糞便中および血漿中の小腸透過性およびメタボロームプロファイルは、糞便微生物叢移植試験に参加した活動性関節症性乾癬患者の臨床効果と関連する： FLORA試験からの探索的知見

米国リウマチ学会
ACRオープンリウマチ早見表
糞便中および血漿中の小腸透過性およびメタボロームプロファイルは、糞便微生物叢移植試験に参加した活動性関節症性乾癬患者の臨床効果と関連する： FLORA試験からの探索的知見

https://acrjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/acr2.11604

Maja Skov Kragsnaes, Jesus Miguens Blanco, Benjamin H. Mullish, Jose Ivan Contreras-Serrano, Jens Kjeldsen, Hans Christian Horn, Jens Kristian Pedersen, Heidi Lausten Munk, Anna Christine Nilsson, Ash Salam, Matthew R. Lewis, Elena Chekmeneva, Karsten Kristiansen, Julian R. Marchesi, Torkell Ellingsen
初版発行：2023年9月22日
https://doi.org/10.1002/acr2.11604
ClinicalTrials.gove識別子： NCT03058900。
年次欧州リウマチ学会（Annual European Congress of Rheumatology 2022 and 2023）にて一部発表。
本研究は、Sygeforsikringen "danmark"（2022-0026）、Fabrikant Vilhelm Pedersen's Mindelegat（ノボ ノルディスク財団の推薦による）、デンマーク地域医療基金（Regionernes Medicin- og behandlingspulje）、南デンマーク大学研究基金、デンマークリウマチ協会、デンマーク乾癬研究基金、オーデンセ大学病院研究基金の支援を受けた。National Phenome CentreはMedical Research CouncilおよびNational Institute for Health Research（NIHR）（助成金MC_PC_12025）の支援を受け、インフラストラクチャーはNIHR Imperial Biomedical Research Centre（BRC）から提供された。Miguens Blanco博士とMarchesi博士、消化器疾患部門、インペリアル・カレッジ・ロンドンのMRC NIHR National Phenome Centreは、インペリアル・カレッジ・ヘルスケアNHSトラストとインペリアル・カレッジ・ロンドンを拠点とするNIHR BRCから財政的、基盤的支援を受けている。Miguens Blanco博士の研究は、Versus Arthritis（旧Arthritis Research UK）のPhenomic characterization of Psoriatic Arthritisの助成金を受けている： MI-PARTプロジェクト（21228）。Mullish博士はNIHR Academic Clinical Lectureship（CL-2019-21-002）を受けている。
Kragsnaes博士とMiguens Blanco博士は本研究に等しく貢献した。
Marchesi博士とEllingsen博士も同様に本研究に貢献した。
著者の情報開示はhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/acr2.11604。
論文について
セクション

概要
目的
我々は、メトトレキサート治療を受けた活動性関節症（PsA）における腸管透過性、糞便、血漿、尿のメタボロームプロファイル、および偽薬または糞便微生物叢移植（FMT）1回後の臨床効果との関連について検討した。

方法
この探索的研究は、FLORA試験コホートに基づくもので、このコホートでは、少なくとも3ヵ月間のメトトレキサート治療にもかかわらず、中等度から高度の末梢性PsA疾患活動性を有する31名の患者が、26週間の二重盲検、1：1の無作為化、偽薬対照試験に組み入れられた。参加者は、胃カメラによる1回の健常ドナーFMT（n=15）または偽薬（n=16）を受ける群に無作為に割り付けられた。主要エンドポイントは26週までの治療失敗の割合であった。ベースライン時（n＝31）と26週目（n＝26）にラクチュロース対マンニトール比（LMR）試験を行い、小腸透過性を評価した。ベースライン時、4週目、12週目、26週目に採取した糞便、血漿、尿検体のメタボロームプロファイルを1H核磁気共鳴法を用いて測定した。

結果
試験失敗者（n = 7）は、26週目において、反応者（n = 19）と比較してLMRが有意に高く（0.027 [0.017-0.33] vs. 0.012 [0-0.064], P = 0.013）、腸管透過性の亢進を示した。多変量解析により、便中（P < 0.0001）および血漿中（P = 0.005）のメタボロームプロファイルに基づいて、すべての時点において反応者（n = 19）対失敗者（n = 12）の有意なモデルが明らかになったが、尿中のメタボロームプロファイルは群間で差がなかった（P = 1）。便中N-アセチル糖蛋白質GlycAは健康評価質問票障害指数と相関し（係数=0.50、P=0.03）、便中プロピオン酸は26週目の米国リウマチ学会20奏効率と相関した（係数=27、P=0.02）。

結論
PsA患者の腸管透過性、糞便および血漿中のメタボロームプロファイルは、臨床試験の主要エンドポイントである不成功と奏効に関連していた。

はじめに
腸管透過性（1、2）と微生物酵素産物が疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARDs）の生物学的利用能、臨床効果、毒性にどのような影響を及ぼすかを提唱するファーマコバイオミクスの分野に後押しされ、近年、免疫介在性関節炎の疾患管理における微生物叢に基づく治療（糞便微生物叢移植[FMT]を含む）の臨床的展望が注目されている（3）。いくつかの初期の、しかし一貫したエビデンスは、腸内微生物環境の異常と乾癬性関節炎（PsA）を結びつけている(4)。健常人と比較して、PsA患者では便の細菌多様性が減少し(5)、細菌組成の特徴が明瞭である(6)。また、抗菌ペプチドの発現増加やインターロイキン-17(IL-17)、IL-22、IL-9のアップレギュレーションを特徴とする不顕性腸炎がみられる(7)。しかし、現在のところ、これらの構造的・組成的変化とPsAの病態との関連や、疾患の重症度や治療効果に対する機能的な影響に関する基礎的なメカニズムは、まだ研究されていない(8)。

短鎖脂肪酸（SCFAs）、アミノ酸（AAs）、二次胆汁酸などの微生物叢由来の代謝産物や代謝拮抗物質は、宿主と微生物叢の複雑なクロストークにおいて、無数の反応の産物としても反応物としても重要な役割を果たしている。腸-関節軸の文脈では、これらの代謝産物は腸バリアの完全性と機能を調節し、免疫細胞サブセットに対して直接的な免疫調節活性を発揮することができる(9)。また、微生物抗原や代謝産物は、特に局所の炎症（「リーキー」ガット）によって腸管透過性が変化している場合（2）、制御不能な形で腸関門を通過し（10）、遠くの組織や臓器に作用する可能性もある（11）。

これまでの研究で、関節リウマチ（RA）や健常人と比較して、PsAでは糞便中（12）や血清中のメタボロームシグネチャーが明瞭であり（13、14）、特定のサイトカインや臨床的特徴と相関していることが示されている。従って、腸管透過性の評価と生体液の代謝プロファイリングは、免疫介在性関節炎の病因と治療反応に対する宿主-微生物叢相互作用の寄与を探る上で、新たな役割を担っている(15)。ラクチュロース-マンニトール比（LMR）アッセイは、腸管バリアの完全性を評価するための確立された検査法であり、一方、1H核磁気共鳴（NMR）は、さまざまな生体流体にわたって宿主および微生物の広範な代謝産物を評価する「グローバル・メタボローム・プロファイリング」のためのハイスループットで再現性の高いツールである。

我々は以前に、スクリーニングされた健常人から提供された腸内細菌叢をレシピエントの腸に移植する1回のFMTが、末梢性活動性PsAのメトトレキサート（MTX）非反応患者における良好な治療補助となり得るかどうかを検討した、26週間の二重盲検無作為化FLORA試験の臨床結果を報告した（16）。この試験では、FMTを26週間投与した患者の40％で、疾患の重症度が十分に低下したのに対し、偽薬（生理食塩水）移植を受けた患者では80％であった。したがって、有益な反応に関連する腸内環境の代謝の変化を調べることは、この分野における今後の介入研究の指針になると考えられる。そこでわれわれは、糞便、血漿、尿のメタボローム・プロファイルに加え、小腸の機能的透過性がFLORA試験の主要アウトカムおよび主要な副次的アウトカムにどのように関連しているかを調査しようとした。

患者と方法
試験設定と参加者
MTX治療を継続しているにもかかわらず、末梢の疾患活動性が中等度から高度のPsA患者31名が、この26週間の二重盲検並行群間1：1無作為化偽薬対照試験（FLORA; NCT03058900）に組み入れられた(16)。本試験は、南デンマークの健康研究倫理に関する地域委員会（DK-S-201580）およびデンマークデータ保護庁（15/41684）により承認された。患者はClassification for Psoriatic Arthritis（CASPAR）の基準を満たし、試験組み入れの少なくとも3ヵ月前から定常量のMTX（単剤）を皮下注射（n=25）または経口錠剤（n=6）として投与する治療を受けていた(16)。彼らは全員、試験期間中この治療を継続した。試験参加中は非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）を服用しないよう患者に求めた。患者は、胃内視鏡ガイド下単回糞便FMTを1回受けるか、偽移植（褐色生理食塩水）を受けるかのいずれかに無作為に割り付けられた。糞便の提供は、健康で十分なスクリーニングを受けた血縁関係のない痩せた4人（男性2人、女性2人、年齢は26～54歳）から行われた(16)。各FMT製品は、デンマークの標準的なプロトコール(16)に従って調製された、ドナーの1人からの50gの糞便処理物から構成されていた。製品は-80℃で保存され、臨床応用の直前に36℃まで解凍された。

本試験の主要評価項目は、26週までの治療失敗の割合であり、現在の症状の改善が不十分であったため、または疾患が悪化したため、治療の増量が必要であったと定義された(16)。本報告では、この主要評価項目を試験不成功対レスポンダーと呼ぶことにする。登録時、すべての患者は国のガイドラインに従って生物学的DMARDsの輸注を開始する候補であり、その結果、試験中に1例を除くすべての試験失敗例で腫瘍壊死因子阻害薬（TNFi）が投与された。したがって、12週目に採取された5つの便/血液/尿サンプルと26週目に採取された7つの便/血液/尿サンプルは、TNFiによる治療を開始した患者からのものであった。本試験の3つの主要な副次評価項目は26週目に評価された：Health Assessment Questionnaire Disability Index（HAQ-DI）スコア、American College of Rheumatology（ACR）20 response、Spondyloarthritis Research Consortium of Canada（SPARCC）Enthesitis Indexである(16)。

試験サンプルの収集、保管、発送
ベースライン時、4週目、12週目、26週目に生物学的検体を採取した。患者検体の採取、保管、発送に関する詳細は、補足的方法に記載されている。

1H NMR分光法のための試料調製
サンプル調製プロトコールは、補足的方法に記載されている。

1H NMR分析
糞便、尿、血漿のメタボロームプロファイルをBruker 600MHzスペクトロメーターで測定した。血漿サンプルは310Kの一定温度で測定し、糞便および尿サンプルは300Kで測定した。緩和遅延（RD）-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition：t1（2つの90°パルス間の短い遅延）＝4μs、tm（混合時間）＝100μs、90°パルス＝約10μs。各実験で合計32回のスキャンを行った。Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）スピンエコーシーケンスを用いて、血漿および血清中のNMR緩和時間に基づいてピーク強度を編集し、リポタンパク質やその他の高分子の存在によって生じるブロードピークを分解した。ベースライン補正、自動位相調整、およびトリメチルシリルプロパン酸（TSP）（0 parts per million [ppm]）に対するスペクトル校正は、Topspin 4.1.3ソフトウェアで行った。サンプルの抽出、調製、実験はすべて無作為に行った。

1H NMRスペクトルの前処理
NMR生スペクトルをMATLABソフトウェア（R2014a）にインポートし、社内スクリプトを統合してデータの前処理を続けた。まず、得られたNMR生スペクトルを以下のように位相調整し、参照した：血漿および糞便水スペクトルは、TSP信号を用いて0 ppmに参照した。ベースラインは10ppmのスペクトルに補正され、0.0005ppmの分解能で20,000データポイントにデジタル化された。次に、水、尿素（尿サンプルのみ）、TSPのピークを除去した。スペクトルのアライメントは、再帰的セグメント単位のピークアライメントアルゴリズムを用いて解決した。すべてのNMRデータセットは、確率的商正規化によって正規化された。

1H NMR代謝物同定
代謝物は、1次元1H NMR周波数領域スペクトルの特定の位置にシグナルを示します。化学シフト、ピーク面積積分、および多重度は、構造代謝物の同定に使用されました。選択された代謝物は、以前に社内で発表された MATLAB スクリプトを使用して、各代謝物のピーク下面積から相対インデックスを積分する初期統計的全相関分光法を用いて同定されました (17)。ピークの重なりを避けるため、ピーク積分は慎重に選択した。さらに、サンプル間の積分幅とベースラインのばらつきも避けた。アノテーションの確認は、選択したサンプル数の 2D J 分解 NMR スペクトルを用いて行った。アノテーションの確認には、Human Metabolome Data Baseのような内部および外部のデータベースを使用した。

LMR試験
ベースライン時（n = 31）と26週目の最終診察時（n = 26）にLMR試験を行い、小腸壁の機能的透過性を評価した（LMRが高いほど透過性が高いことを示す）(18)。一晩絶食後、患者は10gのラクチュロース（Pharmanovia A/S）と5gのD-マンニトール（Fresenius Kabi）を含む100mLの水を摂取する前に尿サンプルを提供した。その後3時間に排出された尿をすべて採取した。試験中は飲食（水を除く）を禁止した。高分解能質量分析計Waters Xevo G2-S QTof（Waters Corp.）と結合したWaters Acquity超高速液体クロマトグラフィーシステムで開発されたLC-MS法を用いて尿中のLMRを測定した。尿糖のクロマトグラフィー分離は、ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm, 2.1 × 150 mm カラム（Waters Corporation）を用い、流速0.4 mL/min（45℃）で操作した。移動相Aは水中pH9.8の10 mM酢酸アンモニウム、移動相Bはニートアセトニトリルを使用した。詳細はSupplemental Methodsに掲載されている。

統計解析
統計解析は、この探索的研究の主要臨床変数として、試験の主要有効性エンドポイント（レスポンダー対不成功）を用いて行った。本試験は、当初の臨床試験のデザインおよび対象患者数によって限定された探索的試験であったため、検出力計算は行わなかった。処理および解析は、MATLABおよびSIMCA 17.0ソフトウェアの社内スクリプト(19)を用いて実行した。1H NMRデータには、各変数を標準偏差の平方根で割ることによってデータをスケーリングするParetoスケーリングを使用した。LMR データについては、StataSE-64 version 17 を用いて Wilcoxon rank sum と matched-pairs signed-rank test を行った。LMRデータは中央値（最小値、最大値）で示した。

主な研究目的は、1）糞便サンプル、2）血漿サンプル、3）尿サンプルで測定されたメタボロームプロファイルが、受けた実験的治療に関係なく全患者について、また各介入群（FMT対偽薬）に割り付けられた患者について、主要な試験転帰と関連しているかどうかを調べることであった。非教師あり主成分分析（PCA）は、次元削減と検体スペクトル間の本質的変動の可視化のために使用した。PCA分析の後、教師あり多変量直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を用いて、群間の代謝差をモデル化した。直交信号補正（Orthogonal-Signal-Correction）は、選択したサンプルクラス（臨床データ、Y）と相関のないサンプルの分光データ（予測行列、X）の変動をフィルタリングするために使用した。モデルの品質を評価するために、K-foldクロスバリデーションが使用された。クロス・バリデーションの結果は，R2とQ2パラメータの値によって要約された；最初のパラメータは適合度を要約し（R2 = 1は完全な適合を示す），Q2はモデルの予測可能性を要約する（Q2 = 1は完全な予測可能性を示す）．P値はK-foldクロスバリデーションから推定され、デフォルトのSIMCAソフトウェア7-foldクロスバリデーションソフトウェアが使用された。モデルのさらなる検証を得るために、P値が0.05以下を有効なモデルとして、並べ替え検定（1000回の並べ替え）を用いた。有意なモデルについては、相関係数としてスケーリングされたモデルの負荷量を表すp(corr)パラメータを使用し、-1.0～1.0の範囲を標準化しました。p(corr)のカットオフは0.5に設定しました。

有意な代謝物の積分は、Wilcoxon 符号順位検定および Kruskal-Wallis 一元配置分散分析で統計学的に分析した。Kruskal-Wallis検定後の事後分析はDunnの多重比較検定で行った。P値は、Benjamini-Hochberg法による偽発見率（FDR）計算で、FDRカットオフを0.05として多重仮説検定補正を行った。前述の検定はRのrstatixパッケージで実行した。可視化はggplot2とComplexHeatmapパッケージで作成した。

次に、FMTが個々の糞便代謝物にどのような影響を与えるかを調べたいと考えた。2元配置分散分析（ANOVA）を用いて、FMT群と偽薬群間の同定された糞便代謝物の時間的動態の違いを調べた。最後に、全患者およびFMT治療患者において、各糞便代謝物と本試験の3つの主要な副次評価項目との相関を検討した。これらの相関を評価するために、混合効果モデルを用いた。これらのモデルは、lme4 Rパッケージを用いてフィッティングした。モデルは性別、年齢、体格指数で調整し、データの縦断的性質を考慮するために被験者IDをランダム効果として導入した。P値はBenjamini-Hochberg補正を用いてFDRで調整し、カットオフは0.10とした。

結果
患者の特徴
31人の患者が試験に組み入れられた。主なベースラインの人口統計学的特徴と疾患特性の要約を表1に示す。詳細な人口統計学的データは別のところで発表されている(16)。

表1. ベースラインの人口統計学的特徴と疾患特性
特徴 FMT（n = 15） Sham（n = 16） 合計（n = 31）
女性性, n (%) 8 (53) 12 (75) 20 (65)
年齢（歳） 48.9 (16.1) 52.4 (11.0) 50.7 (13.6)
身長（cm） 175.2 (7.0) 169.8 (8.6) 172.4 (8.2)
体重、kg 93.6 (15.4) 92.4 (24.8) 93.0 (20.5)
診断からの期間、ya 2.6 (0.3-5.8) 5.6 (0.5-8.8) 3.7 (0.5-8.3)
リウマトイド因子IgM陰性, n (%)b 13 (93) 15 (94) 28 (93)
抗窒素化ペプチド抗体陰性, n (%)b 14 (100) 16 (100) 30 (100)
HLA-B27 陰性, n (%) 15 (100) 13 (81) 28 (90)
C 反応性蛋白、mg/L 4.98 (7.18) 5.54 (5.87) 5.27 (6.43)
HAQ-DIc 0.89 (0.51) 0.78 (0.50) 0.83 (0.50)
腫脹関節 66カウント 7.5 (3.0) 6.7 (2.7) 7.1 (2.8)
圧痛関節 68カウント 14.9 (8.9) 17.3 (8.8) 16.1 (8.8)
SPARCC咬合炎指数d
スコア1以上 n (%) 13 (87) 15 (94) 28 (90)
スコア1以上の患者のスコア 8.1 (4.3) 7.2 (3.3) 7.6 (3.8)
組み入れ後1年以内の抗生物質投与, no (%) 4 (27) 6 (38) 10 (32)
喫煙状況、n (%)
現在 5 (33) 4 (25) 9 (29)
以前 4 (27) 8 (50) 12 (39)
一度もない 6 (40) 4 (25) 10 (32)
アルコール消費量、単位／週 0.9 (0.9) 0.8 (0.6) 0.8 (0.7)
データは、特に断りのない限り、平均値（SD）またはn（％）である。
略語 DMARD、疾患修飾性抗リウマチ薬、FMT、糞便微生物叢移植、HAQ-DI、健康評価質問票障害指数、HLA-B27、ヒト白血球抗原B27、IgM、免疫グロブリンM、SPARCC、カナダ脊椎関節炎研究コンソーシアム。
a 乾癬性関節炎と診断されてからの期間は中央値および四分位範囲として示した。
b リウマトイド因子（IgM）および抗シトルリン化ペプチド抗体の存在は、FMT群の1例では認められなかった。
c HAQ-DIのスコアは0～3の範囲で、スコアが高いほど障害が大きいことを示す。
d SPARCC Enthesitis Indexは0から16の範囲で、スコアが高いほど重症であることを示す。
障害群における小腸透過性の増加
ベースライン時のLMRには、4人の健常FMTドナーと31人の患者との間に有意差は認められなかった（0.0065 [0-0.063] vs. 0.014 [0-0.28]; P = 0.50）。LMRは、偽薬治療を受けた16人の患者でベースラインから26週目まで有意に増加した（0.0046 [-0.012 to 0.088]; P = 0.032）。この差は、FMT治療を受けた10人の患者では見られなかった（0.0020［-0.27～0.32］；P = 0.92）。しかし、26週目のLMRでは、FMT治療群（n＝10）と偽薬治療群（n＝16）の間に有意差は認められなかった（図1A）。興味深いことに、26週目のLMRは、反応者（n = 19）と比較して失敗者（n = 7）の方が有意に高かった（0.027 [0.017-0.33] vs. 0.012 [0-0.064]; P = 0.013）。これは、失敗群において小腸透過性が高いことを示している（図1B）。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図1
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パワーポイント
キャプション
健康なドナーのメタボロームプロファイルはPsA患者のものと著しく異なる
我々は、様々な生体流体の全体的なメタボロームプロファイルが、健常便ドナーとPsA患者でどの程度異なるかを評価することを目的とした。31人のPsA患者と4人のFMTドナーから採取したベースライン検体では、29の糞便代謝産物（図2A）、35の血漿代謝産物（図2B）、43の尿代謝産物を定量することができた（補足表1）。すべての代謝物について多変量OPLS-DA分析を行ったところ、FMT提供者のメタボロームプロファイルとベースライン時の患者の糞便サンプルとを有意に区別できるモデルが作成された（OPLS-DAモデル；R2＝0.87、Q2＝0.565；P＜0.0001）。酪酸（r = 0.56）とバリン（r = 0.51）はドナー検体と相関していたが、グルタミン酸（r = -0.64）、チロシン（r = -0.63）、アラニン（r = -0.62）、トリプトファン（r = -0.53）は患者検体と相関していた。ベースラインの糞便メタボロームプロファイル（OPLS-DAモデル；R2＝0.196、Q2＝-0.444、P＝1）、血漿プロファイル（OPLS-DAモデル；R2＝0.174、Q2＝-0.452、P＝1）、尿プロファイル（OPLS-DAモデル；R2＝0.182、Q2＝-0.140、P＝1）において、FMTに割り付けられた患者と偽移植に割り付けられた患者の間に差は観察されなかった。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図2
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パワーポイント
キャプション
糞便中メタボロームプロファイルによる奏効例と不成功例の区別
すべての時点の全患者において、試験反応者（n = 19）と失敗者（n = 12）の間で糞便メタボロームプロファイルに明らかな差が認められた（R2 = 0.613, Q2 = 0.220, P < 0.0001）。このOPLS-DAモデルと、相関係数（r）が0.50以上の代謝物と主要な試験結果との相関を図3Aに示す。受けた実験的治療によって患者をサブグループ化した結果、偽薬治療患者ではメタボロームプロファイルに基づいて反応者と失敗者を区別できる強いモデルが得られ（R2 = 0.622、Q2 = 0.280、P = 0.0008）、FMT治療患者では弱いモデルが得られた（R2 = 0.211、Q2 = 149、P = 0.082）。偽薬治療患者のモデルでは、チロシン（r = 0.67）、ロイシン（r = 0.67）、フェニルアラニン（r = 0.57）が障害と相関していた。このモデルは統計的に有意ではなかったため、FMTモデルにおける代謝物の相関は評価しなかった。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図3
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パワーポイント
キャプション
定義された血漿中代謝物は反応者と失敗者で異なる
血漿中代謝物のスーパーバイズド多変量OPLS-DA解析により、すべての時点の全患者において、試験反応者（n=19）と失敗者（n=12）の有意なモデルが明らかになった（R2 = 0.514; Q2 = 0.121; P = 0.005）。相関係数（r）が0.50以上の各代謝物と主要試験結果との相関を図3Bに示す。患者を介入タイプで層別化すると、モデルは引き続き有意な分離を示した（FMT群： R2=0.766、Q2=0.383、P<0.0001；偽薬群： R2 = 0.790, Q2 = 0.260, P = 0.002）。FMTおよび偽薬モデルのいずれにおいても、血漿グルコース（r = 0.67およびr = 0.63）は不成功と相関し、リジン（r = -0.83およびr = -0.65）は反応性と相関した。

尿中代謝物
監視下のOPLS-DA解析では、尿検体のメタボロームプロファイルにおいて、反応者（n＝19）と失敗者（n＝12）の間に有意差は認められなかった（R2＝0.115、Q2＝-0.274、P＝1）。

FMT後の便中酪酸値の上昇
FMTと偽薬の糞便中代謝物濃度への影響を比較したところ、FMT群では糞便中酪酸濃度が有意に上昇し（P = 0.026）、それは介入後最初の週に最も顕著であった（図4）。FMT群と偽薬群との間の経時的な個々の代謝物レベルの違いを調べた二元配置分散分析の追加結果は、Supplemental ResultsのSupplemental Figure 2に示されている。

詳細は画像に続くキャプションに記載されている。
図4
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パワーポイント
キャプション
特定の糞便代謝産物と主要な二次性関節炎疾患活動性エンドポイントとの関連
多重検定で調整した結果、便中N-アセチル糖タンパク質GlycA（r=0.50；P=0.03）は、すべての時点において全患者（n=31）のHAQ-DIと正の相関を示した。また、26週目のFMT群（n = 15）では、6つの糞便代謝物がACR20レスポンダーであることと有意に関連していた（表2）。これらのACR20との有意な関連は偽薬群では観察されなかった。26週目のSPARCC咬合炎指数と有意な相関を示した代謝物はなかった。

表2. 26週目のFMT群における便中代謝産物とACR20レスポンダーであることの関連性
代謝物係数（95％CI） P値
プロピオン酸 27（4.7～49） 0.02
ロイシン 0.54（0.14～0.94） 0.01
リジン 0.41 (0.17 to 0.64) 0.004
アラニン 0.24 (0.05 to 0.43) 0.02
フマル酸 -0.012（-0.020～-0.0036） 0.01
ヒスチジン -0.015（-0.024～-0.0059） 0.005
Benjamini-Hochberg法を用いて多重検定を補正した結果、P値が0.10を下回った代謝物のみを表に示した。
略語 ACR20、米国リウマチ学会20；CI、信頼区間；FMT、糞便微生物叢移植。
腸管透過性と便中代謝産物との関連
便中ヒポキサンチンは、ベースライン時の全患者においてLMRと正の相関を示した（r = 0.00013、P < 0.0001）。しかし、この関係は26週目には観察されなかった（r = -0.00022、P = 0.42）。

考察
腸内微生物と宿主免疫系との主要な相互作用部位である腸壁は、腸-関節軸の理解を進める鍵を握っていると思われる(20)。いくつかの小規模研究の結果から、強直性脊椎炎患者では腸管透過性が亢進していることが証明されており(2)、最近の研究では、RAでは大腸のタイトジャンクションタンパク質が変化し、腸管透過性の血清バイオマーカーが増加していることが証明されている(1)。また、非アルコール性脂肪性肝疾患患者では、FMTの6週間後に腸管透過性の有意な低下が観察されており(21)、この疾患は乾癬性疾患とリーキーガットを伴う病態である(22)。われわれの研究では、FMTから26週後の小腸透過性に有意な変化は認められなかったが、われわれの知見は、LMR試験によって評価される透過性の亢進が、PsA患者における疾患活動性および/またはTNFiによる治療と関連している可能性を示唆している。

血漿および便中代謝物の多変量OPLS-DA解析は、すべての時点の全患者において、反応者と失敗者を識別するための頑健かつ有意なモデルであった。便中代謝物モデルでは、チロシンとコリンが失敗群の患者のメタボロームプロフィールと相関することが明らかになった。チロシンと不成功との相関は、偽薬治療患者のみを見た場合にも見られた。さらに、チロシンはPsA患者サンプルと健常ドナーサンプルとで有意な相関がみられた。これに伴い、FMT治療患者ではベースラインから4週目までチロシンレベルのわずかな減少が観察されたが（補足図1、補足結果）、偽薬治療患者では観察されなかった。その結果、FMT治療が失敗群のチロシン濃度上昇の原因とは考えられなかった。チロシンは神経伝達物質やカテコールアミンの前駆体として機能する非必須の芳香族AAであり、さらにシグナル伝達タンパク質にも存在する。我々の観察結果は、中等度から高度のPsAの疾患活動性において、チロシン経路が関与している可能性を示唆している。興味深いことに、チロシン分解経路をコードする腸内細菌遺伝子の増加は、IBD関連関節症と関連している(23)。

疾患活動性の不十分な改善と関連したもう1つの便中代謝産物はコリンであった。コリンはエピジェネティックな制御を含む多くの生理学的過程に関与するメチル供与体である。欧米諸国における主なコリン摂取源は動物性食品である。重要なことは、細菌もまたコリンを産生することができるということである。血清コリンとその腸内細菌叢依存性代謝産物であるトリメチルアミンN-オキシドは、炎症性関節炎疾患の進行に関与しており(24)、PsAにおける関節の圧痛や腫脹とも関連している(25)。脳内コリンもまた、RAにおける疲労の重症度と正の相関があるようである(26)。さらに、in vitroおよびin vivoの研究から、RAの線維芽細胞様滑膜細胞では炎症性条件下でコリン代謝が活性化され、コリンキナーゼの選択的阻害が炎症性関節炎に有益であることが示唆されている(27)。これらの観察とは対照的に、血清コリン値はDAS28で定義されるRAの疾患活動性と逆相関し(28)、MTXに対する有益な反応性と関連することが報告されている(29)。

我々の研究では、有益な反応と関連した唯一の糞便代謝物はメチルコハク酸であり、これはヒト細胞にエネルギーを供給するトリカルボン酸サイクルの中間体であった(30)。高脂肪食誘発高コレステロール血症ラットにおいて、バチルス属菌DU-106の補充は、高コレステロール血症の改善と関連したメチルコハク酸の上昇を含む、腸内メタボロームプロファイルの顕著な変化を誘導することが証明されている(31)。このことから、糞便中のメチルコハク酸レベルが高いことは、脂肪酸代謝の正常化を示すマーカーである可能性があり、これは皮膚乾癬におけるMTX治療の有益な効果と関連している(32)。

もう1つの興味深い観察は、糞便中のSCFAである酪酸の時間軌跡プロットが、FMTの最初の数週間以内に短期的に急激な上昇を示したことである。FMT後の同様の代謝効果は、全身性エリテマトーデス患者やメタボリックシンドローム患者でも報告されている(33, 34)。さらに、乾癬からPsAに移行した患者では、そうでない患者と比較して血清酪酸値が低下している(14)。酪酸は食物繊維の腸内微生物発酵に由来し、タイトジャンクションと腸管バリア機能の改善に重要である(35)。また、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することでエピジェネティックな可能性を持ち、制御性T細胞の誘導やIL-17産生の抑制による抗炎症作用も指摘されている(36)。これらの資産と一致して、FMT後の酪酸レベルの上昇は、炎症性腸疾患患者における有益な反応と関連している（37）。

興味深いことに、26週目にFMT群でACR20反応と強い相関がみられたことから、我々はPSAにおいてもう1つの便中SCFAであるプロピオン酸を臨床的に関連する可能性のある代謝物として同定した。プロピオン酸は、腸管平滑筋の収縮促進や宿主防御ペプチドの発現刺激など、ヒトの体内でいくつかの機能を果たしている(38)。RAでは、プロピオン酸は適応免疫細胞に全身的な効果をもたらし、関節炎を起こす滑膜線維芽細胞の機能的表現型を修飾すると考えられている(39)。コラーゲン誘発関節炎マウス（前臨床RAモデル）にプロピオン酸を飲料水に添加すると、骨髄巨核球赤血球前駆細胞集団の頻度が減少することが示されており(40)、炎症性関節炎を抑制する効果があると考えられている(41)。最後に、ある前向き観察研究において、高繊維質の低肉食（SCFA生合成の燃料となる）は、RAにおける生物学的治療への反応確率の向上と関連していた(42)。

本研究では、血漿メタボロームプロファイルの識別力は、試験集団全体、および2つの治療群（FMT対偽薬）それぞれについて同様であった。3つのモデルすべてにおいて、血漿グルコースは失敗と相関し、一方、必須アミノ酸であるリジンは奏効と相関した。これと同様に、RA患者を対象とした最近の研究では、血漿リジンがトシリズマブに対する6ヵ月反応者で有意に上昇したことが報告されている(43)。また、26週目のFMT群では、便中リジンがACR20反応と正の相関を示した。宿主による吸収を伴う腸内細菌叢によるリジンの合成は、この代謝物の重要な供給源となる可能性が示唆されているが、その絶対的な寄与についてはまだ明らかにされていない(44)。タンパク質合成の前駆体としての重要性に加え、リジンはβ-酸化に重要な役割を果たすカルニチンの生合成の前駆体でもある。

MTXとTNFiによる治療は、ともにインスリン感受性の改善と関連している(45, 46)。さらに、試験中に全身性コルチコステロイドによる治療を受けた患者はいなかったので、DMARDsが失敗群で観察された血漿グルコース値上昇の原因であるとは考えられない。それどころか、血漿中のグルコース濃度が高くなると、DMARD治療に対する反応性に悪影響を及ぼすのではないかと推測している。この仮説を支持するものとして、これまでの研究で、RA患者における2型糖尿病の存在はMTXに対する不十分な反応と関連することが報告されている(47)。また、メタボリックシンドロームは、TNFi治療を受けているPsA患者において、最小疾患活動性を達成する確率の低下とも関連している(48)。したがって、血漿グルコースは治療効果のマーカーであり、免疫介在性関節炎におけるMTXや他のDMARDsの効果（の欠如）に直接関与している可能性がある。これと一致するように、血漿GlycAもまた治療失敗と相関することが観察された。この全身性炎症と心代謝リスクの血清学的バイオマーカーは、以前にもRAと乾癬性疾患活動性の両方に関連していた(49)。しかし、便中GlycAとPsAの重症度（HAQ-DI）との相関の可能性を示唆した報告は今回が初めてである。

この研究の限界は、参加者数が限られていることと、LMR検査の場合、実験的介入から追跡調査までの間隔が長かったこと（26週間）である。LMR試験は腸の機能的透過性を評価する最も一般的な方法であるが、そのため、FMTに反応した腸の透過性の短期的な初期変化を見逃した可能性がある。さらに、試験中に報告されていないNSAIDsの使用が、治療失敗群の腸管透過性に影響を与えた可能性を完全に否定することはできない。

便中ヒポキサンチンがベースライン時の小腸透過性（LMR）と有意に関連していたという事実は、この代謝物が以前に腸管バリア機能、腸上皮細胞におけるエネルギー代謝、および腸の炎症と関連していたことから、興味深い所見である（50）。しかし、効果量が小さく、26週目では関連性がみられなかったことから、他の因子が同等かそれ以上に重要である可能性がある。したがって、腸管バリア完全性の内因性および外因性修飾因子を同定することは、今後の研究にとって重要な課題である。

次に、OPLS-DAモデルに含まれる縦断的データは、31人の患者から4つの時点で収集されたサンプルに基づいている。被験者数が限られているため、反復測定について調整することができなかった。OPLS-DAの最も純粋な形は、各患者の1時点/サンプルだけであることは認める。とはいえ、FMT群と偽薬群の両方で各患者に同じ数の時点数を用いたため、バイアスのリスクは低いと考えられる。OPLS-DAによる反復測定を用いた我々のアプローチの利点については、以前に議論されている(51)。

最後に、異なるドナーに由来するFMT製品間で、奏効率が0％から100％まで異なることが観察された。しかし、数が少ないため（4人のドナーとわずか15人の患者）、われわれのドナーを「良い」ドナーと「悪い」ドナーにしっかりと分けることはできなかった。これらを総合すると、免疫介在性関節炎におけるFMTの結果に対するドナーのばらつきの臨床的意味を探り、PsAの疾患経過における腸管透過性動態の臨床的重要性を明らかにし、OPLS-DAモデルから得られた知見を確認するためには、より多くの大規模コホートが必要である。

結論として、小腸透過性の亢進は、末梢性活動性PsA患者の糞便中および血漿中のメタボロームプロファイルと同様に、1回の単回投与によるFMTの安全性と有効性を評価した最初の無作為化試験の主要臨床エンドポイント（失敗vs.レスポンダー）と関連していた。この探索的試験の結果は、PsAと宿主-微生物叢のクロストークとの関係を補強し、PsAにおける微生物叢生態系の回復および／または特定の代謝産物／微生物叢-宿主経路の調節を目的とした治療の可能性を示している。今回の知見の臨床的意義を明らかにするためには、さらなるランダム化比較試験が必要である。

謝辞
すべての患者およびドナーの重要な貢献に感謝する。

著者貢献
すべての著者が論文の草稿作成に関与し、あるいは重要な知的内容について批判的に修正し、すべての著者が最終版を承認した。Miguens BlancoとKragsnaesは本試験の全データにアクセスでき、データの完全性とデータ解析の正確性に責任を負う。

研究の構想とデザイン
Kragsnaes、Miguens Blanco、Marchesi、Ellingsen。

データ収集
Kragsnaes、Horn、Munk、Ellingsen、Miguens Blanco、Marchesi。

データの解析と解釈
Kragsnaes、Miguens Blanco、Mullish、Marchesi、Ellingsen。

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