オルガノイド移植はL-リンゴ酸を介したM2マクロファージ分極化によりマウスの腸管虚血再灌流障害を抑制する

2023年10月26日 10:18

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掲載：2023年10月25日
オルガノイド移植はL-リンゴ酸を介したM2マクロファージ分極化によりマウスの腸管虚血再灌流障害を抑制する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-42502-0

張芳玲, 胡振, ...劉克宣著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：6779（2023）この記事を引用する

メトリクス詳細

要旨
腸管オルガノイド移植は、粘膜損傷に対する有望な治療法である。しかし、移植されたオルガノイドがレシピエントマウスの免疫微小環境をどのように制御しているのか、また、腸管虚血再灌流（I/R）傷害の治療においてどのような役割を担っているのかは不明である。ここで我々は、腸管オルガノイドを腸管虚血再灌流障害マウスに移植する方法を確立した。その結果、移植によりマウスの生存率が改善し、腸管幹細胞の自己再生が促進され、抗炎症性M2表現型に偏極したマクロファージの能力増強に依存して、腸管I/R後の免疫微小環境が制御されることを見出した。具体的には、L-リンゴ酸（MA）が、移植マウスのオルガノイド由来条件培地および糞便内容物に高発現・濃縮されていることを報告し、オルガノイドが生着中にMAを分泌することを実証した。in vivoおよびin vitroの実験から、MAがSOCS2依存的にM2マクロファージ分極を誘導し、インターロイキン-10レベルを回復させることが示された。本研究は、腸管I/R傷害に対する治療戦略を提供するものである。

はじめに
消化と多量栄養素の吸収における小腸の役割は十分に確立されており、正常な小腸機能が生存に必須であることを示している。腸管虚血/再灌流（I/R）傷害は、粘膜上皮の大規模な壊死と絨毛および陰窩の消失を引き起こす一般的な臨床病態生理学的過程である。その結果、腸管バリア機能障害を引き起こし、有害な合併症を引き起こし、死亡率は50-90％に達する1,2。腸管I/R障害は、急性・慢性腸閉塞、急性腸間膜虚血、心肺バイパス、腹部大動脈瘤手術、小腸移植、新生児壊死性腸炎などで起こる3。腸管I/R傷害を予防する試みとして、ラクトバチルス・ムリヌス菌とその代謝産物による治療4、虚血プレコンディショニング5など、いくつかの生物学的および外科的予防アプローチが開発されてきた。しかし、重度の小腸粘膜潰瘍を治療し、虚血後の粘膜修復を促進する新たな治療戦略が必要とされている。

オルガノイドは自己組織化幹細胞から誘導され、生体内の生理的構造、機能、遺伝的シグネチャーを元の組織と同じように維持する6。そのためオルガノイド技術は、幹細胞生物学、がん、生化学、分子生物学を理解するために急速に応用されている7。これまでの幹細胞を用いた治療法には、転写異常や移植時の生存率の低さなどの限界があった8。近年、オルガノイドが移植の有力な候補として浮上してきた。例えば、膵島オルガノイドを移植すると、インスリンを分泌する機能が維持され、マウスの糖尿病が回復する9。さらに、回腸由来のオルガノイドを大腸に異種移植すると、本来のコレステロール吸収機能が回復し、機能的な小腸結腸が形成された10。腸管オルガノイドは、腸粘膜傷害に対する新たな治療オプションと考えられている。げっ歯類の大腸オルガノイドや小腸陰窩由来のオルガノイドは、同種の大腸潰瘍モデルの治療に用いられてきた11,12。ヒト小腸13、大腸組織14、多能性幹細胞15由来のオルガノイドは、マウスに移植後、健康な粘膜上皮細胞の増殖、修復、再構築を誘導した。このことは、小腸オルガノイドを傷害粘膜に移植することが、粘膜傷害とその合併症の治療に有望なアプローチであることを示している。しかしながら、小腸臓器移植がI/R誘発腸管傷害を軽減する新たな治療法として利用できるかどうかはまだ研究されておらず、その具体的な基礎メカニズムは不明である。

腸管粘膜の免疫微小環境は、腸管幹細胞（ISC）16,17の増殖や腸管上皮傷害の修復に重要な役割を果たしている18。サイトカイン、成長因子、ケモカイン、その他多くのメディエーターを含む免疫エフェクターが、腸粘膜傷害の回復に関与している19。数種類の免疫細胞が免疫微小環境を構成しているが、中でもマクロファージが優勢である20。マクロファージは機能的にM2様表現型に偏向し、抗炎症性表現型20として機能するだけでなく、ISCの自己再生を積極的にサポートする21。細胞から産生される様々な代謝産物が、マクロファージの極性化を制御している22。一方、腸管オルガノイドは、様々な陰イオン、体液23、タンパク質24、ホルモン24、細胞外小胞25の産生に寄与している。さらに、免疫系のモデル化における細胞治療の潜在的効果も広く報告されている26,27。しかしながら、オルガノイドが代謝因子を分泌してマクロファージを極性化し、免疫微小環境を制御することによって、腸管傷害を軽減する役割を果たすかどうかは、依然として不明である。

ここでは、腸管I/R傷害におけるマウス小腸オルガノイドの効率的なin vivo生着モデルを開発し、粘膜傷害の回復促進におけるオルガノイド移植の可能性を検討した。さらに、移植されたオルガノイドが、腸管幹細胞（ISC）の自己複製を制御し、レシピエントマウスの免疫微小環境を制御することにより、保護的役割を果たすかどうかを検討した。さらに、マウスの腸管I/R傷害モデルを用いて、その基礎となるメカニズムを探った。

結果
臓器移植は腸管I/R障害を軽減する
移植されたオルガノイドが腸のホメオスタシスを制御し、腸傷害の回復を促進するかどうかを調べるため、野生型（WT）マウスに腸I/R傷害を誘発した。まず、腸炎症のさまざまな段階におけるオルガノイド移植の効果を調べるため、マウスを50分間の虚血にかけた後、オルガノイドまたはコントロール溶液を移植し、指示した時点で犠牲にした（図1A）。次に、腸管I/R損傷から7日後のマウスの生存率に対するオルガノイドの生着効果を評価した。オルガノイドの移植は、対照群と比較して死亡率を有意に減少させた（図1B）。さらに、免疫蛍光法により、Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2から増殖したオルガノイドが傷害を受けた上皮粘膜に接着し、取り込まれていることを確認した（図1C）。注目すべきことに、この結果は、腸管I/R損傷から36時間後に、単離されたばかりの陰窩や選別されたロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体5（Lgr5）＋幹細胞よりも、培養されたオルガノイドの方が生着率が高いという先行研究11と一致している（補足図1A-D）。移植群と比較すると、対照群では48時間前のさまざまな時点で、顕著な上皮壊死、粘膜絨毛の破壊、潰瘍を伴う、よりひどい粘膜損傷を示した（補足図2A）。小腸に潰瘍が散在し、移植群、対照群ともに術後6時間で陰窩の約半分が消失した（図1D）。注目すべきことに、移植群の陰窩の深さは術後36時間後に対照群のそれを有意に上回った（図1D）。このことは、オルガノイド移植後にレシピエントの腸陰窩がうまく再構成されたことを示唆している。36時間後の病理学的スコアも、移植群は対照群より有意に低かった（図1E）。次に、腸の完全性を評価するために、OccludinとZO-1のレベルを評価したところ、OccludinとZO-1のタンパク質レベルとmRNAレベルの両方が、移植群で対照群よりも高かった（補足図2B-E）。

図1：腸虚血再灌流（I/R）におけるオルガノイド移植の治療効果。
図1
A 腸管虚血再灌流とオルガノイド移植の誘導プロトコルの模式図。B 腸管I/R誘導後の臓器移植マウスとコントロールマウスのカプランマイヤー生存曲線（n = 17匹/群）。両側log-rank検定で有意p = 0.0277を表す。C I/R障害36時間後の小腸におけるオルガノイド生着の代表的画像。D 腸陰窩の深さの統計的解析。各群で各マウスから5つの異なるフィールドを得た（オルガノイドを移植した偽群、6時間後の対照群、36時間後の移植群はn=4匹、それ以外の群はn=5匹）。両側student's t testを用いて有意p = 0.0198を表す。E 指示された時点における病理学的スコアの定量化（オルガノイドを移植した偽群、6時間後の対照群、36時間後の移植群はn=4匹、それ以外の群はn=5匹）。有意p = 0.0023（両側studentのt検定による）。IL-10のタンパク質濃度（F）およびmRNAレベル（G）（オルガノイドを移植した偽グループ、6時間後のコントロールグループおよび36時間後の移植グループのn = 4マウス、その他のグループのn = 5マウス）。(F)では両側student's t testを用いて有意なp = 0.0109を表し、(G)では両側student's t testを用いて有意なp = 0.0199を表す。H血清中のIL-6、IL-1βおよびTNF-αタンパク質濃度の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）分析（オルガノイドを移植した偽群、6時間後の対照群および36時間後の移植群はn＝4匹、それ以外の群はn＝5匹）両側学生のt検定を用いて有意なp値を表す、IL-6：0.0016；IL-1β：0.039： 0.039. I Ki-67およびリゾチーム染色後の腸陰窩の免疫蛍光像。Ki-67+増殖細胞(J)とlyz1+パネス細胞(K)の定量（オルガノイドを移植した偽群、6時間後のコントロール群、36時間後の移植群はn=4匹、それ以外の群はn=5匹）。Ki-67+増殖細胞：両側Mann-Whitney検定で有意*p値=0.0159を表し、両側student's t検定で有意p値=0.0019を表す。Lyz1+パネス細胞：両側学生のt検定で有意な*p値=0.0181を表す。各群で各マウスから25個の異なる陰窩を得た。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）による腸組織のKi-67（L）およびリゾチーム（M）mRNA発現解析（オルガノイドを移植した偽グループ、6時間後のコントロールグループおよび36時間後の移植グループはn＝4匹、それ以外のグループはn＝5匹）。左から右へ、両側Student'sを用いて有意なp値を表し、Ki-67：0.0249, 0.0365、リゾチーム：0.0103, 0.0019。統計学的検定としては、両側log-rank検定、両側student's t検定、Mann-Whitney検定が採用された。*p < 0.05、**p < 0.01。スケールバー、(C)では100μm、(I)では50μm。各ドットは1匹のマウスのデータを表す（[D]、[G]、[J-M]）。棒グラフは平均±標準偏差（SD）を表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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炎症性サイトカインレベルはI/R傷害後に劇的に変動した。特に、インターロイキン-10（IL-10）の分泌は経時的に逆の傾向を示した。移植群のIL-10発現は術後36時間で有意に増加したが、対照群のそれは術後48時間ではほとんど変化を示さなかった（図1F、G）。移植群では、インターロイキン-6（IL-6）とインターロイキン-1β（IL-1β）の両方の産生が、対照群に比べて36時間後に減少した（図1H）。これらのデータは、臓器移植がI/R傷害後の腸の炎症を抑制することを示していた。

さらに、移植したオルガノイドの再生促進能を評価するために、オルガノイドを移植したマウスでは、24時間後と36時間後にKi-67+増殖細胞が対照群に比べて有意に増加していることがわかった（図1I, J）。さらに、移植マウスの小腸陰窩では、36時間後にリゾチーム＋パネス細胞、オルファクトメジン4（OLFM4）＋幹細胞、Muc2＋杯細胞が、対照マウスのそれと比べて有意に増加していた（図1I、K、および補足図2F、G）。Ki-67とリゾチームの相対mRNA量は、移植群では36時間後に対照群に比べて劇的に増加していた（図1L, M）。これらの結果は、オルガノイド移植がISCの自己再生を促進することを示している。

ミエロイドランドスケープはオルガノイド移植療法に必須である
われわれはさらに、腸管I/R傷害中および傷害後の局所粘膜免疫微小環境に対するオルガノイド移植の効果を調べた。最初に、好中球と単球の大量浸潤が6時間で検出されたが、マクロファージは12時間で劇的に増加した（図2A）。好中球、単球、マクロファージの割合は、24時間までは移植群と対照群の虚血粘膜で同程度に増加したが、36時間では移植マウスと比較して対照群でより顕著に増加した。興味深いことに、T細胞レベルは移植群、対照群ともに、I/R傷害の初期にわずかに低下し、その後12時間後には回復したが、有意差は認められなかった（図2A）。これらのデータは、臓器移植が腸管I/R損傷後の免疫微小環境を標的とした保護効果を徐々に発揮することを示している。

図2：細胞治療にはミエロイド・ランドスケープが不可欠である。
図2
A 小腸固有層（LP）における好中球（CD45+CD11b+Ly6G+）、単球（CD45+CD11b+Ly6C+）、マクロファージ（CD45+CD11b+F4/80+）、T細胞（CD45+CD11b-CD3+）のフローサイトメトリー解析（n = 5マウス、偽マウス群、オルガノイド移植群）、 6時間後のコントロール群、6時間後の移植群、12時間後のコントロール群、48時間後の移植群、12時間後の移植群と48時間後のコントロール群はn＝6匹、その他の群はn＝4匹）。好中球：左から右へ、Studentの両側検定による有意なp値：0.0270、0.0293、0.0406；単球：6時間後、Studentの両側検定による有意なp値=0.0191、Mannの両側検定による有意なp値=0.0173。単球：6時間後では両側Mann-Whitney検定で有意なp値=0.0191、36時間後では両側Student's t検定で有意なp値=0.0345、マクロファージ：両側Student's t検定で有意なp値=0.0297を表す。B 腸管I/Rおよび移植36時間後、オルガノイド移植マウスおよびコントロールマウスにおける生きたCD45+CD11b+小腸LP細胞によるLy6CおよびMHCIIの発現。C オルガノイド移植マウスから採取した標記細胞サブセットにおけるCX3CR1およびCD206の発現。D 異なる群の小腸のCD45+CD11b+細胞におけるLy6C+MHCII-、Ly6C+MHCII+およびLy6C-MHCII+サブセットの頻度（n = 6マウス/群）。Ly6C+MHCII-細胞：両側Mann-Whitney検定を用いて有意なp値=0.0022を表す；Ly6C+MHCII+細胞：両側Student's t検定を用いて有意なp値=0.0008を表す；Ly6C-MHCII+細胞：両側Student's t検定を用いて有意なp値=0.0084を表す。E 腸管I/R損傷後36時間の小腸LPにおけるCD206+細胞の代表的フローサイトメトリー解析。F CD206+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（n = 6 mouse/group）。両側student's t testを用いて有意なp値<0.0001を表す。G CD206発現の代表的ヒストグラム。H 腸管I/R損傷36時間後の小腸LPにおけるCD206平均蛍光強度（MFI）の定量（n = 6 mice/群）。有意なp値=0.0001を両側student's t testで表す。I F4/80+マクロファージにおけるCD206 mRNAのqRT-PCR解析（n = 6 mice/group）。有意なp値=0.0008を両側student's t testで表す。J IL-10+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（n = 6 mice/group）。両側Mann-Whitney検定を用いて有意なp値=0.0022を表す。K IL-10発現の代表的ヒストグラム。L 腸管I/R損傷後36時間の小腸LPにおけるIL-10 MFIの定量（n = 6 mice/群）。両側Mann-Whitney検定を用いて有意なp値=0.0022を表す。M F4/80+マクロファージにおけるIL-10 mRNA発現のqRT-PCR解析（n = 6 mice/group）。両側Mann-Whitney検定を用いて有意な**p値=0.0022を表す。統計学的検定としては、両側スチューデントのt検定およびMann-Whitney検定を用いた。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。各点は1匹のマウスのデータ（[A]、[D]、[F]、[H-J]、[L, M]）。棒グラフは平均±SDを表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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単球とマクロファージの変化は協調的であることを考慮して、術後36時間後に腸組織に存在する単球サブセットとマクロファージの機能を評価した。単球はその表現型を徐々に変化させ、組織常在マクロファージへの成熟のさまざまな段階を反映している28,29,30。われわれは、腸管固有層（LP）における単球のマクロファージへの採用と分化の過程で、3つのサブセットを同定した（図2B）。オルガノイド移植群では、細胞がLy6C+MHCII-炎症性単球からLy6C-MHCII+マクロファージへと発達するにつれて、CX3CR1とCD206の発現が徐々に増加した（図2C）。これと一致して、移植群における炎症性Ly6C+MHCII-単球の割合は、対照群よりも有意に低かった。オルガノイド移植マウスでは、Ly6C+MHCII+細胞およびLy6C-MHCII+細胞を含む単球由来マクロファージが、コントロールマウスと比較して有意に増加していた（図2D）。さらに腸管マクロファージ（F4/80+）サブセットを解析したところ、オルガノイド移植群ではCD206+ M2様マクロファージの相対数およびタンパク質発現が対照群に比べて有意に増加していた（図2E-H）。移植マウスのLPから単離された成熟マクロファージも、CD206（図2I）とIL-10（図2M）のmRNA発現が、傷害の36時間後に対照マウスのものと比べて増加していた。移植群のマクロファージは対照群に比べてIL-10レベルが高く、これが傷害を受けた腸の組織回復促進に寄与したと考えられる（図2J-L）。これらの結果から、臓器移植は単球の動員を減少させ、マクロファージのM2様表現型への分極を促進することが明らかになった。

臓器移植はマクロファージを介して腸のI/R障害を軽減する
組織マクロファージと移植されたオルガノイドの機能的関係を調べるため、クロドロネートリポソームを3回腹腔内注射することにより、腸管I/Rモデル化の前に腸管マクロファージを欠失させた（図3A）。病理学的解析によると、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）リポソーム処理移植群の組織損傷は、PBSリポソーム処理対照群と比較して改善されていた。しかし、クロドロネートリポソーム処理は、PBSリポソーム処理移植群と比較して、移植群の病理学的スコア（図3B）と炎症性サイトカインレベル（図3C）を逆転させた。マクロファージの枯渇は、クロドロネートリポソーム処理移植群とコントロール群の両方でIL-10を産生することができなかった（図3C）。さらに、クロドロネートリポソーム処理によって、移植群と対照群では上皮バリアが劇的に破壊された（図3D-F）。これらの結果は、マクロファージが腸管I/R障害における臓器移植の治療効果に不可欠であることを示している。さらに、クロドロネートリポソームの投与は、移植マウスのLy6C+MHCII+マクロファージおよびLy6C-MHCII+マクロファージの生成能力を低下させ（図3G、H）、M2様マクロファージのレベルも低下させた（図3I-K）。これらの結果を総合すると、オルガノイド移植の効果はLPマクロファージに大きく依存していることが示された。

図3：マクロファージは細胞治療に不可欠である。
図3
A 腸管I/R損傷および移植の36時間後に、クロドロネートリポソームまたはPBSリポソームで処理したマウスのF4/80+CD45+CD11b+細胞について、フローサイトメトリーを用いてLPマクロファージを解析した。マクロファージ集団の代表的な画像と定量化（n = 5 mouse/group）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0079（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS＋Lipo vs Clodronate＋Lipo）。B 腸管I/R誘導36時間後のマウス小腸組織のヘマトキシリン・エオジン（H & E）染色と小腸病理スコアの定量（n = 5匹/群）。二元配置分散分析(ANOVA)およびTukey検定を用いて有意なp値を示す。0.0326（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0036（Org trans、PBS＋Lipo vs Clodronate＋Lipo）。C腸管I/Rおよび移植36時間後のマウスにおけるIL-6およびIL-1β、IL-10産生のELISA検出（n = 5 mice/群）。IL-6については両側Mann-Whitney検定を用いて有意なp値を表す。0.0079（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS＋Lipo vs クロドロネート＋Lipo）。IL-1βについては、二元配置分散分析にTukey検定を適用して有意なp値を表す。0.0334（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0021（Org trans、PBS＋Lipo vs Clodronate＋Lipo）。IL-10の両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0079（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS＋Lipo vs クロドロネート＋Lipo）。D 36時間腸管I/Rおよび移植を行ったマウスの小腸組織におけるOccludinおよびZO-1 mRNAのqRT-PCR解析（n＝5マウス/群）。OccludinとZO-1については、二元配置分散分析にTukey検定を加えて有意なp値を表す。Occludinについては、0.0011（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0004（Org trans、PBS＋Lipo vs Clodronate＋Lipo）。ZO-1については、＜0.0001（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、＜0.0001（Org trans、PBS＋Lipo vs Clodronate＋Lipo）。E オクルディン染色の代表的な免疫組織化学的画像とオクルディン染色領域の定量化（n = 5 mice/群）。二元配置ANOVAとTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0255（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0042（Org trans、PBS＋Lipo vs クロドロネート＋Lipo）。F ZO-1の代表的な免疫組織化学像とZO-1染色領域の定量化（n = 5 mice/群）。二元配置ANOVAとTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0040（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0022（Org trans、PBS＋Lipo vs Clodronate＋Lipo）。G 腸管I/Rおよび移植36時間後のマウスにおける生きたCD45+CD11b+小腸LP細胞によるLy6CおよびMHCIIの発現。H 異なる群の小腸のCD45+CD11b+細胞におけるLy6C+MHCII-、Ly6C+MHCII+、およびLy6C-MHCII+サブセットの頻度（n = 5 mice/群）。Ly6C+MHCII-、Ly6C+MHCII+、Ly6C-MHCII+細胞について、両側Mann-Whitney検定を用いて有意なp値を表す。Ly6C+MHCII-細胞については、0.0079（PBS+Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS+Lipo vs クロドロネート+Lipo）。Ly6C+MHCII+細胞については、0.0079（Org trans、PBS+Lipo vs クロドロネート+Lipo）。Ly6C-MHCII+細胞については、0.0159（PBS+Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS+Lipo vs Clodronate + Lipo）。I CD206+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（n = 5 mice/群）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0159（PBS + Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS + Lipo vs Clodronate + Lipo）。J CD206発現の代表的ヒストグラム。K 腸I/R損傷36時間後の小腸LPにおけるCD206 MFIの定量（n = 5 mice/群）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0079（PBS＋Lipo、Ctrl vs Org trans）、0.0079（Org trans、PBS＋Lipo vs クロドロネート＋Lipo）。スケールバー、100μm。採用した統計学的検定：二元配置分散分析（ANOVA）、多重比較のためのTukey検定、およびMann-Whitney検定。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。各ドットは1匹のマウスのデータ（[A-F]、[H, I]、[K]）。棒グラフは平均±SDを表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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オルガノイドから分泌されるL-リンゴ酸（MA）はマクロファージの分極を調節する
腸管I/R傷害における36時間の移植オルガノイドの治療効果が有意であったことを考えると、オルガノイドはまだ新しいニッチを形成して絨毛を生成していない。以前の研究で、前立腺オルガノイドはクエン酸を産生することで男性の生殖能力を維持することが報告されている31。オルガノイドが分泌機構を利用してマクロファージの分極化に影響を及ぼしているかどうかを調べるため、コンディショナー培地を用いた実験を行った（図4A）。オルガノイド培養液からコンディショニング・メディアを分離したところ、オルガノイド由来のコンディショニング・メディア共培養系では、骨髄由来マクロファージ（BMDM）のIL-10分泌が、対照群に比べて増加することがわかった（図4B）。BMDMsのフローサイトメトリー解析と免疫蛍光法により、CD206の発現にも同様の変化が観察された（図4C、D）。さらに、オルガノイド由来調整培地とBMDMsを共培養すると、アルギナーゼ1（Arg1）、CD206、Ym1/2、IL-10などのM2マーカー遺伝子の発現上昇が誘導されたが、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、CD86、IL-1βなどのM1様表現型に関連する遺伝子には、コントロール培地とBMDMsを共培養した場合と差が見られなかった（図4E）。

図4：オルガノイド由来MAはマクロファージの極性を制御する。
図4
A 実験セットアップの模式図。B ELISA法で測定した、オルガノイド由来調整培地または対照培地と共培養したBMDMの上清中のIL-10濃度（対照群はn = 5生物学的複製、CM群はn = 6生物学的複製）。両側student's t testを用いて有意な**p値<0.0001を表す。C CD206+F4/80+CD11b+マクロファージとCD206 MFIの定量（コントロール群ではn = 4生物学的複製、CM群ではn = 5生物学的複製）。CD206+F4/80+CD11b+マクロファージ：両側学生のt検定で有意なp値=0.0462を表す；CD206 MFI：両側学生のt検定で有意なp値=0.0389を表す。D オルガノイド由来調整培地またはコントロール培地で刺激したBMDMにおけるCD206（緑）とDAPI（青）の免疫染色の代表的画像。E オルガノイド由来調整培地またはコントロール培地で刺激したBMDMの遺伝子プロファイリング（n = 6生物学的複製/群）。左から右へ、両側Student'sを用いて有意なp値を表す：0.0037, 0.0036, 0.0451。F オルガノイド由来コンディショニングメディウム群における上位35代謝物を、アンターゲット液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）メタボローム解析によるネガティブイオンモードでコントロール群と比較した結果。G I/R後、ネガティブイオンモード下でオルガノイド移植マウスとコントロールマウスの糞便内容物中の異なる代謝物を、アンターゲットLC-MSメタボローム解析を用いて表示したボルケーノプロット。オルガノイド移植マウスのオルガノイド由来条件培地群および糞便内容物において、それぞれポジティブ（H）およびネガティブ（I）イオンモード下でコントロールマウスと比較して、総意的に上昇した代謝物を表示したベン図。J ターゲットLC-MSメタボローム解析によるオルガノイド由来調整培地群とコントロール培地群のMA濃度（コントロール群はn=3生物学的複製、CM群はn=5生物学的複製）。有意なp値=0.0047を両側student's t検定で表す。標的LC-MSメタボローム解析を用いたI/R後のオルガノイド移植群および対照群の糞便内容物中のK MAレベル（対照群n = 7マウス、移植群n = 9マウス）。両側Mann-Whitney検定を用いて有意なp値=0.0012を表す。L 術前の患者の糞便中のMA含量とLIFEスコアとの相関解析（n＝23検体／群）。M T0と比較したT1の患者における術前便中MA量と血清I-FABP値との相関解析（n＝23検体/群）。N T0と比較したT1の患者における術前の糞便中MA濃度と血清D-乳酸濃度との相関解析（n = 23検体/群）。スケールバーは100μm。統計学的検定には、両側学生のt検定、スピアマンの相関係数、Mann-Whitney検定を用いた。*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001。各ドットは1サンプル（[B, C]、[E]、[L-N]）のデータを表す。棒グラフは平均±SD。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されている。

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続いて、オルガノイドを移植したマウスとコントロールマウスから分離した糞便内容物だけでなく、オルガノイド由来のコンディショニング培地の代謝プロファイルを解析した。コントロール培地をバックグラウンドとし、オルガノイド由来コンディショニング培地サンプルからバックグラウンドの代謝物を差し引いた。ポジティブイオンモードでは296代謝物が、ネガティブイオンモードでは193代謝物がアップレギュレートされた（Supplement Data 1）。ネガティブイオンモードのオルガノイド由来コンディショニングメディウムサンプルにおける上位 35 代謝物の濃縮度を図 4F に示します。マウス糞便内容物中の異なる代謝物の変数は、P < 0.05、fold change >1.5、および variable importance in projection (VIP) > 1 として同定された。Volcanoプロット解析の結果、移植群の糞便内容物の112代謝物が、マイナスイオンモード（補足データ3）下で対照群の代謝物より有意に上昇した（図4G）。また、ポジティブイオンモードでは、移植群116代謝物が対照群より有意に発現上昇していた（Supplement Data 4）。16種類の「コンセンサス」代謝物が、オルガノイド由来のコンディショニングメディウムと、ポジティブイオンモード下で移植群の糞便内容物において上昇した差異的代謝物の間で共有されていた（図4H）。さらに、12種類の「コンセンサス」代謝物が、オルガノイド由来条件培地と移植群の糞便内容物において、ネガティブイオンモードで上昇した差分代謝物の間で共有された（図4I）。興味深いことに、移植群のα-ケトグルタル酸（αKG）およびL-リンゴ酸（MA）濃度は、対照群の濃度に比べて上昇しており、移植マウスでは高い酸化速度でクレブスサイクルが氾濫している可能性が示唆された。

実際、トリカルボン酸（TCA）サイクルの代謝産物は、抗血栓作用、免疫調節作用、抗炎症作用を示すことが知られている32,33。TCAサイクルの中間体であるMAは、米国食品医薬品局（FDA）により安全で無毒、無害な食用有機酸として認められており34、ミトコンドリア内でのATP産生に重要な役割を果たしている。酸化的リン酸化がマクロファージの機能を調節し、I/R障害を軽減する可能性35において重要な役割を果たしていることを考慮し、オルガノイドがMAとαKGを産生するかどうかを確認するため、標的代謝を測定した。その結果、オルガノイドを移植したマウスのオルガノイド由来コンディショナ培地および糞便内容物中のMA濃度は、対照群と比較して有意に上昇していた（図4J-K）。オルガノイド由来調整培地中のαKGレベルは対照群に比べ有意に上昇したが（補足図3A）、糞便内容物中のαKGレベルは群間で差がなかった（補足図3B）。

MAと腸管I/R傷害を受けた患者の予後との臨床的相関をよりよく理解するために、心肺バイパス（CPB）下で待機的心臓弁置換術または冠動脈バイパス移植術を受けた患者から、術前（T0）と術後12時間（T1）に糞便と血液サンプルを採取した。これは、数時間体外循環を受けるCPB手術患者は、術後に心拍出量が低下する結果、手術時の腸管虚血、または術後の非閉塞性虚血を発症する傾向があるためである36。相関分析では、手術前の患者の糞便中のMA含量と、腸傷害の陽性バイオマーカーである術前の血漿中の腸脂肪酸結合蛋白（I-FABP）およびD-乳酸値との間に有意な相関を示すことはできなかった（補足図3C、D）。しかし、術前の糞便検体中のMA含量は、T0と比較してT1におけるLausanne腸管障害評価（LIFE）消化管障害スコア、血漿I-FABPおよびD-乳酸濃度と負の相関を示し（図4L-N）、MAの減少が消化管機能の回復の悪化と関連していることが示された。術前の糞便検体中のαKG濃度とLIFE消化管障害スコアおよび血漿I-FABP濃度との間には、T0時とT1時のいずれにおいてもT0時と比較して有意な相関は認められなかった（補足図3E-F）。従って、MAは腸管I/R障害に対する治療薬としての可能性を示すと推測された。

MAはM2マクロファージの分極を促進し、I/Rマウスの粘膜回復を促進する
次に、MAが腸のI/R傷害に影響を及ぼすかどうかを調べた。腸管I/Rモデルの前に、マウスに1日250mg/kgのMAを5日間経口投与した。その結果、I/RマウスにMAを投与すると、病理学的損傷（図5A）とバリアタイトジャンクションタンパク質とmRNA発現（図5B-D）が改善することがわかった。さらに、MAは、炎症性サイトカインIL-6およびIL-1βの産生を、ビヒクル群と比較して有意に減少させた（図5E）。MAの補充はまた、マクロファージCD206（図5F-H）およびIL-10タンパク質（図5I-L）の発現レベルを回復させた。同様の観察はin vitroでもなされ、MAで刺激したBMDMは、ビヒクル群よりも高いArg1、Ym1/2、およびIL-10発現（図5M）、ならびに高いCD206表面発現を示した（図5N-O）。これらのデータは、腸内のMA濃度を回復させることにより、マクロファージの分極化が回復し、粘膜の回復が可能になることを示している。

図5：I/RマウスにMAを補充すると、M2マクロファージ量が回復し、粘膜の回復が促進される。
図5
A 腸管I/R誘導36時間後のマウス小腸組織のH & E染色と小腸病理スコアの定量（移植群n = 5匹、その他の群n = 6匹）。二元配置分散分析(ANOVA)およびTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0167（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0172（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。B 腸管I/R後36時間のマウス小腸組織におけるOccludinおよびZO-1 mRNAのqRT-PCR解析（移植群：n＝5匹、それ以外の群：n＝6匹）。Occludinの両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0043（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0043（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。ZO-1については、二元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0105（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0259（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。Cオクルディン発現の代表的な免疫組織化学的画像とオクルディン免疫組織化学的染色面積の定量化（移植群：n＝5匹、それ以外の群：n＝6匹）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0043（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0022（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。D ZO-1の代表的な免疫組織化学像とZO-1染色面積の定量化（移植群：n＝5匹、それ以外の群：n＝6匹）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0043（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0022（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。E 腸管I/R後36時間のマウスにおけるIL-6およびIL-1β産生のELISA検出（移植群：n＝5匹、それ以外の群：n＝6匹）。二元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。IL-6については、0.0297（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0190（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。IL-1βについては、＜0.0001（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0002（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。F CD206+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（移植群：n = 5匹、その他の群：n = 6匹）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0043（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0022（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。G CD206発現の代表的ヒストグラム。H 腸管I/R損傷から36時間後の小腸LPにおけるCD206 MFIの定量（移植群：n = 5匹、それ以外の群：n = 6匹）。二元配置分散分析(ANOVA)およびTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0056（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0012（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。I IL-10発現の代表的ヒストグラム。J IL-10+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（移植群：n = 5匹、その他の群：n = 6匹）。二元配置分散分析(ANOVA)とTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0083（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0085（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。K 腸管I/Rから36時間後の小腸LPにおけるIL-10 MFIの定量（移植群：n＝5匹、その他の群：n＝6匹）。両側Mann-Whitney検定による有意なp値を表す。0.0022（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。L 腸管I/R後36時間のマウスにおけるIL-10の血清濃度（移植群：n＝5匹、それ以外の群：n＝6匹）。二元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0247（ビヒクル、Ctrl vs Org trans）、0.0013（Ctrl、ビヒクル vs リンゴ酸）。M MAを添加または無添加で刺激したBMDMの遺伝子プロファイリング（ビヒクル群：n=4生物学的複製、MA群：n=6生物学的複製）。左から右へ、両側student'sを用いて有意なp値を表す：0.0108, 0.0096, 0.0015。N MA添加の有無にかかわらず刺激したBMDMにおけるCD206発現の代表的画像とCD206+F4/80+CD11b+の定量（n = 3生物学的複製/群）。有意 *p値=0.0266（両側studentのt検定による）。O MA添加の有無にかかわらず刺激したBMDMにおけるCD206（緑）とDAPI（青）の免疫染色の代表的な画像。スケールバーは100μm。採用した統計学的検定：二元配置ANOVAと多重比較のためのTukey検定、両側スチューデントのt検定、Mann-Whitney検定。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。各ドットは1サンプル（[A-F]、[H]、[J-N]）のデータを表す。棒グラフは平均±SD。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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さらに、MA添加マウスでは、36時間後にKi-67+増殖細胞がビヒクル群と比較して有意に増加した（補足図4A）。また、MA添加群の小腸陰窩では、36時間後にPaneth細胞、OLFM4+細胞、杯細胞が、ビヒクル群と比較して有意に増加していた（補足図4A-C）。これらのデータは、MA補充がISCの自己再生維持を促進することを示唆した。

MAは、サイトカインシグナル伝達抑制因子2（SOCS2）依存的にM2分極を誘導する。
MA投与後のBMDMの転写シグネチャーを調べるために、RNA配列決定（RNA-seq）解析を行った。BMDMを4μMのMAで24時間処理し、シーケンス解析用のRNAサンプルを得た。遺伝子発現の差は、ヒートマップを用いてマッピングした。MAを投与したマクロファージと投与しなかったマクロファージとの間で、有意差が観察された。MAで処理したBMDMと有意に関連した応答は、アルギニン代謝、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）受容体結合、グラム陰性菌に対する防御応答に関与していた（図6A）。マクロファージ極性化に対するMAの影響を調べるため、サイトカインシグナル伝達抑制因子（SOCS）ファミリー遺伝子を観察した。SOCS遺伝子ファミリーは、マクロファージの分極化を含む多くの生理的プロセスに重要な影響を及ぼす37。我々は、SOCS遺伝子が、ビヒクル群と比較して、MA処理BMDMで有意に発現上昇していることを見出した（図6B）。MAで処理したBMDMにおけるSOCS遺伝子ファミリーの発現差を検証し、SOCS2のmRNA発現がRNA-seqの結果と一致することを確認した（図6C）。

図6：in vitroでのMAによるSOCS2を介したマクロファージ極性化の誘導。
図6
A 遺伝子オントロジー（GO）パスウェイ濃縮解析による2群間の発現上昇DEG。ノードの大きさはDEGの数を表し、ノードの色は対応するP値を表す。B MA投与群とビヒクル投与群のDEGを比較した散布図。遺伝子は発現レベル（log10強度）に従ってモニターした。赤と緑の点はそれぞれ、発現が増加した遺伝子と減少した遺伝子を表す。C：MA投与群と非投与群におけるSOCSファミリー遺伝子の遺伝子プロファイリング。D siRNAを用いてSOCS2を枯渇させ、MAと共培養したBMDMと共培養していないBMDMにおけるCD206発現の代表的ヒストグラムと定量（siNC投与ビヒクル群はn＝3生物学的複製、それ以外の群はn＝4生物学的複製）。二元配置分散分析（way-way ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0034（siNC、ビヒクル vs MA）、0.0007（MA、siNC vs siSOCS2）。E siRNAを用いてSOCS2を枯渇させ、MAと共培養したBMDMと共培養していないBMDMにおけるCD206（緑）とDAPI（青）の免疫染色の代表的画像。F IL-10発現の代表的ヒストグラムとIL-10+ MFIの定量（n = 3 biological replicates/group）。二元配置ANOVAとTukey検定による有意なp値を示す。0.0335（siNC、ビヒクル vs MA）、0.0072（MA、siNC vs siSOCS2）。G siRNAを用いてSOCS2を枯渇させ、MAと共培養したBMDMにおけるIL-10+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（n = 3生物学的複製/群）。二元配置ANOVAとTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0353（siNC、ビヒクル vs MA）、0.0066（MA、siNC vs siSOCS2）。H siRNAを用いてSOCS2を枯渇させ、MAと共培養したBMDMs、またはMAなしで共培養したBMDMsによって放出されたIL-10濃度のELISA検出（n = 3 biological replicates/group）。二元配置ANOVAとTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0020（siNC、ビヒクル vs MA）、0.0001（MA、siNC vs siSOCS2）。スケールバーは100μm。採用した統計学的検定：二元配置分散分析（ANOVA）、多重比較のためのTukey検定、両側スチューデントのt検定。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。各ドットは1サンプル（[D]、[F-H]）のデータ。棒グラフは平均±SDを表す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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in vitroでのSOCS2の効果を明らかにするために、BMDM細胞でsmall interfering RNA（siRNA）の一過性トランスフェクションを行った。SOCS2に対するsiRNA（siSOCS2）で処理したBMDMは、MAによって誘導されたCD206発現をビヒクル群と同程度まで低下させた（図6D, E）。さらに、siSOCS2の投与は、MA処理BMDMのIL-10産生機能を、ビヒクル群と比較して低下させた（図6F-H）。

さらに、SOCS2ノックアウトマウスを用いた実験を行い、in vivoでMAがSOCS2依存的にマクロファージの分極を制御し、I/R傷害からの腸の回復を制御するかどうかを検討した。MAを投与したSOCS2-/-マウスの病理学的スコアは、MAを投与したWTマウスよりも有意に高かった（図7A）。さらに、SOCS2-/-マウスでは、腸管バリアーの完全性が低下し（図7B、C）、IL-6、IL-1βの分泌が増加し、IL-10の分泌が減少した（図7D）。さらに、SOCS2欠損マウスは、Ly6C+MHCII+マクロファージおよびLy6C-MHCII+マクロファージの産生能を低下させ（図7E）、M2様マクロファージの割合を減少させた（図7F、G）。これらの結果を総合すると、MA投与はSOCS2依存的にマクロファージのM2様マクロファージへの極性化を促進することが示された。

図7：MAは、SOCS2依存的にマクロファージ分極を制御することにより、腸のI/R障害を緩和する。
図7
A 腸管I/R誘発36時間後のマウス小腸組織のH & E染色と小腸病理スコアの定量（SOCS2-/-マウス/群：n = 3、WTマウス/群：n = 4）。二元配置分散分析(ANOVA)とTukey検定による有意なp値を表す。0.0241（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0020（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）。B Occludin, ZO-1免疫組織化学染色の面積の定量化（SOCS2-/-マウス/群n=3、WTマウス/群n=4）。二元配置分散分析、Tukey検定により有意なp値を示す。Occludinについては、0.0231（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0019（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）；ZO-1については、＜0.0001（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、＜0.0001（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）。C腸管I/R後36時間のマウス小腸組織におけるオクルジンとZO-1のmRNAのqRT-PCR解析（SOCS2-/-マウス/グループn = 3、WTマウス/グループn = 4）。二元配置分散分析、Tukey検定により有意なp値を示す。Occludinについては、0.0056（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0005（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）；ZO-1については、0.0014（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0007（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）。D 腸管I/R後36時間のマウスにおけるIL-6、IL-1βおよびIL-10産生のELISA検出（SOCS2-/-マウス/群n = 3、WTマウス/群n = 4）。二元配置ANOVAとTukey検定を用いて有意なp値を表す。IL-6は0.046（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0046（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）、IL-1βは0.0159（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0052（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）、IL-10は0.0005（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0003（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）。E 異なる群の小腸におけるCD45+CD11b+細胞中のLy6C+MHCII-、Ly6C+MHCII+、およびLy6C-MHCII+サブセットの頻度（SOCS2-/-マウス/群ではn = 3、WTマウス/群ではn = 4）。Ly6C+MHCII-細胞とLy6C+MHCII+細胞について、二元配置分散分析（way-way ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。Ly6C+MHCII-細胞については、0.0169（WT、I/R + Vehicle vs I/R + MA）、0.0221（I/R + MA、WT vs SOCS2-/-）；Ly6C+MHCII+細胞については、0.0004（WT、I/R + Vehicle vs I/R + MA）、0.0011（I/R + MA、WT vs SOCS2-/-）。F CD206+F4/80+CD45+CD11b+マクロファージの定量（SOCS2-/-マウス/グループn=3、WTマウス/グループn=4）。二元配置ANOVAとTukey検定を用いて有意なp値を表す。0.0004（WT、I/R＋Vehicle vs I/R＋MA）、0.0012（I/R＋MA、WT vs SOCS2-/-）。G 腸管I/R損傷36時間後の小腸LPにおけるCD206発現の代表的ヒストグラム。H マクロファージ養子移入の誘導プロトコルの模式図。I マクロファージ養子移入誘導36時間後のマウス小腸組織のH & E染色と小腸病理スコアの定量（レシピエントSOCS2-/-マウスにMA投与WTマウスからマクロファージを養子移入した群ではn = 3匹、それ以外の群ではn = 4匹）。二元配置分散分析にTukey検定を適用し、有意なp値を表す。0.0163（WT、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）、0.0258（SOCS2-/-、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）。J Occludin, ZO-1免疫組織化学染色の面積の定量化（レシピエントSOCS2-/-マウスのMA投与WTマウスからのマクロファージの養子移入群ではn＝3、それ以外の群ではn＝4）。二元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。Occludinについては、0.0003（WT、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）、0.0023（SOCS2-/-、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）；ZO-1については、0. 0018（WT、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）、0.0033（SOCS2-/-、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）。K マクロファージ養子移入36時間後のマウスにおけるIL-6、IL-1βおよびIL-10産生のELISA検出（MA投与WTマウスからマクロファージを養子移入したレシピエントSOCS2-/-マウス群ではn＝3、それ以外の群ではn＝4）。二元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定を用いて有意なp値を表す。IL-6については、0.0288（WT、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）、0.0226（SOCS2-/-、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）；IL-1βについては、0.0012（WT、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）、0. 0004（SOCS2-/-、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）；IL-10については、0.0022（WT、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）、0.0154（SOCS2-/-、WTマクロファージの養子移入 vs SOCS2-/-マクロファージの養子移入）。スケールバー、200μm。採用した統計学的検定：二元配置分散分析（ANOVA）と多重比較のためのTukey検定。*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。各ドットは1サンプル（[A-F]、[I-K]）のデータ。棒グラフは平均±SD。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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MAを投与したWTマクロファージの養子移入は、SOCS2-/-マウスにおける腸管I/R傷害を軽減する
MA投与腸管マクロファージの機能をさらに解明するために、養子移入アッセイを行った。36時間腸管虚血I/R傷害を受けたMA投与WTマウスまたはSOCS2-/-マウスからマクロファージを選別し、レシピエントWTマウスおよびSOCS2-/-マウスに腸管虚血後に養子移入を行った（図7H）。その結果、WTマウスおよびSOCS2-/-マウスともに、MAを投与したWTマウスのマクロファージを養子移入した方が、腸の病理学的損傷が少なかった（図7I）。この結果と同様に、MAを投与したWTマウスからのマクロファージの養子移入は、腸管バリアの完全性を回復させ（図7J）、IL-10分泌を回復させ（図7K）、血清IL-6およびIL-1βレベルを低下させたが、MAを投与したSOCS2-/-マウスからのマクロファージの養子移入では回復しなかった（図7K）。このデータは、MAを投与したWTマウスのマクロファージが腸管I/R傷害に機能的に寄与することを示唆している。

考察
ここでわれわれは、小腸オルガノイドがそのユニークなコロニー形成機能を利用して、腸管I/R傷害時に局所免疫微小環境に影響を与え、ISCの自己再生を促進することを報告した。興味深いことに、オルガノイドは代謝基質としてMAを分泌し、このMAは腸管I/R傷害において、SOCS2依存的にM2マクロファージの分極化を促進し、IL-10レベルを回復させる（図8）。これは、移植オルガノイドが受容体免疫微小環境の制御に利用する新しい代謝内分泌機構であり、腸管I/R傷害の治療に応用できる可能性がある。さらに、CPB手術を受けた患者の糞便中MA濃度は、手術後の腸管障害の程度と負の相関があることがわかり、腸管I/R障害の治療にMAを応用できる可能性が示された。

図8：腸オルガノイド移植の治療効果。
図8
小腸I/R粘膜傷害に移植された腸オルガノイドは、SOCS2依存的にM2分極を促進するMAを分泌することにより、レシピエントの局所免疫微小環境とISCの自己複製に影響を与える。オルガノイド移植は、小腸粘膜傷害に対する有望な治療戦略となる。

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腸管オルガノイドを樹立する方法によって、さまざまな腸管細胞を三次元構造で長期培養・増殖させることができる11。現在までに、マウスおよびヒトの腸由来のオルガノイドは、マウスの大腸炎や短腸症候群の治療に並外れた可能性を示している10,12。対照的に、小腸粘膜損傷を解決するためのオルガノイドの移植はほとんど報告されていない38。移植プログラムを成功させるために、われわれは免疫学的移植片拒絶反応を最小限に抑える近交系マウスモデルを用いた。腸管I/R傷害を受けたマウスは腸の動きを鈍らせ、移植の成功率を高める39。これまでの移植実験から、移植されたオルガノイドはその由来部位の機能的特徴を保持し10、クリプト様ドメインや幹細胞マーカーの発現は移植の成功には必要ないことが示唆されている11,40,41。われわれは、移植のために3種類の代替移植材料を選択し、オルガノイドは新鮮な単離Lgr5+幹細胞やクリプトよりも成功率が高いことを見出した。単一Lgr5+幹細胞は、びまん性に傷害された粘膜には移植されなかった。これは、初代ISCが壊れやすく、細胞選別の後、細胞の生存能力が徐々に失われていくためかもしれない。単一細胞はまた、より高い流体力学的張力と剪断力を経験する可能性もある。注目すべきは、培養したオルガノイドは、単離したばかりの陰窩よりも高い移植効率と治療効果を示したことである。これは、オルガノイドが数日間培養されるため、移植の追加的な操作に対してより耐性があり、その結果、初期移植期間中の細胞生存率が高くなるためではないかと推測している42。さらに、オルガノイドのin vitro培養では、幹細胞の増殖を促進する成長因子や培養条件が存在するため、幹細胞の集団が増幅される可能性がある43。その結果、オルガノイド内の幹細胞数が増加し、レシピエントに移植した際の生着率が向上する。

ここでわれわれは、腸管I/R損傷に対するポストコンディショニング移植法を開発した。さらに、腸管I/Rモデルにより適合し、オルガノイドの移植が成功するように、オルガノイドの送達経路を変更し、マトリゲルと溶媒の比率を最適化した。この方法は、将来的には低侵襲技術によって患者に利益をもたらす可能性がある。さらに、腸管オルガノイド移植の標準化プロトコルと今後の広範な研究は、ヒト疾患の治療への応用に貢献するだろう44。

レシピエントの免疫微小環境とドナー細胞との相互作用は、疾患治療の有効性に重要な役割を果たす。例えば、網膜オルガノイド由来前駆細胞の移植は、ミクログリアの活性化を抑制し、網膜変性症の視力を改善する27。さらに、M2マクロファージは、老化した胃オルガノイドが胃潰瘍を修復するのを助ける45。本研究では、まずT細胞ではなく骨髄系細胞集団が移植群で影響を受けていることを示した。腸管Ly6Chi単球は、MHCIIの獲得とともにマクロファージへと進行的に発達し、Ly6Cの消失は炎症性サイトカインの消失とIL-10産生の増加を伴う28,46。単球のマクロファージ亜集団への分化は、腸内のMHCIIloマクロファージやMHCIIhiマクロファージを含め、その特異的な環境ニッチにより頻繁に起こり、瀕死の上皮細胞の除去や組織のリモデリングに寄与している47,48。我々は、移植群がLy6C+MHCII-単球からLy6C-MHCII+マクロファージへの分化を促進することを見出した。さらに、Ly6C-MHCII+細胞はLy6C+MHCII-単球よりも高いCD206の発現を示した。この結果と一致して、移植群では、マクロファージの抗炎症状態を示すF4/80+マクロファージにおけるCD206とIL-10の発現レベルも、非移植群に比べて有意に高かった。このように、Ly6C+単球が分化してMHCII+マクロファージを補充し、M2様マクロファージの集団が増加することは、移植臓器の影響下における免疫微小環境での独自の役割を反映している。

腸管バリア構造の完全性は、様々な方法でマクロファージの機能と密接に関係している49。特に、上皮の免疫調節機能、腸内環境における自然免疫反応と適応免疫反応の調節への貢献は、ある程度、上皮が産生する多くの免疫調節シグナルに依存している49,50。そこで我々は、オルガノイドは分泌機構を介して免疫微小環境に影響を与えながら機能しているのではないかと考えた。コンディショニング培地を用いて、オルガノイド由来のコンディショニング培地がマクロファージの分極化を促進し、マクロファージによるIL-10の分泌を促進するという仮説を証明した。

いくつかの種類の培養オルガノイドは、単層培養よりも高い代謝レベルを維持している42,51。これは、細胞間の相互作用を促進し、様々な細胞集合体によるシグナル伝達カスケードを作り出す、その三次元構造に起因している可能性がある42,52。その結果、代謝の活性が高まる。代謝産物によって役割は異なる。例えば、前立腺オルガノイドは、男性の生殖能力を維持するためにクエン酸を産生する31。代謝産物αKGは、エピジェネティックな機構を介して免疫応答を制御する53。さらに、内因性の腸内産生がTCAサイクル代謝産物の主要な供給源であることが報告されている54。われわれは、腸オルガノイド由来のコンディショニング培地および移植マウスの糞便内容物中のMA濃度が、対照群と比較して有意に高いことを見いだした。MAの主要な産生源は、オキサロ酢酸還元経路、TCAサイクル経路、グリオキシル酸サイクル経路に主に起因している33,55,56。我々はさらに、MAが腸管障害を軽減し、Ly6C+単球のマクロファージへの分化を促進することを示した。MAはまた、in vivoでもin vitroでも、IL-10レベルを回復させ、M2様表現型へのマクロファージ分極を誘導する。このように、移植されたオルガノイドは、MAの放出によって上皮バリア再構築を改善するために、茎形成促進・回復環境を形成する。しかしながら、成熟したオルガノイドからは複数の機能性酵素、成長因子、ホルモンが分泌される。オルガノイド由来調整培地のタンパク質プロファイルをさらに分析することで、将来的な応用に向けた治療法の選択肢が増えるかもしれない23,24,25。マクロファージ由来のIL-10はその後、炎症を解決することによって腸管免疫微小環境の恒常性を強化する。興味深いことに、オルガノイドを移植したマウスにおいて、（クロドロネートリポソームやMAレベルの増加によって）M2様マクロファージの分極を減少させたり促進させたりすることで、IL-10レベルを減少させたり回復させたりすることは、粘膜傷害に対してそれぞれ相反する効果を発揮する。このことは、腸管傷害の回復は、抗炎症性マクロファージによるIL-10産生の増加に大きく依存していることを示している。

MAは創傷治癒マクロファージの機能的分極化を促進する。M2様マクロファージはTGF-β、Arg1、IL-10を産生し、これらは炎症の解消と組織再生に関与する。Arg1+マクロファージは排出を促進し、炎症からの回復と動脈硬化の解消をもたらす57。アルギニン代謝は、細胞増殖に重要なポリアミンをアルギニン-1から産生する57。TGF-β+マクロファージは筋肉の再生を促進し58、血液バリア機能を回復させる59。IL-1受容体とその下流のエフェクターである血管内皮増殖因子（VEGF）およびSOCS3のアップレギュレーションは、IL-1応答性を強化し、M2マクロファージの抗炎症性に寄与する60。ここで、MAはArg1、SOCS2、VEGFα、TGF-βの発現を有意に増加させたことから、MAが傷害組織の回復を促進することが示唆され、これはマクロファージM2の極性化に大きく起因している。SOCSファミリーは、SOCS-SH2ドメインのホスホチロシンモチーフ結合を好むため、免疫系の恒常性の制御に重要な役割を果たしている61,62。SOCS2は炎症性疾患の抑制に大きな可能性を示しているが63、腸管I/R傷害におけるその役割についてはまだ調べられていない。特にわれわれは、MAがSOCS2依存的にマクロファージ分極を制御し、腸管I/R傷害からの腸の回復を制御することを初めて報告した。

これらの知見を総合すると、移植されたオルガノイドは、腸管幹細胞の自己再生を促進し、免疫微小環境を制御することによって、マウスの腸管I/R障害を軽減できることが示唆される。また、オルガノイドから分泌されるMAがSOCS2依存的にM2マクロファージの分極化を誘導することは、腸管I/R障害の治療においてオルガノイド移植療法が果たす役割の基礎となるメカニズムに新たな知見を与えるものである。本研究は、移植臓器がMAを分泌することによって免疫微小環境を制御するという新規の代謝内分泌メカニズムを明らかにし、それによって臨床における腸管I/R障害と闘う治療戦略の新たな道を開いた。

方法
同じ遺伝子型を持つマウスを独立した実験者が無作為に各群に割り付けたが、特定の無作為化方法は採用しなかった。また、サンプルサイズを事前に推定するための統計的手法も用いなかった。組織学的解析、IFおよび関連する臨床検査を担当した実験者は、マウスのグループ分けについて盲検化されていた。

動物
C57BL/6 J WT雄マウス（6-8週齢）は、南方医科大学南方病院動物センター（広州、中国）から提供された。Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2（Lgr5-GFP）マウスはJackson Laboratory（Ban Harbor, ME, USA）から入手した。SOCS2ノックアウトマウスの繁殖ペアはZai-Long Chi（温州医科大学）の好意により提供された。C57BL/6遺伝的背景を持つSOCS2-/-マウスは、CRISPR/Cas9を介したゲノム工学技術を用いて作製した。エクソン3断片の欠失は、Cyagen Biosciences社（広州、中国）により作製されたgRNA1（TTG GCA GTC GTT TTT CTA GT CGG）およびgRNA2（ATT CAG CTA AAA CTA CCT AA GGG）を用いて行った。すべての動物は、特定病原体フリー（SPF）条件下（12時間明暗サイクル、温度：22±1℃、湿度：55±5%）の動物飼育室で飼育され、標準的なマウス飼料（MD17121、MEDICIENCE、江蘇省、中国）と水を自由に摂取できた。実験に使用した動物は、各群に無作為に割り付けた。ここに記載したすべての動物実験は、南方医科大学南方病院（中国広州市）の動物飼育使用委員会の承認を得て、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）のガイドラインに沿って実施した。すべての動物の取り扱いは、中国動物福祉ガイドラインの方針に従い、南方医科大学の倫理委員会の監督下で行われた。マウスには0.2 mL/20 g ddH2Oまたは250 mg/kg MA（M7397, Sigma-Aldrich, St. ここで用いたマウスは、以下の実験群に無作為に割り付けた：(i)コントロール；(ii)オルガノイド移植；(iii)PBSリポソーム；(iv)クロドロネートリポソーム；(v)ビヒクル；および(vi)MA。ビヒクル群のマウスには、1日1回0.2mL/20gのddH2Oを5日間経口投与し、ビヒクルとした。本研究は、南方病院動物倫理委員会より承認を得た（承認番号：IACUC-LAC-20220508-001）。

マウス腸管I/R損傷モデルの樹立
手術前、すべての動物に18時間餌を与えなかったが、水は自由に飲ませた。マウスは2-3%のイソフルランを吸入して麻酔し、手術前に皮膚を準備した。モデルを確立するために、腹部正中切開により小腸を露出させ、非侵襲的微小血管動脈クランプを用いて上腸間膜動脈（SMA）を50分間クリップし、その後既述のように再灌流を行った4。要するに、虚血の成功は小腸粘膜の淡い色によって識別され、有効な再灌流はピンク色の再出現によって決定された。液性蘇生のため、クランプ解除後直ちに生理食塩水1mLを皮下に注入した。腹部切開を縫合糸で閉じた後、疼痛管理のために1mg/mlのブトルファノール（江蘇恒瑞医薬有限公司、中国江蘇省）を皮下注射した。動脈クランプ解除後6時間ごとにマウスの生存をモニターし、試験期間7日間モニターし続けた。

マウス腸オルガノイドの培養
マウスを犠牲にして小腸を摘出し、滅菌した冷PBSに浸して縦に切り、滅菌した冷PBSで腸内容物を洗い流した。その後、腸を2～4 mmの断片に切り、滅菌冷PBS（あらかじめ用意）を入れた50 mL遠心チューブに入れ、2 mlピペットを用いて滅菌冷PBSで上下に15～20回繰り返し洗浄した。その後、ピースを室温でPBS中30mM EDTA 10mLとともに15分間インキュベートした。その後、試薬を除去し、腸切片をPBSで洗浄し、クリプトに富む上清画分を70μmセルストレーナーで回収した。これらの画分を400×gで5分間遠心し、上清を除去した。沈殿を5mLの冷DMEM/F12（Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）溶液に懸濁し、倒立顕微鏡で陰窩を数え、必要量の液体を遠沈管に吸引し、400×gで5分間遠心した。沈殿を回収し、マウス上皮成長因子（mEGF）、ノギン、R-スポンジンを含む同量のオルガノイド培地（ENR培地）、およびマトリゲル（356231、BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）に再懸濁した。ENR培地には、DMEM/F12培地（Gibco）、Primocin（100μg/mL、InvivoGen、San Diego、CA、USA）、N2サプリメント（1X、Gibco）、B27サプリメント（1X、Gibco）が含まれていた、マウス上皮成長因子（50 ng/mL、PeproTech、Cranbury、NJ、USA）、R-スポンジン1（500 ng/mL、R&D Systems、Minneapolis、MN、USA）、およびマウスノギン（100 ng/mL、R&D Systems）。次に、懸濁液（50μL）を予熱した細胞培養ディッシュに素早く接種し、ドーム状のゲル状構造を形成させた。その後、ディッシュを37℃のインキュベーターに20分間置いた。マトリゲルが固まった後、オルガノイド培養用のENR培地を培養皿に加えた。

同所移植
移植当日、単離したばかりの陰窩と選別した小腸Lgr5+幹細胞を、方法に記載したように調製した。成熟したマウスオルガノイドをマトリゲルから取り出し、冷DMEM/F12溶液で洗浄した。単離されたオルガノイド、単離されたばかりの陰窩、選別された小腸Lgr5+幹細胞は、マトリゲルとDMEM/F12（1:4）に再懸濁され、氷上で30分以上静置された。200μLの液あたり、約3×106個の小腸Lgr5+幹細胞、8000個の単離したての陰窩、および5000個のオルガノイドが得られた。コントロールのDMEM/F12とマトリゲルは同じ条件で調製したが、オルガノイドは含まなかった。腸管I/R傷害を誘発する前にマウスを麻酔した。クリップを解除した直後に、1mL注射器で小腸近位部から遠位部までの十二指腸管腔に200μLのオルガノイド溶液を1回、23ゲージの注射針で注入し、オルガノイドを含まないコントロールのDMEM/F12とマトリゲルも同様に注入した。その後、小腸を慎重に腹腔内に戻し、切開部を閉鎖し、組織接着剤を用いて肛門を接着した。術後6時間後に接着剤を除去した。

血液サンプルと組織処理
マウスは犠牲にする前に麻酔をかけた。血液サンプルは眼球を摘出し、400×gで15分間遠心分離して血清を採取した。小腸を摘出した後、腸組織をパラホルムアルデヒド（PFA）を用いて固定し、病理組織学的分析を行った。その後、冷PBSで内腔を洗浄し、残った組織を回収して液体窒素で凍結した。盲腸を摘出した後、内容物を慎重に絞り出し、滅菌鉗子を用いて採取した。採取したサンプルはすべて、使用前に-80℃で保存した。

蛍光イメージング
蛍光検出の前に、小腸全体をマウスから切り離した。蛍光はAmi HTX Optical Imaging System（Spectral Instruments Imaging社、米国アリゾナ州ツーソン）を用いて検出し、画像は470 nmの励起光、570 nmの発光光、60秒の露光時間で小さなビニング（分解能）を用いて撮影した。すべての画像は、ANALYSIS ONLY Aura 4.0.7 Mを用いて解析・処理した。

オルガノイド由来調整培地
マウス腸管オルガノイドを6ウェルプレートで5～7日間拡張培養した。その後、あらかじめDMEM/F12でリフレッシュした培地でオルガノイドを24時間培養し、24時間培養後に培地を回収し、0.22μmのフィルター（431219, CORNING, Corning, NY, USA）でろ過してオルガノイド調整培地を得た。

組織学と免疫組織化学
凍結包埋切片の場合、組織およびオルガノイドサンプルの固定には4％PFA（Sigma-Aldrich）を用い、15％および30％スクロース溶液を用いて順次脱水した後、包埋し、OCT（Sakura Finetek）で凍結し、6μm間隔で切片化した。パラフィン包埋切片の場合、4％PFAを用いて試料を固定した後、昇順アルコール勾配を用いて試料を脱水し、パラフィンに包埋し、4μmスライスに切片化した。その後、サンプル切片をヘマトキシリン・エオジン（H & E）で染色した。小腸損傷の程度の評価は、Chiuの方法に若干の修正を加えて行った64。簡単に説明すると、修正病理学的採点基準は以下の通りである： 0、腸粘膜および腸絨毛は正常。1、腸絨毛の先端からGruenhagen空洞が形成される。2、グリュンハーゲン腔の形成と腺の軽度の損傷。3, 上皮下間隙の形成と拡大、毛細血管のうっ血と充血。4、上皮の前膜からの中等度の剥離および腺の損傷。5, 先端の絨毛の部分的消失。6、明らかな絨毛の消失と拡張した毛細血管。7、薄層前膜の消失と著しい腺損傷。8, 扁平上皮の消化分解の開始。9、出血と潰瘍の形成。陰窩の深さは底から開口部まで測定した。パラフィン包埋切片は、使用前にTris-EDTA（pH9.0）で10分間加圧調理した。細胞および切片の透過化には、PBS中0.1%または0.3%のTriton X-100（Thermo Fisher Scientific）を用いて室温で10分間インキュベートした後、洗浄し、室温で10%のヤギ血清（Gibco）で1時間ブロッキングした。使用した一次抗体は以下の通り：抗ZO-1（1:400, ab216880, Abcam）、抗occludin（1:200, ab216327, Abcam）、抗Ki-67（1:200, ab279653, Abcam）、抗OLFM4（1： 200, 39141 S, Cell Signaling Technology）、抗Muc2（1:100, 27675-1-AP, Proteintech）、抗リゾチーム（1:500, A0099, Dako）、抗マンノースレセプター（1:200, ab64693, Abcam）；核の染色にはDAPI（1:500, D9542, Sigma-Aldrich）を用いた。陽性細胞は、画像ごとに無作為に選んだ5つの陰窩で定量した。画像はオルソ蛍光顕微鏡（Axio Imager D2, Carl Zeiss）を用いて撮影し、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）を用いて解析、処理した。

RNA抽出および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）
組織、オルガノイド、細胞からの全RNA抽出にはTRIzol試薬（10296028; Thermo Fisher Scientific）を用いた。RNA の純度と濃度は分光光度計（Nano Drop OneC; Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。RNAから相補的DNA（cDNA）への逆転写は、cDNA逆転写キット（FSQ-101、東洋紡）を用いて行った。リアルタイムPCRは、ABI Q6 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用い、SYBR Green検出プロトコル(QPK-201, TOYOBO)に従って行った。最後に、ハウスキーピング遺伝子として18 SリボソームRNAを用い、データの正規化には2-ΔΔCT法を用いた。ここで使用したプライマーを示す（補足表1）。

サイトカイン測定
細胞培養液と血清サンプルを室温で解凍した。次に、サンプル中のIL-6、IL-1β、TNF-α、およびIL-10の濃度を、酵素結合免疫吸着測定（ELISA）キット（KE10002、KE10003、KE10007、およびKE10008、Proteintech社）を用いて、製造業者の説明書に従って測定した。

フローサイトメトリー
小腸をPBSで洗浄し、パイエル板と脂肪組織を除去した47。腸を縦に開き、小片に切り分け、10mL、5mM EDTAで15分間インキュベートし、上皮細胞を含む上清を廃棄した。残りの組織を、コラゲナーゼIV（0.5 mg/mL, C5138, Sigma-Aldrich）、DNase I（100 U, 10104159001, Roche）を含むRPMI-1640培地に移し、37℃で1時間インキュベートした後、上清を捨て、組織片をPBSで繰り返し洗浄し、層状細胞を含む上清を回収した。遠心分離後の画分をPercoll（GE17-0891-01、Sigma-Aldrich）に再懸濁し、密度勾配遠心後に中間界面層を採取した。細胞沈殿物は、その後の使用のために再懸濁した。小腸マクロファージを10％ウシ胎児血清（FBS）中で培養し、APC-Cy7標識抗CD45（I3/2.3、A15395、Thermo Fisher Scientific）、BV510標識抗マウスCD11b抗体（クローンM1/70、101263、Biolegend）、FITC標識マウスF4/80（クローンBM8、123108、Biolegend）で染色し、選別した。

脾臓組織は70μmのセルストレイナーで注意深く粉砕し、PBSですすぎ、15mLの遠心チューブに集め、400×gで5分間遠心した。沈殿を赤血球溶解バッファー（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）に再懸濁し、氷上で5分間インキュベートした。その後、冷PBSを用いて消化を停止し、サンプルを400×gで5分間遠心した。残った細胞ペレットを冷PBSに再懸濁し、さらに使用するまで4℃で保存した。

骨髄腔由来の骨髄組織をDMEM（ギブコ）で洗浄した後、懸濁液を遠心分離した。赤血球は溶解バッファーで溶解し、後で使用するために冷PBSに再懸濁した。

血液サンプルを400×gで15分間遠心分離して血清を得、残りのサンプルを1mLのPBSで希釈した。希釈した血液サンプルを、1mLのFicoll Histopaque（P8900, Solarbio Life Sciences, Beijing, China）を含む15mL遠心チューブに静かに移した。これにより2つの異なる層が形成され、密度勾配で15分間遠心した。細胞の沈殿物は試験のために再懸濁された。

細胞をタンパク質輸送阻害剤カクテル（554724、BD Biosciences）と37℃で4時間、Fcブロック（553141、BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA）と4℃で15分間インキュベートした。次に、蛍光標識抗体による表面染色のため、暗所にて4℃で30分間インキュベートした後、細胞を固定、透過処理し、IL-10（クローンJES5-16E3）およびCD206（クローンC068C2）に対する細胞内サイトカイン染色抗体とインキュベートした。フローサイトメトリーの取得はLSRFortessa X-20 Multidimensional HD Flow Cytometer（BD Biosciences）を用いて行い、データ解析はFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）使用した抗体を補足表2に示す。

小腸陰窩は、上述のようにLgr5-EGFP-IRES-CreERT2マウスから単離した。小腸陰窩はTrypLE Express（Invitrogen, Waltham, MA, USA）を用いてさらに単細胞に解離した。Enhanced GFP（EGFP）幹細胞は、MoFlo XDP超高速フローセルソーティングシステム（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いてゲート選別した。

腸管マクロファージの枯渇
腸管マクロファージを枯渇させるために、クロドロネートまたはPBS担持リポソーム（CP-005-005, LIPOSOMA, Groningen, The Netherlands）200マイクロリットルを、腸管I/Rの前に交互に3回マウスに静脈内注射した。

参加者
南方医科大学南方病院心臓外科（中国広州市）で冠動脈バイパス術または選択的心臓弁置換術を受けている23名の参加者を、2020年9月から2021年11月の間に連続して募集した。参加者全員の年齢は18～75歳であった。除外基準には、慢性消化器系疾患、消化器外科手術の既往、慢性腎疾患、腸虚血・壊死が確認または疑われる者、試験開始前1週間以内にプレバイオティクス、下剤、止瀉剤を使用した者、3ヵ月以内に抗生物質を使用した者が含まれた。各群の人口統計学的および健康関連の特徴に有意差は認められなかった。すべての患者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。本研究は、南方医科大学南方病院より倫理委員会の承認を得た（承認番号：NFEC-202009-k2-01）。

ローザンヌ腸管障害推定（LIFE）スコア
術後7日目に、既述のLIFEスコア推定法に従って患者の消化管不全スコアを算出した65。この評価基準には、腹腔内圧、乳酸値、胃残渣、経腸栄養、運動、腸音などさまざまなパラメータが含まれる。

ヒトFABP2/I-FABP免疫測定法
抗凝固剤（EDTAまたはヘパリン）を用いて術前および術後12時間にヒト血液サンプルを採取し、400×gで15分間遠心分離して上層の血漿を分離した。すべてのサンプルは使用前に-80℃で保存した。ヒト血漿中FABP2/I-FABP濃度は、ヒトFABP2/I-FABP Quantikine ELISAキット(DFBP20, R&D Systems)を用い、製造者の指示に従って測定した。

D-乳酸測定キット
凍結ヒト血漿サンプルは、検出前に室温で解凍した。メーカーのプロトコールに従い、比色D-乳酸アッセイキット（ab83429、Abcam）を用いて、グループ分けを盲検化した研究者が血漿中のD-乳酸濃度を測定した。

BMDM培養
BMDMを分離するため、7～8週齢のC57BL/6 Jマウスの大腿骨と脛骨を洗浄し、懸濁液を400×gで10分間遠心分離し、上清を廃棄した。その後、沈殿物を10％FBS（ギブコ）および20％L929コンディショニングメディウムを添加したDMEM（ギブコ）に再懸濁し、37℃の細胞培養器で培養した。分化から7日後、細胞を実験用に回収した。条件培地実験では、細胞はオルガノイド由来の条件培地か、コントロールとしてDMEM/F12で培養された。MA刺激実験では、細胞は4μMのMAか、ビヒクルとして同量の二重蒸留水（ddH2O）で培養された。MAで刺激する前に24時間siRNAで処理した細胞を陰性対照（NC）群とした。細胞を以下のように異なる群に無作為に割り付けた： (i)ビヒクル、(ii)MA、(iii)ビヒクル＋siNC、(iv)ビヒクル＋siSOCS2、(v)MA＋siNC、(vi)MA＋siSOCS2。

非標的および標的メタボロミクス
非標的メタボローム解析は、Vanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific）とOrbitrap Q ExactiveTMHF-X質量分析計（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。抽出物を得るために、サンプルをホモジナイズして遠心分離を繰り返し、最終的な糞便抽出物を代謝物プロファイリング分析用に分注した。超高速液体クロマトグラフィー質量分析計を用いて生データを作成し、Compound Discoverer 3.1（CD3.1, Thermo Fisher Scientific）で処理し、統合、正規化、ピーク強度のアライメントを行った。次に、mzCloud、mzVault、および MassList データベースを使用して、処理されたデータセットをマッチングした。正規化したデータを用いて主成分分析とOPLS-DAを行い、VIP > 1を閾値とした。

TSQ Quantiva™（Thermo Fisher Scientific）を用いて標的定量メタボロミクスを実施した。MA標準物質（L46691, Acmec, Biochemical, Shanghai, China）、αKG標準物質（61234, Sigma-Aldrich）を4:1メタノール/水（v/v）に溶解し、標準曲線を作成した。サンプルを80%メタノールでホモジナイズし、3分間超音波処理した後、14,000×g、4℃で10分間遠心した。得られた上清をろ過し、その後の実験に使用した。クロマトグラフィー分離にはPrelude SPLC™ sample preparation and liquid phase system（Thermo Fisher Scientific）を、定量検出にはTSQ Quantiva（Thermo Fisher Scientific）を、データ収集にはTraceFinder™ソフトウェアバージョン3.3 SP1（Thermo Fisher Scientific）を使用した。

RNA-seq
RNAは上記のように抽出した。RNA配列決定はShanghai Biotechnology Corporationが行った。簡単に説明すると、すべてのRNAサンプルはFast QC（バージョン0.10.1）を用いて品質管理分析を受けた。シーケンスライブラリーは、TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit（15032612、Illumina、San Diego、CA、USA）を用いて調製した。クラスタの生成にはCBot（HiSeq2500）を使用し、ペアエンド150bpリードの生成にはHiSeq2500シーケンスプラットフォーム（イルミナ）を使用した。Trimadapを使用して修飾されていない配列をフィルタリングし、HISAT2を参照ゲノムのアライメントに使用して、有効なクリーンデータを得た。HISAT2のアライメント結果に基づいて、StringTie (John Hopkins University, Baltimore, MD, USA)を用いて転写産物を再構築し、各サンプルの全遺伝子の発現量を算出した。遺伝子発現差の計算は、BioconductorパッケージのedgeRに実装されている負の二項モデルによって完了した。fold変化（FC）≧2またはFC≦-2でq値＜0.05を有意とみなした。

siRNAトランスフェクション
SOCS2を標的とするマウスsiRNAとネガティブコントロールsiRNAは、Ribo Targets社（広州、中国）により設計・構築された。トランスフェクションは、Lipofectamine 3000（L3000015、Invitrogen社）を用いて、製造元の指示に従って行った。SOCS2ノックダウンの効率は、qRT-PCRおよびウェスタンブロッティングを用いて評価した。

マクロファージの単離
ドナーマウスにMAを5日間連続投与し、腸管I/R傷害を36時間行った後、マウスを犠牲にして脾臓を摘出した。脾臓免疫細胞を上記のように単離し、さらに磁気ビーズ分離法を用いてマクロファージを単離した。要するに、単一細胞懸濁液中の細胞数を測定し、細胞懸濁液を遠心分離する。細胞ペレットを抗F4/80マイクロビーズ（130-110-443、Miltenyi Biotec、ドイツ）とメーカーの指示に従ってインキュベートする。

移植
腸管I/R損傷を受けたレシピエントマウスに、クランプ解除後すぐに2-3×10^6マクロファージを静脈注射した。

統計解析
統計解析はGraphPad Prism（バージョン8.3.0）ソフトウェアを用いて行った。Kaplan-Meier生存曲線には両側log-rank検定を用いた。Shapiro-wilk検定は、データが正規分布しているかどうかを判定するために使用される。正規分布データの場合、独立した2群の平均を比較するために両側スチューデントのt検定を用いた。一元配置分散分析（One-way ANOVA）と二元配置分散分析（Two-way ANOVA）、それに続くTukeyの多重比較検定（Tukey's multiple comparisons test）が、2つ以上のグループの平均を比較するために用いられた。正規分布でないデータについては、Mann-Whitney検定などのノンパラメトリック法を用いた。すべてのデータは平均値±標準偏差で表した。P < 0.05を統計的に有意とみなした。さらなる統計的詳細については、個々の図の説明を参照のこと。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
すべてのデータは本文または補足資料で入手できる。発現差のあるメタボローム生データは補足資料に掲載されている。本研究の生のRNA-seqデータはSequence Read Archive (SRA)にアクセッションコードSRP434172で寄託されている。ソースデータは本論文とともに提供される。

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謝辞
図の模式図はSmart Medical Art (SMART): https://smart.servier.com/。貴重なご指導をいただいたPeng Chen教授、SOCS2-/-繁殖ペアを提供していただいたZai-Long Chi教授に感謝する。中国北京市国家自然科学基金（82172141 to Kexuan Liu）、中国北京市国家自然科学基金重点計画（82330067 to Kexuan Liu）からの資金援助に感謝する。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Fang-Ling Zhang、Zhen Hu、Yi-Fan Wang。

著者および所属
南方医院麻酔科、南方医科大学、広州、510515、中国

張芳玲、胡振、王毅範、張文健、周伯偉、孫基俊、林澤斌、劉克宣

貢献
K.-X.L.、F.-L.Z.、Z.H.はプロジェクトの設計と運営に貢献した。F.-L.Z.とZ.H.は実験の実施に貢献した。Y.-F.W.は実験データを収集した。Z.-B.L.およびQ.-S.S.は患者から糞便および血液サンプルを採取した。F.-L.Z.とY.-F.W.はデータの正確性をチェックし、統計解析を行った。F.-L.Z.とW.-J.Z.は表と図を作成した。B.-W.Z.は原稿の編集と査読を行った。著者全員が原稿を修正した。著者らは最終原稿を読み、承認した。

責任著者
Ke-Xuan Liuまで。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、Kaatje Lenaerts氏、油井史朗氏、および本論文の査読に貢献した匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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この記事の引用
張楓（Zhang, FL.）、胡錦濤（Hu, Z.）、王陽峰（Wang, YF.）ら、L-リンゴ酸を介したM2マクロファージ極性化により、オルガノイド移植がマウスの腸管虚血再灌流障害を抑制することを明らかにした。Nat Commun 14, 6779 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42502-0

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受領
2023年02月01日

受理
2023年10月12日

掲載
2023年10月25日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-42502-0

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