微生物-エピジェネティクス回路が、腸上皮における系統的な概日プログラムを制御している

2023年8月9日 10:56

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オリジナル研究論文
フロント Syst. 生物学、2023年08月08日
Sec.統合遺伝学とゲノミクス
第3巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fsysb.2023.1175306
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宿主-微生物界面における環境リズム

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微生物-エピジェネティクス回路が、腸上皮における系統的な概日プログラムを制御している

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fsysb.2023.1175306/full

www.frontiersin.orgJunjie Ma www.frontiersin.orgJianglin Zhang www.frontiersin.orgZheng Kuang*
米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、カーネギーメロン大学、生物科学部
腸内細菌叢は、哺乳類の概日リズムと健康を制御する重要な因子である。われわれは以前、微生物叢がヒストン脱アセチル化酵素3（HDAC3）を介して、腸管上皮における脂質の取り込みと代謝を同調させることを報告した。しかし、腸内における微生物叢と概日リズムのクロストークの幅や意義についてはよくわかっていない。ここでは、腸内細菌叢が広範な生物学的プロセスのリズム発現をプログラムし、リズムのある腸内環境に応じて上皮機能と生理を時間的に調整していることを示す。タンパク質合成、細胞増殖、代謝・免疫活動は、昼間と夜間でそれぞれ異なる発現を示し、腸内で「働く」テーマと「充電する」テーマが毎日交互に繰り返されていることを示している。無菌マウスでは遺伝子発現のリズムが減衰または変化しており、微生物叢が宿主の遺伝子発現のタイミングを構成するのに役立っていることが示唆された。さらなる解析の結果、HDAC3が、ヒストンのリズミカルな脱アセチル化を通じて、これらの微生物叢依存性概日プログラムの大部分を駆動していることが示された。モチーフ濃縮解析の結果、HDAC3は、異なる転写因子をリクルートすることによって、異なるリズム経路を制御している可能性が高いことが明らかになった。これらの知見は、常在細菌叢がどのようにしてエピジェネティックな因子を利用して腸管上皮のジャストインタイムの機能をプログラムし、宿主のホメオスタシスを維持するのかについて系統的な見解を与えるものである。

1 はじめに
生理的過程は昼夜逆転の影響を受け、概日時計によって周期的に制御されている。概日時計は遺伝子のリズミカルな発現を促し、昼夜のサイクルと連動している。哺乳類では、概日リズムは視床下部の視交叉上核（SCN）にあるマスターペースメーカーによって決定される（Weaver, 1998）。概日リズムの分子機構は、しばしば転写-翻訳ループと表現される（Mohawk et al.） CLOCKとBMAL1は、Cry遺伝子とPer遺伝子に結合してその発現を促進する転写因子である。一方、CRYとPERタンパク質はCLOCK-BMAL1ヘテロダイマーを阻害し、その結果、CryとPer遺伝子の発現が減少する。このフィードバックループは、それぞれの標的タンパク質のレベルを昼夜逆転させるのに役立っている。

SCNの中心時計は、周辺時計を階層的に制御している。このようにして、昼夜の光周期は、様々な組織特異的プロセスを制御する末梢時計を同期させる。その中でも、消化管（GI）における概日リズムは、栄養摂取と免疫防御機能に不可欠である。特に消化管は、24時間の昼夜サイクルの結果として、食物摂取と絶食が交互に繰り返される。腸管上皮は、食物を消化し、栄養素を吸収し、潜在的な病原体の侵入を防御する腸の最初の層である。重要なことは、腸上皮における遺伝子発現の概日リズムは、中核的な概日時計と、摂食スケジュールや食餌組成などの環境因子の両方によって制御されていることである（Hoogerwerf et al.）

腸内細菌叢の組成と機能は日周振動と連動しており、この日周振動は食物摂取量と栄養含有量のリズム性によって制御されている（Thaiss et al. (Thaissら、2014；Zarrinparら、2014；Leoneら、2015；Liangら、2015）。総細菌数 (Liang et al., 2015; Risely et al., 2021; Thaiss et al., 2016) と腸管上皮に付着した細菌数 (Brooks et al., 2021; Thaiss et al., 2016) は摂食期間中に多くなる。Thaissらは、マウスでは総微生物叢の60％が相対存在量のリズム性を示したと報告している。マウスとヒトの両方において、腸内細菌叢の最も支配的な2つの門であるファーミキューテス類とバクテロイデーテス類は、摂食期に関連する日周リズムを示す：ファーミキューテス属は摂食の終わりにピークを迎え、バクテロイデーテス属は絶食期にピークを迎える（Thaiss et al.）マイクロバイオームの群集組成のリズム性とともに、細菌の運動性や粘液分解を含む微生物経路のリズミカルな発現によって示唆されるように、細菌の機能組成もリズミカルであることが判明した（Thaissら、2014；Thaissら、2016）。さらに、時差ボケのある被験者の糞便内容物をGFマウスに移植すると、概日リズムの乱れにより肥満と耐糖能異常が誘発された（Thaissら、2014）。さらに、一般的な微生物代謝産物としての短鎖脂肪酸も、リズム的な発生が報告されている（Leoneら、2015；Taharaら、2018；Segersら、2019；Segersら、2020）。

宿主の概日生理の多くの側面は、宿主の遺伝子発現（Thaissら、2016；Wegerら、2019；Kuangら、 2019）、血清代謝産物（Thaissら、2016；Wegerら、2019）、免疫機能（Godinho-Silvaら、2019；Tengら、2019；Wangら、2019）、脂質吸収（Wangら、2017；Kuangら、2019）を含む。腸内に不整脈微生物叢を有する動物モデルを作製することは、現在のところ実現不可能である。したがって、既存の研究では、抗生物質の投与によって腸内細菌叢を切除するか、無菌（GF）マウスを用いることによって行われてきた。Thaissらは、抗生物質を投与したマウスの大腸では、従来型（CV）マウスと比較して、生物学的経路の様々なクラスターがリズム振動を失ったり得たりしていることを報告した（Thaissら、2016）。オミックスデータは、宿主におけるリズム性の変化がマイクロバイオームの変化によって引き起こされることを示唆した。

様々な経路が日内リズムを示すことが示されている。腸の上皮細胞は、幹細胞の活動によって3～5日ごとに上皮全体が入れ替わるという、速い自己再生過程を経る（Heath, 1996; Park et al.）細胞周期自体が概日リズムに支配されていることを示す十分な証拠がある（Yoshidaら、2015；Stokesら、2017）。その上、結腸上皮細胞増殖の日内変動が摂食スケジュール（昼間と夜間の制限摂食）に影響されることが報告されている（Yoshida et al.）免疫防御は、腸内の微生物やその他の有害物質から宿主を守るための、腸上皮におけるもう一つの重要な機能である。例えば、抗菌ペプチドは腸上皮で産生され、その量は概日リズムを示し、分節した糸状菌のリズミカルな付着に対応している（Brooksら、2021年）。toll様受容体の発現には概日リズムがあり、抗生物質投与マウスではそのリズムが減衰することが示された（Mukherji et al.）さらに、IECの主要組織適合複合体（MHC）クラスIIは、微生物-上皮-免疫の恒常性を維持するために、付着常在菌によって日周的に制御されている（Tuganbaev et al.）したがって、腸管上皮の多様な活動は、概日リズムによって時間的に制御される可能性がある。

我々は以前、CVマウスとGFマウスにおけるトランスクリプトームとヒストンアセチル化の概日データセットを作成し、腸内細菌叢が小腸上皮細胞（IEC）におけるヒストンアセチル化（例えば、活性プロモーターのマークであるH3K9ac）と遺伝子発現のリズムを維持する上で極めて重要な役割を担っており、GFマウスではそのリズムが減衰していることを示した（Kuang et al.）我々はさらに、IECにおいてHdac3が特異的に欠失したHdac3欠損マウスモデル（Hdac3ΔIEC）を利用し、ヒストン脱アセチル化酵素であるHDAC3が、腸内概日代謝の微生物制御を媒介する重要な分子であることを示した。バクテロイデス門に属するバクテロイデス・テタイオタミクロンのモノクローナル化が、発現およびタンパク質レベルでヒストン脱アセチル化酵素3（HDAC3）を活性化することができ、それがGFマウスのリズムを促進する可能性があることを見出した（Kuang et al.）しかし、いくつかの重要な疑問はまだよくわかっていない。腸上皮は、細胞増殖、栄養吸収、免疫防御など、腸内の機能的に異なるプロセスをどのように時間的に調整しているのだろうか？常在細菌叢とHDAC3は、これらの上皮活動のリズムをどのようにプログラムしているのだろうか？

これらの疑問を理解するために、我々は遺伝子発現における微生物叢主導のリズムを調べるために、時系列RNA-seqとChIP-seqデータの系統的解析を行った。その結果、CVマウスでは、24時間周期で上皮経路が連続的に発現するという、特徴的なリズムが確認された。リズムの振幅は、GFマウスのリズミカルなトランスクリプトームと比較して、CVマウスでは比較的大きい。さらに、Hdac3ΔIECマウスにおけるH3K9acのRNA-seqおよびChIP-seqデータを解析することで、HDAC3が主にリズミカルなヒストン脱アセチル化と他の転写因子のリクルートによって、腸内細菌叢依存的にIECのリズミカルな転写と上皮機能をプログラムしていることがわかった。これらの結果から、微生物叢とHDAC3によって日周的に制御される腸上皮の新たな側面が明らかになり、微生物-エピジェネティック回路が宿主の概日リズムを制御し、腸上皮の恒常性を維持していることが示唆された。

2 材料と方法
2.1 RNA-seqデータ解析
RNA-seqデータ（GEOアクセッションID：GSE134303）をGEOからダウンロードし、以前に記載したように解析した（Kuang et al.） Hdac3fl/flマウス（Montgomery, et al., 2008）およびHdac3ΔIECマウスは、テキサス大学サウスウェスタン医療センターのSPFバリアで飼育した。Hdac3fl/flマウス(Montgomery, et al., 2008)は、IEC特異的Villinプロモーター(Madison, et al., 2002)の制御下でCreリコンビナーゼを発現するマウスとの交配により、腸上皮細胞(IEC)特異的Hdac3ノックアウトマウス(Hdac3ΔIEC)を作製するために用いられた。無胚芽（GF）C57BL/6マウスは、テキサス大学サウスウェスタン医療センター（University of Texas Southwestern Medical Center）のgnotobiotic mouse facilityで、記載されているように維持した（Cashら、2006）。すべてのマウスは12時間明期/12時間暗期サイクル下で飼育された。マウスには自由食を与えた。

配列データはTopHat (Trapnell et al., 2012)を用いてmm10ゲノムに対してマッピングし、FPKMはCuffdiff (Trapnell et al., 2012)を用いてデフォルトパラメーターで作成した。K-meansクラスタリングのElbow法を使用して、Kの異なる値に対するWithin-Cluster-Sum of Squared Errors（WSS）の計算に基づいて、データセット内の最適なクラスタ数（K値）を決定した。その後、Rの「heatmap.2」関数を使用して、遺伝子発現量をヒートマップで可視化した。

2.2 ChIP-seqデータ解析
H3K9ac ChIP-seqデータ（GEOアクセッションID：GSE134303）をGEOからダウンロードし、以前に記載されたように解析した（Kuang et al.）配列データはBowtie2（Langmead and Salzberg, 2012）を用いてmm10ゲノムに対してマッピングし、シグナルはアライメントしたリードの総数で正規化し、Cisgenome Browser（Ji et al., 2008）を用いて可視化した。プロモーター領域は、各遺伝子の転写開始点（TSS）から相対的に-1,500塩基対（bp）から500bpと定義し、ヒストンアセチル化シグナルは、以前に記載されたように（Kuang et al., 2014; Kuang et al., 2017）、"countOverlaps "関数を用いてRで計算した。相対振幅は、（max_H3K9ac - min_H3K9ac）/max_H3K9acとして計算した。

2.3 JTK_cycle解析
JTK_CYCLEはノンパラメトリックなリズム検出法であり（Hughes et al., 2010）、転写産物、タンパク質、代謝産物の大規模データセットからリズム成分を検出し、最適な位相と振幅を推定するために、概日生物学の分野で広く用いられている。本研究では、概日周期の決定に18-30時間のウィンドウを組み込んで解析を行った。ボンフェローニ調整p値<0.05を有意とみなした。偽発見率（FDR）をコントロールするためにBenjamini-Hochberg手順を用いた。JTK_cycleの結果は補足表S1に示した。相対振幅は、JTK_cycleによって出力された振幅を最大発現レベルで割ることによって計算した。

2.4 遺伝子オントロジー濃縮解析
オンラインツールDAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/)を用いて、遺伝子オントロジー(GO)解析を行った。

DAVIDから出力された有意にエンリッチされたGO用語が豊富にあるため、Rrvgoパッケージ（Sayols, 2020）を使用し、意味的類似性に基づいて用語をグループ化することで、GOセットの冗長性を簡素化した。また、FDRに比例して面積が拡大する階層構造の可視化により、要約されたGO濃縮結果を解釈するためにトレマップチャートが使用された。

冗長でない生物学的情報を持つGOパスウェイ項ネットワークは、ユーザー提供の遺伝子リストを用いて、Cytoscape (Shannon et al., 2003)に統合されたClueGO (Bindea et al., 2009)によって生成された。ClueGOはκスコアを使って項-項相互作用を定義し、共有遺伝子に基づいて項とパスウェイを機能グループに関連付ける(Bindea et al., 2009)。カッパスコアとはコーエンのカッパ係数のことで、2人のオブザーバーがカテゴリー項目を評価する際に、お互いにどの程度同意しているかを測定するものである(McHugh, 2012)。

κ=Pr(a)-Pr(e)1-Pr(e)
Pr(a)=実際に観察された一致.Pr(e)=偶然の一致の仮説的確率.κスコアは、ネットワーク内の相互作用項をリンクするために0.4（デフォルト）に設定され、有意水準≤0.05の経路項のみが表示された。最終的なパスウェイネットワークは、あらかじめ定義された有意性のカラーコードで可視化された。

2.5 転写因子モチーフ濃縮解析
モチーフ解析は、以前に記載されたように行った（Kuang et al.） CisGenomeを用いて転写因子（TF）結合モチーフをmm9ゲノムにマッピングした（TRANSFAC（Wingender et al.、2001）からの528モチーフ）。尤度比が500以上（すなわちCisGenomeのデフォルトカットオフ値）のモチーフ部位が報告され、その位置が以降の解析に用いられた。ある遺伝子のTSSから-900 bpから100 bpの位置にあるモチーフ部位は、Rの "countOverlap "関数で同定した。与えられた遺伝子リストにおいてモチーフが濃縮されているかどうかを検定するために、以下の4つの数値を用いてフィッシャーの正確検定を行った：リストからTFモチーフを含む遺伝子の数（x1）、リストからTFモチーフを含まない遺伝子の数（x2）、ゲノムからTFモチーフを含む遺伝子の数（z1）、ゲノムからTFモチーフを含まない遺伝子の数（z2）。検定のp値は "p.adjust "関数で調整し、多重比較を考慮して "fdr "法で偽発見率（FDR）を計算した。

3 結果
3.1 CVマウスの腸管上皮では無数の経路が時間的に制御されている
腸内細菌叢が腸上皮の概日リズムをどのように制御しているのかを明らかにするために（図1）、我々は以前に、GFマウスとCV野生型（WT）マウスのIECにおいて、昼夜周期にわたるタイムコースRNA-seqを実施した（Kuang et al.）その結果、腸内細菌叢が小腸の栄養輸送と脂質代謝における遺伝子発現の振動を駆動できることがわかった。ここでは、JTK_cycleアルゴリズムとGO濃縮を利用して、マウスIECにおける概日性遺伝子発現プログラムの系統的な見解を示した（図1）。23,285個の転写産物のうち、合計6,270個が発現量のレベルで有意に振動していた（図2A、調整後p<0.05）。リズム転写産物は、不整脈転写産物に比べて発現量が高く（補足図S1A）、細胞質翻訳、ATP合成、タンパク質輸送、細胞分裂など、分子、細胞、生理学的プロセスの広い範囲に濃縮されていた（補足図S1C, D）。ツリーマップ図上の空間領域の大きさが、濃縮結果の重要性を例証している（補足図S1E）。

図1
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図1. Hdac3fl/flマウス、Hdac3ΔIECマウス、GFマウスのトランスクリプトームおよびChIP-seqデータの系統的リズム解析の概略図。

図2
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図2. 腸管上皮経路はCVマウスにおいて日内変動を起こす。(A) JTK_cycleによってリズム性（黄色）（Bonferroni adj. p値≦0.05）および不整脈性（青緑色）（Bonferroni adj. p値＞0.05）と同定された転写産物の数を示す円グラフ。(B）4つのクラスターにおけるサイクリング転写産物のヒートマップ表示（左）と、各クラスター内のGO解析（右）（クラスター1：マゼンタピンク、クラスター2：緑、クラスター3：オレンジ、クラスター4：紫）。(C) 各クラスター内の代表的なGOパスウェイを描いたヒートマップ（各クラスターの色で注釈）。(D）CVマウスにおけるリズム遺伝子の振幅のピーク位相分布を示すポーラーチャート。振幅は相対振幅である（材料と方法参照）。相対振幅の値は<0.1から>0.25の範囲で、5つのランクに分類した： <0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.25、>0.25の5ランクに分類し、明から暗へのカラースケールで示した。(E) (C)の振動経路の振幅の箱ひげ図。

宿主-環境相互作用における遺伝子発現タイミングの重要性を理解するため、K-meansによってリズム転写産物を4つのグループに分類し（補足図S1B）、ヒートマップによって発現パターンを可視化した（図2B）。GO解析の結果、生物学的プロセスは24時間の明暗サイクルの異なるツァイトゲーバー時間（ZT）（ZT0は点灯、ZT12は消灯）で時間的にオーケストレーションされていることがわかった（図2B、C）。ZT14から夜が始まる頃、脂質代謝やコレステロール生合成などの代謝経路が非常にアップレギュレートされるが、これはマウスの摂食活動の増加に対応していると考えられる。免疫応答経路は夜の終わり近く（すなわちZT20）に活性化されるが、これは食物摂取後の腸内微生物の拡大に宿主が対処するのを助けているのかもしれない。細胞骨格組織とエンドサイトーシスの経路も夜間にアップレギュレートされる。ZT2とZT8では、マウスの活動が低下する昼間に、細胞周期、好気呼吸、リボソーム生合成、細胞質翻訳に関連する転写産物が高発現しており、腸上皮が上皮細胞の集団を充電し、補充している可能性が示唆される。

すべてのリズミカルな転写産物の極値チャートは、24時間を通して各フェーズでの発現の振幅が均等に分布していることを示した（図2D）。注目すべきことに、個々の生物学的経路は発現量の振動振幅が異なり、コレステロール生合成は提示された経路の中で最も高い振幅を示した（図2E）。RNA-seq解析の結果、CV腸管上皮の様々な機能パスウェイのサーカディアン遺伝子発現プログラムが明らかになり、腸内の栄養素や微生物のレベルの変動に応じて、「働く」（例えば、栄養素の取り込みと代謝、免疫機能）と「充電する」（例えば、タンパク質合成や細胞周期）が時間的に交互に繰り返されていることが示された。

3.2 GFマウスでは腸内トランスクリプトームが概日パターンに変化を示す
腸内細菌叢は宿主の概日リズムに大きな影響を与えることが示されている（Thaissら、2016；Wegerら、2019；Kuangら、2019）。微生物叢が宿主遺伝子発現のリズムの調整にどのように役立っているかについての洞察を深めるために、我々はGFマウスの小腸上皮細胞におけるトランスクリプトームの概日リズムを調べた。JTK_cycleアルゴリズムを用いると、23,285遺伝子のうち6,543遺伝子が有意に振動していることがわかった（図3A、調整後p<0.05）。同じパイプラインを用いてGFマウスのリズム遺伝子を解析したところ、リズム転写産物は不整脈転写産物よりも高い発現を示した（補足図S2A）。

図3
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図3. GFマウスでは腸上皮経路が日内変動を起こし、振幅が小さい。(A) JTK_cycleによってリズミカル（黄色）（Bonferroni adj. p値≦0.05）と同定された転写産物の数と、不整脈（青緑色）（Bonferroni adj. p値＞0.05）と同定された転写産物の数を示す円グラフ。(B）4つのクラスターにおけるサイクリング転写産物のヒートマップ表示（左）と、各クラスター内のGO解析（右）（クラスター1：マゼンタピンク、クラスター2：緑、クラスター3：オレンジ、クラスター4：紫）。(C) 各クラスター内の代表的なGOパスウェイを描いたヒートマップ（各クラスターの色で注釈）。(D）GFマウスにおけるリズム遺伝子の振幅のピーク位相分布を示す極座標図。振幅は相対振幅である（材料と方法参照）。相対振幅の値は<0.1から>0.25の範囲で、5つのランクに分類した： <0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.25、>0.25の5ランクに分類し、明から暗へのカラースケールで示した。(E) (C)の振動経路の振幅の箱ひげ図。

同様のK-meansクラスタリング戦略（補足図S2B）を用いて、GFリズム転写産物を4つのクラスターにグループ化した。CVトランスクリプトームとは異なり、機能的パスウェイの大部分はZT8とZT20に濃縮されたが、クラスター1と3では過剰発現するパスウェイは少なかった（図3B）。クロマチン組織化、好気性呼吸、RNAスプライシング、アクチン細胞骨格組織化、コレステロール代謝、細胞移動など、いくつかのパスウェイはCVマウスとGFマウスの両方でリズムを示した（図3B,C）。しかし、ステロール生合成やRNAスプライシングのように、CVマウスと比較して概日リズムの位相がずれているものが多かった。アポトーシス過程や創傷治癒を含むいくつかの経路では、GFリズムの転写産物がユニークに濃縮され、夜間にピークを示した。興味深いことに、低振幅のリズミカルな転写産物がGF IECsで濃縮された（図3E）。提示された生物学的経路の中では、コレステロール生合成が最も振幅が大きく、CVマウスと同様であった。さらに、すべてのリズミック遺伝子のGO解析から、転写の正の制御とタンパク質輸送の2つの主要なパスウェイが濃縮されていることが示された（補足図S1C-E）。これらのデータを総合すると、GFマウス腸上皮における概日性遺伝子発現の異なるランドスケープが明らかになった。

3.3 GFマウスではIECトランスクリプトームの概日リズムが再プログラムされている
宿主の概日リズムを調節する微生物叢の役割を考慮し、次に概日遺伝子発現パターンとリズム生物学的プロセスをCVマウスとGFマウスの間で系統的に比較した。CVマウスでリズミカルな遺伝子の約40％はGFマウスでも周期的な発現を維持し（「CVshareGF」と表示）（図4A）、CVマウスでのみ有意に振動する残りの60％は「CVonly」と表示した。GFマウスでのみリズミカルな発現を示す遺伝子を「GFonly」と表記した。CVマウスでは3群とも概日発現の振幅が相対的に大きく、「CVonly」群が最も高い差を示した（図4B-D）。このことは、腸内細菌叢がIECにおける高振幅の概日リズムの維持に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。興味深いことに、"CVonly "群と "GFonly "群の不整脈転写産物の位相は、いずれもZT0とZT12で特異的な位相分布を示した（図3D中、3E左）。逆に、リズム遺伝子の振幅分布は、24時間周期にわたって各相でより均等に配分されていた（図4C-E）。各フェーズにおいて、GFマウスはCVマウスに比べて低振幅の転写産物が多い（図4C-E）。これらの結果は、腸内細菌叢がリズム振幅を増強することによって宿主の概日リズム遺伝子発現を形成することの重要性を裏付けるものであった。

図4
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図4. IECにおける遺伝子発現の概日リズムは、CVマウスとGFマウスで異なってプログラムされている。(A)CVマウスとGFマウスのIECにおける共有転写産物および固有の振動転写産物のベン図。(B)「CVshareGF」、「CVonly」、「GFonly」それぞれの転写産物におけるCVマウスとGFマウスの振幅の比較。****p<0.0001はStudent's t-testで示した。(C-E)「CVshareGF」(C)、「CVonly」(D)、「GFonly」(E)におけるリズム遺伝子の振幅のピーク位相分布と、機能的に組織化されたGOタームネットワークを右側に示した極座標図。振幅は相対振幅（材料と方法参照）。相対振幅の値は<0.1から>0.25まであり、5つのランクに分類された： <0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.25、>0.25の5ランクに分類され、淡から濃までのカラースケールで示される。GO用語ネットワークのノードの大きさ（C-E）は、マッピングされた遺伝子数を意味し、ノードの大きさに比例する。

さらに、各グループ内の遺伝子の機能を、ClueGOベースのGO濃縮解析（Bindea et al.） RNA代謝、ヌクレオシド三リン酸生合成を含む生物学的プロセスは、「CVshareGF」転写産物に富んでいた（図4C）。リボソーム生合成、アミド生合成、酸化的リン酸化、タンパク質代謝と細胞周期の制御に関連する転写産物は、「CVonly」クラスターに高度に濃縮されていた（図4D）。この結果は、腸内細菌叢がエネルギー代謝、タンパク質合成、細胞増殖の概日リズムの編成に重要な役割を果たしていることを示唆した。最後に、「GFのみ」グループは、核酸代謝、タンパク質修飾、タンパク質輸送経路に関連する転写産物が豊富であった（図4E）。これらの結果を総合すると、腸内細菌叢は、エネルギーと生体分子を要求する様々な必須細胞および生理的プロセスの同調に役立っていることが示唆される。

われわれのこれまでの解析から、腸内細菌叢はIECにおける遺伝子発現の概日期もシフトさせる可能性が示唆された（図3）。そこで、リズム遺伝子の各グループ（すなわち、CVshareGF、CVonly、GFonly）における位相と振幅の違い（GF対CV）を調べた。図5に示すように、「CVonly」グループの振動遺伝子はGFマウスで「右シフト」を示し、腸内細菌叢の欠如による発現タイミングの遅れが示唆された。次に、概日リズムの位相が左右にずれた「CVshareGF」群の転写産物について調べた。CVマウスの概日リズムと比較して、GFマウスでは発現のピークが早く起こる（左シフトする）転写産物は、免疫応答やウイルスプロセスのポジティブ制御を含むいくつかの経路で有意に濃縮されていた（図5）。一方、GFマウスで発現リズムの位相が遅れる転写産物群は、主に細胞周期を制御していることがわかった。このことから、腸内細菌叢はマウスの腸上皮におけるリズム経路の振幅とタイミングの両方を制御していることが示唆された。

図5
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図5. CVマウスとGFマウスにおけるリズム遺伝子の位相と振幅の解析。Phase_diffはPhase1-Phase2と定義し、Amp_diffはAmplitude1-Amplitude2と定義する。1と2はそれぞれGFマウスとCVマウスの同じ遺伝子を示す。左側（＜0）にあるドット（遺伝子）はGFマウスでサーカディアンが進んでいることを意味し、右側（＞0）にあるドットはGFマウスでサーカディアンが遅れていることを意味する。密度プロットは、各比較（CVshareGF: 黄色、CVonly: オレンジ、GFonly: グレー）のamp_diff（右）またはphase_diff（上）の分布を示す。位相が左にシフトした「CVshareGF」グループの遺伝子のGO用語ネットワーク、位相が右にシフトした「CVshareGF」グループの遺伝子のGO用語ネットワーク、ノードの大きさは有意水準に比例する。

3.4 腸内細菌叢はHDAC3を介して上皮の概日リズムを制御する
以前我々は、微生物叢が小腸上皮のHDAC3を活性化し、ヒストンアセチル化のゲノムワイドな振動と、栄養摂取と代謝経路のリズムを駆動することを報告した（Kuang et al.）ここでは、腸上皮における遺伝子発現の概日リズムをどのように制御しているのかを系統的に調べた。まず、JTK_cycleアルゴリズムを適用し、Hdac3ΔIECマウスにおいて有意なリズムを示した転写産物23,285個のうち5,584個を同定した（図6A）。2,176の転写産物はWTマウス（Hdac3fl/fl）とHdac3ΔIECマウスの両方で循環しており（補足図S3A）、「WTshareKO」グループと定義した。Hdac3fl/flマウスのみで発振する転写産物は、Hdac3ΔIECマウスのものと比較して振幅が大きく、HDAC3が腸内細菌叢とともに上皮の概日リズムをプログラムする共制御因子であることが示唆された（補足図S3B）。同様の結果は図4でも観察され、「CVonly」転写産物はより高い振幅を示した。もう一つの興味深い観察結果は、Hdac3fl/flマウスの位相分布と比較して、Hdac3ΔIECマウスではZT12とZT15でより多くの「WTshareKO」転写産物がピークを示すことであった（補足図S3B）。さらに、「WTonly」群と「KOonly」群の両方で、ZT0とZT12における不整脈転写産物の特異的な位相分布が観察された（補足図S3D, E）。これらの結果は、HDAC3が上皮概日プログラムの振幅と位相の両方を制御していることを示唆している。

図6
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図6：HDAC3は腸内細菌叢とともにIECトランスクリプトームの概日振動を制御している。(A）Hdac3ΔIEC（KO）マウスにおいて、JTK_cycleによってリズミカル（黄色）（Bonferroni adj.p値≦0.05）と同定された転写産物の数と、不整脈（水色）（Bonferroni adj.p値＞0.05）と同定された転写産物の数を示す円グラフ。(B）Hdac3fl/fl（WT）およびKOリズム遺伝子において有意に濃縮された生物学的機能を示すヒートマップ。ドットの大きさは、個々の項に濃縮された遺伝子数を入力遺伝子の総数で割った遺伝子比率を示す。(C）微生物叢またはHDAC3によって制御される遺伝子の3つのグループ（グループA、グループB、グループC）を生成するための模式図。(D-F）グループA（D）、グループB（E）、グループC（F）の転写産物におけるGO濃縮解析。

HDAC3によって制御される機能的経路を理解するために、Hdac3fl/flマウスとHdac3ΔIECマウスのリズム転写産物のGO解析を行った。その結果、細胞質翻訳、ミトコンドリアATP合成、細胞周期、mRNAプロセシングなど、いくつかの経路がHdac3fl/flマウスでは循環していたが、Hdac3ΔIECマウスでは遺伝子比に基づいて循環していなかった（図6B）。さらに、脂質代謝過程とタンパク質輸送は、Hdac3fl/flマウスに比べてHdac3ΔIECマウスではあまり濃縮されていなかった（FDR）。次に、"WTshareKO"、"WTonly"、"KOonly "の3つの遺伝子グループについて調べた。その結果、"WTonly "と "CVonly "のリズミカルな転写産物には、エネルギー産生、リボソーム生合成、翻訳、細胞周期など、いくつかの経路クラスターが共有されていることがわかった。これらの結果は、これらの経路のリズムが腸内細菌叢とHDAC3の両方によって制御されている可能性が高いことを示している。一方、"WTshareKO "および "KOonly "と比較すると、"WTonly "グループの転写産物は、パスウェイネットワークにおいて最も豊富な機能カテゴリーを示した（補足図S4C-E）。これは、HDAC3の欠失が正確なネットワーク構造の喪失につながったことから、GOカテゴリーのレベルで基本的な生物学的機能を維持するためにHDAC3が重要であることを示唆している（補足図S4D）。

IECにおける概日リズムのプログラムにおける腸内細菌叢とHDAC3の制御的役割をさらに調べるために、リズム遺伝子の3つのグループを定義し、「A」、「B」、「C」とした（図6C）。GFマウス、CV Hdac3fl/flマウス、Hdac3ΔIECマウスのリズミカル遺伝子は、腸内細菌叢とHDAC3によって発現が振動している可能性のある遺伝子を集める目的で、2段階比較漏斗にかけた。第1レベルの比較は、GF vs. CV Hdac3fl/fl および CV Hdac3fl/fl vs. CV Hdac3ΔIECの2組のグループ内で行った。その結果、GFと比較した "CVonly "とHdac3ΔIECと比較した "WTonly "の2つのクラスターが生成された。さらに、"CVonly "と "WTonly "の間で次のレベルの比較を行った結果、3つのグループができ、それらの発現リズムは以下のような要因で駆動されていることがわかった： A-腸内細菌叢；B-腸内細菌叢とHDAC3；C-HDAC3。次に、これらのグループの遺伝子の生物学的機能を調べた（図6D）。興味深いことに、Bグループの遺伝子は、リボソーム生合成、翻訳、細胞周期の生物学的機能に有意に富んでいた。一方、Aグループの遺伝子は、金属イオン、タンパク質輸送、細胞移動とともに、異化過程により機能的に関連していた（図6E）。Cグループの遺伝子は、その概日リズムがHDAC3によって駆動されている可能性が高く、ステロール生合成、炭水化物誘導体生合成、酸化によるエネルギー誘導など、いくつかの興味深い代謝経路に富んでいた（図6F）。機能パスウェイ解析から、腸内細菌叢とHDAC3は、集団的および独立的な様式で、好ましい生物学的機能の概日リズムを駆動し、調整している可能性が示唆された。

HDAC3が遺伝子発現を制御する主なメカニズムは、ヒストンのアセチル化である。B群の遺伝子（微生物叢とHDAC3の両方によって駆動される概日リズム）におけるヒストンアセチル化（H3K9ac）の振幅を解析し、Hdac3fl/flマウス、Hdac3ΔIECマウス、GFマウスのシグナルを比較した（補足表S2）。Hdac3fl/flマウスでは転写産物の大部分が高いH3K9acの振幅を示したが、GFマウスとHdac3ΔIECマウスでは振幅がかなり低かった（図7A）。興味深いことに、GFマウスとHdac3ΔIECマウスの両方のIECで同様の振幅分布が観察されたことから、微生物叢とHDAC3の両方がヒストンアセチル化を通じて概日性遺伝子発現を促進している可能性が示唆された。そこで、Hdac3fl/flマウスにおけるH3K9acレベルの統計解析に基づいて、これらの転写産物を2つのクラスターに分けるために、0.466の振幅をカットオフ値として設定した。2つの遺伝子クラスターの極座標図を見ると、高アセチル化振幅群（>0.466）ではZT18とZT21に発現ピークを持つ転写産物が多いのに対し、低アセチル化振幅群ではZT0とZT3に発現ピークを持つ転写産物が多いことがわかる（図7B）。さらに、これら2つの遺伝子クラスターについてGO解析を行ったところ、濃縮された生物学的パスウェイの顕著な違いが観察された（図7C）。ドットヒートマップ上で、有意に濃縮された生物学的テーマとKEGGパスウェイを組み合わせた（FDR<0.05）。生物学的機能の大部分は、アセチル化振幅の大きい転写産物でまとめて過剰に発現していた一方、振幅の小さいクラスターではパスウェイは濃縮されていなかった（図7C）。全体として、このデータは、発現リズムが腸内細菌叢とHDAC3によって共駆動されるBグループの遺伝子において、ヒストンアセチル化リズムが遺伝子発現振動の主要な流れを駆動していることを示している。

図7
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図7. HDAC3依存的ヒストンアセチル化は、IECにおける概日プログラムの微生物制御を媒介する。(A）WT、GFおよびKOマウスにおけるB群遺伝子のH3K9acの振幅のヒストグラム。(B）ヒストンアセチル化の振幅が低い（左）、高い（右）リズム転写産物のピーク位相と振幅のポーラーヒストグラムプロット。低いアセチル化振幅：振幅＜0.5、高いアセチル化振幅：振幅＞0.5。振幅は相対振幅である（材料と方法参照）。相対振幅の値は<0.1から>0.25の範囲で、5つのランクに分類された： <0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.25、>0.25の5ランクに分類され、淡から濃までのカラースケールで示された。(C)アセチル化振幅が大きい、または小さい遺伝子の、有意に濃縮されたGO用語とKEGGパスウェイのヒートマップ表示。

3.5 モチーフ濃縮解析から、サーカディアン調節におけるHDAC3とTFの集団的役割が示唆される
HDAC3は転写補因子であり、他のTFと相互作用して特定の下流経路を制御する。HDAC3が遺伝子発現の概日リズムを制御するメカニズムをさらに調べるため、B群のリズム遺伝子（微生物叢およびHDAC3依存性、図6C）を「発現上昇」（Hdac3ΔIECにおいて）と「発現低下」（Hdac3ΔIECにおいて）の2つのクラスターに分け（図8A）、それぞれのクラスターでTFモチーフ濃縮解析を行った。その結果、97個のTFモチーフが「upregulated」グループにのみ濃縮され、一方5個のTFモチーフが「downregulated」グループにのみ濃縮された（図8B）。エンドサイトーシス、感染、アクチン細胞骨格、オートファジーの経路は、発現が増加した転写産物に濃縮されていた（図8C）。その中でもSMADは、ヒストン脱アセチル化酵素活性を介して転写を制御することが報告されている（Ross et al.）転写因子CLOCKBMALは、ゲノムワイドな概日リズムを制御することが知られている概日時計の中核構成因子である（Kimら、2018）。PPARA、LXR、SREBPを含むいくつかの脂質代謝制御因子が濃縮された。STATやNF-κBなどの免疫応答制御因子も濃縮された。これらのTFは代謝・免疫経路や宿主-微生物相互作用に関与している（図8E）。E2F1、AP2GAMMAおよびZF5は、発現低下遺伝子クラスターに高度に濃縮されていた。この結果から、HDAC3は様々なTFと相互作用し、正統的および非正統的なメカニズムを通して、腸上皮における様々な経路の概日リズムをプログラムしていることが示唆された。

図8
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図8. TFモチーフはHDAC3依存的なリズム経路において異なって濃縮されている。(A)HDAC3によって制御される「アップレギュレート」転写産物と「ダウンレギュレート」転写産物のパターンを示す模式図（Hdac3ΔIECマウスでアップレギュレート：赤、Hdac3ΔIECマウスでダウンレギュレート：青）。(B)アップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子にユニークに濃縮されたTFモチーフの数を示す円グラフ。(C）発現上昇遺伝子に有意に濃縮されたKEGGパスウェイ（FDR<0.05）。(D) 個々のTFモチーフの要約と(B)の対応するロゴ表示。(E) 最も有意に濃縮されたTFモチーフのp値を示すレーダーチャート。(F)個々のTFモチーフの要約と(E)の対応するロゴ。

さらに、事前に定義したBグループ、GFonlyグループ、KOonly遺伝子に濃縮されたTFモチーフを調べた。ユニークに濃縮されたTFモチーフは各グループで同等であった（補足図S4A）。Bグループ遺伝子にユニークに濃縮されたTFモチーフの1つはPPARGであり（補足図S4B）、これは概日タンパク質（すなわちBMAL1）と相互依存的に機能することがよく知られている（Chen and Yang.2014）。その上、PPARGは微生物叢依存的に抗菌ペプチド産生を制御しており（Liu et al.、2017）、腸内細菌叢によって生成された酪酸はPPARGの発現を同時に促進する可能性がある。この結果から、腸内細菌叢はPPARGとHDAC3を介して遺伝子発現の概日リズムをプログラムする重要な環境要素である可能性が示唆された。

4 考察
本研究では、マウスIECにおける遺伝子発現の概日リズムを系統的に特徴付け、腸内細菌叢、HDAC3および転写因子が上皮の概日プログラムをどのように制御しているかを解析した。その結果、腸内細菌叢が様々な分子的、細胞的、生理的経路において概日リズムを駆動する一方で、遺伝子発現リズムはGFマウスに比べて比較的高い振幅を維持していることがわかった。興味深いことに、これらのリズム経路は、日中の「充電」状態と夜間の「活動」状態として示される、活動状態と休息状態の1日の交替に同期している（図9）。さらに、概日リズムが微生物叢とHDAC3に依存する遺伝子に有意に濃縮されたTFモチーフを同定し（図8B）、腸内微生物叢がHDAC3とHDAC3相互作用TFを介して宿主の概日リズムをプログラムすることを可能にした。

図9
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図9. 微生物叢がHDAC3を活性化し、昼夜の光周期にわたって「働く」経路と「充電する」経路を時間的に編成して、腸上皮の機能性と恒常性を維持することを示す要約モデル。

これらの発見は、いくつかの重要な意味を持つ。第一に、腸内細菌叢は宿主の遺伝子発現プログラムを同期させ、ダイナミックなリズムの腸内環境に対応して上皮機能を調整する上で不可欠な要素であることが示唆された。いくつかのグループが、腸内細菌叢のリズミカルな生物地理学とメタボロームが宿主の転写振動の時間的プログラミングを駆動することを報告しているが（Thaiss et al., 2016; Weger et al., 2019; Kuang et al., 2019）、我々は、微生物叢依存的な「働く」プログラムと「充電する」プログラムの交替を強調し、その機能的意義についての説明を提供する（図9）。働く」という生物学的テーマには、腸の2大機能である栄養吸収と免疫防御を含む、広範な宿主-腸環境相互作用が含まれる。一方、腸管上皮は速やかに個体群を補充し、その機能性を維持しなければならない。私たちはこれを、主に内在性の維持と再プログラミング過程を含む「充電」のテーマと定義した。我々は、腸内細菌叢が、マウスが休息している昼間に「充電」テーマを、マウスが活動し摂食する夜間に「作業」テーマを配置することで、上皮リズムの管理に役立っていることを示した。従って、夜間（本研究ではZT14から）の摂食によって、代謝および関連する細胞経路がアップレギュレートされ、宿主の栄養摂取能力が高まる。その後、腸内細菌の量が急増するためか、免疫系反応とエンドサイトーシス経路が増加する。マウスは午前中は休息しているが、腸上皮の活動は本質的な「再生」と「充電」のテーマにシフトしている。これは、ATP合成、リボソーム生合成、タンパク質翻訳、細胞周期に関連する転写産物のアップレギュレーションによって証明されている。GFマウスでは、遺伝子発現プログラムのこのような時間的順序は、転写の調節のような、昼と夜の両方で繰り返し濃縮される機能的用語によって希釈され、機能的経路は減衰またはシフトする。

もう一つの興味深い観察は、腸内細菌叢に関係なく、異なる経路が様々な振幅でグローバルにプログラムされていることである。例えば、コレステロール生合成経路は、CVマウスでもGFマウスでも、他の経路に比べて振幅が大きい（図2C；図3C）。このことは、最近のミバエの研究（Zhangら、2023年）により、振幅が大きい方が概日リズムのランダムな変動を防ぎ、生物が環境による中断の影響を受けにくくなることが示唆されていることから説明できる。より高い振幅でリズムを安定させることで、生物は概日リズムの急激なシフトを起こさなくなり、その結果、新しい環境への適応が困難になる可能性がある。ヒトを対象とした別の興味深い研究によると、睡眠中の概日リズムの振幅が小さい被験者ほど、睡眠不足に対する回復力が有意に高く、うまく対処できることが報告されている（Di Milia and Folkard, 2021）。環境の中断が異なる概日リズム経路に異なる影響を与えるかどうかをさらに調査することは興味深い。

さらに、今回の結果は、HDAC3依存的なヒストン脱アセチル化が、腸内細菌叢が宿主の概日リズムを制御する主要なモチーフであるという概念を支持するものである。本研究では、Hdac3fl/flマウスにおいてヒストンアセチル化の強いリズムを示し、腸上皮における多くの必須プロセスに関連する遺伝子群を同定した。しかし、ヒストンアセチル化の振動が低い遺伝子に濃縮された機能的パスウェイは観察されなかった。このことは、HDAC3と腸内細菌叢が、ヒストンアセチル化を介して、上皮における主要な生物学的活動を一括して同期させていることを示唆している。

最後に、本研究は、微生物と概日リズムの転写およびエピジェネティック制御を研究するための新たな道を開いた。我々は、グループB（微生物叢およびHDAC3依存性リズム遺伝子）のアップレギュレート遺伝子群に、エンドサイトーシスや腸内感染など、いくつかのKEGGパスウェイが検出されることを示した（図8C）。したがって、これらの概日経路と腸内細菌叢の因果関係を研究することで、腸内細菌叢が宿主の転写リズムにどのように持続的な影響を与えるのかという残された疑問に光を当てることができるかもしれない。特に、これらの遺伝子のプロモーター領域で有意に濃縮されたTFモチーフをいくつか同定したが、中でもアリール炭化水素受容体（AhR）は、エンドサイトーシスを介して真菌の侵入を促進していることが報告されており（Solis et al., 2017）、AhRの活性は多くのエピジェネティック因子によって誘導され、多様な免疫学的応答に影響を与える可能性がある（Wajda et al., 2020）。さらに、哺乳類の概日リズムを制御する微生物-エピジェネティック回路を理解することは、マイクロバイオーム要素の変化を介して健全な概日リズムを回復させるという点で、1日の時間を有利にする治療的アプローチのためのピン留めされた時間マップを提供するかもしれない。

データの利用可能性
本研究では、一般に入手可能なデータセットを解析した。このデータは https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE134303 Gene Expression Omnibus GSE134303に掲載されている。

著者貢献
JMとZKが本研究を発案した。JMは図1-7のデータ解析を行い、結果を解釈し、原稿を執筆した。ZKは図8のTFモチーフ解析を行った。ZKは計算機解析を監督し、原稿に重要な示唆を与えた。ZKはJMと共にプロジェクトを指揮し、結果を解釈し、原稿を執筆した。JZは原稿の編集を手伝った。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究は、NIH Grant DP2 DK136278（ZK）、R00 DK120897（ZK）、Charles E. Kaufman Foundation（ZK）の支援を受けた。

謝辞
Samskrathi Sharma、Jacob Werner、Bhavana Kalidindi、I-Shu Wangの貴重なコメントに感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fsysb.2023.1175306/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：概日リズム、マイクロバイオーム、腸上皮細胞、HDAC3、ヒストンアセチル化、代謝・免疫、細胞増殖

引用 Ma J, Zhang J and Kuang Z (2023) 微生物-エピジェネティック回路が、腸上皮における系統的概日プログラムを制御している。Front. Syst. doi: 10.3389/fsysb.2023.1175306.

受理された： 30 March 2023; Accepted: 24 July 2023；
発行：2023年08月08日

編集者

リヤン・チェン（カリフォルニア大学サンディエゴ校、米国
査読者

長谷剛, 東京医科歯科大学, 日本
Manvi Sharma, アラバマ大学バーミンガム校, アメリカ合衆国
Copyright © 2023 Ma, Zhang and Kuang. 本論文は、Creative Commons Attribution License (CC BY)の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*通信： Zheng Kuang, zhengkua@andrew.cmu.edu

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