臨床分離バンコマイシン耐性腸球菌に対する必須脂肪酸の抗菌および抗バイオフィルム効果

2023年9月29日 16:32

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オリジナル研究論文
フロント Cell. Infect. 微生物学、2023年9月29日
バイオフィルム
第13巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1266674
臨床分離バンコマイシン耐性腸球菌に対する必須脂肪酸の抗菌および抗バイオフィルム効果
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1266674/full?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Ming Wei1 Peng Wang1 Tianmeng Li1 Qiangyi Wang2 Mingze Su3 Li Gu1* Shuai Wang1* 1．
1首都医科大学北京呼吸器医学研究所・北京朝陽病院感染症・臨床微生物科（中国・北京市
2中国医学科学院老年医学研究所国立老年医学センター北京病院臨床検査部（中国・北京市
中国・首都医科大学北京同仁病院臨床検査部
はじめに腸球菌（Enterococcus faecium）は院内感染の主要な原因菌であり、公衆衛生上の重大な問題となっている。バンコマイシン耐性腸球菌（vancomycin-resistant E. faecium：VRE-fm）の増加により、従来の抗生物質を補完する新たな抗菌薬の開発が急務となっている。本研究では、必須脂肪酸（EFAs）のVRE-fmに対する抗菌活性および抗バイオフィルム活性を評価し、さらにEFAsの抗バイオフィルム活性の分子メカニズムを探索することを目的とした。

方法従来の抗生物質とEFA（α-リノレン酸（ALA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、リノール酸（LOA）、γ-リノレン酸（GLA）、アラキドン酸（AA）を用いた微量希釈ブロス法による抗菌性試験を行った。VRE-fmの細胞形態に対するEFAの影響を走査型電子顕微鏡で調べた。クリスタルバイオレット法を用いて、VRE-fmに対するEFAの抗バイオフィルム活性を評価した。さらに、GLAの作用下におけるVRE-fm分離株のバイオフィルム関連遺伝子（acm、atlA、esp、sagA）の発現を定量的逆転写PCR（qRT-PCR）法により解析した。

結果は以下の通りであった： VRE-fm分離株は、従来のほとんどの抗生物質に対して高い耐性を示したが、キヌプリスチン・ダルホプリスチン（90.0％）、チゲサイクリン（100％）、リネゾリド（100％）に対してのみ高い感受性を示した。EPA、DHA、GLAは優れた抗菌活性を示した。EPA、DHA、GLAのMIC50/90は、それぞれ0.5/1、0.25/0.5、0.5/1 mMであった。SEM画像から、V27株は多数のDHA分子を吸着していることが示された。さらに、すべてのEFAはVRE-fmバイオフィルムに対して優れた阻害活性と除菌活性を示した。バイオフィルム形成能が中等度のVRE-fm 6株に対して，EFAsのバイオフィルム阻害率は45.3～58.0％，菌消失率は54.1～63.4％であった．GLAはVRE-fm分離株に対して顕著な抗バイオフィルム活性を示した。qRT-PCR解析の結果、GLAはVRE-fmのatlA遺伝子の発現を有意に低下させた（P < 0.01）。

結論 DHAは最も強い抗菌活性を示し、GLAは抗菌活性を有するEFAの中で最も強い抗バイオフィルム効果を示した。我々の新たな知見は、GLAの抗バイオフィルム活性が、VRE-fmのatlA遺伝子発現のダウンレギュレーションを介している可能性を示している。したがって、DHAおよびGLAは、複数の抗菌薬耐性E. faeciumに関連する感染症の治療薬として開発される可能性があると考えられた。

1 はじめに
エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）は、ヒトの腸内細菌叢のグラム陽性メンバーである。腸内常在菌であるE. faeciumは健康な宿主では病原性を示さないが、感受性の高い宿主では感染を引き起こすことがある（Ch'ng et al.） E. faeciumは院内感染の主要な原因であり、複数の抗菌薬耐性により治療が困難な場合が多い（Santajit and Indrawattana, 2016; Panda et al.）近年、感染症が集団発生しやすい医療環境に適応したE. faeciumの新しい亜種が出現している（O'Tooleら、2023）。バンコマイシン耐性E. faecium（VRE-fm）による感染症は、広範囲の抗生物質に対する耐性が向上したため、治療の選択肢がさらに減少している（Lagatollaら、2022；Cairnsら、2023）。さらに、バイオフィルムを形成するE. faeciumの能力はその顕著な病原性特性であり、バイオフィルムは浮遊性細胞に比べて抗生物質耐性を大幅に増強する（Ch'ngら、2019；Patilら、2021）。したがって、VRE-fmによる感染は世界的に深刻な課題であり、VRE-fmに対抗するための新たな抗菌剤の開発、ならびにVRE-fmが形成するバイオフィルムの阻害および根絶が急務である。

不飽和脂肪酸が抗菌活性を示すことはよく知られている（Desbois, 2012; Yoon et al.）しかし、従来の抗生物質の発見と開発のために、不飽和脂肪酸の抗菌特性に関する研究は長い間放置されてきた。従来の抗生物質耐性が深刻化する中、不飽和脂肪酸が抗菌剤として見直されている。最近、不飽和脂肪酸が様々な微生物病原体によって形成されるバイオフィルムも阻害または根絶しうることが、数多くの研究で示された（Kimら、2018；Ramanathanら、2018；Cuiら、2019；Wangら、2022）。その結果、不飽和脂肪酸はバイオフィルム関連感染症を治療・予防する次世代の抗菌剤となり得る。

必須脂肪酸（EFAs）は、体内で必要だが作ることができず、食物から摂取しなければならないもので、不飽和脂肪酸に属し、体内で重要な役割を果たす。EFAはα-リノレン酸（ω-3グループ）とリノール酸（ω-6グループ）をベースとしており、乳幼児の発育、心血管疾患の罹患率や死亡率の低下、がん予防、脳や視覚の機能などに相関している（Kaur et al. したがって、EFAを新規抗菌剤の代表として用いて、抗菌および抗バイオフィルムに関する研究を行うには良いモデルである。

その中で、α-リノレン酸（ALA、18:3）、エイコサペンタエン酸（EPA、20:5）、ドコサヘキサエン酸（DHA、22:6）の3つのω-3グループと、リノール酸（LOA、18：リノール酸（LOA、18：2）、γ-リノレン酸（GLA、18：3）、アラキドン酸（AA、20：4）を含む3種類のω-6系成分を用いて、in vitroにおけるVRE-fmに対する抗菌・抗バイオフィルム効果を評価した。さらに、VRE-fmに対するGLAの抗バイオフィルム機構を初めて検討した。本研究により、GLAがVRE-fmおよびバイオフィルム関連感染症の新規治療薬として開発される可能性が示された。

2 結果
2.1 VRE-fmの抗生物質耐性プロファイル
VRE-fm分離株20株の抗生物質耐性プロフィールを表1に、その概要を図1に示す。本研究で分離されたVRE-fmは、ペニシリン（100％）、アンピシリン（100％）、シプロフロキサシン（100％）、レボフロキサシン（100％）、ニトロフラントイン（66.7％）、エリスロマイシン（63.6％）、テトラサイクリン（60. 0％）、テイコプラニン（35.0％）、高濃度ストレプトマイシン（30.0％）、高濃度ゲンタマイシン（30.0％）に中等度耐性であったが、キヌプリスチン・ダルホプリスチン（90.0％）、チゲサイクリン（100％）、リネゾリド（100％）にのみ高感受性であった。

表1
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表1 VRE-fm分離株の抗菌薬感受性

図1
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図1 VRE-fm分離株（n＝20）の14種類の抗生物質に対する耐性パターン。P、ペニシリン；AMP、アンピシリン；VA、バンコマイシン；TEC、テイコプラニン；CIP、シプロフロキサシン；LEV、レボフロキサシン；TE、テトラサイクリン；TGC、タイゲサイクリン；QDA、キヌプリスチン・ダルホプリスチン；E、エリスロマイシン；NIT、ニトロフラントイン；LZD、リネゾリド；STR、ストレプトマイシン；GM、ゲンタマイシン。

2.2 板状菌VRE-fmに対するEFAの抗菌活性
プランクトン型のVRE-fm分離株に対する各種EFAのMIC値を表2に示す。設定したEFA濃度範囲では、LOAとAAに抗菌活性は認められなかった。MIC50とMIC90を比較すると、DHAが最も優れた抗菌活性を示し、EPAとGLAはDHAよりやや低く、ALAはVRE-fm分離株に対して弱い阻害効果を示した。

表2
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表2 VRE-fm分離株に対するEFAのMIC

2.3 走査型電子顕微鏡による形態学的変化
対照群に比べ、実験群ではV27株の細胞壁に多数のDHA分子が吸着し、表面が粗くなっていた（図2）。多数のフィールドを観察したところ、細胞膜が著しく損傷した細菌細胞は観察されなかった。

図2
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図2 走査型電子顕微鏡像。(A）はDHAを添加してインキュベートしたもの、（B）はDHAを添加せずにインキュベートしたもの。赤矢印は粗い細胞、黄色矢印は平滑な細胞を示す。

2.4 VRE-fmのバイオフィルム形成能
EFAの抗バイオフィルム効果を調べるため、in vitroでのバイオフィルム形成に最適な条件を探索した。VRE-fm分離株のバイオフィルム形成を調べるため、トリプチカーゼ-大豆ブロス（TSB）に異なる濃度のグルコースを添加した。結果を図3に示す。異なる濃度のグルコースを添加した場合、バイオフィルムバイオマスに統計学的有意差は認められなかったが、TSB+2%グルコース群のバイオフィルムバイオマスの平均値が最も高かった。したがって、2％グルコースを含むTSB（TSBG）培地が、本試験の最終条件として選択された。

図3
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図3 VRE-fm分離株のバイオフィルム形成に対するTSBブロス中の異なる濃度のグルコースの効果の比較。G、グルコース。

TSBG培地では、20株中6株のバイオフィルム形成能が中程度であったが、14株のバイオフィルム形成能は弱かった（図4A）。ドレーン液由来のVRE-fm分離株と尿由来のVRE-fm分離株のバイオフィルム形成能に統計学的有意差はなかった（図4B）。

図4
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図4（A）TSB+2％グルコースにおけるVRE-fm分離株のバイオフィルム形成能；（B）異なる臨床由来VRE-fm分離株のバイオフィルムバイオマスの比較。

2.5 EFAの抗バイオフィルム効果
これらのEFAの抗バイオフィルム活性を調べるために、中程度のバイオフィルム形成能を持つVRE-fmの6株（V05、V06、V08、V09、V22、V27）を実験に選んだ。VRE-fm分離株に対するEFAの抗バイオフィルム活性は，抗菌活性とは異なるものであった．1mMのEFAはいずれも優れたバイオフィルム阻害・消失活性を示した（図5）。これらのVRE-fm分離株に対するEPA、DHA、ALA、LOA、AA、GLAのバイオフィルム阻害率は、それぞれ45.3％、48.9％、50.0％、52.4％、57.8％、58.0％であった（図5A）。一方、EPA、DHA、ALA、LOA、GLA、AAのバイオフィルム消失率は、それぞれ54.1％、54.1％、56.6％、60.8％、63.2％、63.4％であった（図5B）。GLAは抗菌活性を有するEFAの中でVRE-fmに対して最も優れた抗バイオフィルム活性を示した。

図5
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図5（A）VRE-fm分離株に対するEFAのバイオフィルム阻害率（％）；（B）VRE-fm分離株に対するEFAのバイオフィルム消失率（％）。ALA、α-リノレン酸；EPA、エイコサペンタエン酸；DHA、ドコサヘキサエン酸；LOA、リノール酸；GLA、γ-リノレン酸；AA、アラキドン酸。

2.6 VRE-fmにおけるバイオフィルム関連遺伝子の検出
すべてのVRE-fm分離株において、acm、esp、sagA遺伝子が20/20株（100％）で検出された。バイオフィルム形成能の低い1株のみatlA遺伝子が検出されなかった（95.0％、19/20株）。しかし、agg遺伝子とgelE遺伝子はどの分離株からも検出されなかった（表3）。

表3
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表3 VRE-fm分離株におけるバイオフィルム関連遺伝子のPCR検出結果。

2.7 GLAによるVRE-fmのバイオフィルム関連遺伝子発現の制御
GLAの抗バイオフィルム機構を説明するために、VRE-fm分離株6株におけるバイオフィルム関連遺伝子（acm、atlA、esp、sagA）の発現量を解析した。対照群と比較して、GLAはVRE-fmのatlA遺伝子の発現を低下させ（0.232倍）、その差は統計学的に有意であった（P < 0.01）が、対照と比較したacm（1.013倍）、esp（0.373倍）、sagA（0.931倍）の遺伝子発現レベルには統計学的な差はなかった（P > 0.05）（図6）。

図6
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図6 γ-リノレン酸（GLA）で処理した6つのVRE-fm分離株の成熟バイオフィルムにおけるバイオフィルム関連遺伝子の発現量（fold change）。**P<0.01はDunnettのt検定によりコントロールと比較した。

図7は、異なるVRE-fm分離株におけるバイオフィルム関連遺伝子の発現レベルに対するGLAの制御効果をさらに示した。試験した6つのVRE-fm分離株のうち、acm、atlA、esp、sagA遺伝子の発現レベルは4つの分離株（V05、V08、V22、V27）で低下した。コントロール群と比較して、V05、V22、V27のGLA処理群では有意な差が見られたが、V08では有意な差は見られなかった。一方、他の分離株と比較して、acmおよびsagA遺伝子の発現量は、V06およびV09の処理群で異なっており、GLA処理群では発現量が上昇していた。

図7
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図7 γ-リノレン酸（GLA）で処理した各VRE-fm分離株の成熟バイオフィルムにおけるバイオフィルム関連遺伝子の発現量（fold change）。*P<0.05および**P<0.01はDunnettのt検定によりコントロールと比較した。(a) v05; (b) v06; (c) v08; (d) v09; (e) v22; (f) v27。

3 考察
VRE-fmの出現は公衆衛生に重大な脅威をもたらす。さらに、バイオフィルムを形成するE. faeciumの能力は、その回復力をさらに高め、この病原体による感染症を根絶することを困難にしている。近年、臨床的に分離されたVRE-fmに対するEFAの抗菌効果および抗バイオフィルム効果に対する関心が高まっている。本研究では、VRE-fmに対するEFAの抗菌・抗バイオフィルム作用を評価するだけでなく、まずVRE-fmバイオフィルムのGLAによる除菌の分子機構を解析した。

本研究で分離されたVRE-fmは，従来のほとんどの抗生物質に対して高い耐性を示したが，キヌプリスチン・ダルホプリスチン（90.0％），チゲサイクリン（100％），リネゾリド（100％）に対してのみ高い感受性を示した。したがって、VRE-fmによる感染症は抗生物質の選択肢が限られているために治療が困難である。VRE-fm株のβ-ラクタム系抗生物質（ペニシリンおよびアンピシリン）に対する本質的な耐性は、β-ラクタム系抗生物質との親和性が低いペニシリン結合タンパク質の高発現によるもので、ペプチドグリカンの合成と細菌の増殖を可能にする（Montealegre et al、フルオロキノロン（シプロフロキサシンおよびレボフロキサシン）に対する耐性は、DNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIVを含む標的酵素の変化、ならびに細胞内蓄積の減少によって媒介される（Piddock, 1999）。ゲンタマイシンに対する耐性は、大きなゲンタマイシン分子に対するE. faeciumの細胞壁の透過性が低いことに起因するが、高レベルのゲンタマイシンに対する耐性は、30Sリボソームサブユニットの結合部位の変化、またはゲンタマイシンの不活性化につながる修飾酵素の産生によってもたらされる（Osuka et al.）バンコマイシンとテイコプラニンはともにグリコペプチド系抗生物質に属するが、テイコプラニンは今回の研究で一部のVRE-fm分離株に対して依然として活性を維持していた。これはvanB遺伝子を持つことにより、分離株がバンコマイシンに低レベルの耐性を持ち、テイコプラニンに感受性を持つことが原因かもしれない（Kuzmaら、2022年）。

E. faeciumは従来の抗生物質に対して耐性化しつつあるため、従来の抗生物質を補完する新たな抗菌剤の発見が急務である。抗菌活性を有する有望な薬剤の1つは、微生物感染症の予防と治療のための不飽和脂肪酸である（Chanda et al.）いくつかの研究は、不飽和脂肪酸が幅広い細菌種と戦うことができることを示している（Sunら、2016；Churchwardら、2017；Pushparaj Selvadossら、2018）。本研究では、6種類のEFAを用いてVRE-fmに対する抗菌活性を試験した。我々の以前の研究（Wang et al., 2022）で示されたEFAの化学構造（例えば、二重結合の数、二重結合とカルボキシル基の相対的な位置）に関しては、それらが示す異なる抗菌活性を説明するパターンを見出すことは困難である。EFAの抗菌作用は主にEFAとVRE-fm株の細胞膜との相互作用に依存していると考えられ、EFAの化学構造のみからパターンを見出すことはできない。V27株の細胞壁には多数のDHA分子が吸着していることがSEMで観察された。これは、Dasaら（Dasa et al., 2016）によっても発見されていることであるが、DHAが細胞内への栄養輸送を妨げることによって増殖を阻害する役割を担っている可能性を示唆している。細胞膜が著しく損傷した菌は観察されなかったことから、VRE-fmの細胞膜の直接的な破壊はDHAの主要な抗菌メカニズムではないことが示された。この結果は、Sunら（Sun et al., 2016）が観察した結果とは異なっている、 2014）、Wonらはオレイン酸がStreptococcus mutansの膜酵素を阻害することを報告しており（Wonら、2007）、本研究におけるDHAの抗菌作用にも関与している可能性がある。

バイオフィルムは、宿主の免疫反応から細菌を守り、抗生物質に対する耐性を向上させるため、E. faecium感染症の病因において重要な役割を果たしている。マウリヤら（Maurya et al., 2021）の報告によると、E. faeciumのバイオフィルム形成はTSB培地で最大となり、次いで脳心筋梗塞ブロス、ルリアベルタニブロスの順であった。したがって、本研究ではTSB培地を基本とした。グルコースはE. faecalisのバイオフィルム形成に大きな影響を与えるため（Tendolkar et al.、2004）、VRE-fm分離株のバイオフィルム形成を試験するために、異なる濃度のグルコースをTSBに添加した。最終的に、TSB+2％グルコース培地をその後のバイオフィルム研究に選択した。バイオフィルム細胞は一般的に、成熟したバイオフィルムが厚く、代謝速度が遅く、バイオフィルム群集内での抗生物質耐性遺伝子の水平遺伝子転移率が高いため、プランクトン細胞よりも抗生物質に対する耐性が高いことがよく知られている（Komiyama et al.）そのため、バイオフィルムに関連したE. faecium感染症の根絶はしばしば困難である（Ch'ng et al.）多剤耐性とバイオフィルムは、VRE-fm株感染の治療をさらに困難にしている。不飽和脂肪酸には、真菌さえも含む広範な細菌が形成するバイオフィルムを阻害または根絶する活性があることが、数多くの研究で示されている（Kimら、2018；Ramanathanら、2018；Cuiら、2019；Wangら、2022）。これらの知見は、今回の研究と類似している。このことは、EFAが将来、感染症の臨床治療において役割を果たす可能性を示唆している。

最初の付着はバイオフィルム形成の最初のステップである。この段階には様々な表面接着剤が関与している。腸球菌表面タンパク質（Esp）、凝集物質（Agg）、E. faeciumのコラーゲンへの接着（Acm）を含む表面アドヘシンがないと、ヒト細胞への付着が減少し、バイオフィルム形成が弱まる（Nallapareddyら、2007；Soaresら、2014）。分泌抗原A（SagA）、オートライシン（AtlA）、ゼラチナーゼ（GelE）などのヒドロラーゼも、バイオフィルム形成に重要な役割を果たしている。バイオフィルム形成時に分泌されるSagAは、バイオフィルムマトリックスの重要な構成要素である。SagAは広範な細胞外マトリックスタンパク質と結合する。SagAがプロテイナーゼKによって加水分解されると、バイオフィルムの厚さは減少する（Paganelli et al., 2015）。オートライシン（AtlA）は、バイオフィルムの成長と成熟の段階で役割を果たし、主にE. faecium細胞を加水分解することでeDNAの放出を促進する役割を担っている（Xie et al., 2022）。GelEは主にゼラチン、コラーゲン、カゼイン、ヘモグロビンを加水分解し、eDNAの放出においてAtlAを補助する（Dunnyら、2014；Kiruthigaら、2020）。本研究では、esp、sagA、およびacm遺伝子が20/20株（100％）で検出され、atlA遺伝子は19/20株（95.0％）のVRE-fm分離株で検出された。バイオフィルム形成能の低い1株のみatlA遺伝子が検出されなかった。この結果は、atlA遺伝子だけではバイオフィルム形成能を決定することはできないが、バイオフィルム形成能に影響を与える可能性があることを示唆している。しかし、agg遺伝子とgelE遺伝子はどの分離株からも検出されなかった。これは、この2つの遺伝子が主にE. faecalisに存在し（Kiruthiga et al.

バイオフィルムの根絶に関しては、VRE-fmを直接死滅させることに加え、EFAがacm、atlA、esp、sagAを含むバイオフィルム関連遺伝子にどのような影響を与えるかについて、さらなる研究が必要である。バイオフィルム消失率が最も高いGLAと、中程度のバイオフィルム形成能を持つ6つのVRE-fm分離株（V05、V06、V08、V09、V22、V27）を用いて、そのメカニズムを説明した。本研究では、GLAがVRE-fm株のatlA遺伝子の発現を有意に低下させ、eDNAの放出を抑制することで、バイオフィルムの根絶をもたらす可能性が示唆された。この発見は、GLAがE. faecium感染と闘うための従来の抗生物質の代替となる可能性を示唆している。acm遺伝子は、GLAの作用下で2つの分離株でアップレギュレートされたことから、これらの分離株は、acm遺伝子の高発現を通して、バイオフィルムを根絶または修復するEFAに抵抗する可能性が示唆された。これらの推測を確認するためには、さらなる研究が必要である。

以上のことから、DHAとGLAはVRE-fm分離株に対して優れた抗菌活性と抗バイオフィルム活性を示し、次世代の抗菌剤として期待される。また、バイオフィルム関連遺伝子の相対発現量を解析した結果、VRE-fm株ではatlA遺伝子の発現量が有意に低下しており、EFAがバイオフィルムを駆除する重要な分子機構である可能性が示唆された。

4 材料と方法
4.1 株および培養条件
合計20株の臨床VRE-fm株（非複製株）を首都医科大学北京朝陽病院感染症・臨床微生物科（中国北京市）から収集した。これらの菌株は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間法（MALDI-TOF）（VITEK-MS; bioMérieux, France; IVD version 3.0）を用いて同定した。確認された菌株は、-20℃の凍結ストックから定期的にリフレッシュし、すべての実験の前に、コロンビア血液寒天培地に35℃で24時間、少なくとも2回接種した。

4.2 抗菌薬感受性試験
ペニシリンに対するE. faeciumのペニシリン（P）、アンピシリン（AM）、バンコマイシン（VA）、チゲサイクリン（TGC）、シプロフロキサシン（CIP）、レボフロキサシン（LEV）、テトラサイクリン（TE）、キヌプリスチン・ダルフォプリスチン（QDA）、エリスロマイシン（E）に対する感受性を調べた、ニトロフラントイン（NIT）、リネゾリド（LZD）、高濃度ストレプトマイシン（STR）、高濃度ゲンタマイシン（GM）について、Vitek 2 compact system（bioMerieux, Marcy l'Etoile,France）を用いたブロス微量希釈法で試験を行った。テイコプラニン（TEC）の最小発育阻止濃度（MIC）はEtest（bioMerieux, Marcy l'Etoile,France）で測定した。感受性（S）、中間感受性（I）、耐性（R）の解釈は、Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI, 2023）のガイドラインに従って行った。CLSIガイドラインではE. faeciumに対するTGCの推奨MIC感受性のブレイクポイントが示されていないため，TGCのMICはEuropean Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing（EUCAST, 2023）を用いて解析した。抗菌薬感受性試験の品質管理株としてE. faecalis ATCC 29212を用いた。

4.3 生育阻害試験
EFAs（ALA、EPA、DHA、LOA、GLA、AA）の抗菌活性は、既報（Wang et al.）簡単に説明すると、VRE-fm分離株（1.0〜2.0×108 CFU/mL）を、異なる濃度のEFAsを含む200μLのMueller Hinton IIブロスを入れた96ウェル丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに1:200で接種した。EFAは0.125mMから1mMまで2倍希釈した。MIC値は、35℃で24時間培養後、細菌の目に見える増殖を阻害した化合物の最低濃度を読み取り記録した。すべての実験を少なくとも3回行った。

4.4 走査型電子顕微鏡
VRE-fm細胞の形態に対するEFAの影響を調べるため、DHAとインキュベートしたV27株をSEMイメージング用に選択した。最終濃度約7.5×105 CFU/mLのV27株を、1 mMのDHAを添加した場合と添加しない場合で、35℃で1時間振盪培養した。試料を2.5%グルタルアルデヒドで4℃、5時間固定した後、順次エタノール（30%、50%、70%、80%、90%、100%）で脱水し、100%エタノールで15分間、2回脱水した。最後にサンプルを金でスパッタコーティングし、SU8020 SEM（日立、日本）を用いて顕微鏡検査を行った（Rani et al.）

4.5 バイオフィルム形成アッセイ
バイオフィルム形成については、Cruzらによって記載された方法に若干の修正を加えて従った（Cruzら、2018）。簡単に述べると、VRE-fm培養液を0.5％、1％または2％のグルコースを含む新鮮なトリプチカーゼ-大豆ブロス（TSB）で1：100に希釈した。次に、200μLの懸濁液（1×106 CFU/mL）をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、35℃で24時間培養した。

バイオフィルム量を測定するため、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS；pH7.2）で3回洗浄し、浮遊細胞を除去した。残った付着細胞を200μLのメタノールで15分間固定し、200μLのクリスタルバイオレット（0.2%）で20分間染色し、蒸留水で洗浄して余分なクリスタルバイオレットを除去した。その後、結合したクリスタルバイオレットを200μLの33％酢酸で抽出した。OD値は、Multiskan EXマイクロプレート光度計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States）を用いて630 nmで測定した。実験は独立して3回繰り返した。バイオフィルム形成のODカットオフ値（ODc）は、陰性コントロールの平均OD値より3標準偏差上と定義した。

分離株は、強いバイオフィルム産生株（OD 630 nm > 4×ODc）、中程度のバイオフィルム産生株（2×ODc < OD 630 nm ≤ 4×ODc）、弱いバイオフィルム産生株（ODc < OD 630 nm ≤ 2×ODc）、および非バイオフィルム産生株（OD 630 nm ≤ ODc）に分類した（El-Houssainiら、2019）。

4.6 バイオフィルム阻害および根絶アッセイ
バイオフィルム阻害アッセイのために、E. faecium分離株を、1mMのEFAsを含むTSB＋2％グルコース（TSBG）のマイクロタイタープレートに接種した。EFAsを含まないTSBG培地を対照として用いた。マイクロプレートを35℃で24時間インキュベートした後、形成されたバイオフィルムを上記のクリスタルバイオレット法を用いて測定した。バイオフィルム阻害率（％）は式に従って算出した：阻害率（％）＝（ODコントロール-ODサンプル）／ODサンプル×100％（Wangら、2021）。

バイオフィルム除菌アッセイでは、成熟したE. faeciumのバイオフィルムをTSBG培地で24時間培養して予め形成させた。培養後、PBSで2回洗浄して非付着細胞を除去した。その後、1mMのEFAを含むTSBGをウェルに添加した。新鮮なTSBG培地で処理した成熟バイオフィルムを対照として用いた。マイクロタイタープレートを35℃でさらに24時間インキュベートし、上述のクリスタルバイオレット法を用いてバイオフィルム量を検出した。バイオフィルム根絶率（％）は、式に従って算出した：駆除率（％）＝（ODコントロール-ODサンプル）／ODサンプル×100％（Wangら、2021）。

4.7 DNA抽出とバイオフィルム関連遺伝子の検出
E. faecium分離株からバイオフィルム関連遺伝子の存在を検出するために、qPCRアッセイを用いた。TIANamp Bacteria DNAキット（天健生物技術（北京）有限公司、中国、北京）を用いて、製造元のプロトコールに従って、コロンビア血液寒天培地に接種した菌株からゲノムDNAを抽出した。Acm、Agg、AtlA、Esp、GelE、およびSagAをコードするバイオフィルム関連遺伝子を検出するため、すべてのE. faecium分離株のPCR検査に特定のプライマーを使用した。検出に使用したプライマーを表4に示す。PCRの手順は、95℃、3分、40サイクル（95℃、15秒、60℃、1分）であった。

表4
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表4 本研究で使用したプライマーのリスト。

4.8 RNA抽出とqRT-PCR
バイオフィルムに関連するE. faecium遺伝子の転写に対するGLAの影響を調べるため、qRT-PCR法によりacm、atlA、esp、sagAの遺伝子発現量を評価した。遺伝子特異的プライマーと、遺伝子発現量測定の内部コントロールとなる16S rRNAをコードする参照遺伝子（16S）の塩基配列を表4に示す。本研究で使用したいくつかのプライマーは、GenBankデータベースから得られた選択配列に従って、Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）により設計した。

E. faeciumの成熟バイオフィルムは、前述の方法に従って樹立した。バイオフィルムをGLAで24時間処理した後、遠心分離（5000×g、10分間）により細胞を回収した。E. faeciumの全RNAは、RNA抽出試薬キット（Tiangen Biotech, Beijing, China）を用いて、製造者の指示に従って抽出した。単離したRNAサンプルの濃度、純度、品質は、Nano Drop One Spectrophotometer（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて測定した。各サンプルのRNA（1μg）を、SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて直ちにcDNAに逆転写した。qRT-PCRは、PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems, Life Technologies, Austin, USA）を用いて、Applied Biosystems 7500 real-time PCR system（Applied Biosystems, Waltham, MA, USA）で解析した。増幅反応は、10μLの2×PowerUp SYBR Green Master Mix、2μLのcDNA、1μLのForward Primer、1μLのReverse Primer、および6μLのH2Oを含む20μLの反応容量で行った。反応条件は95℃、3分、40サイクル（95℃、15秒、60℃、1分）。遺伝子発現は、2-ΔΔCT法（Livak and Schmittgen, 2001）を用いて参照遺伝子16Sで正規化した。

4.9 統計解析
統計解析は、IBM SPSS Statistics 20.0 ソフトウェア・プログラム（IBM, Armonk, NY, USA）を用いて行った。データは、少なくとも3回の独立した実験の平均値±標準偏差（SD）で表した。2群間の統計的比較はStudentのt検定を用いて行った。コントロール群と異なる処理群間の多重比較は、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてDunnettのt検定を用いて分析した。P値＜0.05を統計的に有意とみなした。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著論文は、論文/補足資料に含まれている。さらなるお問い合わせは、対応する著者までお願いします。

倫理声明
ヒトを対象とした研究は、首都医科大学北京朝陽病院倫理委員会の承認を得た。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。国内法および施設要件に従い、参加者または参加者の法的保護者／近親者からの書面による参加同意は不要であった。

著者貢献
MW：構想、方法論、プロジェクト管理、執筆（原案）。PW：方法論、原案執筆。TL：調査、執筆（原案）。QW: 検証、執筆 - 原案。MS：形式分析、執筆 - 原案。LG: 監修、執筆-校閲・編集。SW：資金獲得、可視化、執筆-校閲・編集。

資金提供
著者らは、本論文の研究、執筆、および/または発表のために財政的支援を受けたことを表明する。本研究は、北京自然科学基金会（助成金番号7234369）および北京朝陽病院科学技術革新基金（助成金番号22kcjjyb-19）の助成を受けた。

謝辞
著者らは、走査型電子顕微鏡によるイメージングを手伝ってくれた中国科学院北京ナノエネルギー・ナノシステム研究所のDan Luo教授と謝志王博士に感謝する。さらに、著者らは、この研究に貢献してくれた北京朝陽病院（中国、北京市）の感染症科および臨床微生物科の全スタッフに感謝したい。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

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キーワード：腸球菌、多剤耐性、バイオフィルム、VRE、脂肪酸

引用臨床分離バンコマイシン耐性腸球菌（Enterococcus faecium）に対する必須脂肪酸の抗菌および抗バイオフィルム効果。Front. Cell. Infect. Microbiol. 13:1266674. doi: 10.3389/fcimb.2023.1266674.

受理：2023年7月25日 2023年7月25日；受理された： 2023年9月13日；
発行：2023年9月29日

編集者

アドライン・プリンシー・ソロモン、サストラ大学、インド
査読者

Poonam Mudgil, ウェスタン・シドニー大学, オーストラリア
ヴィノスカナン・ラヴィチャンドラン（アミティ大学、インド
Copyright © 2023 Wei, Wang, Li, Wang, Su, Gu and Wang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Li Gu, didcm2006@mail.ccmu.edu.cn; Shuai Wang, wangpkq@163.com

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

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