好中球細胞外トラップと細胞外ヒストンは歯周炎におけるIL-17炎症を増強する
インサイト|2023年08月08日
NETヒストンが歯周炎を悪化させる
ベニゼロス・パパヤノプロス
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著者および論文情報
J Exp Med (2023) 220 (9): e20230783.
https://doi.org/10.1084/jem.20230783
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炎症性歯周炎を誘発する微生物性ディスバイオシス。本号のJEMにおいて、Kimら（2023. J. Exp. Med.https://doi.org/10.1084/jem.20221751）は、好中球細胞外トラップヒストンが、歯周炎における歯肉および骨喪失を促進する病原性Th17炎症を煽る主要なメディエーターであることを実証している。
専門分野：感染症と宿主防御、自然免疫と炎症
歯周炎は、歯肉を退縮させ、歯を支える骨を侵食する病原性炎症によって特徴づけられる、ヒトに広く見られる炎症性疾患である。歯周炎は全身性炎症のリスク上昇と関連しており、粘膜バリアでの炎症が全身性炎症状態と共通のメカニズムを共有していることを示唆している（Irwandiら、2022年）。したがって、歯周炎を促進するメカニズムを理解することは、ヒトの健康にとって重要な知見をもたらすかもしれない。
グラフィック
Venizelos Papayannopoulosからの洞察。
微生物異常は、Th17細胞によって組織化された好中球性炎症を誘発することによって歯周炎を促進する（Moutsopoulosら、2012年）。進行性の症例は、アグレガチバクター・アクチノマイセテムコミタンスやポルフィロモナス・ジンジバリスなど、根絶が困難な特定の細菌による侵襲と関連しており、いくつかの研究では抗生物質の有用性が報告されている（Prakasam et al.） これらの微生物種はマクロファージや樹状細胞由来のサイトカインを誘導し、病原性常在記憶Th17細胞を拡大して好中球を勧誘し、歯肉組織や骨のびらんをもたらす（Dutzanら、2018；Moutsopoulosら、2012）。病原微生物がどのように炎症性Th17応答を駆動するのか、また組織破壊のメカニズムはまだ十分に解明されていない。
好中球などの顆粒球は長い間、炎症の槍の穂先とみなされており、センチネル細胞から与えられた指示を実行し、慢性疾患中に病原体を破壊したり宿主組織を損傷したりする。一貫して、実験的歯周炎における好中球の枯渇は病態を軽減する（Dutzanら、2018年）。しかし最近まで、炎症を形成する好中球の能力は見過ごされてきた。好中球が感染を防御したり、病態を促進したりする能力を考えると、その全体的な寄与を確認することは必ずしも容易ではない。通常、引き金となるものとそれに続く好中球のエフェクター機構とのミスマッチが慢性病態を引き起こす。
好中球は、細胞内で病原体を死滅させるか、NETosisと呼ばれる細胞死プロセスによって好中球細胞外トラップ（NET）と呼ばれる大きな網状構造に付着した抗菌薬を放出することによって病原体と戦う（Papayannopoulos, 2018）。NETは脱縮合したクロマチンと抗菌タンパク質で構成され、細胞内で除去できない真菌、寄生虫、細菌バイオフィルムなどの大型病原体に対して主に展開される（Papayannopoulos, 2018; Thanabalasuriar et al.） NETは細胞外ヒストンの主要な供給源であるため、調節不全のNETosisは有害である可能性がある。ヒストンは細菌や宿主細胞に対して細胞毒性を示すが、亜致死濃度では、IL-1βやIL-6などTh17反応に重要なサイトカインを誘導するために、Toll-like受容体4（TLR4）を介してマクロファージを活性化し、炎症を促進することもある（Silvestre-Roigら、2019；Tsourouktsoglouら、2020）。このメカニズムはアテローム形成に関与しているが、感染時の炎症を増幅することもある（Ioannouら、2022；Tsourouktsoglouら、2020；Warnatschら、2015）。さらに、ヒストンは試験管内でTLR2を介してTh17細胞の分化を促進するが、このメカニズムが免疫防御や疾病にどのように関連するのかについては、さらなる解明が必要である（Wilsonら、2022年）。ヒストン駆動性の炎症は、末梢感染に対しては有益であるが、敗血症や慢性炎症状態では病態や免疫機能障害を促進する（Ioannouら、2022；Tsourouktsoglouら、2020）。先行研究でマウス歯周炎における病原性好中球の役割が証明されたため、Kimら（2023年）は、NETヒストンが歯周炎における微生物異常と17型炎症の間のミッシングリンクを提供するかどうかを調べることに着手した（Kim et al.）
図
歯周炎におけるNETヒストン駆動性炎症のモデル。病原性細菌がNETosisの引き金になっている可能性が高い。NET形成は、TLR2シグナルを介してTh17分化を直接促進するNET関連ヒストンの放出をもたらす。さらにヒストンは、Th17の増殖と生存を促進するサイトカインをマクロファージに誘導する。Th17細胞は上皮に好中球ケモカインのアップレギュレーションを指示し、このケモカインがより多くの好中球をリクルートし、考えられるフィードバックループを介して炎症を増幅させる。持続的な歯周炎の炎症は、NETヒストンや下流のサイトカインを循環中に放出したり、播種して全身に作用する病原性Th17細胞を持続させることによって、血管系に全身的な影響を及ぼす可能性もある。
著者らは、実験的結紮糸誘導性歯周炎（LIP）モデルマウスを用いたRNA配列解析により、歯肉組織における持続的な好中球性炎症プログラムの誘導を初めて確認した。好中球の免疫除去によって骨欠損が3倍減少したことから、好中球が骨破壊に積極的な役割を果たしていることが確認された。次に著者らは、LIPモデルにおけるNETの役割を調べた。歯肉組織をNET特異的抗体で染色したところ、広範なNETの沈着が発見された。さらに、エンドヌクレアーゼDNase Iを全身投与してNETを分解すると、骨欠損が30％減少し、炎症性転写シグネチャーも減少した。NET形成に必要なプロテアーゼである好中球エラスターゼ（NE）を欠損させたマウスや、NE阻害剤を用いたマウスでも同様の結果が得られた（Papayannopoulos, 2018）。プロテインアルギニンデイミナーゼ4（PAD4）を欠損させたマウス、あるいは広範なPAD阻害剤を使用したマウスでも、骨量減少が観察された。PAD4はアルギニン残基をシトルリンに変換することでヒストンの電荷を低下させる。この修飾はNETosis中に特異的に起こり、カルシウムフラックス誘導刺激に応答したクロマチン脱凝集に必要である。PAD4は微生物や損傷由来の刺激に応答するNETosisには不要であるが、TLR4との相互作用を高めることにより、ヒストンの炎症誘発能を増強する（Tsourouktsoglouら、2020）。同様に、NETと会合する好中球細胞表面レセプターであるLy6Gの染色により、PAD4欠損マウスの歯肉組織には、炎症と骨欠損の減少を伴って、非ニトルリン化NETが存在することが確認された。興味深いことに、PAD4欠損は、通常NETが介在する炎症とフィードバックループを介して結合する好中球浸潤を減少させなかった。
ヒストンは主要なシトルリン化NETタンパク質である。そこで著者らは、ヒストンH3およびH4、あるいはシトルリン化ヒストンH3を標的としたブロッキング抗体を用いて、ヒストンの炎症促進作用を直接調べた。ヒストン標的化によって骨欠損が減少し、歯肉組織におけるIL-6とIL-17のmRNAが広範囲に減少した。IL-17は好中球ケモカインを誘導し、生存と増殖のためにマクロファージ由来のIL-1βとIL-6を必要とするTh17細胞のような17型細胞によって産生される。したがって、NETヒストンはマクロファージの活性化とTh17細胞の分化の両方に大きな影響を及ぼしていた。歯肉の17型細胞に対するNETの影響を確認するため、著者らはLIPを負荷したマウスをDNase Iで処理し、IL-17レポーターマウス株を用いてIL-17産生CD45+細胞とCD4+細胞の総量を測定した。NET分解は、CD4+ Th17細胞とその他の17型細胞の両方を減少させた。IL-1βとIL-6の誘導に加えて、ヒストンはTLR2依存的にTh17細胞の分化を直接促進することができる。興味深いことに、IL-1Rは不要であり、IL-6のみがマウスLIPにおけるTh17細胞の膨張に必要である（Dutzan et al.） シトルリン化ヒストンH3遮断抗体で処置したマウスで観察されたIL-6の減少は、NETヒストンがマクロファージに作用することによって間接的に、またTh17細胞の分化を促進することによって直接的に、17型炎症を増強することを示唆している。これらの経路の寄与は、TLR2とTLR4の細胞特異的切除を用いることで、さらに明らかにすることができる。
NETが微生物集団を制御する可能性を考慮し、著者らはNETの分解が口腔微生物群に与える影響も調べた。DNaseI処理によって歯肉の微生物量と多様性は変化しなかったことから、炎症の抑制は細菌の変化によるものではないことが示された。シトルリン化ヒストン、カルバミル化ヒストン、無細胞DNAなどのNET特異的成分は、健常対照群と比較して、重度歯周炎患者の歯肉液および血中血清で上昇した。これらのNETマーカーはまた、健常なドナーおよび患者における疾患の重症度と相関していた。したがって、無菌性炎症性疾患の促進因子として最初に同定された炎症を増幅させる経路は、非無菌性の粘膜炎症および全身性炎症にも広く関連している。
これらの知見は、NETヒストンの調節不全な放出に起因する病原性炎症反応であるが、その結果、傷害の解決にはほとんど役立たず、かえって慢性病態を促進するという構図を描いている。NETの高濃度蓄積は、NET結合プロテアーゼによるケモカインの分解を通じて、抗炎症効果をもたらすこともある（Papayannopoulos, 2018）。マウス痛風モデルでは、NETは早期に炎症を促進し、凝集するにつれて後に炎症を抑制する。この制御段階は歯周炎では観察されなかったが、ヒストンブロッキング実験では、ヒストンの中和がNETプロテアーゼの抗炎症特性に有利にバランスを傾ける可能性がある。
このパラダイムにおける重要な疑問は、歯肉におけるNET形成の引き金となるものは何かということである。これらの病原性メカニズムがNETosisの引き金になるとして、凝集してバイオフィルムを形成するA. actinomycetemcomitansのような特定の病原性細菌種を示す証拠がある（Hirschfeld et al.） バイオフィルムがNETバリアを促進し、病原体が貪食を回避しながら感染を末梢に留めることを可能にする（Thanabalasuriarら、2019年）。したがって、バイオフィルムの形成を抑えることで、抗生物質はNETosisと炎症の抑制に役立つ可能性がある。歯周炎における抗生物質使用の有益性を示した研究もあるが、その有効性は広く受け入れられているわけではない（Prakasam et al.） NETマーカーと疾患の重症度との相関から、病原性微生物が陽性になりやすい重症患者は、抗生物質や抗NET療法から最も恩恵を受けることが示唆される。NETマーカーは、抗生物質治療が有効な重症患者をスクリーニングする貴重なツールとなりうる。軽度および重度の歯周炎患者におけるNETマーカーとマイクロバイオームとの系統的な相関分析により、口腔内ディスバイオシスとNETosisとの関連について重要な洞察が得られる可能性がある。
関連する疑問として、Kimら（2023）は、マウスLIPモデルにおいて、NET分解は歯肉マイクロバイオームを形成しないことを発見した。しかし、NETの影響を受ける病原性細菌がさらに存在する可能性があることから、これは患者の状況を十分に反映していない可能性がある。NETはバイオフィルム形成などの細菌の病原性メカニズムをアップレギュレートするため、患者におけるNET形成の制御またはNETクリアランスの増強は、口腔マイクロバイオームにプラスの影響を与えるという利点がある可能性がある（Thanabalasuriar et al.） しかし、NEやミエロペルオキシダーゼなど、NET形成に必要な好中球抗菌酵素が欠損している個体では、侵攻性歯周炎や口腔真菌症が蔓延していることは注目に値する（Papayannopoulos, 2018; Sørensen et al.） このことは、NET欠損者においても歯周炎が持続する可能性を示唆しており、したがって、NET形成に対する薬理学的干渉が長期化すると、真菌感染のリスクが高まったり、歯周炎が悪化したりする可能性がある。したがって、NETを標的とした介入の結果は、パピヨン・ルフェーヴル症候群に伴う歯周炎がNET欠損に関連するのか、NEのNET非依存的機能に関連するのかによって異なる。このようなシナリオは複雑であるため、特定のNET成分を標的とするヒストンブロッキング抗体による治療が、より有望な抗炎症治療の手段となる可能性が高い。
異常なNET放出は、NETクリアランスの欠損を伴い、歯周炎におけるNET蓄積をさらに悪化させる可能性もある。このようなNETクリアランスの欠損は、DNアーゼ活性が正常レベルを示す、低悪性度炎症の若い健常人に現れる（Aramburuら、2022年）。10年後、これらのドナーは、歯周炎で顕著な心血管疾患（CVD）発症の初期徴候である血管機能障害を示した（D'Aiutoら、2018）。したがって、歯周炎による低悪性度の炎症がNETクリアランスを阻害する可能性、あるいは既存のNETクリアランスの欠陥が歯周炎のリスクを高める可能性はもっともらしい。
歯周炎において、ヒストンが致死的または亜致死的な性質を介して炎症を誘発するかどうかについても推測することができる。1μM以上の濃度では、ヒストンとヌクレオソームは細胞を急速に死滅させる。この細胞毒性は炎症促進作用があり、アテロームの線維性被膜を不安定化させると考えられている（Silvestre-Roigら、2019）。しかしながら、致死的なヒストン濃度は、単球のサイトカイン産生を誘導しない。なぜなら、ヒストンは単球がサイトカインを産生する前に細胞を死滅させるからである（Tsourouktsoglouら、2020）。従って、ヒストン病態の炎症性要素は、亜致死性のヒストンを介したシグナル伝達によって媒介される可能性が高いが、ヒストンの細胞毒性は直接的な組織破壊を引き起こす可能性がある。
これらの研究は、全身性疾患に対してさらなる示唆を与えている。歯周炎とCVDの強い関連性は、疫学的に支持されているだけでなく、歯周炎のデブライドメントが血管機能障害を軽減することから、機能的にも支持されている（D'Aiutoら、2018）。Kimら(2023)の知見は、アテローム性動脈硬化症と歯周炎が共通の基礎病理学的メカニズムを共有していることを明らかにしている。この共通の糸は、歯周炎の治療がCVDの発症にどのように影響するかを説明するのに役立つかもしれないが、正確な分子的関連を理解するためにはさらなる研究が必要である（D'Aiutoら、2018；Irwandiら、2022）。病理学的メカニズムが共有されていることから、歯周炎に有効であることが証明されたヒストンを標的とする治療法は、CVDの予防と治療において治療的価値がある可能性が示唆される。歯周炎の臨床試験は、より簡便で安価に実施できるため、NETを標的とする治療法について、ヒトにおける概念実証のための重要な情報を提供する可能性がある。
参考文献
Aramburu, I.V., et al. 免疫 https://doi.org/10.1016/j.immuni.2022.11.007
D'Aiuto, F., et al. Lancet Diabetes Endocrinol. https://doi.org/10.1016/S2213-8587(18)30038-X
Dutzan, N., et al. Sci. Transl. Med. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat0797
Hirschfeld, J., et al. Int. J. Med. Microbiol. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2015.04.002
Ioannou, M., et al. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-022-32320-1
Irwandi, R.A., et al. Front. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.915081
Kim, T.S., et al. J. Exp. Med. https://doi.org/10.1084/jem.20221751
Moutsopoulos, N.M., et al. J. Autoimmun. https://doi.org/10.1016/j.jaut.2012.03.003
Papayannopoulos, V. 2018. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri.2017.105
Prakasam, A., et al. J. Pharm. Bioallied Sci. https://doi.org/10.4103/0975-7406.100226
Silvestre-Roig, C., et al. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1167-6
Sørensen, O.E., et al. J. Clin. Invest. https://doi.org/10.1172/JCI76009
Thanabalasuriar、A.ほか、2019年。Cell Host Microbe. https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.02.007
Tsourouktsoglou, T.D., et al. Cell Rep. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107602
Warnatsch, A., et al. Science. https://doi.org/10.1126/science.aaa8064
ウィルソン、A.S.ら、2022年。Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-022-28172-4
© 2023 Papayannopoulos
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