産卵後期の産卵鶏の産卵成績、卵質、免疫機能、腸管形態および微生物叢に及ぼす発酵飼料の影響

第16巻第12号 2022年12月 100676号
産卵後期の産卵鶏の産卵成績、卵質、免疫機能、腸管形態および微生物叢に及ぼす発酵飼料の影響
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https://doi.org/10.1016/j.animal.2022.100676
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ハイライト

産卵周期後期の鶏に対する発酵飼料の効果を調べた。

発酵飼料は産卵率、卵質を向上させ、割卵率を低下させた。

発酵飼料は免疫機能および腸内環境を改善した。

乳酸菌の増加とカンピロバクターの減少により、腸内細菌叢が変化した。

発酵飼料は家禽の腸内健康を改善する理想的な機能性飼料である。

概要
発酵飼料は、家禽の消化管内の微生物環境、健康状態および生産成績を改善する可能性を持っている。そこで本研究では、産卵後期の産卵鶏の産卵成績、卵質、免疫機能、腸管形態および微生物叢に及ぼす発酵飼料の影響を調べることを目的とした。80週齢の健康なHy-Line Brown産卵鶏360羽を用い、56日間の試験を実施した。すべての鶏は、0.0％の発酵飼料を含む基礎飼料（CON）と20％の発酵飼料（FF）の2つの処理群にランダムに分けられ、それぞれ36羽ずつ5反復された。その後の分析で、発酵飼料を給与すると産卵率が有意に上昇し、FF群では割卵率および飼料要求率が低下することが明らかになった（P < 0.05）。さらに、発酵飼料を給与した鶏では、卵白の高さおよび Haugh 単位の値が有意に増加した（P < 0.05）。発酵飼料はまた、十二指腸、空腸および回腸絨毛の高さの増加とも関連していた（P < 0.05）。発酵飼料を与えた産卵鶏は、CONと比較して、免疫グロブリン（Ig）A、IgG、IgMレベルが高く（P < 0.01、）、インターロイキン2、インターロイキン6、腫瘍壊死因子αおよびインターフェロンγ濃度が高かった（P < 0.05）。これらの産卵鶏の微生物相を分析した結果、α多様性は発酵飼料補給によって有意に影響されないことが明らかになった。発酵飼料を給与した鶏の糞便サンプルでは、固形物の存在量がCONのものと比較して減少していた（30.61 vs 35.12%, P < 0.05）。属レベルでは、発酵飼料は産卵鶏の相対的なLactobacillus、MegasphaeraおよびPeptococcusの存在量の改善と関連し、Campylobacter存在量の減少を示した。これらの結果は、発酵飼料の給与が産卵鶏の産卵成績、卵質、免疫機能、腸絨毛の成長および産卵サイクル末期の糞便微生物学的環境に有益である可能性を示唆している。

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キーワード
卵生産能力腸内環境免疫力マイクロバイオーム16S rRNA シークエンス
意味合い
産卵周期の後期に産卵鶏の生産能力を向上させる方法として、発酵飼料の活用に関心が高まっている。本研究は、産卵後期の産卵鶏に対する発酵飼料の影響を調べるために実施された。その結果、産卵成績、卵質、免疫機能、腸絨毛の高さおよび微生物叢が発酵飼料添加により変化することが示され、発酵飼料が産卵後期の産卵成績および腸の健康を改善する理想的な機能性飼料である可能性が示唆された。

はじめに
産卵鶏が産卵周期の後期になると、慢性的な炎症活動、腸管吸収の低下、および/または酸化還元バランスの乱れにより、産卵量と卵質が著しく低下する可能性がある（Xieら、2019年、Wangら、2020年）。したがって、これらの鶏の産卵性能および卵質を改善することは、産卵サイクルを延長し、それによって産卵鶏の飼育効率を高める可能性がある（Zhangら、2019年、Guoら、2020年）。最近の研究は、主に、結果として得られる卵内に抗生物質残留物の存在をもたらさない、この目標を達成するためのアプローチに焦点を当てている。活発な研究の対象となっているそのような戦略の1つは、発酵飼料の使用であり、これは、給餌前の病原体汚染を回避し、家禽の全体的な胃腸の健康、消化率栄養素および性能を改善する可能性を有する（Missottenら、2013、Drażboら、2018、Gaoら、2020）。現在、発酵飼料は、栄養の生物学的利用能を向上させ、抗栄養因子を低減する能力により、成長促進剤として抗生物質の優れた代替品となっている（Zaworskaら、2016、Drażboら、2018、Gaoら、2020）。

発酵は、CP含量レベルを増加させる一方で、そこに含まれる粗繊維、抗栄養因子、および毒性化合物のレベルを下げることによって反映されるように、与えられた形態の飼料の栄養特性に有益な影響を与える（Khempakaら、2014年）。また、乳酸菌（LAB）の増殖により有機酸濃度が上昇し、得られる飼料のpHが低下する（Canibe and Jensen, 2012）。発酵飼料は、消化管の健康とパフォーマンスへの利点が報告されているため、家禽生産の文脈で使用される頻度が高まっている（Zhangら、2016）。Yehら（2018）は、発酵飼料を補充した飼料を鶏に与えたところ、ブロイラーの成長が著しく改善されたことを報告しました。そして、枯草菌発酵アルファルファミールを含む飼料を与えたガチョウにおいて、抗酸化酵素活性および糞便ビフィドバクテリウムとラクトバチルス存在量の増加が報告され、大腸菌群の減少とともに消化酵素活性が改善された（Yin and Huang, 2016）。Jaziら（2019）は、飼料源としての発酵大豆ミールが、サルモネラ・ティフィムリウムにチャレンジしたブロイラー雛のサルモネラ・コロニゼーション率および異好血球／リンパ球比を低下させ、同時に腸粘膜形態および成長成績を全体的に改善することを決定した。実際、発酵飼料の使用は、家禽の免疫反応、腸の形態、酸化ストレス、および腸内細菌叢組成の改善と一貫して関連している（Huら、2016）。

産卵周期の後期における産卵鶏に対する発酵飼料補給の効果は、より注目されている（Zhuら、2022）。我々は、発酵飼料が産卵後期の腸内微生物環境を改善し、栄養素の吸収を促し、腸管系の健全な機能を促進し、産卵鶏の産卵成績および卵質を向上させることができると仮定した。そこで本研究では、産卵周期の後期における産卵鶏の産卵成績、卵質、免疫機能、腸管形態および糞便微生物叢に発酵飼料が与える影響を探ることを目的とした。観察された結果は、産卵鶏の発酵飼料と腸内細菌叢の関係を理解する上で、産卵サイクル後期の産卵成績と腸内健康に関わるものとして、理論的に重要であると考えられる。

材料および方法
発酵飼料の調製
発酵飼料は、Hebei Zhongbang Biological Technology Co. Ltd. Ltd. (中国、保定市)で製造した。発酵の前に、乾燥した基礎飼料（60%のトウモロコシ、25%の大豆粕、15%の小麦ふすま）を均質に混合し、約109CFU/mLの枯草菌とSaccharomyces cerevisiaeを含む蒸留水と合わせて、最終水分レベルが約40%になるように調整した。接種後、飼料を空気攪拌せずにビニール袋（25kg/袋）に詰め、37℃で14日間培養した。発酵後、湿った発酵飼料を0℃の冷蔵ハウスで保存した。

発酵飼料の栄養組成は以下のように測定した：DMは105℃で一定重量までオーブン乾燥することで推定した；窒素はケルダール窒素計で測定し、CP含有量は窒素×6.25で算出した；NDFはANKOM 2000 Fiber Analyzerで熱安定α-アミラーゼを用いて測定した。発酵飼料中のLAB、BacillusおよびSaccharomycesの個体数は、Bonaldiら（2021）の方法に従って、特定の培養液によって定量した。乳酸含量は、高速液体クロマトグラフィー自動分析器（Waters PICO TAG amino acid autoanalyzer; Millipore, MA, USA）を用いて、標準手順に従い測定した。発酵飼料の栄養組成を表1に示す。

表1. 産卵鶏用発酵飼料の組成（DM 基準の％）。

項目 発酵飼料
pH 4.20
乳酸(mg/g) 18.29
LAB（Log10 CFU/g） 8.70
Bacillus sp.(Log10 CFU/g) 8.45
Saccharomyces sp. (Log10 CFU/g) 6.51
DM 63.77
CP 18.52
NDF 5.63
略語。LAB = 乳酸菌、CFU = コロニー形成単位。

実験デザイン
産卵率（74.23%）および BW がほぼ同じ 80 週齢の Hy-Line Brown 産卵鶏 360 羽を本研究で使用した。試験に先立ち、すべての鶏に基礎飼料を給与した。本試験は10週間にわたって行われ、最初の2週間は実験食の適応に使用した。その後、すべての鶏は2つの処理群に無作為に割り当てられ、1群36羽の5つの複製が作成された。実験群は以下の通りである。(1) 基本飼料(CON); (2) 基本飼料に20%の発酵飼料を添加したもの(FF)である。実験飼料は、給餌前に基礎飼料と湿潤発酵飼料（DMベースで4：1）を混合して調製し、最終的なDMは74％とした。基本飼料は中華人民共和国農工標準-鶏飼料（NY_T33-2004）に従って調製した。得られた飼料の飼料組成および栄養組成を表 2 に示す。すべての鶏は、気候制御された施設内の3段式バッテリーケージに収容され（14〜20℃、16時間照明／日）、清潔な水と飼料に自由にアクセスできるようにした。これらの研究は、分析した産卵鶏の所有者の同意を得て実施し、河北農業大学（中国、河北省）の実験動物倫理委員会の承認を得た。すべての実験は、Care and Use of Agricultural Animals in Research and Teaching (3rd edition, 2010)に従って実施された。

表 2. 産卵鶏の基礎飼料および発酵飼料の栄養成分および栄養レベル（DM ベース）。

項目 CON FF
成分 (%)
トウモロコシ 60.00 47.50
大豆粕 22.00 17.20
小麦ふすま 8.00 5.30
発酵飼料 0.00 20.00
石灰石 8.00 8.00
リン酸二カルシウム 1.50 1.50
プレミックス1 0.50 0.50
合計 100.00 100.00
栄養レベル2
ME (MJ/kg) 11.49 11.53
CP (%) 15.82 15.86
NDF (%) 7.38 7.06
全リン(%) 0.50 0.51
カルシウム(%) 3.53 3.52
リジン(%) 0.81 0.80
メチオニン(%) 0.35 0.36
略語 略語：CON = 基本飼料を給与した産卵鶏；FF = 基本飼料に発酵飼料を 20%添加した産卵鶏；ME = 代謝可能エネルギー。

1
プレミックスは以下を提供した（飼料 1 kg あたり）。Fe, 40 mg; Cu, 8 mg; Zn, 80 mg; Mn, 90 mg; Se, 0.2 mg; I, 0.75 mg; choline, 55 000 mg; vitamin A, 8 000 IU; vitamin D3, 3 000 IU; vitamin E, 20 IU; vitamin K, 2.5 mg; niacin, 30 mg; pantothenate, 8 mg; folacin, 1 mg; vitamin B1, 2.5 mg; vitamin B2, 5.5 mg; Vitamin B6, 4 mg; Vitamin B12, 0.02 mg.

2
栄養素の量は近赤外反射分光法で測定した。

産卵成績およびサンプリング
各飼育区の総卵数、割卵数、卵重を毎日記録した。各複製群の総飼料摂取量は週単位で記録した。飼料消費量を全卵重量で割ることにより、各複製群の飼料転換率（FCR）を算出した。8週間の実験データに基づいて、1日の平均飼料摂取量、平均卵重、産卵率、割卵率およびFCRを算出した。試験期間4週目および8週目に、卵質の分析のために各群50卵（各複製10卵）を無作為に選択した。これらの同じ時点で、15羽（各レプリカにつき3羽）の鶏を無作為に選び、気絶させて頸静脈から失血させ、静脈内血液のサンプルを採取し、血清パラメータ分析用に-20℃で保存した。次に、これらの雌鶏から糞便を採取し、スナップ冷凍し、DNA抽出の前に-80℃で保存した。さらに、十二指腸、空腸、および回腸から2〜3cmの組織を採取し、粘膜形態学的分析を行った。

卵の品質判定
採取した卵について、卵重量、卵黄重量、卵黄色、卵殻重量、卵殻厚、ハウユニット、卵殻破壊強度、アルブメン高を測定した。卵殻の鈍端部、先端部、赤道部の厚さをマイクロメーターで測定し、その平均値から卵殻厚を求めた。Haughユニット、卵黄の色、卵白の高さは、EA-01 Egg Multi Tester (Orka Technology Ltd., Ramat Hasharon, Israel)を用いて定量化した。卵殻破断強度は、Eggshell Strength Tester (Orka Technology Ltd., Ramat Hasharon, Israel)を用いて測定した。

免疫反応パラメータ解析
血液サンプルを解凍し、血清中の免疫グロブリン（Ig）A、IgG、IgM、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターフェロン（IFN）-γ、インターロイキン（IL）-2およびIL-6のレベルを、適切な酵素結合免疫吸着測定キット（上海酵素結合生物工学有限公司、上海、中国）を使用して、提供された指示に基づいて、測定した。

腸管形態学的解析
十二指腸、空腸、回腸の組織をホルマリン固定、パラフィン包埋し、Pathological slicer (RM2016, Shanghai Leica Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) で 3 mm 切片にし、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。十二指腸、空腸、回腸の絨毛高さとクリプト深さを画像処理解析システム（NIKON DS-U3、株式会社ニコン、東京、日本）で測定し、絨毛高さとクリプト深さの比率を算出した。

16S rRNAの塩基配列決定
E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, USA) を用いて糞便内容物からDNAを抽出し、DNA抽出は各サンプルに対して2回行った。これらの二重抽出物をプールし、その中のDNAの濃度と純度をそれぞれNanoDrop 2000装置と1%アガロースゲル電気泳動で分析した。その後、サンプルを脱イオン水で1ng/μLに希釈し、16S rRNA PCRのテンプレートとして使用した。細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域は、10μLの鋳型DNAを含む反応において、338F 5′-バーコード-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′および806R 5′-GGACTACNNGGTATCTAAT-3′ プライマーを用いて増幅された。2μLのddH2O、3μLのプライマー、および15μLのPhusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)を含む反応液で行った。

PCR増幅は、Guoら（2019）により以前に記述されたように実施した。同一サンプルからのPCR産物を合わせて2％アガロースゲルで回収し、AxyPrep Dnagel Extraction Kit（Axygen Biosciences, CA, USA）による精製、2％アガロースゲル電気泳動による検出、Quantus Fluorometer（Promega, USA）による定量の順で実施した。ライブラリ構築は、NextFlex Rapid DNA-Seq library construction kit (Bioo Scientific, USA) を用いて行い、その後、上海Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd. にある HiSeq 2500 platform (Illumina, CA, USA) を用いて、プールしたサンプルを標準プロトコルにより配列決定した。

生データの品質管理にはFASTPソフトウェアを使用し、その後、FLASHソフトウェアを使用して結果データをつなぎ合わせた。OTUクラスタリングは、配列類似度97%で行い、Usearch (v7.0 https://drive5.com/uparse/) を用いてキメラを除去した。配列はRDP Classifier (https://rdp.cme.msu.edu/) を用いてSilvaデータベース(SSU132)と個別に比較し、70%の閾値で種分類を行った。Mothur v.1.21.1 (Schloss et al., 2009) を用いて、Shannon diversity, Chao, ACE indices を解析した。細菌サンプル間の距離は、重み付けされていないUniFrac距離メトリックに基づいて測定し、距離行列は非計量多次元尺度法（NMDS）によりOTUレベルで可視化した。NMDSの図は、Vegan 2.0パッケージで作成した。2群間の糞便コミュニティの差を比較するために、Veganパッケージを使用してWilcoxon rank-sum検定を実施した。

統計解析
卵生産量、卵質、腸の形態的特徴、免疫指標、細菌多様性に関するデータは、SPSS v20.0のStudents' T-testを使用して分析した。データは「平均値」で示し、P < 0.05を有意差の閾値とした。

結果
産卵成績
予想通り、発酵飼料添加は産卵鶏の産卵成績に有意な影響を及ぼし、発酵群では対照群と比較して1日平均飼料摂取量（P < 0.05）および産卵率（P < 0.001）が有意に高くなり、FCR（P < 0.05）および割卵率（P < 0.05）が減少した（表 3）。

表3. 産卵鶏の産卵成績に及ぼす発酵飼料の影響

項目 CON FF SEM P値
1 日平均飼料摂取量（g、DM ベース） 99.76 102.10 0.586 0.035
平均卵重（g） 60.33 61.04 0.417 0.420
産卵率（%） 73.96 78.24 0.890 0.005
割卵率（%） 0.98 0.73 0.058 0.020
FCR 2.20 2.12 0.025 0.035
略語 略語：FCR＝飼料要求率、CON＝基礎飼料を給与した産卵鶏、FF＝基礎飼料に発酵飼料を20%添加した産卵鶏。

卵の品質
発酵飼料を給与しても卵殻重量、厚さ、強度に有意差は認められなかった（表 4）。しかし、発酵飼料を含む飼料を給与した産卵鶏では、卵白高、卵黄色およびHaugh単位が有意に増加し（P < 0.05）、卵黄重量はCONのものと比較して増加傾向を示した（P < 0.1）。

表4．産卵鶏の卵質に及ぼす発酵飼料の効果．

項目 CON FF SEM P値
卵殻の厚さ（mm） 0.39 0.40 0.001 0.541
卵殻重量（g） 7.19 7.18 0.264 0.994
卵白の高さ（mm） 5.47 6.04 0.139 0.029
ハウユニット 69.01 75.82 1.409 0.005
卵黄重量(g) 16.94 17.96 0.297 0.085
卵殻強度（kg/cm2） 37.11 37.58 0.197 0.246
卵黄の色 7.40 8.20 0.200 0.035
略語 略語：CON = 基本飼料を与えた産卵鶏；FF = 基本飼料に20%の発酵飼料を加えたものを与えた産卵鶏。

血清中の免疫応答パラメータ
発酵飼料添加により、IgA、IgM、およびIgGのレベルがCONと比較して有意に改善した（それぞれP < 0.01, P < 0.01, P < 0.01） (Table 5). さらに、血清IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ（P < 0.05）の濃度は、FF群でCONよりも高かった。

表5. 産卵鶏の免疫反応に対する発酵飼料の効果。

項目 CON FF SEM P値
IgA (ng/L) 5 502.86 6 363.96 172.981 0.003
IgM (ng/L) 3 956.16 4 556.04 120.392 0.003
IgG (ng/L) 51.48 59.60 1.668 0.004
IL-2 (ng/L) 208.62 224.38 3.665 0.020
IL-6 (ng/L) 64.24 73.05 1.67 0.001
TNF-α (ng/L) 50.81 59.81 2.094 0.020
IFN-γ (ng/L) 100.64 119.83 3.906 0.004
略語。略語：Ig＝免疫グロブリン；IL＝インターロイキン；TNF＝腫瘍壊死因子；IFN＝インターフェロン；CON＝基礎飼料を与えた産卵鶏；FF＝基礎飼料に20％発酵飼料を添加した産卵鶏。

腸の形態
発酵飼料添加により、産卵鶏の十二指腸、空腸および回腸の絨毛高が有意に増加した（P < 0.05）（表6）。回腸の陰窩の深さも発酵飼料添加後の鶏で増加する傾向があった（P < 0.05）。しかし、十二指腸、空腸、回腸の絨毛高さと陰窩深さの比率については、FF群とCON群の間に差は見られなかった。

表6．産卵鶏の腸の形態に及ぼす発酵飼料の影響．

項目 CON FF SEM P値
十二指腸
絨毛の高さ（μm） 1 260.00 1 421.90 41.358 0.041
陰窩の深さ（μm） 197.75 216.20 7.108 0.212
筋層の厚さ（μm） 229.19 245.85 5.196 0.111
絨毛／陰嚢 6.42 6.62 0.129 0.625
Jejunum
絨毛の高さ（μm） 950.36 1,077.15 27.752 0.010
陰核の深さ（μm） 142.10 152.65 3.922 0.194
筋層厚(μm) 213.37 229.17 5.046 0.122
ヴィラス／クリプト 6.69 7.09 0.159 0.228
回腸
絨毛の高さ（μm） 580.41 715.51 27.564 0.004
陰核の深さ（μm） 106.70 122.07 4.832 0.043
筋層の厚さ（μm） 205.05 215.39 5.204 0.350
ヴィラス／クリプト 5.45 5.73 0.120 0.271
略号 略語：CON = 基本飼料を与えた産卵鶏；FF = 基本飼料に20%の発酵飼料を加えたものを与えた産卵鶏。

糞便中マイクロバイオーム組成
発酵飼料が糞便マイクロバイオームの構成に及ぼす影響を調べるため、次に、これらの鶏のサンプルの16S rRNA配列決定を行い、門および属レベルで細菌プロフィールを評価した。FF群とCON群の間で、Shannon指数、Ace指数、Chao指数に有意差は認められなかった（表7）。NMDS解析の結果、FFプロットはCONグループと有意に区別され（図1）、これは2群の鶏の間の腸内細菌叢組成の有意差と一致した（ANOSIM、R = 0.2488, P = 0.0002）。配列分類の結果、すべての腸内細菌叢サンプルにおいて、Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, Fusobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Deferribacteres, WPS-2 および Actinobacteriaなどの複数の系統が検出された。全サンプルで85%以上の配列がBacteroidetesとFirmicutesの2つの系統に属していた(Fig. 2A)。FF群の糞便サンプルは対照群に比べ、Firmicutesの存在量が有意に低かった（30.61 vs 35.12%, P < 0.05）。全サンプルで合計221の細菌属が検出され、そのうち82は全サンプルに存在した。相対存在量レベルが0.01%以上のすべての属をFig.2Bに示した。分析した鶏マイクロバイオームサンプルにおいて、グループ間で最も豊富な差属は、Bacteroides、Rikenellaceae RC9 gut group、Phascolarctobacterium、未分類のBacteroidales、および未分類のRikenellaceaeでした（Fig. 3A）。さらに、FF群ではLactobacillus、Megasphaera、Peptococcusが濃縮され、CON群ではCampylobacterの存在量が多かった（Fig.3B）。

表7．産卵鶏の糞便中微生物α多様性に及ぼす発酵飼料の影響。

項目 CON FF SEM P値
シャノン 4.76 4.49 0.068 0.080
エース 876.28 869.82 17.343 0.707
チャオ 898.83 887.38 16.092 0.686
略語。略号：CON = 基本飼料を与えた産卵鶏；FF = 基本飼料に20%の発酵飼料を添加した産卵鶏。

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図1. 発酵飼料添加飼料と非添加飼料を給与した産卵鶏の糞便サンプルにおける細菌群集のUnweighted-Unifrac類似度に基づく非計量的多次元尺度構成序列。赤はFF群、青はCON群を表す。略号 CON = 基本飼料を与えた産卵鶏；FF = 基本飼料に20%の発酵飼料を添加した飼料を与えた産卵鶏。

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図2. 発酵飼料添加飼料および非添加飼料を給与した産卵鶏の盲腸における16S rRNA配列の門および属レベルのマイクロバイオーム組成。(A) 門レベルでの盲腸内細菌叢の相対的存在量、(B) 属レベルでの盲腸内細菌叢の相対的存在量。略号 CON = 基本飼料を与えた産卵鶏；FF = 基本飼料に20%の発酵飼料を添加したものを与えた産卵鶏。

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図3. Wilcoxon rank-sum testを用いたFF群とCON群の産卵鶏の糞便群集の差分解析。(A)FF群とCON群における上位10属の差の割合。(B)上位10属の割合の差。赤はFF群、青はCON群、「*」「**」はそれぞれP < 0.05、P < 0.01を表す。略号 略語：CON = 基本飼料を与えた産卵鶏；FF = 基本飼料に20%の発酵飼料を添加したものを与えた産卵鶏。

考察
発酵飼料は、家禽の全般的な健康状態および生産性を改善するために、ますます採用されるようになってきた。Zhuら（2020）によって報告された研究は、発酵飼料が14日齢の産卵鶏のヒナの平均BWを有意に増加させ、FCRを減少させることを示唆した。Salehら（2021）も、発酵湿潤飼料を与えたブロイラー鶏の成長成績が対照と比較して向上することを確認した。これらの研究と一致して、我々の研究もまた、発酵飼料を与えた80週齢の産卵鶏のFCR値がコントロールと比較して低下することを示唆した。Guo ら（2021）は、発酵飼料は産卵鶏の一日平均飼料摂取量およびその他の関連指標に影響しないと報告したが、発酵飼料を給与した産卵鶏のこれらの指標は、我々の研究でも改善されていた。この矛盾は、接種する菌の種類や量、家禽の年齢や健康状態に関係している可能性がある。本研究で鶏の生産成績が向上したのは、さまざまな生物学的酵素を産生し、乳酸菌の増殖を促進することができるB.subtilisとS.cerevisiaeを加えたことに起因している可能性がある。

重要な卵の鮮度指標として、卵黄の色、アルブメンの高さ、ハフ単位は産卵後期に急速に低下する（Qu et al.、2019）。先行研究（Lvら、2022、Yangら、2022）では、発酵飼料によって卵白高やHaugh単位などの卵質パラメータが改善されることが示されており、今回の知見と一致した。これらの効果は、腸内環境の改善と腸内細菌叢の組成の変化により、タンパク質の吸収が促進されたことに起因すると考えられる。さらに、発酵は飼料中のペプチドとアミノ酸のレベルを改善することが報告されており（Wu et al., 2015）、これもアルブメン高とHaugh単位の増加の要因である可能性があります。

免疫グロブリンは、病原体および他の潜在的に有害な微生物からそれを産生する種を保護する抗体であり、血清免疫グロブリンレベルは、したがって、与えられた宿主の全体的な体液性免疫状態の重要な指標として機能する（Luら、2019年）。食事による補充は、産卵鶏の体液性免疫の改善と結びついている（Zhuら、2020）。鳥類では、IgG、IgM、およびIgAが3つの主要な免疫グロブリンクラスである。本研究では、産卵周期の後半に発酵飼料を給与した鶏で血清IgA、IgG、IgMレベルが上昇し、発酵飼料が鶏の免疫機能を向上させることが示された。サイトカインは、細胞を介した免疫反応に関与していると考えられている。IL-2、TNF-α、IFNなどのTヘルパー1型サイトカインは細胞媒介性免疫応答を促進し、IL-4、IL-6、IL-10などのTヘルパー2型サイトカインはB細胞の増殖と分化を促進し、体液性免疫応答を活性化する（Kohut et al.） 我々の結果は、発酵飼料の補充が、IL-2、TNF-α、IFN-γレベルの増加およびCONよりもFFグループのIL-6濃度の高さによって反映されるように、細胞媒介免疫応答および体液性免疫応答を有意に改善することを明らかにした。我々の知見と一致して、Zhuら（2020）は、発酵飼料の添加が産卵鶏の免疫機能を改善することを報告した。Tヘルパー1型およびTヘルパー2型サイトカインの改善は、FF群における乳酸菌量の増加に起因する可能性がある。以前の研究では、乳酸菌は、細胞壁、ペプチドグリカン、リポテイコ酸などの細菌成分が生物にとって免疫学的に活性であるため、マウスのTヘルパータイプ1およびTヘルパータイプ2サイトカインのレベルを改善することが報告された（Leeら、2016）（Crossら、2001）。

絨毛膜の高さや陰窩の深さは、腸の健康状態を知る上で重要な指標であり、腸管粘膜の吸収能に直接影響する。我々は、発酵飼料を含む飼料を給与した鶏で、十二指腸、空腸および回腸絨毛の高さの増加を観察し、これはLvら（2022）と同様であった。さらに、発酵飼料を給与した鶏の回腸サンプルでは、陰窩深度が増加する傾向が見られた。腸絨毛の高さとクリプト深度の向上は、乳酸菌がカンピロバクターやその他の病原菌を抑制し、腸粘膜上皮細胞の損傷を軽減することに起因しているのかもしれない。

発酵飼料を家禽に投与すると有益な効果が得られることを示す証拠が増えている（Jazi et al.、2019）。腸内細菌叢は、免疫機能、栄養素の取り込み、および腸の形態の調節に重要な役割を果たす消化管の不可欠な面である。腸内細菌叢の構成は、年齢、遺伝子型、食事、生活環境など様々な要因の影響を受けますが、中でも食事は特に重要です。本研究では、発酵飼料による鶏の細菌群集のα多様性に大きな影響は見られなかったが、糞便微生物叢の組成と構造には大きな影響を与えた。先行研究（Oakley et al., 2014）と一致して、産卵鶏の糞便微生物叢はBacteroidetesとFirmicutes種に支配されており、その微生物群全体の85％以上を構成していることが分かった。Firmicutes属は、多くの脊椎動物に存在する主要な繊維分解微生物であり、FF群ではCON群に比べこれらの細菌の存在量が少なかった。Firmicutes属は、セルロースを分解して多糖類を生産し、宿主のエネルギー源および炭素源として利用することができる。また、これらの細菌は、酢酸やプロピオン酸などの有益な化合物を生産することができる（Ozbayram et al.、2020）。したがって、FFグループで観察されたFirmicutesの存在量の低下は、本研究で使用した基礎飼料に比べ、発酵飼料内に存在するNDFのレベルが低いことに起因している可能性があると推察される。属レベルでは、発酵飼料を含む飼料を与えた80週齢の鶏で、Lactobacillusの存在量の増加およびCampylobacterの割合の減少が観察された。Lactobacillusは乳酸を産生し、それによって病原微生物のコロニー形成を抑制することができる。カンピロバクター種は最も一般的な病原性細菌の一つであり、結腸、盲腸、小腸にコロニーを形成することができる（Sahin et al.、2015）。ラクトバチルス・サリバリウスは、鶏の盲腸におけるカンピロバクター・コロニーゼーションを減少させることが判明しました（Saint-Cyrら、2017年）。本研究でも同様の結果が得られた。発酵飼料サプリメントは、病原性微生物を抑制し、有益なマイクロバイオームを有利にすることで、腸内生態環境を改善しました。そして、FF群における有益な効果は、有益な微生物を増加させ、有害な微生物を抑制することが報告されている枯草菌による可能性が高い（Choiら、2011）。

全体として、我々の結果は、発酵飼料補給が産卵周期後期の産卵鶏の産卵成績、卵質を改善し、FCR を低下させることを 示した。また、発酵飼料の給与は、免疫機能および腸の健全性の改善にも関連した。さらに、乳酸菌量が増加し、カンピロバクター量が減少することで、糞便の微生物学的環境も改善された。これらの結果から、発酵飼料は産卵期後期の家禽の産卵成績および腸内環境を改善するための理想的な機能性飼料である可能性が示唆された。

倫理的承認
すべての実験手順は、中国河北農業大学の実験動物倫理委員会（承認番号：HAU-LAEC-2020032）が承認した動物実験ガイドラインに従った。

データおよびモデルの利用可能性に関する声明
どのデータも公式リポジトリに寄託されていない。本研究の研究成果を裏付けるデータセットは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。

著者ORCID
W. Guo: https://orcid.org/0000-0002-7323-6327;

L.-N. Xu: https://orcid.org/0000-0003-4605-1690;

X.-J. Guo: https://orcid.org/0000-0002-2730-0551;

W. Wang: https://orcid.org/0000-0002-1342-6364;

Q.-H. Hao: https://orcid.org/0000-0002-8616-2566;

S.-Y. Wang: https://orcid.org/0000-0003-2198-5251;

B.-C. Zhu: https://orcid.org/0000-0001-7935-5012.

著者の貢献
Guo Wei：調査、形式分析、執筆（原案）、資金獲得。Xu Lina: データキュレーション、執筆-レビューと編集。Guo Xiaojun: 概念化、調査、形式的分析、資金獲得、執筆-原案。Wang Wei: コンセプト立案、監修、資金獲得、査読、編集。Hao Qinghong: 資金獲得とリソース。王世英。王世英：資金獲得、監修。朱宝城。監督とプロジェクト管理。すべての著者は、この原稿の公開版に同意している。

利害関係者の宣言
なし。

謝辞
なし

財政的支援声明
本研究は、河北省自然科学基金（助成番号C2021204166）、河北省自然科学基金（助成番号C2019204284）、中国自然科学基金（助成番号32002218）、重点研究開発プロジェクト（助成番号20322901D）、重点研究開発プロジェクト（助成番号21322910D）により支援されたものである。

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