1型糖尿病患者における全身および腸管IgA免疫応答の変化

哉百名


J Clin Endocrinol Metab. 2020 Dec; 105(12): e4616-e4625. オンライン公開：2020年8月29日.
PMCID: PMC7549925PMID: 32860693
1型糖尿病患者における全身および腸管IgA免疫応答の変化

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7549925/

Juan Huang,1,2 Gan Huang,1 Xia Li,1 Fang Hu,1 Zhiguo Xie,1 Yang Xiao,1 Shuoming Luo,1 Chen Chao,1 Keyu Guo,1 F Susan Wong,3 Zhiguang Zhou,1 and Li Wen2
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要旨
目的
免疫グロブリンA（IgA）が腸内恒常性とその後の宿主免疫を調節することにより、自己免疫の感受性に重要な影響を及ぼすという観察を支持する証拠が増加している。われわれは、1型糖尿病患者ではIgA免疫が変化しているという仮説を立てた。この仮説を検証するために、1型糖尿病患者における腸管、経口、末梢のIgA免疫応答について検討した。

方法
1型糖尿病と診断された患者（1年以内と1年以上）と健常対照者から便、口腔、血液を採取した。血清膵島自己抗体価は放射性抗原測定法により検出した。IgA結合細菌およびIgA発現B細胞はフローサイトメトリーにより調べた。経口遊離IgA値は酵素結合免疫吸着測定法により測定した。血清および便の遊離IgA濃度は免疫比濁法により測定した。

結果
1年以内に1型糖尿病と診断された人は、健常対照者と比較して便中IgA結合菌の割合が増加していた。便中IgA結合菌の割合は、グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体価と正の相関を示した。さらに、罹病期間が長い人は、1年以内に診断された人よりもIgA結合菌のレベルが高かった。健常対照者と対照的に、1型糖尿病患者では血清IgA濃度が上昇していた。

結論
1型糖尿病患者では、IgA免疫の変化、特に便中IgA結合菌の増加が認められ、これがβ細胞自己免疫と疾患発症に関与している可能性が高い。

キーワード B細胞、腸内細菌叢、IgA免疫、粘膜免疫、1型糖尿病
1型糖尿病は、膵β細胞の破壊によって引き起こされる免疫関連疾患であり(1)、免疫細胞とβ細胞との複雑な相互作用が関与している(2)。CD4+T細胞やCD8+T細胞などの適応免疫リンパ球がβ細胞障害において支配的な役割を果たすことが証明されている一方(2-6)、B細胞はT細胞を介した自己免疫の促進において重要である(7)。ヒト1型糖尿病の動物モデルを用いた先行研究では、B細胞欠損（μMT-/-）非肥満性糖尿病マウスは免疫グロブリンの産生にも障害があり、1型糖尿病の発症から保護されることが明らかにされており、B細胞とBリンパ球が産生する抗体が1型糖尿病の免疫病態に重要であることが示唆されている(7-10)。さらに、我々は、新たに1型糖尿病と診断された人において、辺縁帯B細胞（MZB）が増加し、濾胞B細胞（FoB）が減少していることを示したが、これはβ細胞機能やグルコースレベルの変化と密接に関連しており、B細胞に対する自己寛容の喪失にB細胞が関与していることを示している(11)。

B細胞から分泌される免疫グロブリンのうち、免疫グロブリンA（IgA）は、腸管上皮部位への細菌性病原体の移動および／または付着を抑制することにより、粘膜免疫の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが知られている(12-15)。腸内常在菌に反応するIgAは腸内細菌叢に結合し、腸内細菌叢の組成と機能を変化させ、その結果、宿主の免疫力を制御することが実証された(16-19)。健康なヒトでは、初期の研究で、かなりの割合の腸内細菌叢がIgAと結合し、恒常的な状態で安定に維持されていることが示された(20)。近年、IgAの異常分泌や細菌へのIgA結合が、炎症性腸疾患、抗リン脂質症候群、アレルギーなどの自己免疫疾患の罹患率の上昇と関連していることが報告されている(21-23)。さらに、選別されたIgA結合細菌の16SリボソームRNA配列決定から、これらの自己免疫疾患や炎症性疾患を有する人の腸内IgA結合細菌の分類学的構造は、健常対照者のそれとは大きく異なることが明らかになった（21、24、25）。興味深いことに、IgA結合菌は非IgA結合菌よりも大腸炎の誘発に強い病原性を示す(15)。これらの研究は、IgAが腸の恒常性の維持や自己免疫感受性の媒介に重要な役割を果たしていることを示唆している。しかし、1型糖尿病における粘膜IgA免疫の役割についてはほとんど知られていない。我々は、粘膜部位を含むIgA免疫応答の変化が1型糖尿病の発症に関与している可能性があると考えた。

1型糖尿病におけるIgA免疫の役割を包括的に検討するために、我々は1型糖尿病患者の粘膜および全身のIgA免疫を評価した。粘膜IgA免疫については、便および口腔におけるIgA結合菌の割合、ならびにこれら2つの粘膜部位における遊離IgA量を調べた。全身性IgA免疫については、末梢血単核球（PMBC）におけるIgA発現B細胞の割合と、1型糖尿病患者および性・年齢をマッチさせた健常対照者の血清中の循環IgAレベルを調べた。その結果、ヒトの1型糖尿病の発症におけるIgAの潜在的な役割について新たな知見が得られた。

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材料と方法
研究参加者
1年以内に1型糖尿病と診断された23人（平均罹病期間5.5ヵ月、範囲1日〜12ヵ月）と、性・年齢をマッチさせた25人の健常対照者を、中南大学第二湘雅病院から中国人集団から募集した（表1）。また、糖尿病罹病期間が長い患者におけるIgA結合菌レベルをさらに調査するために、年齢がほぼ同じであるが1年以上1型糖尿病と診断されている33人（平均罹病期間4年、範囲〜13ヵ月〜12年）も募集した。研究参加者の平均年齢は11〜13歳であった（表1参照）。1型糖尿病は米国糖尿病学会の基準（26）に従って診断された。除外基準は以下の通りであった： 1）試験登録前3ヵ月以内に抗生物質による治療を受けた者、2）試験登録前1週間にプロバイオティクスを使用した者、3）急性または慢性の炎症性疾患を有する者、4）試験中および/または試験登録前にインスリンによる糖尿病治療以外の薬物治療を受けていた者； 5)アレルギー、喘息、全身性エリテマトーデス、クローン病などの免疫学的既往歴のある人、6)悪性腫瘍の既往歴のある人、消化管疾患、重篤な心血管疾患、脳血管疾患、肝疾患、腎疾患などの健康問題の既往歴のある人、7)精神障害のある人。また、指示に従って検体を採取しなかった人も除外した。参加者全員とその法的保護者がインフォームド・コンセントを行った。口腔、便、血液サンプルは、新たに診断された参加者（1年以内に診断された）から採取し、1年以上前に診断された人からも便サンプルを採取した。本研究はヘルシンキ宣言に則って実施され、第二湘雅病院の倫理委員会の承認を得た。

表1.
人口統計および臨床情報a

健常者 1型糖尿病患者（1歳以下） 1型糖尿病患者（1～12歳）
人数（女性/男性） 25人（12/13） 23人（12/11） 33人（15/18）
年齢（歳） 11 (9.0-17.0) 12 (10.0-18.0) 13.0 (10.5-15.8)
空腹時グルコース、mmol/L 4.6（4.2-5.1）6.5（5.4-8.4）b 6.9（6.0-10.2）b
HbA1c, mmol/mol NA 74 (58-105) 69 (52-83)
HbA1c, % NA 8.90 (7.50-11.80) 8.50 (6.95-9.70)% FCP, pmol/L
FCP, pmol/L NA 121.5 (34.0-183.9) 14.8 (12.6-77.2)c
2hPCP, pmol/L NA 281.8 (173.7-528.4) 21.2 (14.1-180.0)c
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略語 2hPCP、食後2時間Cペプチド、FCP、空腹時Cペプチド、HbA1c、糖化ヘモグロビン、NA、入手不能。

aデータは中央値（25-75パーセンタイル）で示した。

b 健常対照者と比較したPは0.001未満であった。

c 1年以内に1型糖尿病と診断された患者と比較したPは0.001未満であった。

検体採取
口腔サンプル採取は、口腔衛生習慣、飲食の前の早朝に、10mLの滅菌生理食塩水で口腔内を洗浄することにより行った。採取後、サンプルを12,000 gで5分間回転させ、細菌をペレット化した。口腔内細菌は最終濃度25％のグリセロールに保存し、アッセイ前に-80℃で凍結した。上清は「遊離」IgA測定用に-20℃で凍結保存した。新鮮な便検体は、病院内または病院近くのホテルで無菌的に採取した。採取された検体は氷上に保存され、直ちに検査室に運ばれ、採取から2時間以内に分注され、-80℃で凍結された。血液検体は一晩絶食後に採取された。全血検体は、末梢血単核球（PBMC）分離の場合は抗凝固剤としてEDTAを、血清採取の場合は分離ゲルを含む採血管に採取した。血液サンプルは採取後2時間以内に処理された。密度勾配遠心分離で分離したPBMCは、凍結培地（40％子牛胎児血清、10％ジメチルスルホキシド、50％Roswell Park Memorial Institute-1640培地）に懸濁し、使用前に液体窒素で凍結した。血清サンプルは、3000rpmで5分間遠心分離した血液から採取し、検査前に-20℃で保存した。

糖化ヘモグロビン、グルコース、C-ペプチドアッセイ
糖化ヘモグロビン（HbA1c）は、BioRad VARIANT IIヘモグロビン検査システムを用いて測定した。血糖値の測定には日立7170型分析装置を用いた。C-ペプチド値はAdiva Centaur System（Siemens）を用いて検査した。以前に報告されたように、変動係数はアッセイ間で3.7％〜4.1％、アッセイ内で1.0％〜3.3％であった(27)。

膵島自己抗体測定法
抗グルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体(GADA)、抗インスリノーマ関連抗原-2自己抗体(IA-2A)、および抗亜鉛トランスポーター8自己抗体(ZnT8A)を含む自己抗体の力価は、放射性リガンドアッセイによって定量された。GADA、IA-2A、ZnT8Aアッセイの感度はそれぞれ82％、76％、72％であった。特異度はそれぞれ98％、100％、100％であった。GADA検査におけるアッセイ間およびアッセイ内の変動係数は、それぞれ8.9％および11.2％であった。これらの結果は、以前に記載されたように、2016年膵島自己抗体標準化プログラムにおいて評価された(28)。

免疫グロブリン測定
口腔洗浄液中のIgA濃度は、Southern Biotechnology社から購入した酵素結合免疫吸着アッセイ試薬を用いて検出した。簡単に説明すると、プレートに標準品または口腔サンプルを4℃で一晩コーティングした。洗浄およびブロッキング後、プレートをアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgAと室温で2時間インキュベートし、続いてさらに洗浄し、リン酸基質（Sigma）を添加した。酵素的な色の変化は、マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いて、推奨される光学濃度で測定した。血清IgM、IgG、およびIgAは、製造元の説明書（Beckman Coulter Life Sciences）に従って、比濁阻害免疫測定法により測定した。感度は、95％の信頼性でゼロと区別できる測定可能な最低濃度として定義される。血清IgG測定の感度は33.3 mg/dLである。血清IgM測定の感度は4.2mg/dL。血清IgA測定の感度は108mg/L。

細胞染色
PBMCを37℃の水浴中で適切に解凍し、完全培地で洗浄し、Fcブロッカーとともに室温で20分間インキュベートした。その後、細胞を表面分子に対するモノクローナル抗体で染色した。核内転写因子染色では、核内抗体染色の前に、細胞を固定し（1時間）、True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set（BioLegend社製）で透過処理した。細胞は以下のマーカーに対する抗体で染色した：フィコエリトリン（PE）抗ヒトIgA（RRID: AB_2727738）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）抗ヒトIgG（RRID: AB_1163674）、FITC抗ヒトCD185（CXCR5）（RRID: AB_2561896）、FITC抗ヒトCD40（RRID： AB_1186034）、APC抗ヒトIgM（RRID: AB_493012）、APC抗ヒトCD86（RRID: AB_2721448）、Alexa Fluor 647抗Pax-5（RRID: AB_2562425）、APC/Cy7抗ヒトCD19抗体（RRID: AB_314248）、PE/Cy7抗ヒトIgD抗体（RRID: AB_10680462）。染色した細胞をBD FACSCanto IIフローサイトメーターで分析し、結果をFlowJo 8.8.6（Tree Star）で解析した。リンパ球は、前方散乱領域（FSC-A）／側方散乱領域（SSC-A）の特性に基づいてゲーティングされた。単一細胞およびその後の生細胞は、それぞれFSC-A/前方散乱高さ（FSC-H）特性および7-AAD（7-アミノアクチノマイシンD）生存率染色に基づいてゲーティングした。解凍したサンプルの生存率は日常的に90％～96％であった。

細菌染色
便サンプルを解凍し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（1g/mL）に再懸濁し、30秒間激しくボルテックスしてホモジナイズした。遠心分離（300 g、1分間、室温）して大きな残渣を除去した後、300 μLの上清を「遊離」IgA測定に使用し、100 μLの上清をさらに12 000 gで5分間回転して細菌をペレット化し、IgA結合細菌染色に使用した。口腔サンプルは、37℃の水浴中で素早く解凍し、12,000 gで5分間スピンして細菌をペレット化した。糞便または口腔内の細菌ペレットを洗浄し、抗ヒトIgA-PE抗体（Miltenyi、RRID：AB_2727738）と室温で30分間インキュベートする前に、50μLの1％ウシ血清アルブミン／PBSに15分間再懸濁した。その後、サンプルを洗浄し、フローサイトメトリー解析用にPBSに懸濁した。コントロールとしてアイソタイプ抗体を用いた。

統計解析
統計解析はGraphPad Prismソフトウェア、バージョン8 for Macを用いて行った。データは平均値（平均値の下限95％信頼区間、上限95％信頼区間）、平均値±SD、または中央値（25～75パーセンタイル）で表した。解析の前にデータの正規性検定を行い、両側t検定（データが正規分布している場合）または両側Mann-Whitney検定（データが正規分布していない場合）で群間の統計的差異を解析した。多群間比較では、1元配置分散分析検定にTukey補正を加えた多重t検定を用いて差を分析した。B細胞上の表面マーカーの発現と血清免疫グロブリン濃度との間の差は、Holm-Sidak補正を加えた多重t検定を用いて決定した。相関と回帰は、両側PearsonまたはSpearmanノンパラメトリック相関係数検定と線形回帰を用いて解析した。G* Powerソフトウェアを用いた検出力の計算では、サンプルサイズ23は、効果量0.53、両側検定、Pが0.05のときに80％の検出力を与えることが示された。各実験で実施された正確なグループサイズと統計検定は、図の凡例に記載されている。P値が0.05未満を有意とみなした。

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結果
1型糖尿病患者は全身性免疫グロブリンA免疫に変化を示した
まず、新たに1型糖尿病と診断された人の末梢血B細胞の表現型を評価した。CD19+B細胞の割合に有意差は認められなかったが（データは示さず）、新たに1型糖尿病と診断された人のB細胞は、健常対照者のB細胞と比較して、CD40の発現の増加によって示されるように、より活性化された表現型を示した（97.01% [95% CI, 95.84%-98.19%] vs. 95.08%[95%CI,93.19%]）。 1B）、CXCR5の発現増加（93.30％［95％CI、92.28％-94.31％］ vs 90.66％［95％CI、88.97％-92.34％］、P = 0.03、図1C）であった。さらに、B細胞分化に重要な役割を果たす転写因子PAX-5の発現も、新たに1型糖尿病と診断された人では健常対照者と比べて増加していた（94.54％［95％信頼区間、91.97％-97.11％］ vs 86.39％［95％信頼区間、81.99％-90.79％］、P = 0.003、図1D）。さらに、新たに1型糖尿病と診断された人は、健常対照者と比較して、B細胞上の表面免疫グロブリンの発現が増加していた。 50％［95％信頼区間、25.63％-33.37％］ vs 22.34％［95％信頼区間、19.10％-25.58％］、P = 0.02）、IgG（5.46％［95％信頼区間、4.458％-6.462％］ vs 3.63％［95％信頼区間、2.702％-4.571％］、P = 0.02）であった。IgAの発現には有意差は認められなかったが（22.70％［95％CI、19.62％-25.78％］ vs 17.96％［95％CI、14.70％-21.22％］、P = 0.07）、明らかな傾向（統計学的調整前はP = 0.03）がみられたのに対し、IgDの発現は同等であった（図1Eおよびand1F）。循環における免疫グロブリンの放出を知るために、血清免疫グロブリン濃度を測定した。興味深いことに、分泌された循環中のIgMやIgG濃度には有意差はなかったが（図1G）、循環中のIgA濃度は、新たに1型糖尿病と診断された人では健常対照者よりも高かった（1.353g/L [95% CI, 1.119-1.587g/L] vs 0.8812g/L [95% CI, 0.5995-1.163g/L], P = 0.03、図1G）。これらのデータは、一般的にB細胞がより活性化されているだけでなく、IgAを発現しているB細胞は、健常対照者と比較して、新たに1型糖尿病と診断された患者において免疫グロブリンを放出する能力が強化されていることを示していた。

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図1.
新たに1型糖尿病と診断された患者と健常対照者の末梢血における全身性免疫グロブリンA（IgA）免疫応答。AからCは、新たに1型糖尿病と診断された人（n=23）と対照者（n=25）のCD19+ B細胞における活性化マーカーの発現。これらはA, CD40, B, CD86, C, CXCR5であった。D,新たに1型糖尿病と診断された人（n=23）と対照者（n=25）のCD19+ B細胞における転写因子PAX-5の発現。EおよびF、新たに1型糖尿病と診断された人（n=23）および対照者（n=25）のCD19+ B細胞における細胞表面免疫グロブリンの発現。EはB細胞上のIgM、IgG、IgA、IgDの代表的フローサイトメトリープロット、Fは要約した割合。G,新たに1型糖尿病と診断された人（n=23）と対照者（n=25）における血清IgM、IgG、IgA濃度。データはA～D、FおよびGは平均値±SDで表し、統計解析にはHolm-Sidak補正を加えた多重t検定または両側Mann-Whitney検定を用いた。*Pは0.05未満。**Pは0.01未満であった。

1型糖尿病患者は経口免疫グロブリンA免疫が正常であった
IgA産生B細胞の大部分は口腔と腸の粘膜部位に存在することが知られている（29-31）。そこで、新たに1型糖尿病と診断された患者と健常対照ドナーの口腔粘膜部位におけるIgA免疫をまず調べることにより、粘膜IgA免疫を評価した。口腔IgA免疫を調べるために、新たに1型糖尿病と診断された患者とコントロール被験者から採取した口腔サンプルにおいて、口腔内細菌へのIgA結合と非細菌結合遊離IgAレベルを検査した。異なる全身性のIgA免疫とは異なり、新たに1型糖尿病と診断された人と健常対照者との間で、口腔内のIgA結合細菌の割合に有意差は認められなかった（図2Aおよびand2B）。さらに、1型糖尿病患者の口腔検体における遊離IgAのレベルは、健常対照者のそれと同様であった（図2C）。したがって、新たに1型糖尿病と診断された人の口腔内IgA免疫には異常がないことが示された。

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図2.
新たに1型糖尿病と診断された人と健常対照者における口腔免疫グロブリンA（IgA）結合菌の割合と遊離IgA濃度。AおよびB、新たに1型糖尿病と診断されたドナーと健常対照者の口腔内IgA結合菌の割合。A、アイソタイプコントロールの代表的フローサイトメトリーゲーティング、および健常対照参加者と新たに1型糖尿病と診断された個人からの経口IgA結合細菌のゲーティング。B、新たに1型糖尿病と診断された人（n = 23）と健常対照者（n = 25）における口腔内IgA結合細菌の割合をまとめたもの。C、新たに1型糖尿病と診断された患者（n=23）と健常対照者（n=25）における口腔内IgA濃度。データはBとCの平均値±SDで示され、Bでは両側Mann-Whitney検定、Cでは両側対応のないt検定を用いて統計学的有意性を評価した。NSは有意ではない。

1型糖尿病患者では腸管免疫グロブリンA免疫に特徴がみられた。
粘膜IgAの多くは主に小腸の固有層で産生され、腸管免疫反応に重要な役割を果たすことが知られている(18)。次に、口腔粘膜で行ったのと同様に、細菌と結合するIgAのレベルと遊離IgAの濃度を評価することによって、腸粘膜におけるIgA免疫を評価した。興味深いことに、新たに1型糖尿病と診断された人は、健常対照者よりもIgA結合細菌の割合が高かった（29.71％［95％信頼区間、21.28％-38.14％］ vs 17.38％［95％信頼区間、12.96％-21.79％］、P = 0.009、図3Aおよび3B］。1型糖尿病群および健常対照群の女性と男性を比較したところ有意差は認められず（データ示さず）、性差はこの差に関連していないことが示された。さらなる解析の結果、IgA結合菌のレベルは、空腹時C-ペプチド濃度で示される膵島機能と非統計的に有意な負の相関を示したが（r = -0.3776, P = 0.08、図3C）、抗GADA力価とは有意な正の相関を示した（r = 0.5098, P = 0.04、図3D）。しかし、便中IgA結合菌レベルと抗IA-2または抗ZnT8自己抗体価との間には正の相関は認められなかった（データは示さず）。腸内細菌へのIgA結合に加えて、便検体中の非細菌結合遊離IgAの濃度も測定した。IgAと結合した細菌の濃度が高いのとは対照的に、1型糖尿病患者における遊離IgAの濃度は健常対照者と有意差はなかった（図3E）。腸内IgA結合菌の濃度が膵島β細胞破壊の重症度と関連しているかどうかをさらに検討するために、年齢がほぼ同じで1型糖尿病と診断されて1年以上（範囲は1〜12年）の患者を集め、これらの患者から便サンプルを採取した。便中のIgA結合菌の割合を測定し、1年以内に1型糖尿病と診断された患者および健常対照者の割合と比較した（図3B）。興味深いことに、IgA結合菌の頻度は罹病期間と密接に関連しているようで、1型糖尿病の罹病期間が長い人ほど健常対照者よりもIgA結合菌のレベルが高かった（52. 13％［95％信頼区間、44.94％-59.32％］ vs 17.38％［95％信頼区間、12.96％-21.79％］、P＜0.001、図3F）、1年以内に1型糖尿病と診断された人（52.13％［95％信頼区間、44.94％-59.32％］ vs 29.71％［95％信頼区間、21.28％-38.14％］、P＜0.001、図3G）も同様であった。したがって、口腔ではなく腸からのIgA粘膜免疫の変化が、β細胞自己免疫と疾患発症に関与している可能性が高い。

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図3.
1型糖尿病患者および健常対照者における便中免疫グロブリンA（IgA）結合菌の割合と遊離IgA濃度。AおよびB、新たに1型糖尿病と診断されたドナーと健常対照者の便中IgA結合菌の割合。A、健常対照者（中央のプロット）および1型糖尿病患者（右のプロット）における便中IgA結合細菌の代表的フローサイトメトリープロファイル、アイソタイプ対照（左のプロット）と比較。B, 1年以内に診断された1型糖尿病患者（n = 23）と健常対照者（n = 25）におけるIgA結合菌の割合をまとめたもの。C, 新たに1型糖尿病と診断された人（n = 23）におけるIgA結合菌の割合と空腹時Cペプチド（FCP）レベルとの相関。D、新たに1型糖尿病と診断された人（n＝17）におけるIgA結合菌の割合とグルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体（GADA）力価（n＝17）との相関。E,新たに1型糖尿病と診断されたドナー（n=23）と健常対照者（n=25）における分泌性IgA濃度。F、新たに1型糖尿病と診断された人（n=23）、1型糖尿病罹病期間が長い人（1-12年、n=33）、および健常対照者（n=25）の便中IgA結合菌。B, E, F, データは平均値±SDで示した。データの解析には、Bは2検定対応の無対t検定、Eは2検定対応のMann-Whitney検定、Fは1元配置分散分析検定にTukey補正を加えた多重t検定を用いた。C、両側Pearson係数検定と線形回帰、またはD、両側Spearmanノンパラメトリック係数検定と線形回帰を用いてデータを解析した。NSは有意ではない。**Pは0.01未満。***Pは.001未満。

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考察
IgAは、潜在的に有害な病原体や分子を除去することにより、粘膜バリアの完全性を維持する上で重要な役割を果たすことが知られている（13, 32）。さらに、粘膜IgAは常在細菌の機能と遺伝子発現を制御することができ、それが宿主免疫系に影響を及ぼす(16-18)。近年、腸内細菌叢に対するIgA応答の異常が、炎症性腸疾患の成人(15)や抗リン脂質症候群(21)、また喘息やアレルギーを発症する前の乳幼児(22)で見つかっている。したがって、IgAは自己免疫疾患に対する感受性を媒介する上で重要な効果を発揮する。本研究では、1型糖尿病患者では便中のIgA結合菌の割合が高く、GADA力価および罹病期間と正の相関があることを見いだした。このことは、腸内IgA結合菌が膵島β細胞自己免疫およびその基礎にある自己免疫過程と密接に関連していることを示している。腸管IgA結合菌とは対照的に、口腔粘膜IgA結合菌については、1型糖尿病患者と健常対照者との間に有意差は認められなかった。したがって、2つの粘膜部位から得られた今回の結果は、変化した腸粘膜IgA免疫応答が1型糖尿病の進行に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。

最近のマウスをモデルとした研究で、腸内細菌組成の調節により血清IgA濃度と骨髄中のIgA分泌形質細胞の数が変化することが示された(33)。さらに、腸内細菌叢は粘膜免疫系を活性化し、IgA産生を誘導することがわかった(34)。この産生は、toll-like receptor 3（TLR3）アゴニストであるポリI:Cや、TLR5アゴニストであるフラジェリンによって増強される(35, 36)。したがって、腸内細菌叢は宿主のIgA免疫応答の調節に重要な役割を果たしている。本研究では、1型糖尿病患者において、末梢B細胞がより活性化されているだけでなく、血清IgA濃度も上昇していることを見出した。1型糖尿病患者は健常対照者と比べて腸内細菌叢の組成が異なることを示す研究が増えている(38-40)。重要なことに、我々は最近、別の研究において、1型糖尿病患者の腸内細菌が、無菌の非肥満性糖尿病マウスにおいて異なるIgA免疫応答を誘導することを見いだしたが、これは、1型糖尿病から身を守ることができる腸内微生物の代謝産物の欠乏が原因である可能性が高く(41)、1型糖尿病患者の腸内細菌叢の変化がIgA応答の変化に寄与している可能性があることを裏付けている。興味深いことに、Paunたちは最近、1型糖尿病患者の血清IgAは、健常人のそれと比較して特定の細菌と結合する能力に差があることを報告している(42)。しかし、これらの活性化されたB細胞と血清IgAの増加が、細菌と結合する腸粘膜IgAの増加にも寄与しているのかどうか、また1型糖尿病の免疫病態における腸管IgA結合細菌の役割については、さらなる解明が必要である。

以上をまとめると、我々の研究は、IgAに結合した腸内細菌叢がβ細胞の自己免疫と疾患の進行に関与している可能性のある、これまで明らかにされていなかった免疫病態経路を明らかにした。我々の研究にはいくつかの限界がある。第一に、本研究は縦断的研究ではなく横断的研究であるため、同じ研究参加者におけるIgA免疫応答の動的変化や変化に関する縦断的な情報は得られていない。したがって、1型糖尿病患者においてみられるIgA免疫の変化が、糖尿病前段階において生じているかどうかは不明である。私たちの今後の方向性は、これらの限界に対処するものである。しかしながら、これらの注意点は、1型糖尿病患者では全身および腸管IgA免疫応答が変化しており、特に便中IgA結合菌が増加しているという我々の新しい知見を損なうものではない。

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謝辞
本試験に参加されたすべての方々、および検体採取にご協力いただいた看護師の方々に感謝する。

財政的支援： 本研究は、米国国立衛生研究所基金（L.W.への助成番号：DK 045735およびHD 097808）、中国国家重点研究開発計画（Z.Z.への助成番号：2016YFC1305000および2016YFC1305001）、中国国家自然科学基金（Z.Z.への助成番号：81820108007）、湖南省科学技術主要プロジェクト（Z.Z.への助成番号：2017SK1020）の支援を受けた。

著者貢献： L.W.がプロジェクトを立案した。J.H.、Z.Z.、L.W.が研究をデザインした。J.H.、G.H.、X.L.、F.H.、Z.X.、Y.X.、S.L.、C.C.、K.G.はデータの収集、および/または解析を行った。原稿はJ.H.、F.S.W.、L.W.が執筆した。すべての著者が最終版の原稿を承認した。

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用語解説
略語
GADAグルタミン酸脱炭酸酵素自己抗体
IA-2A インスリノーマ関連抗原-2自己抗体
MZBs 周縁帯B細胞
NS 有意ではない
PBMCs 末梢血単核球
PBS リン酸緩衝生理食塩水
ZnT8A 亜鉛輸送体8自己抗体
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追加情報
情報開示の要約：著者らは何も開示することはない。

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データの利用可能性
本研究で作成および/または解析されたデータセットは一般には公開されていないが、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。

参考文献
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