされたmiRNAがマウスとヒトの間で高度に分散していることを観察した（図S3H）一方、miR-30a-5p、miR-10b-5p、miR-125b-5pは、マウスとヒトの糞便の両方で偶然ダウンレギュレーション傾向を示した（図3G）。
タキオースによって変化した糞便中のmiRNAは、乳酸菌の増殖を促進し、腸内細菌叢を形成する。
腸内細菌叢の形成における宿主IECs由来の糞便miRNAの能力を考慮すると、スタキオースが腸内細菌叢の全体的構造をシフトさせるかどうかを評価することは価値がある24,25,26。図S4A-S4Cに示すように、スタキオースは腸内細菌の構造を変化させ、その結果、ラクトバチルス・ガセリ（Lg）やラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）を含む7つの異なる種の存在量が変化した。その後、スタキオースの腸内微生物組成への影響をさらに解明するため、全長16S rRNA配列決定を行う用量依存性マウス実験を行った。具体的には、各サンプルについて80,000を超えるタグが生成され、ユニークな配列がdivisive amplicon denoising algorithm 2（DADA2）のdereplicationに基づいて分類され、1,500を超えるシグネチャー配列にグループ化された。平均相対存在量が0.5%を超える9つのフィラが同定され、その中でファーミキューテス（Firmicutes）が支配的な貢献者の1つであった（図S4D）。ユークリッド距離を用いたβ-多様性に基づく主成分分析（PCA）では、スタキオース投与マウスと無投与マウスでは明らかに異なる構造が示され、スタキオース投与マウス（S-L、S-M、S-H）では正常マウス（NC）と比較してより類似していた（図4A）。同様のパターンは、図S4Eに示した主座標分析（PCoA）の結果からも観察された。スタキオースに関連する可能性のある微生物をより広範囲に捕らえるため、p＜0.1かつ平均相対存在量＞0.5％という、より厳密でない基準を用いた。この基準では、マウスで検出された302属のうち、14の支配的なスタキオース応答性属が強調された（図4B）。マウスで得られた結果と同様に、ヒト被験者でもスタキオース介入前後で微生物組成にわずかな違いが見られた（図S4F）。属レベルでは、6つの多量な属が強調され、それらの相対量に有意な変化を示したが、最も顕著な倍数変化を示した属としてLactobacillusが際立っていた（FC = 13.1、図4Cおよび4D）。同時に、被験者の腸機能（排便回数、便の硬さ、通過のしやすさ）は、スタキオース介入後にわずかに改善したが、有意差はなかった（表S2）。全体として、スタキオースは、マウスおよびヒト被験者の大腸微生物群集の組成を変化させ、特に乳酸桿菌を保有している。
図4 スタキオースはマウスとヒトの腸内細菌叢を形成する。
スタキオースは天然のプレバイオティクスであることから、スタキオースによる腸内細菌叢の変化は、その伝統的なプレバイオティクスの役割によるものなのか、それとも糞便中のmiRNAの変化によるものなのかを考える必要がある。まず、スタキオースによる糞便中miRNAの変化が、そのプレバイオティックな効果に依存している可能性を排除するために、我々は広域抗生物質を用いて擬似無胚葉（PGF）マウスモデルを確立した。抗生物質の使用により、16S rRNA（一定領域）のレベルはほぼ検出できないレベルまで著しく低下し（p< 0.01）、ほとんどの大腸細菌がうまく除去されたことが示された（図5AおよびS4G）。驚くべきことに、腸内細菌を除去してもなお、スタキオースは糞便中の宿主miRNAの組成を変化させ、腸管外腔miRNAに対するスタキオースの直接的な制御効果を確認した（図5B）。図3Aと同じ基準で、スタキオースを投与したPGFマウスで高発現した47のmiRNAを同定した（図S4H）。その中で、miR-30ファミリーは顕著な変化を示し、その中でmiR-30a-5pはスタキオースに応答して最も顕著なダウンレギュレーションフォールド変化（Log2FC = -2.12）と最も明白な発現変動（miRNA発現変動 = 111.62）を示した（図5C）。スタキオース処理した正常マウスとPGFマウスで発現差のあるmiRNAを比較したところ、miR-30a-5pを含む14のmiRNAが比較的に発現低下していた（図5D）が、発現上昇傾向を示したmiRNAはなかった（図S4I）。同様に、ガラクトオリゴ糖はMODE-K細胞のエクソソームmiRNAプロファイルを変化させ、腸内細菌叢とは無関係にマウスの糞便中miRNAプロファイルを変化させた（図S5）。
図5 スタキオース-糞便中miRNA-腸内細菌叢の軸： タキオースは糞便中miRNAを直接制御し、それが腸内細菌叢を形成する。
スタキオースによって変化した糞便中miRNAと腸内微生物との因果関係をより深く理解するために、腸内微生物叢の動物間変動を最小限に抑えることを目的として、マウスを抗生物質で前処理した後、無菌水（Ab）またはスタキオース（Ab-S）を投与されたPGFマウスから採取した糞便中miRNAを、腸内微生物叢の再構築中に移植した（図5E）。糞便miRNAは加熱不活性化した糞便から単離した。実験期間中、すべてのマウスの体重は安定して増加した（図S6A）。Ab-S群からの糞便miRNAの移植は、レシピエントマウスの腸内微生物構造を明らかに変化させた（図5FおよびS6B）。特に、スタキオース改変糞便miRNAを投与したマウスでは、5属の相対量が明らかに変化し、特に乳酸桿菌が最大倍率の変化を示した（p< 0.05、図5G）。また、デュボシエラ属、クロストリジウム属、ラクトバチルス属は、スタキオース投与後も正常マウスと同様の変動傾向を示した（p< 0.05、図5Gおよび5H）。以上のデータから、スタキオースによって変化した糞便中miRNAの腸内細菌叢、特に乳酸桿菌に対する制御作用が確認された。
これらのmiRNAと乳酸桿菌との相関をさらに解明するために、MODE-K Exosマウス、正常マウス、PGFマウスで同定された55のスタキオース応答性miRNA（｜log2FC｜＞1、p＜0.1）について、GOおよびKEGG濃縮解析を行った（図S6Cおよび5I）。その結果、細菌の遺伝子翻訳やエネルギー代謝に関連するリボソーム、酸化的リン酸化、光合成、解糖などの経路が、20のmiRNAの標的となることが予測された（図5I）。さらに、予測された脂肪酸（プロパン酸およびピルビン酸）代謝経路は、腸のホメオスタシスに重要であった31。これらのデータは、スタキオースに応答するIECs由来のエクソソームmiRNAと乳酸菌との間の緊密な連携が有望であることを示唆している。従って、我々は、スタキオース-腸管外分泌miRNA-腸内細菌叢の制御軸を確立し、乳酸桿菌がスタキオースに応答する重要な腸内微生物の一つであることを検証した。しかしながら、これらのmiRNAと乳酸菌との間の特異的な標的関係については、まだ明らかにされていない。
タキオースが制御するmiR-30a-5pとmiR-133b-3pは乳酸菌の増殖を抑制する
スタキオース-腸管エクソソームmiRNA-乳酸菌の制御軸に関する知見に刺激され、我々は次に、どのmiRNAが乳酸菌の増殖を特異的に制御しうるかを検討した。この問題に対処するため、乳酸菌の存在量とスタキオースで変化した糞便中miRNAのレベルとの線形フィッティングを行ったところ、miR-191-5pが乳酸菌と有意な相関を示した（p< 0.05、図6A）。また、スタキオース処理した正常マウス、PGFマウス、ヒト、MODE-K細胞で共通のダウンレギュレーション傾向を示したmiR-30a-5pは、乳酸菌を標的とするmiRNAの候補であると推測された（図6B）。そこで次に、miR-191-5pまたはmiR-30a-5pのmiRNA模倣体を合成して、Lgと Lrを培養した。Lgと LrにおけるFITC標識miRNAの局在とmiRNAの相対発現レベルを測定したところ、miR-191-5pとmiR-30a-5pの両方がLrに入った（p< 0.05、図6CS6D, S6E）。さらに、MirandaとTargetscanデータベースを用いたシーケンスブラストにより、miR-191-5pとmiR-30a-5pがLrのmRNAと共局在する可能性が指摘された（図6D）。次に、乳酸菌の増殖に対するmiR-191-5pとmiR-30a-5pの影響を調べたところ、スタキオースとは逆に、miR-30a-5pはLrの増殖を有意に抑制した（p< 0.05）が、2μMのmiR-191-5pは2種の乳酸菌に対して弱い影響を示した（図6EおよびS6F）。これは、miR-30a-5pではmiRNAのシード配列とLrの標的遺伝子の一致が完全であったが、miR-191-5pでは不完全であったためと考えられる（図6D）。つまり、LrのmRNA上のmiR-30a-5pの結合部位は、アノテーションされた遺伝子に対応しておらず、Lrの成長に影響を与えるmiR-30a-5pの標的遺伝子は不明であった。しかしながら、コントロールとして、スクランブルmiR-30a-5pはLrの成長に影響を与えなかったことから、Lrに対するmiR-30a-5pのターゲティング効果は配列特異的であることが示唆された（図6EおよびS6F）。
図6 miR-30a-5pはラクトバチルス・ロイテリの増殖を抑制する。
さらに、試験管内培養試験に先立ち、マウスのパイロット実験で得られたスタキオース改変小腸miRNAと腸内細菌に基づいて部分最小二乗回帰（PLSR）モデルを構築し、Lgの存在量はmiR-133b-3pを含むいくつかの発現差のあるmiRNAと高い相関があるかもしれないことを見出した（図S7A）。これらのmiRNA模倣体をLgと共培養したところ、スタキオースを投与されたマウスの小腸で発現が低下していたmiR-133b-3pがLgに入り込み、Lgの増殖を特異的に抑制することが確認された（図S7B-S7D）。これらのデータを総合すると、スタキオースが、IECから放出された糞便中の小さなmiRNA、特にmiR-30a-5pとmiR-133b-3pを介することによって、乳酸菌の増殖を選択的に促進するという新しい分子メカニズムが支持される。
スタキオースによって変化した腸内細菌叢と糞便中miRNAとの間には、負のフィードバックループが存在する。
宿主由来の糞便中miRNAと腸内細菌叢との間には双方向のコミュニケーションがあり、宿主の糞便中miRNAは腸内細菌叢の構造を形成し、また異なる糞便中微生物叢に特異的に反応する32 、33。この観点から、抗生物質で前処理したマウスに、プールした糞便miRNAまたは糞便miRNA＋細菌を経口投与する糞便移植実験（FMT）を行った（図7A）。糞便中の16S rRNA量を図7Bに示すように、8週間の回復期間後、すべてのマウスの腸内細菌叢は正常に再構築された。しかし、S-Mマウスの糞便からmiRNAと細菌を受け取ったマウス（Naive-S群）の微生物構造は、Naive-NC群やAb-Sマウスの糞便からmiRNAを受け取っただけのmiR-Ab-Sマウスの微生物構造とはクラスタリングしなかった（図7C）。属レベルでは、Naive-SマウスとmiR-Ab-Sマウスはともに乳酸菌の相対量の増加を示したが、Naive-SとNaive-NCの増加度（log2FC値0.4 8）は、miR-Ab-S対miR-Ab（log2 FC値3.29）よりもはるかに低く、スタキオースを変化させたmiRNAによって形成された腸内細菌叢は、逆に乳酸菌の増殖を阻害する可能性が示唆された（p＜0.05、図7DおよびE）。宿主の生理機能に対する腸内細菌叢の影響は、主にその代謝産物に関係していることから34、我々は次に、miR-Ab-SおよびmiR-Abレシピエントから、RNase Aと0.22μmフィルターを用いて糞便中の微生物代謝産物を単離した。その結果、スタキオースを改変した糞便中miRNAを受け取ったマウス（miR-Ab-Sレシピエント）の代謝産物は、Lgと Lrの増殖を明らかに阻害した（図7F）。
図7 腸内細菌叢と糞便中miRNAのクロストーク
スタキオース型の糞便微生物叢が糞便中miRNA、特にmiR-30a-5pに影響を及ぼすかどうかをさらに調べるため、Naive-NC、Naive-S、miR-Ab、miR-Ab-Sレシピエントの糞便中の宿主由来miRNAをプロファイリングした。スタキオースを改変した糞便中miRNAと細菌を移植したマウス（Naive-S）の糞便中miRNAプロファイルは、スタキオースを改変した糞便中miRNAのみを移植したマウス（miR-Ab-S）のそれと明らかに異なっていた（図7G）。特に、スタキオース改変糞便miRNAに反応して明らかに減少したmiR-30a-5pは、スタキオース型腸内細菌叢の存在下では観察可能な差異を示さなかった（図7H）。以上を総合すると、スタキオース-腸内miRNA-腸内微生物という確立された軸を除けば、スタキオース形状の糞便微生物叢が糞便微生物叢とmiRNAの両方に負のフィードバック効果を及ぼす可能性がある。このループシステムの下では、乳酸菌とmiR-30a-5pは代償的に変化した。とはいえ、これらの予備的知見を実証するためには、さらなる証拠が必要である。
考察
ほとんどの栄養素は、消化管で低分子に分解された後、小腸から血流に吸収され、必要な組織や臓器に再分配される35,36。古典的なFOの一つであるスタキオースが消化管での消化を免れ、腸内細菌の「餌」として直接大腸に到達し、プレバイオティクス効果を発揮することはよく知られている37。スタキオースは、消化器官上部の "長旅 "を通過する際に、膜タンパク質HSP90βと結合することによって、小型IECのエクソソームmiRNAプロファイルを変化させる。タキオースが変化したこれらのmiRNAは、さらに腸内細菌叢を形成する。これらの発見は、難消化性スタキオースの微生物に依存しない新たな作用様式を明らかにするものであり、スタキオースは小腸と直接「会話」することで腸内細菌叢を操作し、小腸IECs由来のエクソソームmiRNAを再構成する。
消化管にはα-ガラクトシダーゼが存在しないため、哺乳類はスタキオースを加水分解することができない。驚くべきことに、我々の観察結果はこの考えを覆し、スタキオースが小型IECの膜上に蓄積するだけでなく、細胞膜のHSP90βに直接結合することを明らかにした。HSP90二量体の開状態は、多胞体と細胞膜の融合を促進することによってエクソソームの放出を可能にすると定義されているが、閉状態ではこの機能が阻害される可能性がある19。スタキオース処理によってMODE-K細胞からのエクソソーム分泌がわずかに減少したことは、スタキオースがHSP90βを閉状態で封鎖しているのではないかという仮説を支持する予備的証拠となる。とはいえ、この推測にはさらなる検証が必要である。さらに、HSP90βは初期エクソソームの形成に不可欠な小胞体でのタンパク質プロセッシングを調節する可能性が高い。アラクトオリゴ糖もまた、MODE-K細胞のエクソソームmiRNAプロフィールを変化させる。これまでにも、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イヌリン、ヤギ乳オリゴ糖は、IEC上の膜貫通タンパク質toll-likeレセプターを制御し、腸の健康を改善することが示されてきた4,5,6,7,8。しかしながら、スタキオースが直接腸上皮とコミュニケーションをとる新しい方法、特に膜性HSP90βと結合してエクソソームmiRNAプロファイルを制御する方法が、別個の現象なのか、それとも難消化性FOsで観察されるより広範な傾向なのかはまだ不明である。様々な単糖組成、鎖長、結合型を持つFOが小腸のエクソソームmiRNAに与える影響や、FOのHSP90βへの結合親和性を決定する重要な構造要素については、さらなる研究が必要である。
腸細胞由来のエクソソームmiRNAが腸内細菌叢とクロストークし、腸のホメオスタシスを制御していることは、広範な研究によって示されている。スタキオースの乳酸桿菌に対する増殖作用は、先行研究で広く報告されているとおり、健常マウスとヒトの両方において検証されている43,44,45,46しかし、「鶏」と「卵」、どちらが先なのだろうか？抗生物質で定着させたPGFマウスに糞便中のmiRNAを移植したところ、スタキオースが微生物叢とは無関係に糞便中のmiRNAプロファイルを再プログラムし、これらのmiRNAが腸内細菌叢を形成し、特に乳酸桿菌の増殖を促進するという軸の関係が初めて浮かび上がった。このことから、スタキオースは小腸エクソソームの組成を変化させることによって、微生物群に依存しない有益な生物学的効果を小腸で直接引き出すことができるのかどうかが注目される。スタキオースは、小腸エクソソームの組成を変化させることによって、微生物に依存しない小腸での有益な生物学的効果を直接引き出すことができるのだろうか。
宿主細胞から分泌される内因性エクソソームmiRNAと、食事由来の外因性エクソソームmiRNAの両方が、腸内細菌叢を調節することが報告されている。従って、特定の細菌を標的とするmiRNAの候補を同定するという魅力的な視点は、ヒトの健康のために腸内細菌叢に作用するmiRNAの標的や制御因子を開発するための有望な新しい道を提供することになる。スタキオースが乳酸菌を増殖させるための糞便中の潜在的なmiRNA標的を同定するために、正常マウス、PGFマウス、ヒト、MODE-K細胞でスタキオース投与後に発現が低下したmiR-30a-5pと、PLSR解析で乳酸菌と有意な相関を示したmiR-133b-3pに注目した。また、miR-30a-5pはLrのmRNAと共局在化し、配列特異的にLrの増殖を抑制し、miR-133b-3pはLgの増殖を抑制した。 また、糞便中のmiR-142a-3pはLrの増殖を促進することで大腸炎を予防することが確認されている17。以上のことから、スタキオースは糞便中のmiR-30a-5pおよびmiR-133b-3pレベルをダウンレギュレートすることによって、乳酸菌の増殖を選択的に刺激すると結論できる。52ナノベシクルに薬剤をカプセル化することは、標的治療、特に腫瘍免疫療法において大きな可能性を示している。53細菌に対するmiRNAの標的化役割に関する新たな研究領域は、微生物に関連した疾患に対する有望な治療法として、特定のmiRNAをカプセル化したナノベシクルの開発を導く可能性がある。これら2つのmiRNAに加えて、スタキオースに高度に反応する数十の他のmiRNAを同定した。本研究では、これらのmiRNAは細菌の増殖に直接的な作用を示さないが、そのうちのいくつか（miR-125b-5pやmiR-99b-5pなど）は、免疫細胞サブセットや腫瘍免疫微小環境の制御に重要な役割を果たすことが以前に報告されており、スタキオースの既知の免疫調節作用と一致している54,55,56,57。実際に、スタキオースがプレバイオティクスの役割以外に、マイクロバイオームではなくIECs由来のエクソソームmiRNAに依存して他の有益な効果を発揮するかどうかを探るために、さらに詳細な研究が行われる。当然のことながら、最初の幅広いスクリーニング段階では、生物の腸内環境にはかなりの個人差があることを考慮して、スタキオースと潜在的に関連する可能性のあるmiRNAや微生物をより幅広く捕捉するために、比較的緩やかなカットオフ値を採用した。この制限は、今後の研究で緩和されるはずである。
宿主由来の糞便中miRNAと腸内細菌叢との間のコミュニケーションは、宿主IECsとHopx+細胞がmiRNAを糞便中に分泌して腸内微生物を制御しているという事実が証明するように、双方向的である。一方、大腸炎マウス由来の大腸原性微生物叢を無菌マウスに投与すると、「健康な」微生物叢を投与したマウスと比較して、糞便中miRNAプロファイルが明らかに変化する33。そこで我々は、スタキオース-腸内miRNA-腸内細菌叢の軸における逆フィードバック制御を同定した。スタキオースで変化した糞便中miRNAを投与されたマウスから分離された細菌の代謝産物は、in vitroで Lgと Lrの増殖を阻害した。さらに、スタキオース改変糞便中miRNA単独の移植とは対照的に、スタキオース改変糞便中miRNAと細菌全体の移植は、スタキオース介入後にPGFマウスで減少していた糞便中miR-30a-5pレベルをわずかに増加させた。また、miR-21a-5pレベルがin vivo（正常マウス）では有意に低下していたが、in vitro（MODE-K細胞）では逆に上昇していたという「矛盾した」結果も、このフィードバック制御による誘導が疑われた。これらの結果は、スタキオース型腸内細菌叢が腸内細菌および宿主小IECs由来の糞便中miRNAに負のフィードバック効果を及ぼす可能性を示したが、その詳細な分子事象はまだ明らかではなく、さらなる研究が必要である。以上のことから、スタキオースは腸内細菌に対して、細菌への直接的な影響と糞便中miRNAを介した間接的な影響の二重の影響を示すことがわかった。驚くべきことに、腸内微生物を除去しても、スタキオースはマウスの糞便中miRNAプロファイルを変化させることができる。さらに、マウスの腸内細菌叢が再構成される過程で、これらのスタキオースによって調節された糞便中miRNAは、その後、腸内細菌叢を再構築し、その結果、変化した糞便中細菌叢／代謝産物は、糞便中miRNAに相互に影響を及ぼす。
結論として、我々は上部消化管内における難消化性スタキオースの新たな機能を明らかにした。スタキオースは、重要な膜タンパク質であるHSP90βと直接結合することで、小型IECのエクソソームmiRNAプロファイルを変化させる。この新たな発見は、オリゴ糖は小腸の "通過者 "であるという従来の認識を覆すものである。さらに、我々は新たな制御軸を構築した。スタキオースは、プレバイオティクスの役割とは無関係に、IECs由来のエクソソームmiRNAのプロファイルを変化させ、これらのmiRNAはその後、腸内細菌叢を再構築するために結腸内腔に放出された。特に、スタキオースによって制御されたmiR-30a-5pとmiR-133b-3pは、それぞれLrと Lgの増殖を有意に抑制した。スタキオースによって変化した糞便中miRNAによって形作られる腸内細菌叢が、乳酸菌の増殖を抑制する一方で糞便中miR-30a-5pのレベルを補充するという、太極拳の「八図」における陰陽のバランスに似た相互作用を示すという制御回路に、我々は思いがけず触れることができた。本研究は、オリゴ糖が腸上皮とどのように相互作用し、腸内細菌と宿主のクロストークを調節するのかという新たな分子メカニズムに光を当て、宿主の健康を改善するための腸内細菌の特異的標的としての糞便中miRNAの可能性を明らかにした。
本研究の意義
本研究の結果は、スタキオースが膜性HSP90βと直接相互作用することによって、小型IECのエクソソームmiRNAプロファイルを調節することを示している。にもかかわらず、この相互作用を支える複雑な分子メカニズム、特にHSP90βがmiRNA発現を調節する特定の経路は、依然として謎のままである。この制御過程を媒介する潜在的な中間分子やシグナル伝達カスケードを同定するためには、さらなる研究が不可欠である。乳酸菌に対する糞便中miR-30a-5pとmiR-133b-3pの標的効果については、現在の関連技術では、糞便中miRNAプール全体におけるmiR-30a-5pとmiR-133b-3pの割合を正確に調べ、特定の腸内細菌を標的とする糞便中miRNAの効果的な投与量を決定することは困難である。さらに、miRNAと細菌との複雑な相互作用についての理解を進めるためには、個々のmiRNAが特定の細菌株の増殖を調節する複雑なメカニズムを解明するための、さらなる努力が必要である。その上、微生物代謝産物も考慮に入れた、糞便中のmiRNAと腸内細菌叢との間のフィードバックループに関する最初の理解は、より広範で総合的な探求の始まりに過ぎない。糞便マイクロバイオームや糞便微生物代謝産物を統一的なシステムとして考えることは、その複雑な関係を理解するためのほんの表面をなぞったに過ぎない。これらの構成要素間の複雑な相互作用を徹底的に解明するには、メタボロミクスを含む複数のオミックス技術を取り入れた今後の取り組みが不可欠である。
リソース
連絡先
詳細情報およびリソースのリクエストは、リードコンタクトであるTing Li(tingli@snnu.edu.cn)までお願いします。
資料の利用可能性
本研究では新たな試薬は使用していない。
データおよびコードの利用可能性
ncropped blot およびすべてのソースデータはData S1 にある。低分子量RNA配列決定および16S rRNA遺伝子配列決定のaw readsは、Mendeley Data:https://data.mendeley.com/preview/b539dhwhv8?a=b5e5b127-7fd1-4296-ba13-9abffbe16f9d;https://data.mendeley.com/preview/dwjjk7dpcv?a=d8f2c123-41dd-40ec-9c98-a837fa22512a;https://data.mendeley.com/preview/mxsxgh6ync?a=0722aad4-9d1f-4548-87e1-9738598c7cdd;https://data.mendeley.com/preview/7nnvx4z3hz?a=b32b0490-2e90-4de0-bd01-0578ba0c0d5b に寄託した。
オリジナルコードを報告した。
本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報については、要請があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
Runguang Zhang、Guanghui Xiao、Peng He、Zhongqi Liに感謝する。本研究は、中国国家自然科学基金（32272309および31901702）、陝西省科学技術青年星（2023KJXX-017）、中国陝西省科学技術協会青年人材基金（20220218）、陝西師範大学優秀青年人材プロジェクト（GK202309004）の助成を受けた。
著者貢献
.L.とX.Y.が研究のコンセプトを考案し、設計した。.L.、Y.L.、T.D.は、L.W.、X.W.、X.D.の協力を得て、ほとんどの実験を行った。.L.とX.F.は分子ドッキングと動力学シミュレーションを担当した。.W.とY.W.は細胞培養とエクソソーム抽出を担当した。.L.、L.S.、H.T.は原稿を修正した。.L.とX.Y.が原稿の最終確認を行った。
利害関係
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
TAR★方法
EYリソース表
EAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER
抗体
nti-CD63ポリクローナル抗体 Proteintech Cat#25682-1-AP; RRID: AB_2783831
nti-TSG101 ポリクローナル抗体 Proteintech Cat#28283-1-AP; RRID: AB_2881104
nti-HSP90AB1 ポリクローナル抗体 Proteintech Cat#11405-1-AP; RRID: AB_2121207
細菌およびウイルス株
アクトバチルス・ロイテリ 中国産業文化センター CICC 6123
アクトバチルス・ガッセリ 中国産業文化センター CICC 24878
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
タキオース（純度98％以上） Yuanye Bio-Technology B21193
AS:54261-98-2
ITC（フルオレセインイソチオシアネート） Yuanye Bio-Technology S19127
AS:3326-32-7
ヨウチン 遠洋バイオテクノロジー B21899
AS:58-85-5
ホダミン-ファロイジン サイトスケルトン Cat#PHDR1
API（4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）Sigma 268298, CAS:28718-90-3
アラホルムアルデヒド Sigma 441244, CAS:30525-89-4
セトン Sigma 179124, CAS:67-64-1
DS-PAGEゲル ASPEN Cat#AS1012
VDFメンブレン Millipore Cat#IPVH00010
BS Sangon Biotech Cat#E607008
MEM 培地 Sangon Biotech Cat#E600009
BS（ウシ胎児血清） Gibco Cat#10091148
キソゾームフリー FBS Gibco Cat#A27208-03
エニシリン-ストレプトマイシン溶液、100× Abiowell AWH0529a
オーマル チャウ ENVIGO TD.89347
エオマイシン Sangon Biotech A430130, CAS:1405-10-3
トレプトマイシン Sangon Biotech A430977, CAS:3810-74-0
エニシリン Sangon Biotech A430123, CAS:69-57-8
アンマイシン Sangon Biotech A430243, CAS:1404-93-9
エトロニダゾール Sangon Biotech A600633, CAS:443-48-1
アシトラシン Sangon Biotech A424898, CAS:1405-89-6
イプロフロキサシン Sangon Biotech A430786, CAS:93107-08-5
エフタジジム Solarbio C9731, CAS:72558-82-8
エンタマイシン Sangon Biotech A428430, CAS:1405-41-0
ゲンタマイシン Sangon Biotech A505255, CAS:9002-18-0
RS Thermo Cat#CM0359B
Nase A Solarbio R1030、CAS:9001-99-4
市販アッセイ
inute™ 血漿膜タンパク質分離および細胞分画キット Invent SM-005
ll-in-One™ miRNA qRT-PCR 検出キット Gene Copoeia QP115
掲載データ
アタS1 本論文 ノンクロップブロットと全ソースデータ
細胞サンプルのSmall RNAシーケンスリード 本論文; Mendeley
atahttps://data.mendeley.com/preview/dwjjk7dpcv?a=d8f2c123-41dd-40ec-9c98-a837fa22512a
マウスサンプルのSmall RNAシーケンスおよび16S rRNA遺伝子シーケンスのaw sequencing reads 本論文; Mendeley Datahttps://data.mendeley.com/preview/b539dhwhv8?a=b5e5b127-7fd1-4296-ba13-9abffbe16f9d
ヒトサンプルのSmall RNAシーケンスおよび16S rRNA遺伝子シーケンスのawシーケンシングリード 本論文; Mendeley Datahttps://data.mendeley.com/preview/mxsxgh6ync?a=0722aad4-9d1f-4548-87e1-9738598c7cdd
細胞およびマウスサンプル（GOS）のSmall RNAシーケンスのaw sequencing reads 本論文; Mendeley Datahttps://data.mendeley.com/preview/7nnvx4z3hz?a=b32b0490-2e90-4de0-bd01-0578ba0c0d5
実験モデル エルライン
ODE-K BeNaカルチャーコレクション BNCC338300
実験モデル 生物/系統
マウス 57BL/6J 陝西師範大学実験動物センター NO. 010153
ヒト 被験者 ボランティア 該当なし
リゴヌクレオチド
rimer: 細菌16S一定領域 27F: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'1492R: 5'TACGGTTACCTTGTTACGACTT3' Sangon Biotech N/A
miRNA用リマー、表S3 参照 Tsingke N/A
iRNAの模倣とスキャブル、表S4 参照 Sangon Biotech社製 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
micStudio tools LC Biotechhttps://www.omicstudio.cn/tool
roteinPilot SCIEXhttps://sciex.com.cn/products/software/proteinpilot-software
raphPad Prism 8.0 グラフパッド ソフトウェアhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
en ソフトウェア Ziesshttps://www.zeiss.com/microscopy/int/downloads.html?vaURL=www.zeiss.com/microscopy/int/downloads/zen.html
iji / ImageJ バージョン 2.0.0 NIHhttps://imagej.net/Fiji
実験モデルと被験者の詳細
エル培養
MODE-K細胞株（BNCC338300、BeNa Culture Collection）は、Musculusの腸組織由来の上皮細胞タイプである。ODE-K細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM培地中、37℃、5％CO2で培養した。またはエクソソームの抽出と同定を行うために、FBSをエクソソームを含まないFBS（A27208-03、Gibco）に変更した。
動物
動物実験は、米国国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従い、陝西師範大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）の承認を得た。-週齢の雄性C57BL/6Jマウスを陝西師範大学実験動物センターから入手し、以下の一連の実験に使用した。パイロット実験（8週間）。(1)ノーマル・チャウ(NC)群には0.9%NaCl溶液を1日1回投与した。2）スタキオース（S）群には400mg/kg⋅bwのスタキオースを投与した。タキオース用量依存性実験（12週間）。(1)ノーマルチョー（NC）群には0.9％NaCl溶液を投与した。2）低用量スタキオース（S-L）群には200 mg/kg・bwのスタキオースを投与した。 3）中用量スタキオース（S-M）群には400 mg/kg・bwのスタキオースを投与した。 4）高用量スタキオース（S-H）群には800 mg/kg・bwのスタキオースを投与した。seudo-germ-free（PGF）マウス実験（12週）。(1)抗生物質投与群（Ab）：0.9%NaCl水溶液を投与。2）抗生物質＋スタキオース（Ab-S）群には400 mg/kg-bwのスタキオースを投与した。ecal miRNA移植実験（12週間）。氷を最初の4週間は抗生物質の混合物で処理し、これらの抗生物質で前処理したマウスを無作為に2群に分けた：(1) miR-Ab群には、Ab群のマウスの糞便から単離した糞便miRNA（25mg）を毎日投与した。2）miR-Ab-S群には、Ab-S群のマウスの糞便から分離したmiRNA（25mg）を毎日投与した。ecal材料移植実験（12週）。(1)Naive-NC群には、NCマウスの糞便（25mg）から分離した糞便を投与した。2）Naive-S群には、S-Mマウスの糞便25mgから分離した糞便を投与した。
(2)Naive-S群にはS-Mマウスの糞便25mgから分離した糞便を投与した。飲料水と餌はオートクレーブで滅菌し、抗生物質とスタキオースは0.22μmのフィルターでろ過した。マウスへの投与は無菌状態で行った。食餌は毎日新鮮なものを採取した。各実験終了後、糞便検体を採取し、RNA後者に浸し、スナップ凍結し、腸内細菌叢、miRNAおよびqPCR解析のために-80℃で保存した。
ヒト試験
健康な被験者2名（男性6名、女性6名）を登録した。被験者は18～36歳で、西京病院が承認したプロトコール（NCT05392348）に従って同意書に署名した。実験期間の2ヵ月前および実験期間中に抗生物質、プレバイオティクス、プロバイオティクスを使用したボランティアは除外した。スタキオース投与前と投与後に糞便検体を採取した。便サンプルは週1回採取し、RNA後者に浸し、スナップ凍結し、さらに処理するまで-80℃で保存した。
トレーニング
Lactobacillus_reuteri株（CICC 6123）およびLactobacillus_gasseri株（CICC 24878）は、China Center of Industrial Culture Collection（CICC）から購入した。
方法の詳細
非焦点顕微鏡法
ODE-K細胞をスライドグラスにプレーティングし、4 mM FITC標識スタキオースで0-4時間処理した後、4%パラホルムアルデヒドで0.5時間固定した。固定後、細胞をアセトン中で4℃、5分間透過処理し、染色した。ormalin固定した小腸組織をパラフィンに包埋し、10μmの切片を切り出し、染色した。核はDAPIで、細胞骨格はRhodamine-phalloidinで染色した。画像は63倍の対物レンズを用いた共焦点顕微鏡で取得した。Leica Application Suite X (LAS X)を用いて、erged channelとorthogonal viewを処理した。蛍光強度はImageJで解析・算出した。
モール分子（SM）プルダウンアッセイ
Minute™ Plasma Membrane Protein Isolation and Cell Fractionation Kit (Invent, USA)を用いて全細胞膜タンパク質を抽出した。ビオチン標識スタキオースとストレプトアビジン磁性ビーズを混合し、氷上で2時間インキュベートした後、スタキオース結合磁性ビーズを分離し、膜タンパク質（1 mg）と4℃で一晩インキュベートした。PBSTで3回洗浄後、タンパク質を回収、溶解し、12% SDS-PAGEゲルで分離した。陰性コントロールとしてブランクのストレプトアビジン磁気ビーズを用いた。各プルダウンアッセイについて3回の反復を行った。
チップの脱塩
酵素分解後、タンパク質サンプルを10-20μLの0.2% TFAで溶解し、10,000rpmで20分間遠心した。バランス溶液で10回平衡化した後、サンプル溶液を10サイクル吸入し、リンス液で8回リンスした。クロスコンタミネーションを避けるため、100μLのフラッシング液を個々のチューブに分注し、各サンプルに別々のチューブを使用することが重要である。最後に、50μLの溶離液を清潔なチューブに加え、ピペッティングを繰り返してペプチドを溶出した。
C-MS/MS分析
ペプチドサンプルを1μg/μLに希釈した。サンプル量5μLで、希釈したペプチドサンプルを質量電荷比350-1200で60分間スキャンした。質量分析データは、Triple TOF 5600 + LC/MSシステム（AB SCIEX、米国）を使用して収集した。簡単に説明すると、ペプチドサンプルを2%アセトニトリル/0.1%ギ酸に溶解し、Eksigent nanoLC システム (AB SCIEX, USA) と組み合わせた Triple TOF 5600 plus 質量分析システムを使用して分析しました。ペプチド溶液をC18キャプチャーカラム（3 μm, 350 μm×0.5 mm, AB Sciex, USA）に添加し、C18分析カラム（3 μm, 75 μm×150） を60分の時間グラジエントと300 nL/分の流速で適用した（Welch Materials, Inc）。またはグラジエント溶出では、移動相として2%アセトニトリル/0.1%ギ酸/98%H2 Oおよび98%アセトニトリル/0.1%ギ酸/2%H2 Oを使用した。または情報依存取得では、イオン蓄積時間250msでMSスペクトルをスキャンし、イオン蓄積時間50msで30個のプリカーサーイオンのMSスペクトルを取得した。S1スペクトルは350-1200 m/zの範囲で収集し、MS2スペクトルは100-1500 m/zの範囲で収集した。質量分析計からのオリジナルのMS/MSファイルは、データ解析のためにProteinPilot v4.5(https://sciex.com.cn/products/software/proteinpilot-software, SCIEX, USA)に提出された。またはタンパク質の同定には、ProteinPilotのParagonアルゴリズムを使用してuniprotデータベースを検索した。パラメータは次のように設定した：装置はTripleTOF 5600、システインはヨードアセトアミドで修飾、生物学的修飾はIDフォーカスとして選択。または同定されたタンパク質の結果は、未使用スコア＞1.3（95％以上の信頼性）のペプチドという一定のフィルタリング基準が用いられた。
分子ドッキングと動力学シミュレーション
分子ドッキングは、HSP90βとPU3の複合体の結晶構造（PDB:1UYM ）を用い、Autodock Vina（Scripps Research Institute, USA）を用いて行った。HSP90βの構造は、元のリガンドと水分子を取り除き、必要に応じて水素原子と電荷を加えて得られた。リガンドのエネルギー最小化はYASARAを用いて計算した。そして、最もエネルギーの低い最良のコンフォメーションを分子動力学（MD）シミュレーションにかけ、その安定性を予測した。レセプターHSP90βとリガンドスタキオースを12面体ボックスに入れ、溶質とボックス間の距離を5Åとして0.9%NaClに溶かした。すべてのシミュレーションはAMBER ff99SB力場を用い、298Kで行い、その後シミュレーションアニーリングを行った。速度は10ステップごとに0.9ずつスケールダウンし、500ステップで5psの時間をかけた。実行温度は、時間平均温度に基づいてBerendsenサーモスタットを用いて調整した。00 nsのMDシミュレーションを2 fsの時間ステップで行い、スナップショットを10 psごとに保存した。構造図はPyMol v.1.3を用いて得られた。
細胞エクソソームの分離
ellは10％エクソソーム除去FBS添加培地で培養した。細胞残屑と代謝物を分離した後、細胞上清中のエクソソームを100,000 g、70分間の超遠心分離により単離した58。エクソソームの総タンパク質含量はNanoDrop One (ND-01)により分析した。
透過電子顕微鏡
単離したエクソソームをグロー放電したホルムバーコート銅メッシュグリッド上に広げた。乾燥後、日立 HT-7700 電子顕微鏡（100 kV）で撮影した。
ウエスタンブロット分析
エクソソームの全タンパク質とMODE-K細胞の膜タンパク質をSDS-PAGE電気泳動で分離し、PVDF膜（Thermofisher, 88520）に転写した。膜は5％BSA（w/v）を含むTBSTで順次ブロッキングし、抗体（抗CD63、抗Tsg101、抗HSP90AB1）とインキュベートした。得られた抗体複合体をChemiDoc MP (BIO-RAD, 1708280)で検出した。
低分子干渉RNA（siRNA）のトランスフェクション
HSP90ab1（HSP90βの遺伝子）を標的とするsiRNAはGenePharma社（中国、上海）により合成された。24ウェルプレートで37℃、24時間培養後、Lipofectamine 3000（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.）を用い、MODE-K細胞（1×105 cells/ウェル）にsiRNA（50 nmol）をトランスフェクトした。ノックダウン効率はRT-qPCRで検出した。使用したsiRNAの配列は以下の通りである： SP90β-NC（センス：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；アンチセンス：ACGUGACACGUUCGGAGAATT）、HSP90β-1307（センス：CCGCAAGAACAUCGUCAAGAATT；アンチセンス：UUCUUGACGAUGUUCUUGCGGTT）、HSP90β-986（センス：GCAGGAGGUAUGUAUGGUTT： センス：CAGGAGGAGUAUGGCGAAUUTT；アンチセンス：AAUUCGCCAUACUCCUUGCTT）、HSP90β-243（センス：GCCCUGGACAAGAUUCGAUAUTT；アンチセンス：AUAUCGAAUCUUGUCCAGGGCTT）。
CRISPR/Cas9によるHSP90β-KO MODE-K細胞株の活性化
またはHSP90ab1をノックアウトするために、オンラインCRISPRデザインツール(Red Cotton™, Guangzhou, China,https://en.rc-crispr.com/)を用いて、HSP90ab1のエクソンE3領域をターゲットに、それぞれCGGおよびGGGプロトスペーサー隣接モチーフを持つ2つのsgRNAをデザインした。2つの標的部位に対するオリゴのペアをアニールし、YKO-RP005ベクター（Ubigene Biosciences社、広州、中国）にライゲーションした。次に、Cas9および2つのsgRNA配列を発現するプラスミドを、Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）を用いてエレクトロポレーションによりMODE-K細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから8時間後、細胞をスクリーニングするためにピューロマイシンを添加した。その後、限定希釈法により単一細胞クローンを得、96ウェルプレートに接種した。選択されたHSP90β-KO細胞クローンは、PCRとゲノムDNA配列決定によって検証された。CRISPR/Cas9編集に用いたsgRNAとプライマーは、g1: GATTCGATGAGAGCCTGA CGG, g2： CGTGCGCTCCTGAGGGTTG GGG、F1： TTAAGGGTGAGTACCAG、R1： ATAACCATCTGCTGCGCAAGGおよびR2： TCCCACTGTCCAACTTAGAAGG。
抗生物質投与
氷は飲料水に混合抗生物質（100mg/mLネオマイシン、50mg/mLストレプトマイシン、100U/mLペニシリン、50mg/mLバンコマイシン、100mg/mLメトロニダゾール、1mg/mLバシトラシン、125mg/mLシプロフロキサシン、100mg/mLセフタジジム、170mg/mLゲンタマイシン）を添加し、週1回交換した59。細菌の除去は、細菌の16S定数領域（27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'および1492R：5'TACGGTTACCTTGTTACGACTT3'）のqPCR分析により確認した。
ecal材料と糞便miRNAの移植
糞便移植は、ドナーマウスの糞便100mgを1mLの滅菌PBSに懸濁し、3000gで10分間遠心分離した後、上清を回収し、抗生物質で前処理した後、レシピエントマウスに経口投与した。または糞便miRNA移植では、Ab群およびAb-S群のPGFマウスから採取した糞便を80℃で60分間加熱して細菌を死滅させ、8000gで5分間遠心分離して死菌を除去し、糞便上清中のmiRNAを保持した15,16,60。
腸の機能評価
llの被験者（男性6名、女性6名）に、スタキオース補給前後の排便回数、便の硬さ、通過のしやすさなどのアンケートに答えてもらった。平均排便回数は、1週間あたりの便の回数として計算した。便の硬さは、修正Bristol Stool Form Scaleによって0（水様）、1（軟）、2（硬）、3（非常に硬）に分類した。通過性は1（非常に容易）、2（容易）、3（困難）、4（非常に困難）で評価した。
エクソソームRNAと糞便RNAの溶出
800μLの滅菌PBSに懸濁した細胞性エクソソーム09粒子および800μLの滅菌PBSにホモジナイズした80mgの糞便をRNA抽出に供した。全RNAはAcid-Phenol:Chloroform抽出により抽出した。queous相沈殿は1.25容量の100%エタノールと混合して行い、その後グラスファイバーフィルターカートリッジで精製した。溶出後、NanoDrop One (ND-01)を用いてA260/A280比でRNAの質を評価した。サンプルは分析まで-80℃で保存した。
モールRNAシーケンス
00ngのMODE-K細胞分泌エキソソームRNAまたは糞便RNAを入力材料として用いた。awリードは、社内プログラムACGT101-miR (LC Sciences, Houston, Texas, USA)にかけられ、アダプターダイマー、ジャンク、低複雑性、一般的なRNAファミリー（rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA）およびリピートが除去された。その後、既知のmiRNAと新規の3p-および5p-由来のmiRNAを同定するために、18〜26塩基長のユニークな配列をBLAST検索によってmiRBase 22.0の特定の種の前駆体にマッピングした。マップされなかった配列は、特定のゲノムに対してBLASTされ、配列を含むヘアピンRNA構造は、RNAfoldソフトウェア(http://rna.tbi.univie.ac. at/cgi-bin/RNAfold.cgi)を用いて80 ntの配列から推定された。正規化されたディープシーケンスカウントに基づくmiRNAの差次的発現は、実験デザインに基づいて、Fisher exact検定、カイ二乗2X2検定、カイ二乗nXn検定、Student t検定、またはANOVAを選択的に用いて解析した。有意閾値は0.01と0.05とした。ean相対発現は、Total miRNA Expression/(Sample Number × miRNA Number)で算出した。
miRNA標的遺伝子の予測
遺伝子中のmiRNA結合部位を同定するために、2つの計算ターゲット予測アルゴリズム（TargetScan, v5.0とMiranda, v3.3a）を用いた。最終的に2つのアルゴリズムに基づいて得られたデータを組み合わせ、オーバーラップを計算した。これらのmiRNAが標的とするGOタームとKEGGパスウェイもアノテーションされた。
qPCRによるecal miRNAの定量
Small RNAシークエンシングで同定されたmiRNAの相対発現レベルを検証するために、定量的PCR（qPCR）アッセイを行った。00mgのマウス糞便をAll-in-One™ miRNA qRT-PCR検出キット（Gene Copoeia社、米国）に投入し、CFX 96 Touch Real-time PCR System（BIO-RED社、米国）でメーカーのプロトコールに従って試験した。miRNAプライマーの前方配列は、Tsingke Biotechnology社（中国、北京）により設計された（表S3 ）。
腸内細菌叢の6S rRNA遺伝子配列決定
CTAB法を用いて糞便中のNAを抽出した。プライマー27F：5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG -3'および1492R：5'-RGYTACCTTGTTACGACTT -3'を用いて16S rRNA遺伝子の全長を増幅し、サンプルごとに特定のバーコードでタグ付けした。Quanti Fluor TM-ST (Promega, USA)で定量した後、アンプリコンプールをライブラリー構築用に調製した。MRTbellライブラリーはPacific Biosciences SMRTbell Template Prep kit 1.0 (PacBio, USA)を用いて調製し、PacBio RS II (LC-Bio Technology Co., Ltd., Hangzhou, China)で塩基配列を決定した。
ircular Consensus Sequence (CCS)リードは、SMRT Link (v6.0)で生サブリードから以下のパラメータで生成した: min Passes = 5; min Predicted Accuracy = 0.9. その後、ima（v1.7.1）を用いて異なるサンプルのCCSリードを区別し、cutadapt（v1.9）を用いてプライマーを同定した。1200bpから1650bpのCCSリードが、長さのフィルター後に残った。DADA2を用いてキメラ配列の重複除去およびフィルタリングを行い、特徴テーブルと特徴配列を得た62。α多様性とβ多様性は、ランダムに同じ配列に対して正規化することで算出した。Amplicon Sequence Variants (ASVs)は、SILVAデータベース（リリース138）に対して特徴配列をアライメントすることでアノテーションした。また、有意差のある属の解析には、統計的比較を確実にするため、Wilcoxon順位和検定を用いた。また、主座標分析（PCoA）では、PERMANOVAを利用してグループの変異の有意性を評価した。llダイアグラムはQIIME2とRパッケージを用いて作成した。
miRNA模倣体の合成
miR-30a-5p、miR-30a-5pスクランブル、miR-191-5pおよびmiR-191-5pスクランブル、miR-133b-3pおよびmiR-133b-3pスクランブル、miR-3068-5pおよびmiR-3068-5pスクランブルの合成miRNA模倣体（FITC標識の有無は問わない）は、Sangon Biotech社（中国、上海）から提供された。これらのmiRNA模倣体の配列を表S4に示す。
共培養アッセイのためのecal miRNA単離
糞便中の全miRNAは、mirVana™ miRNA isolation kit (AM1560, Ambion)を用いて、メーカーの手順に従って抽出した。miRNA の品質は NanoDrop One (ND-01) を用いて A260/A280 比で評価した。サンプルは分析まで-80℃で保存した。
糞便代謝物の分離
Lactobacillus gasseriまたはLactobacillus reuteriとの共培養により、マウス1匹あたり100 mgの糞便を1 mLの滅菌PBSに懸濁し、3000gで10分間遠心した。RNase Aと0.22 μmフィルターで処理した上清を糞便代謝産物として回収した。
試験管内細菌増殖測定
actobacillus gasseriおよびLactobacillus reuteriを、コロニー分離にはMRS寒天培地で、増殖アッセイにはMRS培地で嫌気的に増殖させた。ウェル当たり2μMのmiRNA模倣体または単離された糞便miRNAを含む150μL培地中の約104CFUの細菌を96ウェルプレートに接種し、37℃で180rpm振盪培養した。菌の増殖は、分光光度計で 24 時間、600nm の吸光度（OD600 ）としてモニターした。300mgの糞便から抽出した糞便代謝物の影響も共培養系を用いて測定した。
蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによる細菌中のmiRNAのo-局在化
FITC標識miRNA模倣体（2μM）で培養した放線菌を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリー解析のために回収した。蛍光シグナルはFluorescence Microscope (ZEISS, DMi8 automated)で捉えた。ローサイトメトリー解析は、FACS CaliburフローサイトメトリーとCell Questソフトウェア（Becton, Dickinson Biosciences, USA）を用いて行った。各サンプルについて、ゲート内の10,000イベントを記録した。FITC陽性菌の割合を算出した。
解析と統計解析
統計解析はOmicStudioツール（https://www.omicstudio.cn/tool）を用いて行った。グラフは、GraphPad Prism、SPSS 19.0、R 3.5.3またはTBtoolsで作成した。各実験の統計的詳細は、図の凡例に記載されている。
追加資料
臨床試験の登録番号はNCT05392348（https://clinicaltrials.gov/study/NCT05392348?intr=stachyose&rank=1 ）である。
補足情報 (3)
文献S1。図S1-S7および表S1-S4
データS1. 図1、2、3、4、5、6、7、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、および表S2に関連する、すべてのブロット、グラフ、および表の基礎となる加工済み生データ。
S2. 論文＋補足情報
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