ミトコンドリア活性の向上がNASHの進行を遅らせる腸内細菌叢プロファイルを再構築する：
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ミトコンドリア活性の向上が、NASHの進行を遅らせる腸内細菌叢のプロファイルを再構築する
Juárez-Fernández, María1,2; Goikoetxea-Usandizaga, Naroa3; Porras, David1; García-Mediavilla, María Victoria1,2; Bravo, Miren3; Serrano-Maciá, Marina3; Simón, Jorge2,3; Delgado, Teresa C.3 Lachiondo-Ortega, Sofía3; Martínez-Flórez, Susana1; Lorenzo, Óscar4,5; Rincón, Mercedes6; Varela-Rey, Marta2,3; Abecia, Leticia7,8; Rodríguez, Héctor7; Anguita, Juan7,9; Nistal, Esther1,2; Martínez-Chantar, María Luz2,3; Sánchez-Campos, Sonia1,2
著者情報
Hepatology 77(5):p 1654-1669, May 2023. | DOI: 10.1002/hep.32705
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INFOGRAPHIC（インフォグラフィック
メトリックス
要旨
背景と目的
最近の研究では、ミトコンドリア機能不全が腸肝状態を悪化させることでNASHへの進行を促進することが示唆されている。しかし、そのメカニズムは未だ不明である。そこで我々は、ミトコンドリア活性を高めることで、特定の微生物相を再構築し、それを無菌マウスに移植することで、NASHの進行を遅らせることができるのではないかと考えた。
アプローチと結果
野生型およびメチル化制御Jタンパク質ノックアウト（MCJ-KO）マウスに、対照食またはコリン欠乏L-アミノ酸定義高脂肪食（CDA-HFD）を6週間与えた。各群の1匹のマウスは、GFマウスの腸内細菌叢のドナーとして機能し、GFマウスもCDA-HFDモデルを3週間摂取した。その後、肝障害、腸管バリア、腸内細菌叢、および関連する糞便のメタボロームを調査しました。6週間のCDA-HFDの後、ミトコンドリア複合体I活性の阻害剤であるメチル化制御Jタンパク質の不在は、攻撃的なNASH食事モデルにおいて肝損傷を軽減し、腸-肝臓軸を改善しました。この効果は、食道微生物叢移植によりGFマウスに移行した。MCJ-KOは、糞便中のDorea属とOscillospira属の相対量が増加し、AF12、Allboaculum、Ruminococcus]が減少しており、短鎖脂肪酸、NAD+代謝、サーチュイン活性を高めることで保護作用を発揮し、その後、脂肪酸酸化を高めることが示唆されました。重要なことは、Dorea属がこの微生物叢依存的な保護表現型の主要な調節因子の1つであることを明らかにしたことである。
結論
全体として、我々は、NASHにおけるミトコンドリアと微生物叢の相互作用の関連性を示す証拠を提供し、それを標的とすることが貴重な治療アプローチとなりうることを示した。
輸出
はじめに
ミトコンドリア機能障害は、酸化ストレスや腸内細菌叢の変化とともに、NASHへの進行を促進します1。実際、NAFLDでは腸-肝臓軸が破壊されることが知られていますが2、NAFLDおよびNASHに関連する特定のマイクロバイオームのシグネチャーは完全に解明されているわけではありません3。
最近の研究で、ミトコンドリア機能障害と腸内細菌叢の双方向の相互作用の可能性が明らかになりました4。ミトコンドリア機能の調節障害とそれに伴う活性酸素種（ROS）の増加は、腸管バリアの完全性を調節することによって腸内細菌叢に影響を与え、それによって免疫反応を誘発することが考えられます。反対に、腸内細菌叢はミトコンドリア生合成を制御することが知られており、微生物の代謝物はミトコンドリア呼吸にも影響を与える可能性があります5。したがって、ミトコンドリア機能障害を標的とすることは、腸-肝軸を適切に維持し、それによってNASH進行を遅らせたり予防するための防火壁になり得ます。
メチル化制御Jタンパク質（MCJ）、またはDnaJC15は、ミトコンドリア複合体I6の内因性ネガティブレギュレーターである。その欠乏は、呼吸とアデノシン三リン酸（ATP）合成を増加させ、呼吸性超複合体の形成を刺激し、酸化ストレスの産生を制限することが、NASHで実証されています6-8。 -そのため、Mcj欠損マウスは、NAFLDおよびNASHにおける腸内細菌異常および腸肝軸の変化に対する肝ミトコンドリアの寄与を研究するための信頼できるモデルであると考えられる。
本研究では、NASHの食餌性モデルマウスにおいて、腸内細菌叢組成の変化を駆動力として考え、MCJ欠損の効果を評価し、さらにメチル化制御Jタンパク質ノックアウト（MCJ-KO）マウスで観察された肝保護表現型が、セカル微生物叢移植（CMT）を通じて無芽胞（GF）マウスに移植できるかどうかを調べることを目的としている。
実験方法
実験計画
すべての手順は、ARRIVEガイドラインおよび動物飼育に関する欧州研究評議会ガイドラインに従って行われ、CIC bioGUNEおよびUniversity of Leónの機関動物飼育使用委員会（OEBA-ULE-003-2018およびCIC bioGUNE CBBA/IACUC [REGA 48/901/000/6106, P-CBG-CBBA-218] ）に従って所轄官庁（Junta de Castilla y LeónおよびDiputación de Bizkaiaそれぞれ）から承認を受けた。CIC bioGUNEはAAALAC Intl.の認定を受けている。
A モデル：ドナーマウスの選択
C57BL/6バックグラウンドの6週齢の野生型（WT）（n = 14）およびMCJ-KO（n = 19）雄マウスをCIC bioGUNEの動物施設で飼育した。動物には、対照食または脂肪から60％kcal、0.1％メチオニン、コリン欠乏高脂肪食（CDA-HFD）（A06071302 Research Diets）を含むL-アミノ酸を6週間与えた。その後、マウスをイソフルラン2.5%で麻酔し、心臓穿刺を用いた失血死により安楽死させた。頸部内容物は、還元剤としてシステインを含むスキムミルク（10%）（0.5g/L）で直ちに保存し、液体窒素に浸し、微生物叢移植まで-80℃で保存した。モデルAの各実験群から1匹のマウスを、表S1に規定されたパラメータに基づいて、腸内細菌叢ドナーとして選択した。
Bモデル：腸内細菌叢の移植
6週齢のGF雄性C57BL/6Jマウス（n＝60）を、レオン大学の特定病原体フリー動物施設に収容した。すべてのマウスは、一定の温度、湿度、光条件下に維持され、照射されたチョウとオートクレーブされた水を自由摂取で与えた。馴化期間後、ドナーセカル内容物100μlを単回経口胃内投与して移植した。マウスは、4種類のドナー移植微生物叢と食餌に基づいて8群に分けられた（図S1）。3週間後、すべての動物をイソフルラン麻酔下で心臓穿刺により安楽死させた。
サンプル採取
モデルAおよびBのマウスの肝臓、腸、褐色脂肪組織および精巣上体白色脂肪組織（WAT）、ならびに糞便および便の内容物を採取し、直ちに液体窒素に浸漬し、-80℃で保存して後日分析した。血液を採取し、6000rpmで10分間遠心分離して血漿を得た。
結果
肝ミトコンドリアは、リーンNASHマウスモデルにおいて、腸管バリアの完全性を改善し、特定の腸内細菌叢のシグネチャーを推論する。
WTマウスでは、6週間のCDA-HFD投与により腸管透過性が上昇し、コントロールと比較して血清のfluorescein isothiocyanate（FITC）-dextranレベルが上昇したことが示された（図1A）。興味深いことに、CDA-HFDを与えたMCJ-KOマウスでは、FITC-デキストランの透過性が著しく低下しており、保護効果の可能性が示唆された（図1A）。組織学的評価では、回腸組織の粘膜厚、陰窩の深さ、および絨毛の高さについて、有意差は示されなかった（図S3A）。
図1：
メチル化制御Jタンパク質ノックアウト（MCJ-KO）遺伝子型が腸-肝臓軸と微生物叢組成に及ぼす影響。(A）フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストランの血清レベル。(B）オクルディンおよびZonula occludens 1（Zo-1）の腸管メッセンジャーRNA（mRNA）相対発現。(C）定量化および代表的なZO-1染色回腸切片。(D) 回腸のオクルディンレベルのデンシトメトリー解析は、対照食WT群（C/WT）に対する相対値で表した。(E) リピッドA血漿濃度のデンシトメトリー解析は、コリン欠乏・L-アミノ酸定義・高脂肪食（CDA-HFD）/野生型（WT）に対する相対化として表した。(F）IL-6およびTNF血漿中濃度。(G）NOD・LRR・ピリンドメイン含有タンパク質3（Nlrp3）およびToll様受容体4（Tlr-4）肝mRNA相対発現。(H）操作分類単位（OTU）レベルでのBray-Curtisの非類似度指数に基づく主座標分析プロット。WTマウスとMCJ-KOマウスにコントロール（I）およびCDA-HFD（J）を与えた場合の属レベルでの相対存在量の違い。(K）WTマウスとMCJ-KOマウスの属・種レベルでの線形判別分析の効果量（閾値＝2.0、p＜0.05）。各実験群に少なくともn＝6を使用した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 対 C/WT; # p < 0.05, ## p < 0.01 対 CDA-HFD/WT
タイトジャンクションタンパク分析により、オクルディンおよびZonula occludens 1（Zo-1）のメッセンジャーRNA（mRNA）レベルの有意な減少（図1B）、クラウディン1陽性免疫染色（図S3B）、ZO-1陽性免疫蛍光（図1C）、 とオクルディン蛋白レベル（図1DとS3C）は、CDA-HFD飼育のWTマウスでは、コントロールとCDA-HFD飼育のMCJ-KOマウスの両方と比較して、MCJ欠損マウスでは接合部の完全性が向上し、細菌と微生物産物のトランスロケーションを避けることが確認された。
血清内毒素および炎症性サイトカインの測定では、WTと比較してCDA-HFD/KO群では、リポ多糖の成分であるリピドA血漿タンパク質濃度（図1EおよびS3D）の有意な低下、ならびに炎症性IL-6およびTNF血漿濃度の低下（図1F）が認められた。
腸-肝臓軸のシグナル伝達に関しては、抗菌ペプチドの分泌を制御する核内胆汁酸受容体であるファルネソイドX受容体の腸内mRNA発現量は、CDA-HFD飼育のWTマウスでは、コントロールおよびCDA-HFD/KO群の両方と比較して増加し、Gタンパク質共役胆汁酸レセプター-1の発現には変化が認められなかった（図S3E）。また、CDA-HFD摂取により、腸内細菌由来の肝毒性または免疫刺激性化合物のセンサーであるToll様受容体-4（Tlr-4）およびNOD、LRR、およびピリンドメイン含有タンパク質3（Nlrp3）の肝臓mRNAレベルが上昇したが、Mcj欠損によりNlrp3アップレギュレーションは防止できた（図1G）。
以上のことから、MCJの欠乏は、NASHにおける腸管バリアーの完全性の喪失に対抗し、細菌産物のトランスロケーションを減少させ、インフラマソーム応答を変調させることがわかった。
私たちのグループは、MCJの欠乏がNAFLDを改善することを以前に実証している9。先行研究では、CDA-HFDがリーンNASHの攻撃的モデルであるとされている12ため、この食事下で脂肪肝疾患におけるMCJの役割を分析することを進めた。まず、CDA-HFD後の肝臓組織学的分析では、炎症巣を伴う高度の微小小胞および大小胞脂肪症が認められた（図S2A）。CDA-HFDはまた、血清肝アミノトランスフェラーゼレベルを増加させた（図S2B）。重要なことは、体重に対する肝臓およびWATの重量比の両方が、WTと比較してCDA-HFD飼育のMCJ-KOマウスで低かったことである（図S2C）。その上、MCJの欠如は、C-Cケモカイン受容体5（Ccr5）、IL-1β、IL-6、およびTnfなどの主要な炎症性サイトカインの肝mRNA発現を有意に減少した（図S2D）。肝線維化については、MCJ-KOマウスにおいて、シリウスレッド染色で解析したコラーゲン量の有意な減少（図S2E）、プロバイオロジーのコラーゲン1型α1鎖（Col1a1）およびトランスフォーミング成長因子β（Tgf-β）の発現も確認でき、MCJ非存在下では線維化の進展が著しく低下していた（図S2F）。
腸内細菌叢もNAFLD感受性を決定する13。そこで、Aモデルにおける糞便中の細菌叢組成を解析した。
OTUレベルのBray-Curtis指数に基づく主座標分析（PCoA）により、細菌群集は食餌によって第1軸に沿って別々にクラスター化した（F = 27.39; p < 0.0001）のに対し、第2軸スコアプロットは遺伝子型によるクラスターの可能性を示唆し（F = 1.99; p = 0.082 ）、主にコントロール食摂取群で観察された（図1H）。
3週間後、CDA-HFD摂取により、シャノン多様性指数で算出される微生物叢の多様性は増加したが、MCJ欠乏では減少する傾向があった（図S4A）。門レベルの腸内細菌叢プロファイルは、食餌と遺伝子型によって著しく変化した（図S4B）。食餌は腸内細菌叢の構成を属レベルでも大きく変化させたが、MCJ-KO遺伝子型に関連する特定のプロファイルが確認された。AF12、Anaeroplasma、Christensenella、Coprococcus、Ruminococcus、Turicibacterの相対量は、対照食を与えたMCJ-KOグループで減少したが、DoreaとOscillospiraはWTマウスと逆のパターンを示した（図1I）。さらに、CDA-HFD給餌によるMCJ-KO遺伝子型に関連した変化も観察され、Bacteroides属の増加、Bilophila、Lactobacillusおよび[Ruminococcus]の減少が指摘された（図1J）。興味深いことに、MCJ欠損マウスでは、Doreaが増加し、AF12、Allobaculum、[Ruminococcus]が減少するなど、食餌に関係なく遺伝子型に依存した影響を示す細菌があった（図1K）。MCJ-KO遺伝子型に関連するOTUレベルでの差異を線形判別分析効果量分析により調べた（図S4C）。
NASH発症におけるMCJ-KO遺伝子型に関連するこの腸内細菌叢プロファイルは、肝保護効果、線維化の進行の回避および腸管バリアの完全性の維持に重要な役割を果たすと考えられる。
MCJ-KOマウスからCDA-HFD飼育GFマウスへの腸内細菌叢移植は肝障害を改善する
CDA-HFD飼育MCJ-KOマウスで観察された保護効果が特定のマイクロバイオームシグネチャーによるものであり、したがって移植可能かどうかを調べるために、GFマウスにCMTを施し、3週間CDA-HFD食を与えた（図S1）。選択されたドナーの個々の値は、表S1に描かれている。
CDA-HFD食は、組織学的評価によると、肝脂肪沈着、初期炎症、バルーン形成の増加を伴うNAFLDの初期段階を移植GFマウスにもたらした（図2A）。MCJ-KO CDA-HFD飼育ドナー（dCDA-HFD/KO）移植GFマウスでは、炎症が抑制された（図2A）。そのほか、WT CDA-HFD食ドナー群と比較して、dCDA-HGF/KO移植マウスでは肝トリグリセリド量の減少（図2B）および血清アミノトランスフェラーゼ値の低下（図2C）も確認された。炎症性サイトカインの研究では、Ccr5、Il-1β、Il-6、Tnfの発現がMCJ-KOドナーからのCMT後に有意にダウンレギュレートされたことから、これらの結果が確認された（図2D）。さらに、MCJ-KO対照食餌ドナー（dC/KO）およびdCDA-HFD/KOレシーバー群のいずれにおいても、線維化の進展は遅延し、WTマイクロバイオータ移植群と比較して、α平滑筋アクチン染色（図2E）およびCol1a1、マトリックスメタロペプチダーゼ9（Mmp9）ならびにTgf-βの発現（図2F）が著しく減少しました。
図2：
選択したドナーから移植した無菌マウスにおけるNAFLDに関連する特徴の発現。(A）ヘマトキシリン・エオジン染色した肝臓切片（100倍）およびNAFLD活性スコア（脂肪症、小葉の炎症、バルーニングの個々のスコアから算出）。(B) 肝内トリグリセリド量。(C）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）形質値。(D）炎症性C-Cケモカイン受容体5（Ccr5）、Il-1β、Il-6、Tnfの肝臓メッセンジャーRNA（mRNA）相対発現量。 E）α-平滑筋アクチン（α-SMA）染色肝臓断面の定量と代表値。(F）線維化マーカーであるコラーゲンタイプ1α1鎖（Col1a1）、マトリックスメタロペプチダーゼ9（Mmp9）、トランスフォーミング成長因子β（Tgf-β）の肝mRNA相対発現。各実験グループには少なくともn = 6を使用した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 対 野生型（WT）対照食摂取ドナー（dC/WT）（対照食）； # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0. 001対dC/WT（コリン欠乏・L-アミノ酸規定・高脂肪食［CDA-HFD］）；a p < 0.05, aa p < 0.01, aaa p < 0.001 対WT CDA-HFD-fed donor (dCDA-HFD/WT) (CDA-HFD)
以上より、MCJ-KOドナーからのCMTを受けたCDA-HFD飼育GFマウスは、NASHの進行が抑制されていることがわかった。このように、MCJ-KOマウスで観察された肝保護効果は、腸内細菌叢の移植によって移行可能であることがわかった。
MCJ-KOの微生物叢シグネチャーはCMTを通じて移植可能であり、CDA-HFD飼育のGFマウスにおいて腸管バリアの完全性を維持する。
MCJ-KOドナーからのCMTが腸管バリア統合性と腸肝軸に及ぼす影響を明らかにするため、CDA-HFDを与えたGFマウスで組織学的および遺伝子発現試験を実施した。回腸の組織学的解析では、有意差は認められなかった（図3A）。しかし、MCJ-KOドナー由来のGFマウスでは、Nlrp3およびTlr-4の肝臓mRNAレベルの低下とともに、Claudin-1およびZo-1の相対発現が増加した（図3B）（図3C）。したがって、Aモデルで示された、これらの遺伝子のアップレギュレーションを打ち消すMCJ欠乏の能力は、CMT後にも観察された。
図3：
メチル化制御Jタンパク質ノックアウト（MCJ-KO）遺伝子型のコリン欠乏L-アミノ酸規定高脂肪食（CDA-HFD）-無菌（GF）マウスへの移植が腸-肝軸および腸内細菌叢組成に及ぼす影響。(A）ヘマトキシリン・エオジン染色した腸切片（×100）、組織学的評価。(B）クローディン-1およびZonula occludens 1（Zo-1）の腸内メッセンジャーRNA（mRNA）相対発現。(C）NOD、LRR、およびピリンドメイン含有タンパク質3（Nlrp3）およびToll様受容体4（Tlr-4）肝mRNA相対発現。(D) GFマウスの各ドナーから各レシピエントグループへの運用分類単位（OTU）レベルのベン図（相対存在量＞0.01%）。(E）CDA-HFD投与GFマウスのOTUレベルでのBray-Curtis非類似度指数に由来する主座標分析プロット。Aモデル（F）とCDA-HFD飼育の無菌マウス（Bモデル）の属レベルでの相対存在量の違い（G）。各実験群に少なくともn = 7を用いた。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 対 野生型（WT）対照食投与ドナー（dC/WT）（CDA-HFD）; # p < 0.05, ### p < 0.001 対 WT CDA-HFD 与えるドナー（dCDA-HFD/WT） （CDA-HFD)
ベン図を用いて、GFマウスの各ドナーから各レシピエントグループへのOTUレベルでの腸内細菌叢の移行を描写した。全OTUの約50%は、すべてのドナーと対応する両方のレシピエントの間で共有され、その他のOTUは少なくともどちらかのレシピエントグループで共有されていた（図3D）。CDA-HFD飼育のレシピエントは、コントロール飼育のレシピエントと比較して、シャノン指数に基づくα多様性がわずかに減少したが、この差はWTドナーからの微生物叢を移植したグループでのみ有意となった（図S5A）。その上、CDA-HFDを与えたGFマウスのOTUレベルでのBray-Curtis指数に基づくPCoAでは、第1軸に従ってドナーの遺伝子型を考慮したセカール微生物叢の明確な分離が見られた（Fdonor_genotype = 8.29; p < 0.0001）. しかし、ドナーの食事は、細菌群集を識別する別の要因として作用した（Fdonor_diet = 7.44; p < 0.0001）（図3E）。さらに、すべての実験グループを比較するBray-Curtis指数に基づくPCoAも実行された（図S5B）。
移植されたGFマウスの門派レベルでの微生物叢組成分析は、食事、またはドナーの食事と遺伝子型のいずれかに影響された（図S5C）。Aモデルと同様に、食事と遺伝子型は、門レベルで腸内細菌群集構造に広範な変化を引き起こした（図S4C）。属レベルでは、MCJ-KO遺伝子型（図3F）に関連する腸内細菌叢プロファイルは、CMTを介して、CDA-HFDを与えたGFマウス（図3G）へ移行した。Aモデルでは、AF12と[Ruminococcus]の相対存在量はMCJ-KO遺伝子型に伴って減少パターンを示したが、DoreaとOscillospiraは反対の傾向を示した（図3F）。CDA-HFD（図3G）および対照食（図S5D）を与えたGFマウスでは、これらの属の相対存在量に同じ腸内細菌叢プロファイルが観察された。
MCJの欠乏は肝NAD+を増加させ、それはCMTを介して伝達され、脂肪酸酸化を増強することができる。
MCJ欠損は脂質βの酸化を促進し、食事誘発性NAFLDモデルにおける肝脂肪症を改善する9。そこで、MCJ-KOマウス（Aモデル）でも同様の効果を確認することを目的とした。CDA-HFDを投与したMCJ-KOマウスでは、脂肪酸輸送タンパク質2（Fatp2）およびアシル-CoA脱水素酵素長鎖（Acadl）の肝臓での発現が有意に増加し（図4A）、脂質β酸化活性の亢進が指摘された。さらに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）は脂肪酸酸化に不可欠であり、酸化型（NAD+）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに対する還元型（NADH）の比率が大きく増加すると、その抑制に有利になる。NAD代謝に関与する酵素を分析すると、CDA-HFD MCJ-KOマウスではWTと比較して肝ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Nampt）およびサーチュイン（Sirt）1相対発現が増加した（図4B）。興味深いことに、肝NAD+、NADH、およびそれらの比の測定は、CDA-HFD食MCJ-KOマウスにおけるNAD+利用率の有意な増加を示した（図4C）。
図4：
AおよびB両モデルにおける肝脂肪酸酸化およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）産生。Aモデル：（A）AcadIおよび脂肪酸輸送タンパク質2（Fatp2）の肝臓メッセンジャーRNA（mRNA）相対発現量。(B）NAD+合成酵素であるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Nampt）およびサーチュイン（Sirt）1の肝臓mRNA相対発現量。 C）総NAD（NADt）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）およびNAD+／NADH比の肝臓レベル。Bモデル：（D）NAD+合成酵素NamptとSirt1の肝mRNA相対発現量。 E）NADt、NADH、NAD+/NADH比の肝臓レベル。(F)脂肪酸酸化アッセイ。(G）AcadIおよびFatp2の肝mRNA相対発現量。各実験グループにおいて、少なくともn＝6を使用した。*p < 0.05; **p < 0.01 対 コリン欠乏、L-アミノ酸定義、高脂肪食（CDA-HFD）/野生型（WT）。AモデルにおけるDoreaの相対存在量と（H）肝NAD+/NADH比および（I）Sirt1の相対mRNA発現量との間のピアソンの相関係数、p値および直線関係（黒線および四角）。(J）BモデルにおけるDoreaの相対存在量とNamptおよびSirt1の肝相対mRNA発現量とのピアソンの相関係数、p値、および直線関係（青線および点）。
次に、このNAD+利用率の向上が、CMTを介してCDA-HFDを摂取したGFマウスにも移行しているかどうかを調べることを目的とした。MCJ-KO微生物叢を摂取したGFマウスでは、NamptとSirt1の肝発現が有意に高く（図4D）、NAD+利用率の有意な上昇も見られた（図4E）。そこで、肝臓の脂肪酸酸化活性とFatp2およびAcadlの発現を測定したところ、MCJ-KO微生物叢の移植を受けたGFマウスでは、有意に活性が上昇していることが確認された（図4F,G）。
MCJ-KOメタゲノムが肝保護効果を発揮する特定のメカニズムに関する可能な洞察を得るために、肝、メタゲノム、およびメタボローム結果に基づく相関分析を実施した。興味深いことに、Aモデルでは、Dorea属の相対量と肝の(1)NAD+/NADH比および(2)Sirt1発現量の間に正の相関が観察された（図4H、I）。さらに、肝のSirt1およびNampt発現量も、BモデルにおけるDoreaの相対的存在量と正の相関を示した（図4J）。
したがって、MCJ-KOマウスの肝臓に見られるNAD+の利用可能性の増加は、CMTを介して伝達され、肝脂肪酸酸化の増加、NASスコアと肝内脂質の蓄積の減少を可能にします。
MCJ-KOマウスの特異的なマイクロバイオームの特徴は、具体的なメタボロームプロファイルとリンクしており、腸内のNAD+生合成を促進する。
両モデルに共通するマイクロバイオームシグネチャーを確認した後、腸内細菌叢がこの肝保護効果を発揮している可能性のあるメカニズムを明らかにするために、両モデルの糞便メタボロームを解析しました。
Aモデルでは、主成分分析（PCA）により、第1軸に基づく食事に応じた代謝物の明確な分離（38.6%）に加え、遺伝子型に起因するわずかな分離（12%）も見られました（図5A）。さらに、部分最小二乗判別分析を用いて、コントロール（図S6A）とCDA-HFD（図S6B）を与えたWTマウスとMCJ-KOマウスを識別する代謝物を特定し、MCJ欠損に関連する特定の代謝物プロファイルを示しました。各グループに対する特定の代謝物の寄与を、VIP（Variables Importance in Projection）スコアで示し、コントロール食を与えた動物（図S6C）およびCDA-HFDを与えた動物（図S6D）でVIPスコアが高い上位15代謝物を示した。MCJ-KOとWTの遺伝子型を識別することができるいくつかの代謝物は、コントロールとCDA-HFDを与えた動物の間で異なっていたが、リボフラビン、イソバレリルカルニチン、ヘキソース、インドールなどの他の代謝物は共通していた。食餌とは無関係にMCJ欠乏症と有意に関連した代謝物はシチジンとリボフラビンであったが、アデノシン、カルニチン、ゲンチジン酸、ヒデオキシコール酸などの他の代謝物は、遺伝子型によって有意に達することなく変化した（図5B）。さらに、コントロール給餌マウスのMCJ欠損は、デオキシコール酸の有意な減少、アラントイン、カルノシン、デスチオビオチン、およびソルビトールの有意な増加と関連していた（図5C）。しかし、CDA-HFD飼育マウスのMCJ欠乏症では、ベタイン、ビシン、N-アセチルノイラミン酸のわずかな増加が観察されたものの、パントテン酸と4-アミノ安息香酸は反対の傾向を示した（図5D）、検出代謝物の有意差は報告されていない。
図5：
Aモデルの糞便メタボローム解析。(A）代謝物プロファイルの主成分分析。PC1値およびPC2値を括弧内に示す。斜線部は、食餌および遺伝子型に応じたサンプルクラスターを示す。(B）野生型（WT）マウスとメチル化制御Jタンパク質ノックアウト（MCJ-KO）マウスの食餌に依存しない代謝物の差異を示す。(C）対照食を与えたWTマウスとMCJ-KOマウスの代謝物の違い。(D)コリン欠乏・L-アミノ酸定義・高脂肪食（CDA-HFD）を摂取したWTマウスとMCJ-KOマウスの代謝物の違いについて。*p < 0.05. (E）主要な短鎖脂肪酸：酢酸、酪酸、プロピオン酸、イソ酪酸の糞便中濃度。(F) Doreaの相対量とアデノシン、ベタイン、リボフラビンのピーク面積のピアソンの相関係数、p値、および直線関係。各実験群に少なくともn = 5を使用した
さらに、腸内バリアーの維持、肝脂質代謝、炎症に関与する腸内細菌叢の機能性に関連する主要代謝物の一つである糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）を測定したところ14、MCJ-KOマウスは食事によりその含有量が著しく増加したが、CDA-HFD飼育WTマウスはコントロールと比較してSCFAが減少していた。驚くべきことに、CDA-HFD飼育のMCJ-KOマウスは、CDA-HFD飼育のWTマウスと比較して、プロピオン酸およびイソ酪酸濃度が著しく増加した（図5E）。
さらに、MCJ-KO腸内細菌叢シグネチャーを特徴づける主要属の1つであるDoreaの相対存在量と、MCJ-KO遺伝子型に直接関連する代謝物であるアデノシン、ベタイン、リボフラビンレベルとの間に正の相関が見出された（図5F）。
MCJ欠損に関連する特異的なメタボロームプロファイルが、CMTを介してBモデルにも移行可能かどうかを調べるために、移植したGFマウスの糞便メタボロームを解析しました。PCAの結果、代謝物は第2軸に基づく食事によってクラスター化されていたが（19.4%）、ドナー食事に関連する第3軸に沿って腸内細菌叢に起因する分布も観察された（8.8%）（図S7A）。さらに、CDA-HFDにおけるメタボロームのクラスタリングを特定するために、2回目のPCAを実施し、ドナーの食事と遺伝子型の影響を観察しました（図S7B）。さらに、アデノシン、インドール、イソバレリルカルニチン、リボフラビンはdC/KOレシピエントで部分的に増加し、MCJ-KOマウスで観察されたプロファイルに似ており（Aモデル）、CMTを介してわずかに伝達効果があることを示唆した（図 S7C）。
これらの結果から、Aモデルで観察されたMCJ欠損に関連する特異的なメタボロームは、GFマウスでは完全には移行・維持されなかったが、アデノシンやリボフラビンなどのいくつかの代謝物パターンは依然としてすべてのGFマウス群で検出され、NAD+代謝の増強に関与している可能性があることが示されました。
MCJ-KO微生物叢を投与したCDA-HFD飼育GFマウスで認められた肝NAD+利用率の上昇が、MCJ欠乏症の腸内細菌叢シグネチャーによることを確認するために、NAD+代謝に関わる主要酵素の発現と腸内のNAD+レベルを測定しました。興味深いことに、MCJ-KO微生物叢を移植したGFマウスでは、腸内総NADレベルおよびNAD+/NADH比（図6B）とともに、NamptおよびSirt1の腸内発現が著しく増加した（図6A）。実際、dCDA-HFD/KO移植群では、腸内のNAD+/NADH比が最も高く、NAD+の利用可能性が増加したことが確認された。興味深いことに、Doreaの相対的存在量と腸内NAD総量との間に正の相関が観察された（図6C）。また、腸内Sirt1発現量も、肝Sirt1レベルで起こったことと同様に、Dorea属の相対的存在量と正の相関があった（図6D）。その上、同じパターンが、CDA-HFDを与えたMCJ-KOマウスを用いたAモデルで観察され（図6E-G）、NADシグナル伝達経路におけるこのバクテリアの役割の可能性を示唆した。
図6：
BモデルおよびAモデルの両方における腸内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）代謝。Bモデル、腸：（A）NAD+合成酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Nampt）およびサーチュイン（Sirt）1の相対的メッセンジャーRNA（mRNA）発現、（B）総NAD（NADt）、還元ニコチンアミドアドネインジヌクレオチド（NADH）およびNAD+/NADH比のレベル。(C,D）コリン欠乏L-アミノ酸規定高脂肪食（CDA-HFD）を与えた動物におけるDoreaの相対量と（C）総NAD、（D）Sirt1の相対mRNA発現量のピアソンの相関係数、p値、直線関係（青線と点）。Aモデル、腸：（E）NAD+合成酵素NamptおよびSirt1のmRNA相対発現量。 F）NADt、NADHおよびNAD+/NADH比のレベル。各実験グループには少なくともn = 6を使用した。*p < 0.05; **p < 0.01, ***p < 0.001 対 CDA-HFD/wild type (WT)。(G）CDA-HFDを摂取した動物におけるDoreaの相対量とSirt1の相対mRNA発現量のピアソンの相関係数、p値、直線関係（黒線と四角形）。
以上のことから、Mcj欠損マウス由来の特定のマイクロバイオームシグネチャーとその特定の代謝が、食事誘発NAFLDモデルにおいてNASHの進行を遅らせることができ、この肝保護はCMTを通じて伝達可能であることが示されました。
NAFLD患者さんのヒトコホートにおけるDorea属の役割の検証
さらに、Dorea属は、MCJ欠乏によって発揮されるNAFLD発症に対する保護効果における腸内細菌叢の調節の役割を理解する上で、最も適切な属の1つとして際立っています。これは、MCJ-KOマウスにおけるその高い存在量とGFマウスへの完全な伝播によるものだけでなく、相関分析により、この属が観察された効果の主要な貢献者の1つであると指摘されたためである。そこで、ヒト疾患における本属の関連性を検証するため、公開されているヒト情報の解析を実施した。双子と肝硬変患者のコホート15からのデータを、Leeらのアプローチに従って解析した16。患者は、体格指数（BMI）に応じて肥満（BMI≧30；n＝71）と非肥満（BMI＜30；n＝121）に分けられ、興味深いことに、非肥満のサブセットにおいて、Doreaの糞便存在量は、NAFLDが存在すると著しく低下したが（p＝0.026）、肥満の患者では有意差が認められなかった（p＝0.636）（図 S8）。これらの知見は、Dorea属の減少を特徴とする、痩せ型NASH患者における腸内細菌叢組成の特異的変化を指し示す可能性がある。
考察
ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、および腸内細菌叢の変化が、その移行に重要な役割を果たす可能性があります。1 最近のデータでは、内因性のミトコンドリア複合体Iの阻害剤であるMCJの欠如が、NASHにおけるミトコンドリア活性を高めることが示されています9 。さらに、潰瘍性大腸炎における腸内細菌と宿主の相互作用にMCJが関与していることが以前に報告されている11。したがって、我々は、NASHにおける腸-肝臓軸のミトコンドリア活性の増加が及ぼす影響を調べ、MCJ-KOマウスで観察された肝臓保護表現型が微生物に関連しており、CMTを介してGFマウスレシピントに移行するかどうかを明らかにする目的で、この実験を行った。
我々の以前の知見と同様に、6週間のCDA-HFD後のMCJの欠如は、炎症と線維化を相殺し、NAFLD発症におけるMCJ欠乏の潜在的な保護効果を補強した9。NASHの進行における腸-肝臓軸の役割は深く報告されているが2、腸の状態および腸内細菌叢の組成におけるMCJ-KOの影響は調査されていなかった。我々の研究では、脂肪性条件下で、MCJ欠損は主要なタイトジャンクションタンパク質の発現を増加させ、血漿中のエンドトキシン（Lipid A）および炎症性サイトカインレベルを減少させました。興味深いことに、MCJ-KOマウスは、腸内細菌由来の肝毒性または免疫刺激性化合物の潜在的センサーである肝Tlr-4およびNlrp3の発現が低下し、腸-肝軸の状態が改善されていた18。したがって、MCJ欠損によるミトコンドリア活性の向上は、NAFLDの進行を特徴づける腸肝軸の変化に対抗するものであり、腸のバリアを強化し、肝炎を悪化させ病気の進行を加速させる門脈血行への細菌産物の移行を減少させるものである19。
さらに、MCJ-KOマウスは、食事とは無関係に特定の腸内細菌叢組成を示し、Dorea属の増加、AF12、Allobaculum、[Ruminococcus]の減少によって特徴づけられる。これらの点から、NAFLDにおけるDorea属の関与を示した研究もある3,20。しかし、いずれの場合も、肥満のある被験者を対象とした研究であり、DoreaとBMIの間に正の相関があることが示された。実際、NAFLD患者の公的コホートの解析では、NAFLD患者のうち非肥満の患者では、NAFLDでない患者と比較してDoreaが有意に減少していることが示された21、22。さらに、CDA-HFDはリーンNASHの攻撃的な食事モデルとして報告されており、肥満を促進することなく疾患の進行状態を作り出す12。したがって、本研究では、CDA-HFD/KOマウスにおけるDorea属の増加が観察された保護効果に関与していると考えられる。また、Dorea属は、マルチストレインプロバイオティクスによる治療後に増加し、肝脂肪率の低下と関連することが報告されている23。さらに、AllobaculumはNAFLDマウスモデルにおける高脂肪食の摂取と関連し、13、24、RuminococcusはNAFLD発症と広く関連しており3、20今回の結果を補強する。しかし、我々の研究では、遺伝子型に起因する特定の微小環境とその結果としての特定の代謝が、MCJ-KO依存的に腸内細菌叢25を形成し、結果として微生物叢シグネチャーを生み出していることは確かであることは注目に値する。
MCJ-KOマウスの特異的なマイクロバイオームシグネチャーに関連して、糞便メタボローム解析では、アデノシン、シチジン、リボフラビンが食事とは無関係に増加し、ベタインなどの他の代謝産物はCDA-HFD飼育MCJ-KOマウスで増える傾向があることが示された。アデノシン26とベタインが高値を示した理由は、ミトコンドリア活性の亢進にあるのかもしれない27,28。興味深いことに、CDA-HFDを投与したMCJ-KOマウスでは、糞便中のプロピオン酸およびイソ酪酸の濃度が有意に増加した。この2つのSCFAは、人間の健康にとって有益な効果をもたらす主要なSCFAの1つである。実際、SCFAによる治療は、抗酸化作用、炎症性メディエーターのダウンレギュレーション、腸管バリアの完全性の維持、およびミトコンドリア呼吸能力の増加を示している14,30,31。
重要なことに、我々の解析では、アデノシンおよびベタインと、MCJ-KO遺伝子型と関連する主要な分類群の一つであるDorea属の存在量との間に正の相関が示され、以前に示されたように、これらの代謝物によるDorea属の存在量の制御が示唆された32, 33 まとめ：これらの代謝物の存在量は、主にDorea属種の腸内の適合性を高める、MCJ-KO特有の微生物署名を決めている可能性があります。
MCJ-KOマウスからCDA-HFD飼育GFマウスへのCMTは、肝障害を改善し、腸バリア完全性と腸-肝軸状態の部分的回復を誘導したことから、遺伝子型の保護効果が微生物叢によって伝達されることが示されました。さらに、Aモデルで観察されたAF12、Dorea、Oscillospira、およびRuminococcusの相対量に関する同じパターンがBモデルでも検出され、肝保護効果がこの特定のマイクロバイオームシグネチャーによって媒介されていることを裏付けています。
次に、MCJ-KO依存のメタボロームによって形成されたこの細菌群が、食事性NASHモデル後の腸と肝臓の両方でどのように保護効果を発揮するかを理解しようとしました。MCJの欠損がミトコンドリア活性とATP産生を増加させ、NAD代謝に影響を与えることは既に述べたとおりである8。MCJ-KOマウスでは、肝臓と腸管組織の両方でNAD+/NADH比の有意な増加が観察され、興味深いことに、MCJ-KO遺伝子型からのCMT後のCDA-HFD飼育GFマウスでも観察された。NAD+は、エネルギー代謝とミトコンドリア機能の燃料として重要な役割を果たすだけでなく、抗酸化防御システムの重要な構成要素であるNADPHの前駆体でもある37。実際、NAD+はNAFLDを予防・回復するターゲットとなりうることが提案されている38。NAD+前駆体は、NAFLDの前臨床モデルにおいて、肝ミトコンドリア機能を改善し、酸化ストレスを減少させることが判明しており39、その補充はNASHへの進行も防ぐ40。これらの知見と一致し、CDA-HFD飼育MCJ-KOマウス（Aモデル）およびGFマウス（Bモデル）では、肝のミトコンドリア機能の改善および脂質β酸化活性の向上が認められた。さらに、NAD+の生合成と調節における腸内細菌叢の寄与についてもわずかに述べられている41。本研究では、肝臓と腸で観察されたNAD+レベルの上昇は、MCJ-KOマウスだけでなくGFマウスでもDorea属の存在量の高さと関連していることが明らかになった。先行研究に基づき、我々は、CDA-HFDで飼育されたMCJ-KOマウスに見られるSCFAレベルの増加が、腸の代謝を促進し、その結果、NAD+レベルの増加を可能にしたのではないかと仮定する30。全体として、これらのデータは、NASH発症時のMCJ-KO腸内細菌群の保護作用の基礎となるメカニズムの可能性を指摘する。
さらに、NAD+は、SIRTを含む様々な酵素の基質としても機能する38。肝のSIRT1活性は、デノボ脂肪生成を抑制し、β酸化を促進し42、腸では、SIRT1は急性腸炎において抗炎症作用を発揮し43、腸のバリア機能を維持している44。我々は、CDA-HFDで飼育したMCJ-KOマウス（Aモデル）、およびMCJ-KOの微生物群を移植しCDA-HFDで飼育したGFマウス（Bモデル）で、Sirt1の肝および腸のmRNAレベルが有意に高いことを確認した。実際、NAD+/NADH比の場合と同様に、2つのモデルにおいて、Sirt1発現とDorea存在量の間には、肝臓と腸組織の両方で正の相関が観察されました。水素は、ミトコンドリアのNAD+生産を回復させるだけでなく、サーチュインのダウンレギュレーションを回避することができる45。
現在、NASHの発症を抑制または回復させる有効な治療法は承認されていません。リーンNASHの患者の重症度とともに、その有病率の増加を考慮すると、代替治療が強く求められています。ここでは、MCJの欠損とその結果改善されたミトコンドリア活性が、攻撃的なNASHリーン食モデルにおいて疾患進行を遅らせることができる特異的で保護的なマイクロバイオームの特徴を再構築していることが示された。これらの結果は、NASHにおけるミトコンドリアと微生物叢のクロストークの重要性を強調し、微生物叢の移植に基づく治療戦略を指し示し、異なるアプローチへの道を開くものである。
著者貢献
研究の着想または設計： María Juárez-Fernández、Naroa Goikoetxea-Usandizaga、María Luz Martínez-Chantar、Sonia Sánchez-Campos、。データの取得、分析、解釈： María Juárez-Fernández、Naroa Goikoetxea-Usandizaga、David Porras、Maria Victoria Garcia-Mediavilla、Héctor Rodríguez、Ester Nistal、Miren Bravo、Marina Serrano-Maciá, Jorge Simón, Teresa C. Delgado, Sofía Lachiondo-Ortega, Susana Martínez-Flórez, Óscar Lorenzo, Mercedes Rincón, Marta Varela-Rey, Leticia Abecia, Juan Anguita, María Luz Martínez-Chantar, Sonia Sánchez-Campos. 原稿を作成した： María Juárez-Fernández、Naroa Goikoetxea-Usandizaga、María Luz Martínez-Chantar、Sonia Sánchez-Campos（ソニア・サンチェス・カンポス）。著作物の実質的な改訂を行った： María Juárez-Fernández、Naroa Goikoetxea-Usandizaga、Esther Nistal、Maria Luz Martínez-Chantar、Sonia Sánchez-Champos。
資金情報
本研究は、Ministerio de Ciencia e Innovación, Programa Retos-Colaboración RTC2019-007125-1 (for Jorge Simón and María Luz Martínez-Chantar) からの助成金によって支援されました； Instituto de Salud Carlos III, Proyectos de Investigación en Salud DTS20/00138 (for Jorge Simón and María Luz Martínez-Chantar); Departamento de Industria del Gobierno Vasco (for María Luz Martínez-Chantar); Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades MICINN： PID2020-117116RB-I00、FEDER基金との共同出資による国家科学技術・イノベーション研究計画（Maria Luz Martínez-Chantar用）、Ayudas Ramón y Cajal de la Agencia Estatal de Investigación RY2013-1366（LeticiaAbecia用）、BIOEF（バスクイノベーションとヘルスリサーチのための基金）； Asociación Española contra el Cáncer (for María Luz Martínez-Chantar); Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) Rare Tumor Calls 2017 (for María Luz Martínez-Chantar); La Caixa Foundation Program (for María Luz Martínez-Chantar); Proyecto Desarrollo Tecnologico CIBERehd (for María Luz Martínez-Chantar). 本研究は、Ministerio de Economía y Competitividad/FEDER (BFU2017-87960-R; PID2020-120363RB-I0) (for Sonia Sánchez-Campos) および Junta de Castilla y León (FEDER) (GRS2126/A/2020; LE063U16; LE017P20) (for J.G.-G および Sonia Sánchez-Campos) からの助成も得ている。María Juárez-Fernándezは、Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades（FPU18/06257）のフェローシップ、David Porrasは、欧州社会基金の共同資金によるJunta de Castilla y Leónのフェローシップによって支援されました。CIBERehdは、スペインのInstituto de Salud Carlos IIIから資金援助を受けています。メタボローム解析を行ったMS-OmicsのDanielsen博士、メタゲノム解析を行ったUnidad de Genómica of SCSIE from Universitat de Valenciaに感謝したい。
利益相反
Rincón博士はMitotherapeutix LLCのScientific Founderであり、Martínez-Chantar博士はMitotherapeutix LLCの顧問を務めています。
データ利用声明
データは、合理的な要求があれば入手可能である。本研究の16S配列データは、EMBL-EBIのEuropean Nucleotide Archive (ENA) にアクセッション番号PRJEB55379で寄託されています。
参考文献
バラードJWO、タワルニッキSG. ミトコンドリア、腸内細菌叢、活性酸素。セルシグナル(Cell Signal). 2020;75:109737.
引用元｜こちら
Googleスカラー
2. Ye JZ, Li YT, Wu WR, Shi D, Fang DQ, Yang LY, et al. メチオニン・コリン欠乏食誘発非アルコール性脂肪肝炎の発症における腸内細菌叢とメタボロームの動的な変化. World J Gastroenterol. 2018;24:2468-81.
引用元｜こちら
グーグル スカラー
3. Boursier J, Mueller O, Barret M, Machado M, Fizanne L, Araujo-Perez F, et al. 非アルコール性脂肪性肝疾患の重症度は、腸内細菌叢の代謝機能の変化と腸内細菌異常と関連している。Hepatology. 2016;63:764-75.
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補足デジタルコンテンツ
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