FMTは再発性クロストリジオイデスディフィシル病患者の大腸タンパク質生合成と細胞増殖を回復させる
FMTは再発性クロストリジオイデスディフィシル病患者の大腸タンパク質生合成と細胞増殖を回復させる
View ORCID ProfileG. Brett Moreau, View ORCID ProfileMary Young, Brian Behm, Mehmet Tanyüksel, Girija Ramakrishnan, William A. Petri Jr.
doi: https://doi.org/10.1101/2024.11.28.24318101
この論文はプレプリントであり、査読を受けていない［これはどういう意味か？］ この論文は、まだ評価されていない新しい医学研究の報告であるため、臨床診療の指針として使用されるべきではない。
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抄録
再発性C. difficile感染症（CDI）は、重大な死亡率と経済的コストを伴う健康上の大きな脅威である。糞便微生物叢移植（FMT）は有効な治療法であるが、その作用機序、特に宿主に対する作用機序は十分に理解されていない。ここでわれわれは、FMT治療を受けている再発性CDI患者（n=16）の前向きコホートを登録した。大腸生検を採取し、FMT前とFMT2ヵ月後の宿主遺伝子発現の変化を比較するためにバルクRNAシーケンスを行った。転写プロファイルはFMT治療後に有意に変化し、多くの差次的発現遺伝子（アノテーションされた遺伝子の約15％が検出された）が認められた。エンリッチメント解析の結果、これらの変化はFMT後のタンパク質産生の増加を反映しており、リボソーム生合成、タンパク質プロセッシング、細胞増殖とタンパク質生合成に関連するシグナル伝達経路（Myc、mTORc1、E2F）などの経路が濃縮されていた。H&Eで染色した生検の組織学的検査では、FMT後に大腸陰窩の長さが有意に増加することが確認され、この治療が細胞増殖を促進することが示唆された。陰窩の長さは、ポリアミンの生合成に関連する遺伝子だけでなく、濃縮されたMycおよびmTORシグナル伝達経路と有意に相関しており、このことが起こる潜在的なメカニズムを提供している。最後に、MycとmTORの上流のシグナル伝達経路、特にIL-33シグナル伝達経路とEGFRリガンドが有意に発現上昇しており、FMTがこれらのシグナルを利用して細胞増殖を促進し、腸の回復を図っている可能性が示唆された。
はじめに
Clostridioides difficile感染症（CDI）は、重大な罹患率、死亡率、経済的コストを伴う公衆衛生上の重大な脅威である。米国におけるCDI関連死亡率は一次感染で2.7％であるが、20％の再発率があり(1)、再発した場合の死亡率は10倍近く（25.4％）高い(2)。CDIの標準治療は抗生物質による治療であるが(3, 4)、抗生物質による腸内細菌叢の破壊はCDI再発の重大な危険因子である(5)。このため、糞便微生物叢移植（FMT）が再発性CDIに対する主要な治療選択肢として浮上してきた。最近、2つのFMT治療薬が再発性C. difficileの治療薬としてFDAに承認された： SER-109（Vowst社）は精製したファーミキューテス属の芽胞を利用した経口治療薬であり(6)、RBX2660（Rebyota社）は生きた微生物のコンソーシアムを利用した浣腸による治療薬である(7)。どちらの製品も効果は限定的であるため、FMTの根底にある特異的なメカニズムをより深く理解することで、治療法の改善が期待される。
FMTがどのようなメカニズムで感染防御効果を発揮するのか、特に宿主に対する作用については、まだ理解が不十分である。CDIは抗生物質やマイクロバイオームの崩壊と関連しているため（8、9）、再発性CDIにおけるFMTの役割を検討する研究の多くは、腸内細菌叢の回復（10）およびその結果として生じる胆汁酸などの微生物代謝産物（11-13）への影響に焦点を当てている。これらの結果から、FMTはニッチ制限と移植微生物との競合によってC. difficileを防いでいる可能性が示唆される(14)。しかし、微生物叢からのシグナル伝達は腸管免疫細胞の発達やシグナル伝達にも影響を及ぼす可能性があり（15）、FMTが腸管上皮や免疫細胞の変化を引き起こし、病気の再発予防に影響を与えている可能性もある。原発性CDIの病態における免疫応答の役割は以前に明らかにされており、毒素が介在する組織障害に反応する免疫応答の上昇や炎症の亢進は、細菌負荷とは無関係に臨床転帰の悪化と関連している(16-18)。さらに、免疫応答のタイプは疾患の進行に大きな影響を及ぼす可能性があり、タイプ3の免疫応答は疾患の重症度の悪化と関連している(19)が、タイプ2の免疫は組織の修復と重症化からの保護と関連している(20-22)。これらのデータに基づき、われわれは、FMTが腸内の宿主応答に直接影響を与え、CDIの再発に対する防御を促進するという仮説を立てた。
我々は最近、抗生物質治療のマウスモデルにおいて、FMTの初期段階に関連する遺伝子発現の変化を同定した(23)。この研究では、FMT投与後1週間以内に、転写的にも免疫細胞集団においても宿主免疫応答に有意な変化が認められた。FMTはまた、腸のホメオスタシスと神経ペプチドシグナル伝達に関連する遺伝子のアップレギュレーションと関連していた。このことは、FMTが、事前にC. difficileに暴露されていなくても、腸のホメオスタシスの回復を促進できることを示唆している。FMTの宿主への影響はよりよく理解されるようになってきているが、これらの研究の多くは、腸管大腸炎などの他の炎症性疾患との関連で検討されている(24-26)。また、ほとんどの研究が動物モデルを利用しているため、患者コホートでのデータはまだ限られている。FMT患者を対象とした多くの研究は、全身性バイオマーカーの評価に限定されており、FMTが炎症性バイオマーカー(27, 28)だけでなく、免疫シグナル伝達に影響を与える可能性のあるmiRNAプロファイルも変化させることが分かっている(29)。免疫と大腸の転写変化の両方が、再発性CDIに対してFMTを受けた患者コホートにおいて、われわれのグループによって以前に特徴づけられている(30)。この研究では、FMT後に腸管上皮細胞の分化と細胞外マトリックスの修復を促進する遺伝子の発現の増加とともに、2型サイトカインIL-25の発現の増加が観察された。しかし、この研究はコホート規模が小さい（n=6）ことと、この研究に参加した2人の患者にIBS様症状があったことが交絡因子となったため、限界があった。
本研究では、FMTに関連する生物学的変化のより詳細な特徴を明らかにするため、より広範な生物学的サンプルを収集し、より大規模な患者コホートでこれらの所見を再現することを目的とした。われわれは、FMT前とFMT後2ヵ月の大腸生検のバルクRNAシーケンスを利用して、FMTによる宿主の転写プロファイルの変化を調べた。その結果、FMTは、上流のIL-33およびEGFRシグナル伝達を介して、タンパク質生合成および細胞外マトリックスリモデリング経路の発現を促進する可能性が示唆された。これらの変化は、結腸内の細胞増殖を促進し、腸の恒常性を回復させる可能性がある。
方法
研究参加者
この研究の参加者は、バージニア大学で進行中の臨床研究から抽出された。この研究はInstitutional Review Boardの承認を得ており、ClinicalTrials.gov ID NCT02797288に登録されている。研究対象者（18～85歳）は、UVA外来で大腸内視鏡検査によるFMT療法が予定されている再発CDI患者から募集された。ドナーのFMT材料は、スクリーニングされた便バンク（OpenBiome、マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手した。生検の追跡採取も、FMT投与日から約2ヵ月後（平均63.2日）に行った。
生検標本の採取と保存
生検標本は、FMT大腸内視鏡検査時に遠位結腸から採取し、予定された追跡調査時にS状結腸内視鏡検査で採取した。生検サンプルは直ちに瞬間凍結するか、Allprotect tissue reagent（Qiagen）で保存した後、瞬間凍結した。凍結した生検は分析まで-80℃で保存した。RNA単離とその後の塩基配列決定には、FMTの前後両方の時点で2つの生検を使用した。採取プロトコルの変更により、6人の患者には2つのAllprotect生検が使用され、他の10人の患者には1つのAllProtect生検と1つの急速凍結生検が使用された。追加の生検は、ヘマトキシリン・エオキシン（H&E）染色と組織の可視化のために、ホルマリン固定・パラフィン包埋（FFPE）した。
バルクRNA配列決定とバイオインフォマティクス
上記のようにRNA配列決定のために保存した生検は、まず滅菌した5mmステンレススチールビーズを入れた清潔な2mlスクリューキャップチューブに移し、TissueLyser II（Qiagen）を用いて25Hzで3分間ホモジナイズした。ホモジナイズした組織をボルテックスし、RNeasyキット（Qiagen）を用いて製造元のプロトコールに従ってRNAを単離した。RNAの収量と品質はTapeStation（Agilent）を用いて評価し、使用するまで-80℃で保存した。精製された全RNAは、バルクRNAシーケンス用にNovogene社に提出された。ライブラリーは、mRNA転写産物のPoly(A)濃縮後、NovaSeq X Plusシリーズシーケンサー（Illumina）を用いたペアエンド150塩基対シーケンスで作成した。
解析の前に、未処理のシーケンスリードをFastQC (31)とMultiQC (32)を用いて品質を評価し、BBToolsを用いてアダプター配列を除去するためにトリミングし、Kallisto (33)を用いてヒトゲノムに擬似マッピングした。得られたカウントテーブルをTxImport (35)を用いてR (34)にインポートし、DESeq2パッケージ (36)を用いて、カウント数の少ない遺伝子を除外し、データを正規化し、分散を推定し、負の二項モデルを用いてカウント数をフィットした。遺伝子発現の差は、この多変量モデルに基づいて決定された。
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)は、Rのfgseaパッケージ(37)を用いて行った。簡単に言うと、データセットに含まれるすべての遺伝子を、多変量モデルからのWald統計量に従って、FMT後に最も発現量の多いものから最も発現量の少ないものへとランク付けした。このランク付けされたリストは、Hallmark(38)、Gene Ontology(39)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(40)のデータセットを用いたGSEAに用いられた。データの整理と可視化にはtidyverseパッケージ(41)を使用した。
組織学と陰窩の長さの測定
FFPE生検切片を含むスライドをH&Eで染色し、陰窩の長さを定量化するために画像化した。各スライドから、2つの異なる領域から少なくとも3つの陰窩を選択した。陰窩の長さはSedeen slide viewer software（Pathcore）を用いて計算した。研究者は、病理組織学的解析の時点で、各スライドのFMT状態について盲検化されていた。すべてのスコアを収集した後、FMT前とFMT後の両方の時点において、スライドごとおよび患者ごとに平均値と標準偏差を算出した。統計は、患者内変動性を制御するために患者IDを組み込んだ線形混合効果モデルを用いて、FMT前後のクリプト長を患者ごとに平均した。
結果および考察
患者の特徴
FMT療法を受けた再発性CDI患者計16人は、FMTおよびフォローアップの両予約時に大腸生検サンプルを提供した。このコホートの臨床的特徴を表1にまとめた。このコホートの患者の大多数は女性で、全員が白人であった。94％の患者がFMT前に少なくとも3回の再発を認めたが（平均3.8回）、FMT治療は、追跡期間内に再発がなかったという定義から、すべての患者で成功した。全例はFMT治療前にバンコマイシンによる治療を受けており（UVA病院での標準治療）、FMT後の追跡期間中に抗生物質を使用した患者はいなかった。このコホートではIBDと診断された患者は1例のみであったため、IBDは本研究の主要な交絡因子ではなかった。
表
1：
FMTコホートの臨床的特徴
宿主遺伝子発現に対するFMTの影響を評価するために、FMT直前と2ヵ月後の追跡時に採取した生検についてバルクRNAシーケンス（RNAseq）を行った。バルクRNAseqからのリードは、高品質のリード（>Q30、99.9%の塩基コール精度を示す）のみを保存し、アダプター含量を除去するために処理された。この後、クリーンリードをKallistoを用いてヒトゲノムに擬似マッピングし、これらのリードの80%が正常にマッピングされ、下流の解析に使用された。患者内変動性を考慮し、患者ID番号を組み込んだ負の二項多変量モデルを用いて、DEGs（Differentially Expressed Genes）を算出した。合計1,877遺伝子がFMT後に有意に発現上昇し（調整p値＜0.05）、一方1,788遺伝子は発現低下した（図1A）。合計3,665のDEGは、解析に含まれるアノテーション遺伝子の約15％に相当した。これらの発現差のある遺伝子のうち、154個（8.2%）と182個（10.2%）の遺伝子は、それぞれ少なくとも2倍以上の遺伝子発現の増加と減少があった。これらの結果は、FMTが遺伝子発現の大きな変化を促進し、それが2ヵ月後の追跡調査まで持続することを示している。
図1：
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図1：
FMTは宿主の転写プロファイルに変化をもたらす。
大腸生検サンプルは、FMT直前またはFMT後2ヵ月経過時に採取し、バルクRNAシーケンスを用いて宿主の転写プロファイルを評価した。A) ベースラインと比較してFMT後の患者で増加（青）または減少（赤）した差次発現遺伝子（DEG）を示すボルケーノプロット。B) FMT前後の生検サンプル間で最も差次的に発現した50遺伝子のヒートマップ。
タイムポイント間で最も差のある50の発現遺伝子を図1Bに示す。これらのデータを用いて階層的クラスタリングを行い、サンプルは主にFMTの状態に従ってクラスタリングされた。FMT後に有意に増加した最も顕著な遺伝子は、転写因子AP-1を形成するヘテロ二量体を形成するFOSファミリータンパク質であるFOSL1であった（42）。FOSL1はkRAS依存的にがん細胞で発現上昇し（43）、NF-kBとの相互制御を介して、がん細胞の幹細胞性の亢進と関連している可能性がある（44）。その他の有意に増加した遺伝子には、MMP1やSERPINB5のような細胞外マトリックスのリモデリングに関連する遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は大腸癌の上皮間葉転換や予後不良のマーカーとして関与している(45)。発現低下遺伝子には、SLC6A19、KCNG1、ENPP1、NDRG1、PLOD2などの遺伝子が含まれる。SLC6A19は中性アミノ酸トランスポーターで、幹細胞ではSOX9を介して強く抑制されており(46)、この遺伝子の欠損はタンパク質の制限やmTORc1活性の低下と関連している(47)。ENPP1は細胞外cGAMPヒドロラーゼであり、その活性は免疫調節シグナル伝達の分解と、癌の増殖と転移の効率的な抑制の低下と関連している(48)。全体として、これらの結果はFMT後の環境がより増殖的であることを示している。
これらの知見は、われわれの以前のコホートで得られた知見とほぼ一致していた：Janらで差次的に発現した遺伝子の51.6％は、このデータセットでも有意に変化していた。これには、MMP1、SERPINB5、SLC6A19のような、図1Bから最も差次的に発現した遺伝子のいくつかが含まれる。
RNAseqデータによる経路解析
我々は、FMTによって変化した生物学的経路を同定するために、より系統的なアプローチをとることを目指した。そのために、RNAシーケンスデータをGene Set Enrichment Analysis（GSEA）を用いて解析し、FMT前後で濃縮された潜在的機能を同定した。この解析には、Hallmark、Gene Ontology、Biological Process (GO:BP)の3つの異なるデータベースを使用した： ホールマーク、Gene Ontology: Biological Processes (GO:BP)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)である。各データベースはわずかに異なる遺伝子セットを含んでおり、これらを組み合わせることで、FMTによって発現が変化する可能性のあるパスウェイをより包括的に見ることができるからである。各データベースについて、FMT後に発現が増加した遺伝子セットと減少した遺伝子セットの上位5つを図2に、すべての遺伝子セットを補足表1に示す。
図2：
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図2：
リボソーム／タンパク質合成および脂質代謝に関連する遺伝子セットはFMTによって変化する。
Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）により決定された、FMT後に最も有意に増加した（A）または減少した（B）遺伝子セットの順位棒グラフ。ホールマーク（赤）、Gene Ontology： 生物学的過程（緑）およびKEGG（青）データベース。遺伝子はNormalized Enrichment Scoreに従ってランク付けされている。
FMT後の生検サンプルで最も顕著に発現が上昇したプロセスは、リボソーム生合成とタンパク質プロセシングであった（図2A）。リボソームとタンパク質合成遺伝子セットはGO:BPとKEGGデータベースの両方でFMT後に有意に濃縮され、濃縮された遺伝子セットのトップ5のほとんどを占めた。リーディングエッジ遺伝子（GSEAで各遺伝子セットの濃縮を促進する遺伝子）の解析から、GO:BP遺伝子セットは主に同じコア遺伝子セットによって駆動されていることがわかった。これらの遺伝子は主にリボソームの生合成と成熟の制御因子（RRP15, RRS1, BYSL, UTP11, MAK16）または核タンパク質（NUP88, NOP16）であり、その多くはがんモデルにおける細胞増殖に関与している(49-51)。リボソームの生合成は、核で始まり細胞質で続くプロセスであり、細胞増殖に必要なレベルのタンパク質産生に必要な重要なプロセスである(52, 53)。KEGG遺伝子セットを用いたGSEAでも、遺伝子発現に関連する他の遺伝子セット（スプライソソーム、RNAポリメラーゼ）およびその後のタンパク質プロセッシング（タンパク質輸出、プロテアソーム）とともに、リボソームが最も強く濃縮された遺伝子セットとして同定された。これは、新しいタンパク質の合成を通じたFMT後の代謝活性の高さを強調している。
ホールマーク遺伝子セットはわずかに異なる遺伝子セットを示した。このデータベースから最も濃縮された遺伝子セットは、Myc、mTORc1、E2Fを含むいくつかのシグナル伝達分子の下流標的であった。MycとmTORc1はリボソーム生合成とそれに続くタンパク質合成の主要な制御因子であり(54, 55)、これらの遺伝子セットで観察された遺伝子の多くはこれらのプロセスを示している。HYOU1、HSPA4、BAG3などの遺伝子を含むUnfolded Protein Responseもまた、FMT後に発現が上昇した。これらの遺伝子は、タンパク質合成の増加に起因すると考えられるミスフォールドタンパク質ストレスへの反応に関連している。同様に、プロテオソーム遺伝子もKEGGデータベースで濃縮されており、タンパク質合成とターンオーバーの増加に対する反応であると考えられる。プロテアソーム機構は適切な細胞増殖に重要であり、プロテアソーム阻害剤はいくつかの癌に対して臨床的に承認された治療法である(56)。
FMT後、いくつかの遺伝子セットがダウンレギュレートされた（図2B）。最も顕著にダウンレギュレートされたシグネチャーは脂肪酸異化で、GO:BPとKEGGデータベースの両方で、最も濃縮された遺伝子セットのトップ5で顕著であった。これはACOX1、ACAA2、ADH1C、ACSL5を含む脂肪酸β酸化経路の酵素によって引き起こされた。胆汁酸代謝もFMT後に有意に低下した。脂質代謝におけるこれらの変化、すなわち脂肪酸および胆汁酸代謝経路のダウンレギュレーションは、FMT治療モデルマウスを調査した我々の以前の研究でも、FMT後に観察された(57)。微生物叢は脂質代謝(58)とインスリン感受性(59)の両者において重要な役割を担っており、このような転写変化は、微生物による食事代謝の違いによって引き起こされる宿主の代謝とエネルギー産生の違いによるのかもしれない。実際、宿主のエネルギー代謝経路である解糖と酸化的リン酸化はともにFMT後に有意に濃縮されており（補足表1）、微生物叢がない場合には解糖から脂肪酸β酸化へのシフトが起こる可能性が示唆される。胆汁酸はまた、脂肪の乳化と可溶化を通じて脂質の吸収に大きな役割を果たしている(60)。腸内細菌叢はこれらの胆汁酸を修飾する能力があり、抗生物質投与はこのプロセスを破壊し、腸内胆汁酸組成を変化させる(61)。
IFNおよびIFNシグナル伝達もFMT後に減少し、これらの経路は主にインターフェロン刺激（IFIT1、IFIT2、GZMA）およびアポトーシス関連（CASP7、CASP3）遺伝子のコアセットによって駆動された。胆汁酸代謝、脂肪酸代謝、およびIFNとIFN応答に関連する遺伝子セットはすべて、抗生物質投与マウスではナイーブコントロールと比較して濃縮されており(62)、これらの転写変化は抗生物質が介在する腸内細菌叢の破壊によるものである可能性が高いことを示している。最後に、kRASシグナルによって発現低下した遺伝子は、FMT後にも発現低下しており、これは図1Bで観察されたkRAS発現上昇遺伝子であるFOSL1（43）の発現上昇と一致している。kRASは腸の恒常性維持に重要な役割を果たす低分子GTPaseである。EGFRシグナルを含む多くの細胞外刺激によって活性化され、Raf/ErkやPI3K/Akt/mTORといった下流のシグナル伝達経路の活性化を通してそれらのシグナルを伝達し、細胞増殖や腸の再生を促進することができる(63)。これは、FMTが細胞増殖を促進するシグナル伝達経路を促進することのさらなる証拠となった。
FMTは、MycおよびmTORc1標的遺伝子発現と相関する大腸陰窩の伸長と関連している
。代謝活性の亢進に関連する遺伝子セット（リボソーム生合成、タンパク質輸出、MycおよびmTORc1シグナル伝達）の濃縮が観察されたことから、FMT後に上皮が顕著な増殖を経験するであろうという仮説を立てた。これを検証するため、H&E染色した大腸生検で陰窩の長さを測定した。陰窩の伸長はKi67やLGR5などの細胞増殖マーカーの上昇と関連しているからである(64, 65)。陰窩の長さは、各時点で患者ごとに複数のスライドから盲検下で測定した。統計的差異は、FMT前後の平均陰窩長を、患者内変動性をコントロールする線形モデルで比較することにより決定した。平均陰窩長はFMT後の患者で有意に長く（図3A-B）、FMTが上皮細胞の増殖を刺激したことを示唆している。注目すべきことに、CDIは以前、マウスの研究で陰窩の長さの延長と関連しており、FMTは逆説的に大腸陰窩を非感染マウスに近い短い長さに回復させた(66)。この所見は、C. difficileの急性感染とそれに伴う炎症性免疫反応という状況下でのもので、すでに陰窩の長さの増大が促進されていた。このことは、サルモネラ菌（Salmonella Typhimurium）（67）やHIV（68）など、陰窩の伸長が観察されている他の感染症とも一致している。広範な炎症シグナル伝達はRNA配列決定データからはほとんど見られなかったが、これはFMTがヒトにおいて2型免疫を促進するというわれわれの以前の知見（30）と一致している。このような抗炎症性の大腸環境が、クリプト長に対するFMTの効果の差に寄与している可能性が高いという仮説を立てた。
図3：
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図3：
FMTは大腸陰窩の長さの増加を促進する。
A) FMT前後の同一患者の大腸生検による陰窩の代表的H&E像。B) 全患者の平均陰窩長さの定量化。各ドットは1人の患者を表し、灰色の線は対になったサンプルを結ぶ。統計は、患者内のばらつきをコントロールする線形混合効果モデルを用いて計算した。***RNAseqデータから得られた最も強いシグニチャーの一つは、Myc標的遺伝子であった。これらのシグナル伝達経路はリボソームの生合成、タンパク質の産生、および細胞増殖を促進することが知られているため、私たちは陰窩の長さがこれらの経路の標的遺伝子の発現と相関するという仮説を立てた。これを検証するため、MycおよびmTORc1標的遺伝子の上位10個の最先端遺伝子の発現を、FMT前後の両サンプルから陰窩の長さとの相関を検定した。全体として、6/10のMyc標的遺伝子と4/10のmTORc1標的最先端遺伝子が陰窩の長さと有意に相関し、すべて正の相関傾向を示した（図4A）。これまでの研究で、Mycが陰窩前駆細胞の増殖に必要であることが示されている。Mycがノックアウトされた陰窩はすぐに消失し、Mycが欠損した陰窩に置き換わるからである(69)。これらのMyc欠損陰窩は、Myc欠損陰窩と比較して、陰窩あたりの細胞数が少なく、細胞サイズが小さく、生合成活性が低下していた。我々のデータセットで最も発現量の差が大きかったMyc標的遺伝子は、ポリアミン生合成の速度制限酵素であるODC1であった。もう一つのポリアミン生合成遺伝子であるSRMもまたMyc標的遺伝子であり、この経路にさらに深く関与していた。ODC1を含むポリアミン生合成遺伝子は、リボソームのホメオスタシスに関与しており、これらの遺伝子の枯渇は生合成の障害と関連していた(70)。ポリアミンは腸細胞の重要なエネルギー源でもあり、腸の上皮の再生と適切なバリア機能に不可欠である(71)。ODC1とSRMの発現はともに大腸陰窩の長さと有意に相関しており（図4B-C）、ポリアミンの生合成と利用が、陰窩の伸長を引き起こす潜在的なメカニズムの一つである可能性を示唆している。全体として、これらの結果は、FMT治療が腸上皮の細胞増殖を促進するという新たな証拠を提供する。
図4：
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図4：
クリプトの長さはMycおよびmTORc1標的遺伝子と相関する。
A) GSEAにおけるMycおよびmTORc1標的遺伝子セットの濃縮を促進する上位10個の最先端遺伝子のピアソン相関R値を示すヒートマップ。有意に相関のある遺伝子はアスタリスクで示されている。B-C)ポリアミン生合成の速度制限遺伝子であるODC1(B)またはSRM(C)の平均クリプト長と正規化遺伝子数との相関を示す相関プロット。*IL-33およびEGFRシグナル伝達リガンドはFMT後に発現が上昇する。
FMT後のMycおよびmTORc1標的遺伝子の濃縮、ならびにタンパク質産生の増加および陰窩の長さの変化との関連に基づき、我々は潜在的な上流の作用機序を決定することに興味を持った。mTORc1およびE2Fシグナル伝達カスケードは、それぞれPI3K/AktおよびRas/Raf/Erkシグナル伝達カスケードを通じて、EGFRシグナル伝達によって刺激される可能性がある(72)。加えて、Ras/Raf/ErkとPI3K/Aktのシグナル伝達は、Mycタンパク質の半減期を著しく増加させ、その結果、転写に対する効果を高めることができる(73)。これらのデータに基づき、我々はEGFRシグナル伝達が、我々のGSEAで観察されたMyc、mTORc1、E2F標的遺伝子の有意な増加に部分的に関与している可能性があると仮定した。我々は、アンフィレグリン（AREG）、エピレグリン（EREG）、ヘパリン結合性EGF様成長因子（HB-EGF）など、EGFRのいくつかのリガンドがFMT後に有意に発現上昇していることを観察した（図5A）。
図5：
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図5：
FMTはIL-33シグナル伝達、EGFRリガンド、組織リモデリング遺伝子の発現を促進する。
FMT前（赤）またはFMT後（青）に選択されたA）EGFRリガンド、B）IL-33シグナル伝達、C）組織リモデリング遺伝子の正規化遺伝子数。統計は多重比較を調整したDESeq2多変量モデルから得られた。*はp＜0.05、***はp＜0.01、***はp＜0.001、***はp＜0.0001で
ある。我々のグループのこれまでの研究では、FMTの動物モデルとヒト患者の両方で2型免疫応答が同定されている(23, 30)。腸管2型免疫応答に重要な自然リンパ球2（ILC2）は、マイクロバイオームからのシグナルに反応する(74)。我々のグループは最近、抗生物質投与によってILC2の個体数が有意に減少する一方で、IL-33投与によって個体数が回復することを観察した(75)。ILC2はIL-33処理に応答してAREGを産生し、これは急性CDIに対して防御的であった。これらのデータに基づき、我々は2型免疫、特にIL-33シグナル伝達がFMT後にアップレギュレートされる可能性があると仮定した。IL-33シグナル伝達は異なる発現を示し、サイトカイン（Il33）と受容体（IL1RL1/ST2）の両方の転写産物がFMT後に有意に増加することが観察された（図5B）。ILC2由来のAREGは、EGFRを介してシグナル伝達し、腸組織の修復を促進することができ、このシグナル伝達の破綻は、動物とヒトの両方のモデルにおいて炎症性腸疾患と関連している(76)。さらに、EGFRを介したHB-EGFのシグナル伝達は、IL-33の発現を増加させるためにこのプロセスにフィードバックすることができ、このアップレギュレーションはHB-EGF処理したケラチノサイトにおける創傷修復に必要である(77)。したがって、IL-33/ST2シグナル伝達とその結果生じるAREGおよび他のEGFRリガンドの産生は、FMT後に観察される細胞増殖と腸管修復を促進する可能性がある。
IL-33シグナル伝達は、いくつかのマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現を促進することが示されており（78）、これはFMTが組織のリモデリングと恒常性の回復を促進するメカニズムの一つである可能性がある。我々は、細胞外マトリックスリモデリング遺伝子（MMP1、SERPINB5）が、FMT後に最も高度に発現上昇した遺伝子のいくつかとして同定した（図1B）。これと一致して、組織の修復と再生に関連する上皮間葉転換（EMT）の遺伝子セットが、GSEAによってFMT後に有意に濃縮されていることもわかった（補足表1）。EMTは、極性化した上皮細胞から間葉系細胞への移行を特徴とし、細胞運動性が亢進し、細胞外マトリックスタンパク質の産生が増加する。このプロセスの一環として、これらの細胞は、組織メタロプロテアーゼ阻害剤（TIMPs）やセリンプロテアーゼ阻害剤（SERPINs）などのMMP阻害剤とともに、細胞外マトリックスをリモデリングするMMPsもアップレギュレートする(79)。発現量の異なる遺伝子をさらに標的化解析したところ、FMT後に有意に増加したいくつかのMMP（図5C）と、このプロセスの阻害剤（TIMP1、SERPINB5）が同定された。MMPの制御は、NF-kBやMAPK経路、MMPプロモーター領域へのAP-1結合(80)など、いくつかのシグナル伝達カスケードによって誘導される。さらに、shRNAを用いてMMP1をノックダウンすると、大腸がん細胞株においてEMTが減少し、AktとMycの発現が減少したことから(81)、これらの遺伝子の発現がこれらの経路の活性化を維持している可能性が示唆される。全体として、これらの結果は腸の再生と修復に関連した環境と一致している。
結論
今回の転写データから示唆された経路が、陰窩の長さの変化と腸管修復にどのように寄与しているか、その可能性のあるモデルを図6に示す。FMT後の大腸生検では、FMT前に比べて陰窩の長さが長くなっていることが観察され、FMTが細胞増殖を促進していることが示唆された。これらの生検サンプルのバルクRNAシーケンシングを利用することで、特にタンパク質の合成とプロセシング、および細胞外マトリックスの再編成に関連する経路において、多くの異なる発現遺伝子を伴う条件間の明確な発現プロファイルが観察された。MycおよびmTORc1経路の標的遺伝子は、腸細胞のエネルギー産生に重要な経路であるポリアミン生合成に関連する遺伝子を含め、これらの患者の陰窩の長さと有意な相関があった。また、IL-33シグナル伝達とEGFRリガンド遺伝子にも有意な変化が観察され、IL-33シグナル伝達とその結果としてのEGFRリガンドの産生がこれらの変化の背景にある可能性が示唆された。
図6：
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図6：
FMTが促進する大腸遺伝子発現の変化の視覚的要約。
FMTはIL-33シグナル伝達遺伝子の有意な増加と関連している。IL-33シグナル伝達は、Erk/MAPKおよびPI3K/Akt/mTORシグナル伝達カスケードを刺激しうるアンフィレグリンなどのEGFRリガンドの発現を促進する。ErkとmTORはまた、Mycタンパク質レベルを安定化し、Myc活性化遺伝子の発現増強を促進する。MycとmTORc1の標的遺伝子は、リボソームの生合成、タンパク質の合成とプロセシング、ポリアミンの生合成を促進し、腸上皮細胞の増殖を促進する。一方、Erkシグナルは、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を増加させ、細胞外マトリックスのリモデリングと修復を促進するAP-1転写因子の構成要素であるc-Fosを活性化する。
これらの経路と、われわれの組織学的データで観察された細胞増殖と陰窩の長さの変化との間のメカニズム的関連性を確認するためには、さらなる研究が必要である。しかしながら、これらのデータは、FMTが再発性CDI患者のコホートにおいて腸の再生を促進し、このことがMyc、mTOR、IL-33、EGFRシグナル伝達などの経路における広範な転写変化と関連していることを示唆している。