RNA配列解析により明らかになったアカラシア患者の食道粘膜における分子的・局所的差異
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公開日：2022年11月30日
RNA配列解析により明らかになったアカラシア患者の食道粘膜における分子的・局所的差異
キャロライン・K・パテル、ピーター・J・カハラス、...マリー＝ピエ・テトロー 著者紹介を表示する
Scientific Reports 12巻 記事番号: 20616 (2022) この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
アカラシアは、遠位食道および下部食道括約筋の腸間膜神経節細胞の機能喪失を特徴とする食道運動障害である。アカラシアの食道粘膜には組織学的変化が報告されており、病態への関与が示唆されています。近年、診断の進歩にもかかわらず、分子レベルでのアカラシアの病態に関する理解は非常に限られており、遺伝子発現プロファイリングは行われていない。我々は、アカラシア14名と健常者8名の食道粘膜について、バルクRNA-シークエンシングを行った。アカラシア被験者の遠位食道粘膜では65個の、近位食道では120個の差次的発現遺伝子（DEGs）が同定された。遺伝子発現解析により、近位食道と遠位食道に共通または排他的な遺伝子が同定され、本疾患の地域差が浮き彫りにされた。サイトカイン応答やウイルス防御に関連するシグナル伝達経路の濃縮が観察された。アカラシア患者38名の粘膜には、対照群12名と比較して、CD45+上皮内白血球の浸潤が増加していた。このトランスクリプトーム研究により、アカラシアで起こる分子的変化に関する新たな知見が得られた。アカラシアの粘膜で観察されたいくつかの遺伝子変化は、食道炎と関連している可能性がある。遠位食道と近位食道のDEGの違いは、アカラシアの地域差をよりよく理解することの重要性を強調している。
はじめに
アカラシアは嚥下障害の一つであり、その発症率は世界で年間10万人に3人程度といわれている1。発症率は低いものの、アカラシアは、仕事の生産性、生活の質、機能状態に影響を与え、患者に大きな影響を及ぼしています2。進行すると、食道本体の拡張が起こり、食道が食物を胃に押し込めなくなるため、未消化の食物や液体が滞留するようになり、アカラシアの患者様は、食道の拡張を自覚します。食道の持続的な拡張と食物の停滞は、嚥下困難、逆流、胸痛、体重減少などの症状を引き起こすだけでなく、扁平上皮癌の発症の可能性が高くなります3,4。
最近のアカラシアの診断ツールの進歩により、この運動障害の病態と臨床症状について新たな知見が得られています。食道遠位部およびLESの腸管神経叢細胞の機能低下がアカラシアの主要な病因と考えられているが、抑制性神経細胞が最初に減少する原因はいまだ不明である5。アカラシアは、マノメトリックパターンにより、3つのタイプに分類される6。I型はアカラシアの古典的な病態であり、食道本体の収縮力が完全に失われた状態である。II型は下部食道括約筋（LES）の弛緩障害と汎食道内圧の上昇に関連する。一般に、I型アカラシアはII型に比べ、病態の進行が遅い。最後に、III型は早発性同時筋痙攣性食道収縮を伴うため、異なる病態を示す可能性がある。残念ながら、アカラシアの治療法はありません。アカラシアの治療は、LESの緊張を緩和し、食道を空にしやすくすることで、異常な生理機能を補正し、症状を改善させるだけである。アカラシアの診断法は進歩しているが、アカラシアの病因となる分子的な変化については、まだ十分に理解されていない。
これまで、アカラシアの病態に関する研究の多くは、筋細胞や腸管神経叢に焦点を当てたものであった。しかし、上皮細胞は内腔環境のセンサーであり7,8,9,10、長期間の食物停滞に反応しうるという証拠が増えつつある。また、上皮細胞は防御反応を実行する中心的な役割を担っている。さらに、上皮は、上皮由来因子の放出を通じて、多くの組織や臓器において平滑筋収縮の重要な制御因子として浮上している11。この概念を裏付けるように、食道の完全連成計算モデルを用いたin-silicoシミュレーションでは、正常な食道輸送機能には高コンプライアントの粘膜が不可欠であることが示唆されている12。アカラシア患者の食道粘膜の組織学的変化として、基底細胞の過形成や食道炎などが報告されているが、これらの研究はすべて組織学的解析に依存しており5,13,14、アカラシアにおけるヒトのトランスクリプトームに関する研究はこれまで報告されていない。そこで、アカラシア患者の食道粘膜に健常者と異なる遺伝子発現プロファイルが存在するかどうかを検討した。
結果
対象者
対照群22名（平均年齢32.6歳（25-48歳）、女性72.7％）、アカラシア患者37名（平均年齢50.3歳（25-82歳）、女性59.4％）が含まれた。対照群はすべて内視鏡検査が正常で、20人はHRMで運動性が正常であった。アカラシアのコホートには、I型アカラシア21人（8/21、38.0％が拡張食道）、II型アカラシア14人（6/14、42.9％が拡張食道）が含まれていた。表 1 に解析別の被験者特性を示す。
表1 登録された患者の臨床的特徴
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トランスクリプトーム解析により、アカラシア患者の近位および遠位食道における遺伝子発現レベルの変化が明らかになった
アカラシア14名と健常対照者8名の食道近位部および遠位部の食道粘膜生検に対してRNA-seqを行い、アカラシアで制御異常のある遺伝子標的を同定した（表1）。これらの被験者の食道近位部と遠位部の生検を別々に処理し、配列決定し、被験者内の領域差が観察されるかどうかを判断した。採取・処理した生検の組織像の例を図1に示す。健康な対照群と比較して、遺伝子発現の差異を測定した。全体として、706の遺伝子が食道遠位部で、1896の遺伝子が食道近位部で有意に変化していた（偽発見率調整p値<0.05）。各サンプルの遺伝子発現プロファイルは、ヒートマップ（図2a、3a）およびボルカノプロット（図2b、3b）を用いて可視化し、比較した。PCAを用いて、対照群とアカラシア患者の類似点と相違点を評価し、それぞれの被験者のセットをグループ化できるかどうかを判断した（図2c、3c）。Fig.2cに示すように、PCAプロットでは、アカラシア患者は食道遠位部に集中し、対照群から分離していることが明らかになった。食道近位部のデータは、各グループ内でばらつきがあるものの、アカラシア患者とコントロールのクラスタリングを示している（Fig.3c）。
図1
図1
RNA配列決定に使用したアカラシアと対照群の組織像。I型（b,e）およびII型（c,f）アカラシアの食道切片のH/E染色により、健常対照者（a,d）と比較して遠位（a-c）および近位（d-f）の食道における組織学的変化が示されている。スケールバー 100 μm。
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図2
図2
アカラシアの遠位食道粘膜の変化を比較した遺伝子発現の差分解析。(a)アカラシアで差次的に発現する遺伝子を示すRNAシーケンス（RNA-seq）発現データのヒートマップ。(b)アカラシアにおける遺伝子発現のlog2倍変化と統計的有意性を示すVolcano plot。(c) RNA-seq遺伝子発現プロファイルの主成分分析。赤＝健常対照、青＝アカラシア。(d) log2 fold changeが0.9、FDR < 0.05に基づくアカラシアにおける差次的発現遺伝子（DEGs）の数。(e）上位のアップレギュレートされたパスウェイのヒートマップが示されている。(f) 下降制御されたパスウェイのヒートマップを示す。
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図3
図3
アカラシアの近位食道粘膜における遺伝子発現の差分解析の比較。(a) アカラシアのDEGをRNA-seq発現データのヒートマップで示す。(b) アカラシアの遺伝子発現のlog2倍変化と統計的有意性を示すVolcano plot。(c) アカラシアのRNA-seq遺伝子発現プロファイルを用いて主成分分析を実施した。赤＝健常対照、青＝アカラシア。(d) 差異的発現遺伝子は、log2 fold changeが0.9、FDR < 0.05に基づき選択された。(e) ヒートマップは、発現量の多いパスウェイを示す。(f) ヒートマップは、上位のダウンレギュレーションされたパスウェイを示す。
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トランスクリプトーム解析により、アカラシア患者と健常対照者で異なる制御を受けるパスウェイが特定された
発現量変化の倍率が0.9倍以上または0.9倍未満を閾値として、対照群とアカラシア患者間で差のある発現遺伝子（DEG）をフィルタリングした結果、遠位食道で65個のDEG（発現量増加31、減少34）（図2d）、近位食道で120個のDEG（発現量増加81、減少39）（図3d）が確認されました。アカラシアから対照と比較して差次的に発現している遺伝子のコンパイルを用いて、Metascape Fig.2e,f, Fig.3e,f) と GSEA (Supplementary Fig. 1, 2) を用いた Gene Set Enrichment Analysis を実施した。アカラシア被験者の遠位食道粘膜は、コントロールと比較して、サイトカイン刺激に対する細胞応答やウイルスに対する防御反応に関連するものを含む7つのパスウェイで遺伝子発現が増加していた（Fig. 2e）。アカラシア患者の遠位食道粘膜では、骨格筋器官の発達、Gα（i）シグナルイベント、ERK1およびERK2カスケードの制御、軸索発達に関連するものを含む6つのパスウェイで、対照群と比較して遺伝子制御が減少していた（Fig. 2f）。一方、アカラシアの近位食道粘膜では、ロイコトリエンD4代謝過程、細胞外マトリックスの分解、NGF刺激転写、上皮分化の負の制御、STATタンパク質のチロシンリン酸化の正の制御、血管新生、Notchシグナル伝達経路など12経路で遺伝子制御が増加していた（Fig. 3e）。最後に、アカラシア患者の近位食道粘膜では、ECM糖タンパク質やマトリソーム関連など4つのパスウェイで遺伝子制御が低下していることが検出された（Fig.3f）。
アカラシア患者の近位食道と遠位食道で遺伝子発現の地域差が観察される
RNA-seq解析の結果、アカラシア患者の遠位食道粘膜と近位食道粘膜ではDEGsの数が異なり（図2d、3d）、それぞれの領域でパスウェイの濃縮に差が見られた（図2e、f、図3e、f）。Fig.4aに示すように、アカラシア患者の遠位食道と近位食道で共通するDEGは23個のみであった。これらの遺伝子のうち13個はアップレギュレートされ（Fig.4b）、10個はダウンレギュレートされていた（Fig.4c）。共通するDEGの例としては、CPA3、MAMDC2、CAPN6が挙げられる。42のDEGがアカラシア患者の遠位食道粘膜にのみ存在した（Fig.4a）。これらのDEGのうち18個はup-regulate（図4b）、24個はdown-regulate（図4c）であった。遠位食道のみで最も有意なDEGは、IL-33、IFNε、LOX、JUNなどであった。一方、アカラシア患者の近位食道粘膜では97の遺伝子が特異的に発現していた（Fig.4a）。このうち68の遺伝子は発現量が増加し（Fig. 4b）、29の遺伝子は発現量が減少していた（Fig. 4c）。この中には、CDH16、HES5、IGFBP3、FGF14の発現量の変化が含まれている。
図4
図4
DEGSの地域差は近位型アカラシアと遠位型アカラシアの被験者に観察される。(a) 拡張アカラシア被験者の近位および遠位食道における総DEGsの重複を示すベン図。(b）アカラシア被験者の近位および遠位食道におけるアップレギュレートされたDEGのオーバーラップを示すベン図。(c）アカラシア被験者の近位食道と遠位食道の間でダウンレギュレートされたDEGのオーバーラップを示すベン図である。
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定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により、アカラシアのDEGを対照群と比較し検証する
RNA-sequencingによって同定されたDEGを検証するために、RNA-seqに用いたコホートとは異なる食道粘膜サンプル（コントロール4名、アカラシア患者23名）に対して定量的PCR（qPCR）を実施した。表1に、登録された被験者の臨床的特徴を示す。RNA-sequencingで同定された遺伝子のうち、qPCRで検証する5つの遺伝子を選択した：マスト細胞特異的プロテアーゼカルボキシペプチダーゼ（CPA3）、サイトカインインターロイキン33（IL-33）、タイプ1インターフェロンファミリーメンバー インターフェロンイプシロン（IFNε）、抗ウイルス応答遺伝子MAMドメイン含有2（MAMDC2）、細胞接着分子カドヘリン16（CHD16）であった。図5aに示すように、アカラシア被験者の遠位粘膜ではCPA3 mRNAの発現レベルがコントロールと比較して有意に上昇していたが、近位食道では上昇していないことがわかった。一方、マスト細胞や2型自然リンパ球などの標的細胞を活性化することで知られるサイトカインIL-33は、アカラシア患者の近位食道粘膜でmRNA発現レベルが有意に上昇していたが、遠位食道ではこの変化は認められなかった（Fig.5b）。また、アカラシア患者では、コントロールと比較して、遠位および近位食道粘膜の両方で、I型インターフェロンIFNεのmRNA発現レベルが強く増加していることが観察された（Fig.5c）。興味深いことに、カドヘリンファミリーの非定型メンバーであるCDH16は、アカラシア被験者の近位および遠位食道粘膜の両方で、コントロールと比較して有意に増加していた（Fig. 5d）。最後に、アカラシア患者の近位食道粘膜では、MAMDC2がコントロールと比較して有意に減少していることが観察されたが、この変化は遠位食道では有意ではなかった（Fig. 5e）。
図5
図5
qPCRを用いて、アカラシアの検証コホートにおけるDEGsのmRNA発現レベルを測定した。(a) CPA3はアカラシア被験者の食道粘膜で遠位食道に濃縮されている。*P < 0.02. (b) IL-33 mRNA発現量は、アカラシア被験者の近位食道で増加している。**P < 0.005. (c) IFNεの増加は、近位および遠位食道アカラシアの両方で認められる。**p < 0.002, ***p < 0.001。(d）アカラシアの近位および遠位食道粘膜は、CDH16に富んでいる。*p < 0.05, ***p < 0.001。(e）アカラシアの近位食道粘膜ではMAMDC2の減少が観察される。*n = 4健常対照と23アカラシア。
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アカラシア患者の食道上皮では上皮内白血球の浸潤が検出される
RNA-seqおよびqPCR解析により、アカラシアにおける炎症および免疫細胞の浸潤に関連する多くの遺伝子に変化が認められました。まず、アカラシアと健常者のヒト食道粘膜生検において、白血球マーカーCD45を検出する免疫蛍光検査を行い、免疫細胞の存在を確認した。Fig. 6に示すように、CD45の免疫染色とスコアリングにより、アカラシア被験者の遠位食道粘膜では、コントロール（Fig. 6a、c）と比較して、上皮内白血球の浸潤が増加していた（Fig. 6b、c）。また、アカラシア患者の近位食道粘膜（Fig. 6e,f）でも、対照群（Fig. 6d,f）と比較して上皮内白血球の動員数が有意に増加していることが観察された。
図6
図6
アカラシアにおける上皮内白血球の浸潤の増加。(a,b,d,e) アカラシア被験者の食道粘膜における白血球マーカーCD45（赤）の代表的免疫蛍光染色（b,e）と健常対照者（a,d）の比較。食道遠位部の結果を(a,b)に、食道近位部の結果を(d,e)に示す。核染色にはDapi（青色）を用いた。スケールバーは 100μm。(c,f) アカラシア患者の遠位食道粘膜（c）および近位食道粘膜（f）におけるCD45+上皮内白血球のスコアリングを健常対照と比較した個別値によるカラムグラフ。**n = 健常者12名、アカラシア38名。
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I型アカラシアとII型アカラシアの食道近位部と遠位部では、遺伝子発現の変化と制御されるパスウェイの違いが観察された。
I型アカラシアは通常、疾患進行の後期であることから、次に、I型またはII型アカラシアと健常対照者の食道近位部および遠位部における遺伝子発現の差異を調べた。Fig.7aに示すように、I型アカラシアの遠位食道では健常対照と比較して501のDEG（240がup-regulate、261がdown-regulate）が同定された。II型アカラシアでは、食道遠位部に144のDEGが存在し、そのうち77のDEGがup-regulate、67のDEGがdown-regulateしていた（図7b）。1型アカラシアの食道近位部では329個のDEGが同定され（up-regulate 209個、down-regulate 120個）（図8a）、1型アカラシアの食道近位部では1個のDEGが同定された（図8b）。一方、II型アカラシアでは食道近位部で294個のDEG（up-regulate 191個、down-regulate 103個）が確認された（Fig.8b）。次に、I型およびII型アカラシアに共通または排他的なDEGの数を決定した。遠位食道では、86のDEGがI型とII型アカラシアで共通していることがわかった（図7c）。また、415のDEGがI型アカラシアにのみ存在した（Fig.7c）。そのうち194のDEGがup-regulate（図7d）、221がdown-regulate（図7e）であった。また、II型無痛症に特異的なDEGを58個見出した（Fig.7c）。この58個の遺伝子のうち、31個がup-regulate（図7d）、27個がdown-regulate（図7e）であった。食道近位部では、156のDEGがI型とII型アカラシアに共通して存在していた（図8c）。そのうち110個がup-regulate（図8d）、46個がdown-regulate（図8e）であった。173のDEGがI型アカラシアにのみ存在した（Fig.8c）。そのうち99個がup-regulate（Fig. 8b）、74個がdown-regulate（Fig. 8e）であった。II型アカラシアのDEGは138個であった（Fig.8c）。81の遺伝子がアップレギュレートされ（図8d）、57の遺伝子がダウンレギュレートされた（図8e）。
図7
図7
I型および/またはII型アカラシアの遠位食道粘膜の変化を対照群と比較した遺伝子発現の差分解析。(a) I型アカラシアと健常対照のlog2 fold change 0.9, FDR < 0.05 に基づく差次発現遺伝子数（DEGs）。(b) II型アカラシアと健常対照との間で、log2 fold changeが0.9、FDR < 0.05に基づいて選択された差次的発現遺伝子群。(c) I型アカラシアとII型アカラシアのDEGsの重複を示すベン図。(d）I型アカラシア被験者とII型アカラシア被験者のアップレギュレートされたDEGのオーバーラップを示すベン図。(e）I型アカラシア被験者とII型アカラシア被験者の間でダウンレギュレートされたDEGの重なりを示すベン図である。(f,g) 各比較対象から得られたDEGを用い、Gene Ontology解析により機能パスウェイの濃縮を確認した。(f) 上位発現パスウェイのヒートマップを示す。(g）上位のダウンレギュレートされたパスウェイのヒートマップが示されている。
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図8
図8
I型および／またはII型アカラシアの食道近位粘膜における遺伝子発現の差異を健常対照と比較した。(a,b) I型アカラシア(a)またはII型アカラシア(b)と健常対照の差分発現遺伝子は、log2 fold change 0.9 and FDR < 0.05 に基づいて選択された。(c-e) I型およびII型アカラシアの被験者のDEGの重複を示すベン図。(c)総DEGを示す。(d)I型とII型アカラシアの間でアップレギュレートされたDEGを示す。(e) I型とII型アカラシアの間でダウンレギュレートされたDEGを示す。(f,g) Metascapeを用いたGene Ontology解析。(f)上位のアップレギュレーションされたパスウェイのヒートマップを示す。(g) 下降制御パスウェイのヒートマップを示す。
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I型アカラシアとII型アカラシアのDEGのリストを用いて、Metascapeを用いたGene Set Enrichment Analysis（図7f、g、8f、g）およびGSEA（補足図3-6）を実施した。Fig.7fに示すように、1型アカラシアの遠位食道では、リンパ球の活性化、細胞接着の制御、平滑筋収縮、免疫反応の正の制御、focal adhesionに関連するパスウェイが濃縮されていた。また、細胞外マトリックス、白血球の繋留やローリング、Wntシグナルの負の制御、白血球の増殖の制御に関連する経路の遺伝子制御が低下していることがわかった（図7g）。II型アカラシアの遠位食道では、中間フィラメント組織と創傷治癒の負の制御に関連する経路での遺伝子制御の増加（図7f）、脂肪細胞分化、NGF刺激転写、システムプロセスの制御などの経路に関連する遺伝子の発現減少（図7g）が観察された。食道近位部で行った解析では、マトリソーム、δNp63経路、I型アカラシアにおけるシグナル伝達受容体活性の正の制御に関連するパスウェイが濃縮されていた（Fig.8f）。また、活性酸素の代謝過程、菌に対する防御反応、マトリソーム関連、PLCβを介した事象に関連する遺伝子の制御が減少していた（Fig.8g）。II型アカラシアでは、ペプチド架橋、有機ヒドロキシ化合物輸送、低分子輸送に関連する遺伝子の発現増加が観察された（Fig.8f）。また、分泌の負の調節、平滑筋収縮、血管新生の調節に関連する経路に関連する遺伝子の調節が減少していることが示された（Fig.8g）。
考察
過去数十年にわたり、トランスクリプトームプロファイリングは、ヒトの疾病で起こる分子変化を特徴づけるために用いられる一般的なアプローチであり、数多くの分子バイオマーカーや新しい治療標的を同定するに至っている。本研究は、アカラシア患者の食道粘膜におけるトランスクリプトーム変化を健常対照群と比較して評価した最初の研究である。アカラシア患者の遠位食道粘膜に65のDEG、近位食道粘膜に120のDEGを同定した。その結果、遠位食道アカラシアの生検において、サイトカイン刺激による細胞応答の明瞭な変化を同定した。これらの知見は、アカラシアの病態生理と炎症との関連についての我々の知見と一致するものである。食道の持続的な膨張は、食物の停滞と残留液体を引き起こし、時には細菌の過剰繁殖を引き起こす。このような状態が長く続くと慢性炎症を引き起こし、食道扁平上皮癌の発症リスクが高まります3,4。さらに、アカラシアの食道粘膜の組織学的研究において、以前から報告されていた食道炎の存在を17,18,19で確認し、それを本研究でも確認した。
炎症関連遺伝子のうち、肥満細胞ペプチダーゼCPA3は、アカラシア患者の粘膜で有意に発現が増加していることが本研究で示された。興味深いことに、これまでの研究で、アカラシア患者のLES筋では、対照群と比較して、有意なマスト細胞の浸潤やその分布の変化、脱顆粒が認められている20,21,22。しかしながら、アカラシア患者のLESにおけるマスト細胞の脱顆粒や浸潤の意義や、LESマスト細胞と比較した場合の上皮内マスト細胞の機能については、今後明らかにする必要がある。しかしながら、このことはアカラシアの病態にマスト細胞が関与している可能性を示唆している。さらに、この考えを裏付けるように、食道上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞で一般的に発現しているアラミンであるサイトカインIL-33の発現が増加していることが観察された23。IL-33は刺激により細胞外に放出され、マスト細胞24、好酸球25、好塩基球26、2型自然リンパ球27を活性化することが知られている。IL-33は炎症によるダメージを感知する役割を担っており、好酸球性食道炎28,29や逆流性食道炎30,31の病態に重要であることが報告されている。本結果は、アカラシアの食道粘膜におけるCPA3+肥満細胞とIL-33の関連を示唆するが、食道近位部でCPA3が有意に増加していないことから、アカラシアでは他の免疫細胞型に対するIL-33の役割も示唆される。
また、Transcriptomic解析により、ウイルスに対する防御反応に関連する遺伝子がアカラシア患者の遠位食道粘膜に濃縮されていることが示された。興味深いことに、アカラシアと腸管神経細胞の破壊とウイルス感染との関連性が示唆されている。アカラシアと関連する可能性のあるウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス（HSV）-1、水痘・帯状疱疹ウイルス（VZV）、麻疹、ムンプス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）32がある。ウイルス反応に関連して発現が増加した遺伝子には、I型インターフェロンファミリーのユニークなメンバーであり、ウイルス感染に対する自然および適応反応に重要な役割を果たすIFNεが含まれていた33。肺粘膜では、IFNεは、機能的/細胞傷害性CD8+CD4+T細胞集団のサブセットの浸潤を誘導した34。アカラシア患者の食道粘膜では、CD4+ T細胞が優勢な免疫細胞集団であることが示されている17,19。IFNεの機能、および食道とアカラシアにおける上皮内白血球の活性化に対するその影響は、まだ明らかにされていない。
重要なことは、アカラシア患者の食道では、近位粘膜と遠位粘膜の間に分子的な不均一性があり、健常者と比較して発現が異なる共有遺伝子はほとんどないことである。アカラシアの病態生理を考えると、この不均一性は理にかなっている。疾患の進行に伴い、アカラシア患者は食道本体の巨大な拡張を起こし、食道粘膜に大きな機械的ストレスがかかるようになる。遠位食道粘膜は重力の結果、食物の滞留にさらされることになる。アカラシアの病因は下部食道括約筋と食道遠位部にあることから、アカラシア患者の食道粘膜の変化を特徴づける研究は、ほとんどが食道遠位部粘膜に焦点をあててきた。しかし、本研究の結果は、近位食道粘膜の別個の解析を含めることで、さらなる知見が得られる可能性を示唆している。
また、本研究では、近位食道と遠位食道の両方で、I型アカラシアとII型アカラシアのトランスクリプトームの違いを実証している。I型アカラシアはII型アカラシアに比べ、食物の停滞と拡張を伴うより進行した病態と考えられていることから6、健常対照と比較した場合、I型アカラシアでII型に比べてより多くのDEGが観察されたことは驚くには当たらない。I型アカラシアにおけるこれらのDEGの変化は、創傷治癒や免疫反応の制御に関連する経路の濃縮とも相関している。さらに、II型アカラシアからI型アカラシアへの遺伝子や経路の漸増は、I型アカラシアがII型アカラシアから進行した疾患であるという概念を分子レベルで強く支持するものであった。これらの結果は、4人のI型アカラシア患者と9人のII型アカラシア患者からなる現在のコホートに基づいており、I型アカラシアからII型アカラシアへの進行において生じる変化を直接明らかにするために、より大規模なコホートでI型とII型アカラシアの分子差を継続して調査する強い支持となるものである。
早期アカラシア患者を対象とした研究の大きな制約の一つは、食道生検の取得であり、その生検はしばしば上皮に限定されることである。さらに、我々は、ほとんどのアカラシア患者において上皮の厚みが増し、その結果、これらの生検の一部では基底細胞層が欠落し、他の生検では一部の固有層が存在することを観察している。このことは、遺伝子発現にばらつきを生じさせる可能性がある。さらに、アカラシアの病因を考えると、同じ患者からの食道粘膜サンプルと並行してLESや筋生検の解析を行うことは、非常に貴重で有益な情報である。残念ながら、アカラシア患者の筋組織の採取は、通常、筋切開手術の際に行われるため、この選択肢は制限されている。バルクRNA配列解析は、I型およびII型アカラシアの食道粘膜における遺伝子発現解析の概要を示すのに有用であるが、それは数千の細胞にわたる平均的な遺伝子発現を反映している。したがって、本疾患における細胞の不均一性が覆い隠される可能性がある。したがって、今後、我々のバルクトランスクリプトームによる知見を単一細胞のトランスクリプトーム解析と組み合わせることで、アカラシアの病態に関するさらなる知見が得られる可能性がある。
結論として、本研究では、I型およびII型アカラシアの食道粘膜において、対照群と比較してトランスクリプトーム上の差異があることを示した。また、アカラシアの遠位食道粘膜と近位食道粘膜の領域差も報告された。
方法
被験者サンプルの収集と処理
Northwestern食道センターで新たに食道運動障害シカゴ分類v4.035に従って1型または2型アカラシアと診断された37名の患者を対象とした。3型アカラシアの痙性収縮はボーラス貯留や括約筋の機能とは独立した独自の生理を持つため、3型アカラシア患者は除外した。また、以前にアカラシアに対して空気拡張術、ヘラー筋切開術、口腔周囲内視鏡的筋切開術（POEM）の治療を受けている患者も除外した。すべてのアカラシア患者に内視鏡検査，HRM，バリウム食道造影，FLIP（Functional Luminal Imaging Probe）パノメトリー検査を実施した．バリウム食道写真で食道幅が5cm以上となった被験者の食道は拡張しているとみなされた。ヒト組織を使用するすべての手順は、Northwestern Institutional Review Board（STU00208111）から承認を受け、すべての方法は関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。すべての被験者/法定代理人からインフォームドコンセントを得た。
健康で無症状の（すなわち、嚥下困難、胸焼け、胸痛を含む食道症状がない）成人ボランティア、「対照者」が登録された。食道疾患、自己免疫疾患、摂食障害の診断歴がある場合は除外された。その他の除外基準としては、制酸剤またはプロトンポンプ阻害剤の使用、肥満度30kg/m2以上、タバコまたはアルコール乱用の既往があった。対照群には内視鏡検査、HRM、FLIPを実施した（既報36,37）。
患者および対照の両方について、食道粘膜生検がDigestive Health Foundation Biorepositoryを通じて鎮静下内視鏡検査中に採取された。生検は食道遠位部と食道近位部から、それぞれ扁平上皮接合部の上5cmと15cmの位置で採取された。組織学および免疫染色研究のために、組織を中性緩衝ホルマリン（Fisher Scientific, Hampton, NH）で24時間固定し、パラフィンに包埋し、4μm切片を正帯電スライドに貼付した。スライドはヘマトキシリンとエオシンで染色し、Nikon DS-Ri2 カメラと NIS Elements ソフトウェアを備えた Nikon Eclipse Ci-E 顕微鏡で画像を取り込んだ。RNA研究のために、組織はRNA laterとAllProtect（Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）で保存し、RNA抽出まで-80℃で保存した。
RNAの単離と定量PCR
食道粘膜生検は、RLT溶解バッファー（Qiagen）中でRNA抽出前にホモジナイズした。RNeasyキット（Qiagen, Germantown, MD）を用いて、製造者の説明書に従って全RNAを抽出した。逆転写には、Maxima First-Strand complementary DNA Synthesis for Reverse-Transcription quantitative PCR kit（Thermo Fisher Scientific）を使用した。定量的リアルタイムPCRは、TaqMan Universal Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。TATA box binding protein または GAPDH 遺伝子を内部コントロールとして使用した。
バルクRNA配列決定
cDNAライブラリーは、Tru-Seq Stranded mRNA-seq library prep (Illumina, San Diego, CA)を用いて、製造者の指示に従って作成した。配列決定は、Illumina HiSeq 4000（Northwestern University NuSeq Core Facility）を用いて行った。fastq形式のDNAリードの品質は、FastQCを使用して評価した。Adaptersをトリミングし、品質の悪いリードやrRNA配列にアライメントしているリードをフィルターにかけた。クリーニングされたリードは、STAR38を用いてHomo sapiens genome (hg38)にアラインメントされた。UCSC (University of California Santa Cruz; http://genome.ucsc.edu)から入手したhg38の遺伝子アノテーションファイルと合わせて、HTSeq-count39を用いて各遺伝子のリードカウントを計算した。正規化および発現差の判定にはDESeq2を用いた40。有意に差のある発現遺伝子を決定するためのカットオフは、FDR調整したp値が0.05未満であった。RNA-seqはGene Expression Omnibus (GEO #201699)に寄託され、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE201699 でアクセスすることができる。多変量主成分分析（PCA）は、データの次元を減らし、クラスタリングを評価するために、データセット全体に対して実施された。遺伝子オントロジー（GO）用語は、Metascapeオンラインプラットフォーム（http://metascape.org）41およびGSEA（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）42,43を使用して同定された。
免疫組織化学および免疫蛍光法
パラフィン包埋食道切片に対して熱抗原賦活（2100 Antigen Retriever, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA）を行い、スライドを以下の抗体とインキュベートした。1:500 ウサギ抗CD45 (AB10558, Abcam, Cambridge, MA), 1:500 ウサギ抗CPA3 (HPA008689, Sigma). 種特異的二次抗体を添加し、検出は既報の通り行った44。蛍光標識には Alexa Fluor™ 488 (#A32814, Thermo Fisher Scientific) を使用した．核染色にはDapiを用いた。CD45染色は、(1) 0から4のスケールで陽性細胞によって覆われた表面積パーセント（0 = なし、1 = 1-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 76-100%）と(2) 1から4のスケールで上皮内の陽性細胞の局在（1 = 乳頭の周りに局在、2 = 乳頭からわずかに離れた所、3 = 乳頭から離れて上皮の別の場所、4 = 上皮全体）に基づいてスコア付けされた。CPA3の採点は、高倍率視野あたりの陽性細胞数を数えることにより行った。採点は盲検化された2人の研究者によって行われた。画像はNikon Eclipse Ci-E 顕微鏡にNikon DS-Ri2 カメラとNIS Elements ソフトウェアを装着して撮影した。
統計解析
結果は平均値±SEMで表し、実験条件間の正規化値で行った統計的差は95％の信頼度で確定した。群間の統計的差異を示すためにWelchのt-testを使用した。すべての統計は、Graph Pad Prism version 9.2.0 (Graph Pad software, San Diego, CA)を用いて行った。
データの利用可能性
RNA-seqはGene Expression Omnibus (GEO #201699)に寄託され、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE201699 でアクセスすることができる。
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資金提供
この研究は、以下の支援を受けています。NIH NIDDK P01 117824 to MPT, PJK and JEP; NIH MIGMS T32 GM008061 to NBH; Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center (NIH NCI CCSG P30 CA060553) through the Northwestern University Pathology Core and Facility and the NU-Seq Core Facilityから支援を受けています。
著者情報
著者および所属
Northwestern University Feinberg School of Medicine, M-336 McGaw Building, 240 East Huron, Chicago, IL, 60611-3010, USA 消化器・肝臓内科部門
Caroline K. Patel, Peter J. Kahrilas, Nathan B. Hodge, Lia E. Tsikretsis, Dustin A. Carlson, John E. Pandolfino & Marie-Pier Tétreault
寄稿
C.K.P.とM.P.T.は、データの収集、分析、解釈および報告書の執筆に携わった。N.B.H.とL.E.T.は、データの収集、分析、解釈に携わった。P.J.K., D.A.C., J.E.P.は研究デザインと報告書作成に携わった。N.B.H.は、データの収集、分析、解釈に関与した。C.K.P.、P.J.K.、N.B.H.、L.E.T.、D.A.C、 J.E.P. および M.P.T. は提出した最終原稿を承認しています。
共著者
Marie-Pier Tétreaultに連絡すること。
倫理的宣言
競合する利益
JEP、PJK、Northwestern Universityは、FLIPパノメトリーシステム、方法、装置に関する知的財産権および所有権をMedtronic Inc.と共有している。DAC: Medtronic (講演、コンサルティング). PJK: Ironwood (コンサルティング); Reckitt (コンサルティング), Johnson & Johnson (コンサルティング), Astra Zeneca (コンサルティン グ). JEP: Endogastric Solutions（コンサルティング、講演）、Ironwood（助成、コンサルティング）、Sandhill Scientific（コンサルティング、講演）、武田薬品（講演）、Astra Zeneca（講演）、Medtronic（講演。 コンサルテーション、アドバイザリーボード、ライセンス付きIP-Patent）、Torax/Ethicon（講演、コンサルティング）。CKP, NBH, LET, MPT: 開示するものはない。
追加情報
出版社からのコメント
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この記事の引用
Patel, C.K., Kahrilas, P.J., Hodge, N.B. et al. RNA-sequencing reveals molecular and regional differences in the esophageal mucosa of achalasia patients.（RNA配列決定によりアカラシア患者の食道粘膜の分子的・地域的差異が明らかになった）。Sci Rep 12, 20616 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-25103-7。
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受付終了
2022年6月11日
受理済
2022年11月24日
公開日
2022年11月30日発行
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