早産新生児における早期の抗生物質使用による耐性菌の増加

早期発症の敗血症を経験的に治療するために新生児に抗生物質を標準的に使用することは、新生児の腸内細菌叢に悪影響を及ぼす可能性があり、長期的に健康に影響を及ぼす可能性がある。早産児における抗菌薬耐性と新生児集中治療室における抗生物質の使用に関する研究は限られている。早産児の抗菌薬耐性に対する早期の抗菌薬介入の効果をより深く理解することは極めて重要である。このレトロスペクティブ研究では、メタゲノムシークエンシングを用いて、症候性早産新生児における定期的早期抗生物質使用研究に登録された早産児の糞便およびそれに続く便サンプル中の抗生物質耐性遺伝子（ARG）を評価した。分類学的プロファイリングとARG同定のために、早産児30例の糞便サンプルのサブセットを用いて微生物メタゲノミクスを実施した。すべての早産児がARGを示し、175のユニークなARGが同定され、主にβ-ラクタム、テトラサイクリン、アミノグリコシド耐性と関連していた。注目すべきは、23％のARGが、分娩直後または分娩中に抗生物質に曝露されていない早産児に認められたことである。出生後の抗生物質曝露は、細菌が抗生物質の圧力に耐えるのを助けるメカニズムを変化させながら、β-ラクタム/テトラサイクリン耐性を増加させる。微生物プロファイリングにより774の細菌種が明らかにされ、抗生物質未投与の乳児は、治療を受けた乳児と比較して、微生物叢およびレジストームにおいてより高いα多様性（P= 0.005）を示し、より複雑な生態系が示唆された。早産児における高いARG有病率は、抗生物質への直接曝露に関係なく観察され、年齢とともに増加した。早産児のレジストームとマイクロバイオームの変化は、新生児腸内のARGプロファイルの形成に極めて重要である。

本研究はClinicalTrials.govに NCT02784821として登録されている。

重要性

早産児における抗生物質耐性の高い負荷は、新生児の健康に重大な課題をもたらす。抗生物質耐性遺伝子の存在は、シグナル伝達、エネルギー産生、代謝機構における変化とともに、早産児の治療戦略を複雑にし、有効でない治療のリスクを高め、これらの脆弱な新生児の転帰を悪化させる。早産児は、抗生物質による直接的な治療を受けていないにもかかわらず、抗生物質耐性菌が多い。このことは、妊娠中およびそれ以降の母親の抗生物質曝露や、長引く膜破裂のような妊娠合併症など、より広範な影響が複雑に絡み合っていることを強調している。新生児の健康を守り、この脆弱な集団における抗菌薬耐性の深刻な脅威に対抗するためには、慎重な抗生物質の使用や妊産婦ケアの強化など、緊急の対応が不可欠である。

はじめに

抗菌薬耐性は、病院や地域社会に影響を及ぼす世界的な健康上の大きな課題であり、年間21万4,000人の新生児死亡の一因となっていると推定されている(1 -3)。早産児は、腸管や免疫の未熟さ、腸内微生物の多様性の減少といった固有の脆弱性により、こうした脆弱な集団の中でも際立っている(4,5)。この未発達のために早産児は敗血症に罹患しやすく、世界的に新生児集団の死亡率および罹患率の主な原因となっている。出生後72時間以内に発症する感染症である早期発症敗血症（EOS）は、特に問題となる。EOSは通常、分娩中または母体が血流感染症に罹患している場合や、子宮内で感染や炎症に長期間さらされた場合に発生する垂直感染に起因する(6,7)。EOSの主な危険因子には、長期の膜破裂、早産、子宮内での母体感染の臨床症状（絨毛膜羊膜炎）、B群レンサ球菌（GBS）による母体のコロニー形成が含まれる(6)。それにもかかわらず、EOSの正確な診断は、初期臨床症状のあいまいな性質、診断検査の限られた予測値、および抗生物質治療の延期に関連する潜在的に悲惨な転帰のために困難である(8)。

新生児にとって致命的な脅威であるEOSのリスクと闘うために、培養で感染が確認されていない場合でも、しばしば出生後24時間以内にempiric抗生物質が投与される(9)。その結果、感染していない新生児の30〜40％が、その後EOSが確認されるたびに不必要に抗生物質にさらされている(10)。抗生物質に対するこのような積極的なアプローチは、初期の腸内常在菌を変化させることによって、発育中の腸内細菌叢に長期的な犠牲を強いる可能性があり、新生児の健康に予期せぬ結果をもたらすことになる（11,12 ）。さらに、このハイリスク集団における抗菌薬耐性遺伝子の有病率やマイクロバイオーム構成に対する持続的な抗生物質使用の影響についても、より適切に解明されなければならない。抗生物質耐性が世界的な関心事となっている一方で、未熟児の抗生物質使用に関する研究には顕著なギャップがある。遺伝子の特徴付けに焦点を当てた研究は限られており、新生児集中治療室（NICU）間での抗生物質使用習慣のばらつきの要因を理解することは、依然として進行中の課題である。

ルーチンに使用される抗生物質が早産児の抗菌薬耐性に与える影響を理解することが最も重要である。フロリダ大学のREASON（Routine Early Antibiotic Use in SymptOmatic Preterm Neonates）研究では、早産児の腸内細菌叢、メタボローム、炎症環境に対する抗生物質の影響を調査した(11)。その結果、抗生物質の投与中止は新生児の死亡率や罹患率の有意な増加にはつながらないことが明らかになった。この極めて重要な観察は、臨床現場における従来の仮定を覆すものである。Russellら(13)はまた、個々の未熟児のサブセットにおいて、抗生物質の投与が経時的に糞便微生物叢の多様性に有意な影響を及ぼさないことを示し、根底にある耐性メカニズムを示した。別のサブセットでは、早産児の26％に二種類の抗生物質（ゲンタマイシンとアンピシリン）を投与したところ、抗生物質耐性を引き起こす日和見病原体を多く含む腸内細菌科が増加した(13)。

米国中西部のNICUで実施された未熟児を対象とした他の研究でも同様の観察結果が報告されており、そこでは主にアンピシリンやゲンタマイシンが投与された場合に、抗生物質投与後に腸内マイクロバイオームが潜在的病原体の増加を示した(14)。抗生物質への長期的な曝露は、全体的な微生物多様性の低下と関連しており、ビフィズス菌科のような有益な微生物が減少している。ビフィズス菌科は、ヒトの母乳やオリゴ糖を効率よく発酵させ、腸内で必須の栄養源である短鎖脂肪酸を産生する初期の腸内コロニー形成者である。このことは、一般的に抗菌薬耐性と関連する病原性腸内細菌科細菌の増加につながり、敗血症のリスクを増大させる(15,16)。これらの予備的結果は、抗生物質が早産児に与える影響について、特にこの脆弱な集団における耐性機序の発達を理解することに重点を置いて、さらなる調査を行う必要性を強く示している。この敏感な時期の介入が健康に長期的な影響を及ぼす可能性があることを考えると、早産児における抗生物質使用の結果について深く掘り下げることが不可欠である。抗生物質が耐性菌の発生に与える影響を理解することで、この集団における抗生物質耐性を緩和するための、より正確で実用的な戦略を開発することができる。抗生物質耐性は、細菌が進化し、抗生物質耐性遺伝子（ARG）を持つことによって抗生物質に対抗する新たな戦略を開発し、細菌が抗生物質の効果を克服できるようになり、細菌感染症の治療に抗生物質が有効でなくなることによって生じる(17)。細菌集団に存在するARGの集合はレジストームとして知られている。本研究の目的は、REASON試験に登録された早産児のサブセットから、特に早産児の糞便および便サンプルからARGの有病率を検出し定量化することである。この調査では、早産児に標準治療として抗生物質を日常的に使用することにより、レジストーム中のARG遺伝子の有病率が増加するかどうか、またそれが乳児のマイクロバイオームをどのように変化させるかを評価する。

材料と方法

研究概要、便サンプリング、調査データ収集

このレトロスペクティブ研究では、REASON研究に登録された参加者の早産児の糞便および便サンプル中のARGを検出し定量化するために、メタゲノムシークエンシングを実施した。REASON試験は2017年1月から2019年までフロリダ大学で実施され、新生児を生後48時間以降に抗生物質を投与する群と投与しない群に無作為に振り分けた最初の試験である(11)。この試験はフロリダ大学のInstitutional Review Board（IRB 201501045）によって承認された。早産児からメコニウム（一般的に出生後24～48時間以内に排出される最初の便）と便のサンプルを出生後退院まで毎週採取した。早産児の母親の病歴、治療、摂食に関する情報は、91人の新生児（妊娠33週未満）から採取した最初の便サンプルの分注とともに記録した。新生児腸内細菌叢の微生物多様性に対する抗生物質使用の影響を調査した予備研究(13)があるため、サンプルは-80℃で保存した。

サンプルの入手可能性に基づき、30人の早産児を本研究の対象として選択した（図1 ）。30人の早産児のうち、抗生物質が投与された症候性早産児（n＝16の治療群）と抗生物質が投与されなかった無症候性早産児（n＝14の対照群）から採取された糞便（出生後最初に通過した便）と便（出生後2週から23週の退院前）を本研究で解析した（Fig.）

図1

図1：REASON縦断コホートおよび抗生物質耐性研究の解析方法を示すフローチャート。図の左側は、REASON研究（n= 91早産新生児）から収集されたサンプルの種類とメタデータを強調している。本研究では、30人の早産新生児から、退院前に採取された糞便および便検体を含む、2つのサンプリング時点にわたる検体のサブセットを、ARGの存在について評価した。ARG検出と新生児の健康転帰を促進する潜在的決定因子を分析した。この図はCanvaとBioRenderを用いて作成した。

図2

図2サンプリングの概略図と参加者の属性。合計30人の新生児を対象とし、出生直後（基本便）と退院直前（終便）の2時点で便サンプルを採取した。30人の新生児のうち、16人は出生時に抗生物質治療を受け（黄色の線）、14人は受けなかった（灰色の線）。出生時に抗生物質の投与を受けなかった新生児は、研究期間中、抗生物質への曝露がなかった。新生児の妊娠週数は24週から32週で、中央値は29週、標準偏差（SD）は2.55であった。その他の情報として、分娩様式、母親への抗生物質投与（21人の母親が分娩中に抗生物質を投与された）、便サンプル採取のタイミング（出生後最初の便は青丸、退院前は赤四角で表示）などがあった。PEIは早産児を意味する。乳児IDとは、本研究を通じて各参加者に割り当てられた固有の識別子を指す。

表1

表1本研究で解析した早産児の臨床的特徴（n=30）a

変数新生児治療群

抗生物質

53% (n= 16) コントロール

46% (n= 14)

乳児の性別

男性 62.5%（n= 10） 35.7%（n= 5）

女性 37.5%（n= 6） 64.3%（n= 9）

妊娠月齢

超早産（PB）（28週未満） 43.8%（n= 7）0%（n= 0）

超早産（28週～32週未満）50％（n= 8）57％（n= 8）

中等度PB（32週～37週未満） 6.2%（n= 1）43%（n= 6）

分娩様式と母体の健康状態

経腟分娩 43.8%（n= 7）50％（n= 7）

帝王切開 56.2%（n= 9）50%（n= 7）

膜破裂（ROM）の長さ 18時間未満 68.7% (n= 11) 64.3% (n= 9)

ROMの長さ＞18時間 31.3% (n= 5) 35.7% (n= 5)

GBS (+) 6.3% (n= 1) 14.3% (n= 2)

GBS (-) 56.2% (n= 9) 64.3% (n= 9)

GBS（不明） 37.5%（n= 6） 21.4%（n= 3）

クラミジア（-） 94.7%（n= 15）93%（n= 13）

硫酸マグネシウム（＋）100％（n= 16）79％（n= 11）

硫酸マグネシウム（-）0％（n= 0）21％（n= 3）

出生時体重

≤1,128 g以下 75% (n= 12) 21.4% (n= 3)

>1,128 g25%（n= 4） 78.6%（n= 11）

母親の抗生物質使用率

ANC 抗生物質 (+) 56% (n= 9) 78% (n= 11)

分娩内抗生物質（+）88%（n= 14）50%（n= 7）

PEI 抗生物質使用率

ゲンタマイシン（＋） 100% (n= 16) 0% (n= 0)

アンピシリン（＋） 100% (n= 16) 0% (n= 0)

アジスロマイシン（+） 12.5%（n= 2）0%（n= 0）

メトロニダゾール（+） 37.5%（n= 6）0%（n= 0）

ピペラシリン（+）50%（n= 8）0%（n= 0）

セフォタキシム（＋） 25% (n= 4) 0% (n= 0)

セフタジジム（+） 18.7%（n= 3）0%（n= 0）

バンコマイシン（+）50%（n= 8）0%（n= 0）

経腸栄養の実施

経腸栄養なし（+） 94.7%（n= 15）79%（n= 11）

母親とドナーによる母乳栄養（+） 68.7%（n= 11） 28.6%（n= 4）

母乳栄養（+）75%（n= 12）71%（n= 10）

ドナー母乳（+） 68.7%（n= 11） 28.6%（n= 4）

粉ミルクを与えた（＋） 81.3%（n= 13） 85.7%（n= 12）

強化ミルクを与えた（＋） 81.3% (n= 13) 64.3% (n= 9)

PEIの健康アウトカム

壊死性腸炎（NEC） 13% (n= 2) 0% (n= 0)

EOS 6.3% (n= 1) 0% (n= 0)

遅発性敗血症（LOS）44%（n= 7）0%（n= 0）

気管支肺異形成（BPD） 63% (n= 10) 0% (n= 0)

死亡 6% (n= 1) 0% (n= 0)

早産児の妊娠週数は24週から32週の間であった。さらに、世界保健機関（WHO）の基準に基づき、極早産（28週未満）、超早産（28週から32週未満）、中等度早産から後期早産（32週から37週未満）に分類された。PEIは早産児を意味する。

サンプル処理、DNA抽出、塩基配列決定

DNAesasy PowerLyzwer Power Soil Kit（Qiagen、米国メリーランド州）を用いて60検体から全DNAを抽出した後、dsDNA High Sensitivity Assay（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州）を用いてQubit 4.0プラットフォームでDNAを定量し、DNA収量を評価した。定量後、Native Barcoding Kit 96V14 (SQK-NBD 114.96)を用い、エンドプレップした DNA の量を 10 倍に増やし、その他の試薬をバーコードライゲーション用に変更し、サンプルあたり 50 ng のゲノム DNA をバーコード化した。DNA抽出、ライブラリー調製、配列決定の間、ネガティブコントロール（バックグラウンドノイズ）としてヌクレアーゼを含まない水を使用した。最終ライブラリーをR10.4.1 (FLO-MIN106)フローセルにロードし、MinION装置を用いて72時間シーケンスした後、Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) AMRツールに基づくリアルタイム抗菌薬耐性プロファイリング用EPI2ME ARMAワークフローを用いてデータ解析を行った(18)。

ナノポアの生信号は、Guppyを通してリアルタイムでリードに処理された。バーコードはトリミングされ、qscore < 10のリードはEPI2MEの前にChopperを用いてフィルターされた(19)。合計2,581,644リードが解析され、サンプルあたりの平均リード数は34,536、平均シーケンス長は4,174、品質スコアは12以上であった。微生物群集の分類学的組成を決定するために、NCBI RefSeqデータベース(20)とシーケンシングリードを比較するWhat's In My Potツールを用いて分類学的プロファイリングを行った。マイクロバイオーム解析のために、<2,504遠心スコアの分類学的分類は削除した（21,22 ）。機能アノテーションは、minimap2を用いてCARDに対して配列をアライメントすることにより、潜在的なARGを同定するために行った。アライメント精度が87％以上の臨床的に関連性のあるARGのみが考慮された。ARGの存在量は、平均遺伝子数/ギガ塩基対（gbp）のライブラリーサイズに基づいて正規化した。この正規化方法は他の文献でも検証されている(23,24)。以下の式によると、種レベルでの正規化ARG存在量は、ARGの総カウント（種ごと）をデータ中のヌクレオチドの総数/1gbpで割ることによって計算される(23,24)。ARGは、Center for Disease Control（CDC）の多剤耐性の定義（3つ以上の薬剤クラスの少なくとも1つの抗生物質に対する耐性を含む）に従い、抗生物質クラスに基づいてサブグループに分類された。

最後に、DIAMOND + MEGANパイプラインを使用して、配列をNCBI-nrデータベースにアライメントし、SEED分類に基づいて機能ビニングを行った。

ARGabundance(species)=ARGcounts(perspecies)[ 配列決定されたヌクレオチドの総数/1(Gbp)]。

統計解析

すべての統計解析はR v4.3.1で実行され、母親の健康状態、新生児の治療、摂食習慣を含むすべての調査データはREDCapに安全に保存され、処理のためにCSVファイルとしてエクスポートされた(25,26)。早産児のレジストームとマイクロバイオームの多様性の正規性は、Shapiro-Wilks検定を用いて検定した。腸内レジストームのα多様性はShannon Indexを用いて測定した。シャノン指数は、存在する種の数とそれらの相対的な存在量を考慮することで、群集の多様性を測定する。乳児レジストームとマイクロバイオームのβ多様性は、Bray-Curtis非類似度行列を用いた主座標分析を用いて評価した。早産児レジストームとマイクロバイオームの組成とメタデータ変数の有意差を決定するために、距離行列を用いたveganパッケージの（Adonis）検定で実装された Permutational Multivariate Analysis of Variance（PERMANOVA）を各因子について実施した（27,28 ）。最後に、早産児レジストームの存在量の差異をWilcoxon符号順位検定を用いて解析した。ARGの存在量は中心対数比（CLR）を用いて変換した（29）。この方法は、同じサンプル内のすべてのARG存在量の幾何平均値に対して各ARG値を較正することにより、異なるサンプル間で総ARG数が異なることに伴う固有の偏りを軽減する。同様に、MEGANからの機能的出力は、最小サンプリング深度1,000配列まで希釈した後に解析した。効果量はrstatixパッケージのwilcox_effsize関数を用いて計算した(30)。

結果

コホートの概要

極早産（妊娠28週未満）が23.3％（7例）、超早産（28週から32週未満）が53.3％（16例）、中等早産（32週から37週未満）が23.3％と、さまざまな妊娠月齢の新生児30例（男性19例、女性11例）が研究に組み入れられた。30人の新生児のうち、43％（13/30人）は経膣分娩で、57％（17/30人）は帝王切開で出産された。膜破裂の持続時間［膜破裂（ROM）長］は1時間未満から647時間と幅が広く、平均ROM長は77時間であった。乳児の出生体重は525〜2230gで、中央値は1128gであった。

母親と新生児の両方による抗生物質の使用は熱心に記録された。合計67％（20/30）の母親が妊娠中に抗生物質を投与されたと報告した。最も頻繁に投与された抗生物質はアジスロマイシンであり、次いでアンピシリンとアモキシシリンが単独で投与された。さらに、抗生物質を投与された母親の50％は、妊娠中のある時点でアモキシシリン、ゲンタマイシン、セファゾリンの組み合わせを投与されたと回答した。分娩時、21/30人（70％）の母親が抗生物質の投与を受けていた。今回もアンピシリンが最も多く処方され、単独投与（12/21例）またはセファゾリンとの併用投与（14/21例）であった。

早産児の抗生物質レジメンは、NICU観察中の個々の健康評価に合わせて綿密に調整され、その結果、投与された抗生物質の種類は多岐にわたった。しかし、抗生物質を投与されたすべての早産児には、アンピシリン単独またはゲンタマイシンとの併用など、広域スペクトルの薬剤が投与された。この戦略的な組み合わせは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の広範なスペクトルを効果的に標的とするもので、一般的な小児疾患を管理するための標準化されたプロトコルに従った世界保健機関（WHO）の勧告に沿ったものである。このアプローチによると、予防的抗生物質療法は少なくとも2日間開始され、その後、感染リスクが証明された新生児には再評価が行われる。ゲンタマイシン系やペニシリン系などのアミノグリコシド系抗生物質は、新生児環境におけるEOS治療の第一選択抗菌薬として一般的に使用されている(31)。アンピシリンとゲンタマイシンが主要な抗菌薬であったが、アモキシシリン、バンコマイシン、セフォタキシム、アジスロマイシン、クリンダマイシン、オキサシリンなどの他の抗菌薬の投与も記録された。新生児への抗生物質投与期間はケースバイケースで異なり、3日間のものから12日間にわたる連続コースまであった。入院期間は分娩後1～19週であった。抗生物質を投与された早産児の入院期間は、対照群（中央値＝4、SD2.3週）より3倍長かった（中央値＝11、SD4.48週）。患者のデモグラフィックと健康状態に関する詳細は表1にある。

早産児の腸内レジストームはARGの豊富な多様性を示した

研究を通して、合計175の異なるARGが検出された。これらのうち、ARGは26人の早産児のメコニウムサンプルと30人すべての早産児の便サンプルから同定された。各陽性検体には平均して約11個のARGが検出されたが、標準偏差は7.4であり、検体間のばらつきが認められた。ARG検出率は、乳児が成熟するにつれて79％の症例で増加した（P= 0.009、効果量 = 0.337、検出力 = 99％）（図3A）。新生児期の抗生物質投与は、メコニウム検体で検出されたARGの数には影響を与えなかったが、便検体でのARG検出には中程度の影響を与えた（P= 0.069、効果量 = 0.335、検出力 = 62%）（図3A ）。

図3

図3早産児の糞便および便におけるARGの多様性と存在量。(A) ウィルコクソンの符号順位検定を用いて、時間（メコニウムと便）と治療に基づいて各幼児で同定されたユニークなARGの数。抗生物質（+）は、抗生物質（-）を投与されなかったPEIと比較して、治療を受けたことを示す。B） PEIレジストームのα多様性を、治療と時間に基づいて示す。(C）治療とサンプルの時間軸に基づくARGの相対的存在量。最も存在量の多い上位25のARGが報告されている。PEIは早産児を表す。

同定された175のARGは15の異なる薬物クラスに対応した。その中で、β-ラクタム系62.3％（109/175 ARG）、テトラサイクリン系9.7％（17/175 ARG）、アミノグリコシド系6.3％（11/175 ARG）が最も多く、次いでマクロライド-リンコサミド-スルフィド（MLS）系5.1％（9/175 ARG）であった（表S1）。胎便では、15種類の薬剤すべてに関連するARGが検出され、そのうちβ-ラクタム系（67/109 ARG）、テトラサイクリン系（10/17 ARG）、アミノグリコシド系（5/11 ARG）が優勢であった。

フシダンとホスホン酸に対する耐性は、26人中3人の乳児のメコニンにのみ検出され、便検体では13種類の薬剤にARGが検出された。解析の結果、ユニークなARGの数に時間的な有意差は認められなかったが、テトラサイクリンは早産児の99%で経時的な増加を示した（P= 0.023、効果量 = 0.89、検出力 = 100%）（図S1）。新生児の抗生物質投与と薬剤耐性との間に、メコニウムサンプルを用いた統計学的な差は確認されなかった（図S2）。しかし、抗生物質を投与されなかった乳児は、抗生物質を投与された新生児よりもジアミノピリミジンに関連するARGが多かった（P= 0.031、効果量 = 0.68、検出力 = 99.5％）（図S3）。最後に、23.4％（41/175）のARGが、新生児期や分娩中の抗生物質曝露に関係なく持続した。ここでも、β-ラクタム系ARGが51.2％（21/41）と最も多く、次いでMLSが12.3％（5/41）、テトラサイクリンが9.8％（4/41）であった。それぞれの耐性メカニズム（すなわち、抗生物質の不活性化、標的変更、抗生物質の標的保護、標的置換、または排出）に分類すると、抗生物質の不活性化に関連する遺伝子は、一般的に抗生物質を修飾または分解する酵素をコードしており、経時的な有病率が最も高く、新生児の抗生物質治療レジメンに関係なく観察された（図S4）。

ARGの多様性によって測定される薬剤耐性プロファイルの変化は、経時的に観察された。さらに、レジストームはARGの多様性において増加傾向を示した（P= 0.022、効果量 = 0.32、検出力 = 81%）。新生児期の抗生物質投与は、メコニウムレジストームの多様性には影響を及ぼさなかったが、便レジストームの多様性には影響を及ぼした。抗生物質を直接投与されなかった早産児は、抗生物質を投与された児よりもARGの多様性が高かった（P= 0.022、効果量 = 0.42、検出力 = 79%）（図3B）。さらに、膜破裂（ROM）が18時間以上持続した母親から生まれた乳児の33％は、ROM持続時間の短い乳児と比較して、便レジストームにおいて高いARG多様性を示した（P= 0.035、効果量 = 0.39、検出力 = 76％）（図S6）。特に、ROM期間が長い母親から生まれたこれらの乳児の99％が、β-ラクタム薬耐性に対応するユニークなARGの量の増加を示し、有意な差を示した（P= 0.0079、効果量 = 1.28、検出力 = 100％）（図S8）。母親のGBSコロニー形成は統計的に乳児のメコニウムや便のレジストームに影響を与えなかったが、これは本研究の乳児の30％が出産時に母親がGBSの状態不明であったことに起因すると考えられる。注目すべきは、母親のGBS状態が不明であった乳児の71％が、GBS陰性例と比較して、メコン中のARG多様性が大きかったことである（P= 0.056、効果量 = 0.396、検出力 = 55％）。この所見は、早期のGBSスクリーニング対策の必要性を強調するものである。早期のGBSスクリーニングが行われず、母親の症状が存在する場合、しばしば予防的抗生物質の使用につながり、GBSの状態が不明な母親の78％（n= 7/9）が分娩中に抗生物質を投与された。ARGの多様性は、分娩様式、乳児の性別、絨毛膜羊膜炎の臨床診断、出生後または退院前の母親の抗生物質使用による影響を受けなかった（図S5～S15）。

母親と新生児の抗生物質使用は早産児のレジストームを経時的に形成する

早産児の糞便レジストームのARGβ多様性に影響を与える因子を理解するためにPERMANOVA解析を行った。母親の抗生物質使用、分娩方法、新生児の治療、哺乳方法を組み込んだ多変量解析では、これらの因子がメコニウムレジストームの変動に有意に寄与する因子であることは同定されなかった（表2）。一対比較によるR²値は、妊娠中の抗生物質の使用がメコニウムレジストームの変動の7％（R²= 0.066、P= 0.018）を、分娩中の抗生物質の使用が6％（R²= 0.059、P = 0.041）を説明することを示した。特に、分娩中のアンピシリン使用は、この分散の8％（R2= 0.082、P= 0.006）を占めた（表S2）。

表2

表2早産新生児のメコニウムレジストームとマイクロバイオームのPERMANOVA分析a

因子変数レジストームマイクロバイオーム

R2 F P値R2 F P値

ANC 出生前抗生物質（あり/なし） 0.03412 0.8011 0.726 0.05224 1.88260.072*出生前抗生物質投与数

出生前抗生物質投与数 0.04475 1.0509 0.464 0.04403 1.5869 0.112

分娩産褥内抗生物質投与数 0.04089 0.9602 0.571 0.02562 0.9234 0.539

分娩時抗生物質の投与（あり／なし） 0.06624 1.5554 0.116 0.0641 2.31020.021***分娩時抗生物質の投与（あり／なし

クラミジア 0.05093 1.1959 0.326 0.04042 1.4567 0.157

gbs 0.09961 1.1695 0.322 0.08173 1.4728 0.118

硫酸マグネシウム 0.04378 1.0281 0.471 0.03176 1.1445 0.348

ROMの長さ≧18時間 0.03861 0.9066 0.607 0.04991 1.79890.09*0.04991 1.79890.09

分娩様式 0.03772 0.8857 0.62 0.03437 1.2387 0.28

妊娠月齢 0.03724 0.8745 0.649 0.01371 0.4943 0.924

出生時体重 0.05381 1.2636 0.259 0.08096 2.91780.005**乳児性別

PEI治療乳児の性別 0.04792 1.1253 0.371 0.03462 1.2476 0.252

グループ（抗生物質：あり/なし） 0.04702 1.104 0.404 0.02939 1.0592 0.388

アンピシリンとゲンタマイシンの投与 0.01824 0.4283 0.987 0.03053 1.1003 0.382

抗生物質投与回数 0.03387 0.7953 0.734 0.03861 1.3915 0.19

抗生物質の平均投与期間 0.03294 0.7735 0.772 0.03366 1.2133 0.278

入院期間 0.03178 0.7462 0.786 0.03001 1.0816 0.367

PEI栄養経腸栄養なし 0.04751 1.1156 0.388 0.02115 0.7623 0.701

母乳と母乳ドナーの併用（あり/なし） 0.02935 0.6892 0.843 0.03992 1.4389 0.165

哺乳母乳（あり/なし） 0.03232 0.7589 0.764 0.01938 0.6983 0.775

ドナーからの母乳（あり／なし） 0.03549 0.8334 0.707 0.01955 0.7046 0.736

粉ミルクを与えた（「はい／いいえ」） 0.02822 0.6627 0.866 0.01401 0.5048 0.933

人乳強化剤の投与（あり／なし） 0.02506 0.5885 0.922 0.03157 1.1378 0.322

PERMANOVA、並べ替え多変量分散分析、ARGSs、抗生物質耐性。統計的に有意なP値を持つ変数は太字で、*とわずかに有意なP値を太字で注釈した。26のメコニウムサンプルから得られた知見がこの表に含まれている。乳児レジストームとマイクロバイオームからは、175のユニークなARGと774の細菌種が検出された。統計的に有意なP値を示した変数には**を、わずかに有意なP値を*で示した。PEIは早産児を表す。

メコニウムレジストームとは対照的に、妊娠中に母親が使用した抗生物質の数（R2= 0.044,P= 0.054）、乳児の出生時体重（R2= 0.043,P= 0.041）、新生児の抗生物質使用量（R2= 0. 055,P= 0.016）が便レジストームの変動の約5％に寄与し、新生児へのアンピシリンとゲンタマイシンの投与（R2= 0.041,P= 0.074）がわずかに影響していた（表3）。早産児へのβラクタム系抗菌薬の投与は便レジストームに影響を及ぼし、そのうちアンピシリンとセフタジジムはレジストームの変動の5〜6％に寄与した（アンピシリン-R2= 0.052,P= 0.046,セフタジジム-R2= 0.063,P= 0.0006）（表S3）。

表3

表3早産新生児の便レジストームとマイクロバイオームのPERMANOVA分析a

因子変数レジストームマイクロバイオーム

R2 F P値R2 F P値

ANC 出生前抗生物質投与（あり／なし） 0.03667 1.3046 0.151 0.04574 1.70350.078* 0.078

出生前抗生物質投与数 0.04355 1.54960.054** 0.05043 1.87820.054**分娩数

分娩産褥内抗生物質投与数 0.0372 1.3237 0.143 0.04229 1.5749 0.115

分娩時抗生物質投与（あり／なし） 0.03404 1.211 0.232 0.04212 1.5688 0.105

クラミジア 0.02987 1.0626 0.39 0.03385 1.2607 0.279

gbs 0.07365 1.3102 0.115 0.05195 0.9674 0.504

硫酸マグネシウム 0.03817 1.3579 0.106 0.04006 1.4921 0.119

ROMの長さ≧18時間 0.03748 1.3335 0.118 0.04751 1.76940.094*の場合

分娩様式 0.03764 1.3393 0.141 0.03039 1.1319 0.347

妊娠月齢 0.03916 1.3934 0.103 0.02226 0.829 0.618

出生時体重 0.04277 1.52170.041* 0.04519 1.6830.088*乳児性別

PEI治療乳児の性別 0.03844 1.3675 0.131 0.04113 1.5317 0.13

グループ（抗生物質：あり/なし） 0.05463 1.94350.016** 0.05739 2.13730.03***0.05739 2.13730.03***0.05463 1.94350.016**

アンピシリンとゲンタマイシンの投与 0.04074 1.44940.074* 0.03507 1.306 0.225

抗生物質の投与回数 0.03433 1.2216 0.246 0.02513 0.9361 0.513

抗生物質の平均投与期間 0.03423 1.2177 0.218 0.03374 1.2567 0.232

入院期間 0.02716 0.9662 0.486 0.02559 0.9529 0.472

PEI栄養経腸栄養なし 0.03474 1.2358 0.201 0.02449 0.9121 0.552

母乳と母乳ドナーの併用（あり/なし） 0.03003 1.0684 0.407 0.02622 0.9764 0.491

哺乳母乳（あり/なし） 0.0219 0.7791 0.765 0.01521 0.5665 0.879

ドナーの母乳を与えた（はい/いいえ） 0.02647 0.9418 0.579 0.02299 0.8562 0.574

粉ミルクを与えた（「はい／いいえ」） 0.03223 1.1468 0.292 0.05046 1.87940.06*ヒト乳強化剤の投与

人乳強化剤の投与（あり／なし） 0.03437 1.2227 0.209 0.05652 2.1050.029***乳強化剤の投与（あり／なし

PERMANOVA、並べ替え多変量分散分析、ARGSs、抗生物質耐性。統計的に有意なP値を持つ変数は太字で、*とわずかに有意なP値は太字で注記した。30検体の便から得られた結果がこの表に含まれている。乳児レジストームとマイクロバイオームからは、175のユニークなARGと774の細菌種が検出された。統計的に有意なP値を示した変数には**を、わずかに有意なP値を*で示した。PEIは早産児を表す。

最後に、メコニウムと便の乳児レジストームが有害な健康転帰に及ぼす影響を調査した。新生児のメコニウムレジストームと有害な臨床転帰との間に直接的な関連は認められなかったが、EOSと気管支肺異形成（BPD）の状態は早産児の便レジストームの変動の4～6％に寄与していた（EOS-R2= 0.046、P= 0.032、BPD-R2= 0.063、P= 0.004）（表4）。このことは、生後早期の健康上の有害事象が、乳児の年齢が上がるにつれてレジストームに長期にわたる影響を及ぼす可能性を示唆している。

表4

表4早産児のメコニウム／便レジストームおよびマイクロバイオームと新生児有害転帰に関するPERMANOVA分析a,b

変数レジストームマイクロバイオーム

R2 F P値R2 F P値

PEI メコニウム

NEC 0.03759 0.9459 0.553 0.03193 0.9533 0.524

EOS 0.03889 0.9785 0.521 0.04624 1.38060.058*LOS 0.04692 1.9459 0.553 0.03193 0.9533 0.524

ロス 0.04692 1.1806 0.221 0.0483 1.4421 0.136

BPD 0.04206 1.0584 0.369 0.03217 0.9604 0.463

死亡 0.03971 0.9991 0.57 0.03748 1.119 0.409

PEI便

NEC 0.04292 1.33080.094* 0.03577 1.14 0.354

エオス 0.04602 1.42670.032** 0.05791 1.84560.009***0.03524 1.3308 0.094*0.03577 1.14 0.354

ロス 0.03524 1.0926 0.326 0.01675 0.5339 0.929

BPD 0.06277 1.94620.004** 0.08642 2.75420.005**0.03894 1.0926 0. 326 0.01675 0.5339 0.929

死亡率 0.03894 1.2072 0.197 0.05007 1.59560.055***死亡率

この PERMANOVA は、乳児レジストームおよび腸内マイクロバイオームと新生児の健康転帰との関係を評価したものである。統計的に有意なP値を示した変数には**を、わずかに有意なP値を示した変数には*を付した。本解析では時間を交絡因子とみなした。PEIは早産児を表す。

BPDは、早産新生児（妊娠32週未満）において、生後28日目または月経後36週目に、肺実質疾患のX線所見を伴って、酸素の補充と呼吸補助が継続的に必要となることを特徴とする。BPDと診断された乳児は、この診断が入院後期の退院前に下され、採取された便サンプルのほとんどはBPDと診断される前のものであった。

抗生物質への早期曝露はβ-ラクタムおよびテトラサイクリン耐性を増加させる

この研究で、最も多く確認された薬剤耐性クラス上位5つは、β-ラクタム系、MLS系、LS系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系であった。β-ラクタム系、MLS系、LS系、テトラサイクリン系は、糞便および便検体において一貫して最も豊富であった。しかし、アミノグリコシド系抗菌薬は糞便検体に多く、多剤耐性抗菌薬は便検体に多かった。

ARGレベルでは、MLS（ErmCおよびErmB）、β-ラクタム系（TEM-4）、LS（IsaAおよびvgaC）、およびoqxB（多剤耐性）に関連するARGが、本試験を通して最も多かった（図3C；SM16）。82％〜85％のサンプルで、ErmC（P= 0.008、効果量 = 0.36、検出力 = 99％）、mecA（β-ラクタム薬をコード）（P= 0.0017、効果量 = 0.42、検出力 = 99％）がコードするMLS耐性に関連するARGが検出された。 42、検出力＝99％）、アミノグリコシドをコードするANT(4′)-Ib（P＝0.0017、効果量＝0.42、検出力＝99％）は、便検体と比較して、メコン検体でより豊富であった（図4A; ST 4）。メコニウムサンプルでは、新生児期の抗生物質投与がARGの存在量に中程度の影響を及ぼし、抗生物質投与を受けなかった早産児の方がErmCの存在量が多かった（P= 0.064、効果量 = 0.37、検出力 = 70%）。

図4

図4早産児のARGレベルでの耐性保有量のばらつき。(A ）メコニウムと便サンプルを用いたARGの経時的比較。パネルBおよびCは、それぞれメコニウム（n= 26サンプル/PEI）および便サンプル（n= 30サンプル/PEI）における新生児期の抗生物質治療に基づくARGの存在量の差異を示す。PEIは早産児を表す。

抗生物質を投与された早産児の72％は、β-ラクタムクラスに対する耐性遺伝子が多く（P= 0.04、効果量 = 0.32、検出力 = 58％）、中でもTEM-4ARGが最も多かった（P= 0.09、効果量 = 0.32、検出力 = 63％）（図4B; ST 5）。TEM-4遺伝子は、抗生物質を投与された早産児の便サンプルにおいて、より豊富で有意に高いことが持続した（P= 0.028、効果量 = 0.40、検出力 = 77%）。テトラサイクリン耐性遺伝子の存在量は両時点で比較的低いままであったが、抗生物質を投与された早産児は年齢が上がるにつれてtetB(P)の存在量が多くなった（P= 0.0045、効果量 = 0.51、検出力 = 92%）（図4C; ST 6）。

多剤耐性に関連するARGは2つ（oqxAとoqxB）しか検出されなかったにもかかわらず、早産児の97％（n＝29/30）で同定され、年齢が上がるにつれて有病率と存在量が増加した（図5）。oqxBは抗生物質治療を受けなかった早産児でより豊富であったが（図5A B ）、この差は統計学的に有意ではなかった。ROMの期間が便サンプル中の様々な薬物クラスにわたる多数のARGの存在量に有意に影響する一方で、ROMが長期化した母親から生まれた早産児の76％が多剤耐性の高い存在量を示すことが観察された（P= 0.023、効果量 = 0.42、検出力 = 80％）（ST 7）。特に、oqxB遺伝子は、早産児の80％において、このグループでより豊富であった（P= 0.0038、効果量 = 0.51、検出力 = 93％）。

図5

図5抗生物質曝露後の乳児腸管の機能プロファイリング。MEGANの出力を用いた機能解析。糞便サンプル（A-D）と便サンプル（E-H）（n= 合計60サンプル）を用いて存在量の差分を行った。

代謝シフトが抗生物質耐性を高める

機能アノテーションに基づき、我々は、メコニウムにおいて、抗生物質治療を受けた乳児の79％が、より高い環状ジ-GMPターンオーバータンパク質の存在量を示すことを見出した（P= 0.03、効果量 = 0.43、検出力 = 84％）。環状di-GMPは、様々な細胞プロセスを制御する重要な細菌メッセンジャーであり、付着や成熟したバイオフィルム構造の発達に大きく影響する(32,33)。さらに、環状di-GMPターンオーバータンパク質は、細胞内のバランスのとれた環状di-GMPレベルを維持し、細菌の行動や環境変化への適応に影響を与えている。さらに、いくつかの代謝経路が抗生物質処理によって影響を受けた。具体的には、抗生物質を投与した乳児の70％～85％がプロリン合成の増加を示した（P= 0.0056、効果量 = 0.56、検出力 = 83％）。プロリンは浸透圧ストレス下での浸透圧保護剤としての役割と、排出ポンプ活性をサポートする役割の二重の役割を果たすことで知られている(34)。続いて、D-ガラクツロン酸およびD-グルクロン酸の利用（P= 0.027、効果の大きさ = 0.46、検出力 = 67%）、リポ酸代謝（P= 0.059、効果の大きさ = 0.39、検出力 = 55%）、糖-リン酸ストレス制御（P= 0.044、効果の大きさ = 0.42、検出力 = 60%）が増加した（図5AからD; ST8）。これらの結果は、抗生物質投与が代謝に大きな変化をもたらし、不利な環境条件下での細菌の生存を促進することを示している。

この傾向は乳児が年をとるにつれて持続し、抗生物質治療を受けた乳児は、リポ酸代謝（P= 0.0018、効果量 = 0.39、検出力 = 75%）、D-ガラクツロン酸およびD-グルクロン酸利用（P= 0. 075、効果量＝0.46、検出力＝87％）、ジアミノピメリン酸（DAP）とペプチダーゼのクラスター化（P＝0.083、効果量＝0.44、検出力＝84％）がみられ、これらはペプチドグリカンの合成を促進する役割を果たす(35)。さらに、抗生物質投与児の79％においてエネルギー生成の変化が観察され、無処置児と比較してジヒドロキシアセトンキナーゼの存在量が有意に高かった（P= 0.032、効果量 = 0.31、検出力 = 71％）（図5E〜H; ST9）。ジヒドロキシアセトンキナーゼは、解糖などの代謝経路に組み込まれ、バイオフィルム形成に寄与するジヒドロキシアセトンをリン酸化することにより、代謝において重要な役割を果たしている(36)。これらの結果は、早産新生児が早期に抗生物質にさらされると、代謝経路が変化した腸内細菌が選択されることを示唆している。このことは、腸内細菌が高度な生存戦略を採用していることをさらに裏付けており、細菌の生存における代謝の柔軟性の重要性を強調している。

早産児レジストームと微生物叢の相互作用

全60サンプルで合計774種が検出された。これらの種のうち、ストレプトコッカス属（44種）、スタフィロコッカス属（31種）、コリネバクテリウム属（29種）、クロストリジウム属（27種）に属する種が最も高いARG多様性を示し、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロコッカス・フェカリス、表皮ブドウ球菌、フソバクテリウム・ヌクレアタムが最も豊富であった。

検出された菌種のうち40菌種がARGを保有しており、その60％（n＝24/40）はプロテオバクテリア門に属していた。本研究で検出された15種類の薬剤耐性クラスのうち、MLS（n＝17/40）、β-ラクタム（n＝14/40）、テトラサイクリン（n＝11/40）の3つの薬剤クラスに関する種の豊富さが高く、次いでアミノグリコシド（n＝7/40）耐性であった。大腸菌と黄色ブドウ球菌は、異なる薬剤クラスに関連するARGを最も多く保有し、肺炎桿菌（n＝60/175）と大腸菌（n＝41/175）は最も多くのARGを保有し、その大部分はβ-ラクタム薬耐性を示した。

本研究では、ESKAPEと呼ばれる病原体群（Enterococcus faecium、S. aureus、K. pneumoniae、Acinetobacter baumannii、緑膿菌、およびEnterobacter種からなる）が同定され、少なくとも1つのARGと関連していた。ESKAPEグループからは、黄色ブドウ球菌（21 ARG/gbp）、肺炎桿菌（18 ARG/gbp）、Enterobacter cloacae（14ARG/gbp）および緑膿菌（13 ARG/gbp）が最も高いARG数を示した。黄色ブドウ球菌は、β-ラクタム系（mecAをコードするメチシリンを含む）、ジアミノピリミジン系、MLS系、アミノグリコシド系、フシダン系、テトラサイクリン系に耐性を示す最も多様なARGを保有しており、次いで緑膿菌であった。緑膿菌はジアミノピリミジン耐性、β-ラクタム耐性、アミノグリコシド耐性を示し、中でもアミノグリコシド（APH(6)-Idと APH(3′'-Ib)）耐性が最も多かった（図6）。さらに、大腸菌、フェカリス菌、化膿レンサ球菌、カンピロバクター・ジェジュニ菌など、いくつかの非ESKAPE菌もARGを保有していた。興味深いことに、大腸菌だけが多剤耐性に関連するARGを保有していた。

図6

図6新生児糞便および便サンプル中の細菌種とARG量の比較和音図。この図は2組の和音図を示しており、それぞれ薬剤クラス別に分類された最も流行しているARGの上位50位と、そのARGに関連する細菌種の上位10位との相互関係を示している。A図とB図は抗生物質に直接曝露されなかった早産児を表し、C図とD図は抗生物質投与群に対応する。具体的には、A図とC図はメコニウムサンプル内の関連性を強調し、B図とD図は退院直前に採取された便サンプル内の関連性を示している。

最後に、レジストームにおけるARGの多様性は、微生物叢の多様性の変化とも関連している。さらに、ARGを保有する黄色ブドウ球菌は、メコニウムサンプルにおいてより多く（P= 0.033、効果量 = 0.55、検出力 = 96％）、豊富であった（P= 0.0016、効果量 = 0.57、検出力 = 97％）。 024、効果量＝0.53、検出力＝95％）、一方、抗生物質を投与された早産児では、ARGを保有する緑膿菌が多かった（P＝0.11、効果量＝0.67、検出力＝58％）（図6AおよびC）。便サンプルでは、抗生物質を投与されなかった早産児は、抗生物質を投与された児よりもARGを保有する黄色ブドウ球菌が多かった（P= 0.033、効果量 = 0.53、検出力 = 40％）。

抗生物質の使用、授乳方法、時間が微生物叢の動態を左右する

特に出生体重は8％（R2= 0.081、P= 0.021）と最も有意な変動を説明し、次いで分娩時に投与された抗生物質（R2= 0.064、P= 0.021）が続き、アンピシリンの投与は微生物叢の7％（R2= 0.066、P= 0.054）の変動をもたらした（表2；表S2）。さらに、妊娠中の抗生物質の使用（R2= 0.052、P= 0.072）、特にアモキシシリンの使用（R2= 0.067、P= 0.056）、および破膜期間の延長（R2= 0.049、P= 0.09）は、糞便微生物叢にわずかな影響を与えた（Table 2; Table S2）。

新生児期の抗生物質治療と人乳強化剤の摂取は、便微生物叢で観察された変動の約6％に関与していた（R2= 0.057、P= 0.03およびR2= 0.056、P= 0.029）（表3）。便レジストームの観察結果と一致して、微生物叢はβ-ラクタム系抗生物質の投与にも影響され、主にセフタジジムが観察された変動の8％を説明し（R2= 0.080、P= 0.003）、次いでアンピシリンとピペラシリンに起因する変動がわずかであった（R2= 0.052、P= 0.079およびR2= 0.053、P= 0.069）（表S3）。さらに、妊娠中の抗生物質曝露（R2= 0.050、P= 0.054）と出生時体重は、乳児の年齢が上がるにつれて微生物叢にわずかな影響を与えた（R2= 0.045、P= 0.088）。さらに、出生前の抗生物質曝露（R2= 0.046、P= 0.078）および膜破裂の遷延（R2= 0.048、P= 0.094）は、微生物叢が進化するにつれて、引き続き微生物叢にわずかな影響を及ぼした（表3 ）。

臨床的意義については、メコニム微生物叢の変動は早期発症敗血症と関連していた（R2= 0.046、P= 0.058）。EOSの発生率は、乳児の年齢が高くなるにつれて微生物叢の変動性を牽引し続け（R2= 0.058,P= 0.009）、新生児の健康転帰に対する微生物叢の重要な影響を強調した。さらに、BPDの状態は有意な因子として浮上し、便微生物叢の変動の9％を説明した（R2= 0.086,P= 0.005）（表4）。これらの知見は、抗生物質の使用および新生児栄養が微生物叢に及ぼす影響を強調し、敗血症およびBPDを含む主要な新生児の健康課題にマイクロバイオームが大きく影響することを示している。

考察

乳児の腸はARGの重要な貯蔵庫として機能している（37 、38 ）。この傾向は、抗生物質への直接曝露に関係なく持続し、乳児の年齢が上がるにつれて強まる。このパターンは、Leoら(1)やGuitorら(15)による最近の研究と一致しており、分娩後7〜10日の抗生物質未投与の正期産および早産新生児からARGが検出された。さらに、出生後48時間の抗生物質の使用は、メコニウム中のARGの量や多様性には影響を及ぼさなかったが、便レジストームには持続的な影響を及ぼしたことが示唆された。抗生物質に曝露されていない早産児は、便サンプル中のARGの量と多様性が高かった。このことは、ARGの濃縮が進化する腸内細菌叢の自然な側面であり、種の豊富さの増加と相関していることを示唆している。

分娩後48時間以内に処方される抗生物質としてβ-ラクタム系抗生物質が最も多かったことから、早期からの抗生物質投与はβ-ラクタム系抗生物質耐性を高める一因となり、抗生物質投与児のメコニンに多く見られた。ゲノム解析にとどまらず、腸内細菌叢は、細胞シグナル伝達、エネルギー産生、代謝再プログラミングなど、いくつかの経路を変化させることで抗生物質の圧力に耐えていることがわかった。例えば、抗生物質を投与された乳児におけるサイクリック・ジ・GMPターンオーバー・タンパク質とジヒドロキシアセトン・キナーゼレベルの増加は、既知の生存戦略であるバイオフィルム形成への移行を示している。さらに、抗生物質を投与された乳児は、プロリン合成、リポ酸代謝、D-ガラクツロン酸/D-グルクロン酸利用などの代謝の著しい変化を示した。乳幼児が年齢を重ねてもこのような代謝の変化が持続することは、初期の抗生物質曝露が発育中の腸内細菌叢に長期的な影響を与えることを強調している。これらの変化は総体として、細菌の成長を遅らせることでストレス下での回復力を高め、抗生物質耐性を助長し、β-ラクタム系抗菌薬のような殺菌薬の効力を損なう(39 -41)。このことは、抗生物質治療の有効性を低下させる可能性のある複雑で多面的な細菌防御機構を示しており、臨床管理上の課題を提起し、抗生物質を慎重に使用することの重要な必要性を強調している。

妊産婦ケアと抗菌薬スチュワードシップの著しい進歩にもかかわらず、敗血症は米国における新生児死亡原因のトップ10にランクされている(9)。この脅威に対して、経験的治療として抗生物質を投与することが新生児医療で広まっている。このような環境下での抗生物質の使用を考慮すると、REASON試験は、新生児を出生後48時間の間に抗生物質を投与する群と投与しない群に無作為に割り付け、抗生物質投与が発育中の腸内細菌叢とメタボロームに与える影響を評価した最初の試験である(13,42)。そこで本研究では、早産児に抗生物質を日常的に使用することで、レジストーム内のARG検出が増強されるかどうかを評価し、それが早産児のマイクロバイオームにどのような変化を与えるかを評価することを目的とした。

ARGは乳児の糞便中に15の薬物クラスにわたって検出され、新生児の年齢が上がるにつれて持続した。最も多く検出されたARGは、β-ラクタム系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系、マクロライド系に対する耐性であった。β-ラクタム系、アミノグリコシド系、マクロライド系の耐性は、新生児に直接投与された抗生物質、あるいは妊娠中や出産時に母親に投与された抗生物質に起因する可能性がある。β-ラクタム耐性を有する菌種は3種同定された：肺炎桿菌（K. pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、大腸菌（E. coli）である。特に、K. pneumoniaeは抗生物質を投与された乳児に多く、一方、S. aureusは抗生物質を投与されていない早産児に多くみられた。しかし、テトラサイクリン、ジアミノピリミジン、多剤耐性など、他の薬剤クラスに対する耐性をもたらすARGが同定されたのは、母親が生後早期に抗生物質を使用したことに起因している可能性があり、これは我々の研究の範囲外であった。

それにもかかわらず、テトラサイクリン耐性tet遺伝子は、母親と新生児の間で最も頻繁に共有されるARGであることが報告されている(43,44)。テトラサイクリンは歯の染色に影響を及ぼす可能性があるため、妊娠中や生後間もない時期には推奨されないが、感染症の治療に使用されたり、動物に使用されたりすることが多いため、女性のテトラサイクリン遺伝子の環境的・食事的供給源となり、抗生物質に直接暴露されていない乳児にも見つかる可能性がある(17)。我々の研究では、テトラサイクリン耐性遺伝子は抗生物質を投与された乳児の糞便中に多く存在し、いずれの乳児群においても経時的に増加し、複数の生物種で検出された。垂直伝播だけでなく、ARGの出現における環境要因の役割を認識することも重要である。抗生物質耐性菌の増加はNICUにおける重大なリスクであり、特に早産児は通常、満期産児よりも入院期間が長い(45)。早産児の入院期間が長くなると、抗生物質耐性菌に遭遇しやすくなり、それを保有しやすくなる可能性がある。

新生児への抗生物質の直接投与とは別に、我々の研究は、母親の抗生物質使用と健康状態が早産児の微生物叢とレジストームにいかに大きく影響するかを明らかにした。我々は、妊娠・出産時の母親による抗生物質の使用が、微生物種とARGプロファイルの多様性の分散の6〜7％を占めることを見出した。特に、分娩時にアンピシリンレジメンを投与することは、新生児のGBSコロニー形成を減少させることを目的とした一般的な戦略であり、メコニウムレジストームおよびマイクロバイオームの分散の6％～8％に寄与し、便レジストームには持続的な影響が認められた。

GBSは新生児の感染症の顕著な原因であり、アドヘシンや溶血活性のような病原性因子を持つため、生存率が高く、さまざまな部位にコロニーを形成する能力が高く、時には呼吸器に影響を及ぼすことさえある(46)。現在のガイドラインでは、妊娠36週から37週の間にGBSのスクリーニングを行うことが推奨されている。しかし、この方法では早産を十分に考慮できない場合があり、その結果、母親が重要なスクリーニングを受けられないことが多い。その結果、GBSの状態が判定できない場合、特に母体の発熱がない場合や、ROMが18時間を超えて長引く場合には、早期発症と後期の新生児感染の両方につながることが知られているGBSに対する予防措置として、ペニシリンやアンピシリンなどのβ-ラクタム系抗生物質が分娩中に投与される（47 、48 ）。興味深いことに、分娩中に抗生物質を投与された27人の母親を対象としたRoeschらの研究(48)では、治療を受けなかった母親と比較して、膣内微生物叢の微生物多様性が増加し、優占種が減少していることが発見された。このような多様性の増加は、新生児をARGを保有する細菌を含む、より広範な細菌にさらす可能性がある。本研究の新生児のうち、33.3％（10/30人）の母親が長期のROMを経験していた。ROMはメコニウムレジストームのβ多様性やARG多様性にすぐには影響を及ぼさなかったが、便レジストームには持続的な影響を及ぼし、その結果、ユニークなARGの数とARG多様性が増加した。長期のROMはまた、早産児の便サンプル中のマクロライド、ジアミノピリミジン、β-ラクタム、フェニコール、テトラサイクリンを含む複数の薬物クラスにまたがる様々なARGの存在量に有意な影響を与えた。18時間以上ROMを経験した母親から出生した乳児は、多剤耐性に関連するARGがより多く存在した。同定された細菌種の中で、大腸菌は多剤耐性の唯一の保菌者として際立っており、早産児が成熟するにつれてその存在量が増加した。この知見は、大腸菌が乳児レジストームの主要な一因であり、早産児における多剤耐性の割合が高いことを強調した最近の研究結果と一致している（49,50 ）。全体として、これらの知見は、妊娠中の母親の健康、特にROMの期間と新生児における微生物耐性の発現との間の複雑な関係を強調するものであり、この集団における微生物の健康に影響を及ぼす複雑な相互作用に光を当てるものである。

限られたサンプルサイズや環境データの不足といった課題にもかかわらず、本研究は早産児のレジストーム、マイクロバイオーム、有害転帰の複雑な相互作用に関する貴重な知見を提供するものである。メタゲノムシークエンシングを活用し、腸内細菌叢内のARGの分布を種レベルで掘り下げた。誤分類のリスクを軽減するために複数のフィルタリング技術を用いたが、今後の研究では精度を高めるために超深度シーケンスを取り入れるべきである。さらに、DNA配列決定はARG転写の代用となったが、RNAの直接分析によってこれらの知見を検証するためにはさらなる研究が必要である。さらに、糞便の検査は、通過が遅いために遅れることもあるが、初期の腸内微生物の状況を垣間見ることができ、子宮内環境の状態を把握し、母体と胎児の微生物の相互作用、初期のコロニー形成、および長期的な健康への影響の可能性に光を当てることができる(51)。同じ新生児から採取した糞便と便のサンプルを縦断的に分析することで、マイクロバイオームの進化を追跡することができ、腸に対する外的要因の持続的な影響を反映することができる。

さらに、新生児の抗生物質治療に対する微生物やARGの多様性を調べる研究では、新生児研究ではしばしば限界に遭遇する。このような研究ではしばしば、決定的な発見に必要な統計的検出力が不足しており、P値のみに依存している(52,53)。このようなP値への依存は、観察された差の臨床的関連性を適切に伝えないため誤解を招きやすく(54)、未熟児のレジストームやマイクロバイオームに対する抗生物質やその他の要因の真の影響を不明瞭にしてしまう。エフェクトサイズとサンプルサイズの両方がP値を左右することを考えると、群間のわずかな差のために、臨床的価値がほとんどない偽有意な結果をもたらす可能性がある(52)。P値とは異なり、効果量はサンプルサイズに依存しない一貫した指標を提供し、より信頼性の高い結果の解釈を可能にする。従って、P値に基づく解析、特に限られたサンプルサイズでの解析に内在する脆弱性を認識し、本研究全体を通して評価尺度として効果量を採用した。

我々の研究では、早産児では抗生物質への直接曝露の有無にかかわらずARGの有病率が高く、それはマイクロバイオームの発達と並行して年齢とともに強まることがわかった。特に、抗生物質を投与された乳児は、より多くのβ-ラクタム系ARGを保有し、抗生物質耐性メカニズムの増強を示した。妊娠中や分娩中に新生児や母親に投与された薬剤とは無関係なARGの存在は、環境暴露とともに、妊娠期間外における母親の抗生物質使用が未熟児のレジストームやマイクロバイオームに影響を与える可能性があることを示唆している。妊娠中および分娩中の母親の健康状態および抗生物質の使用は、乳児のレジストームおよびマイクロバイオームの変化と関連していた。これらの結果は、抗生物質の使用に慎重であることを正当化し、より早期の微生物スクリーニングや、長引くROMの発生率を減少させるための代替アプローチなど、妊産婦ケアの継続的な改善を求めている。これらの妊娠関連合併症を予防することで、母親の抗生物質使用への依存を減らすことができ、早産児へのARGのさらなる拡散を防ぐことができる可能性がある。今後の研究では、新生児の健康転帰を形成する妊娠中の母親のマイクロバイオームの探索をより重視すべきである。母体の健康と乳児の転帰を同時に評価することは、早期の微生物コロニー形成と抗菌薬耐性／耐性を左右する因子を理解する上で極めて重要である。このような統合的なアプローチにより、介入のための重要な窓口が明らかになり、健康転帰の改善と現在のケア方法の改良が可能になり、介入が短期的および長期的に健康を保護・促進するように調整されることが保証されるであろう。

謝辞

助成金を提供してくださったLittle Giraffe Foundationに感謝する。

補足資料

補足資料 - msphere.00286-24-s0001.docx

補足図および表。

ダウンロード
2.77 MB

ASMは、論文にリンクされている、あるいは論文を通じてアクセスできる補足資料の著作権を所有しません。著者はASMに対し、補足資料ファイルを公開するための非独占的かつ世界的なライセンスを付与しています。再利用を希望される場合は、対応する著者に直接ご連絡ください。

参考文献

Leo S, Cetiner OF, Pittet LF, Messina NL, Jakob W, Falquet L, Curtis N, Zimmermann P. 2023. 新生児腸管レジストームのメタゲノム解析。また、新生児腸管レジストームのメタゲノム解析も行っている。

早産新生児における早期の抗生物質使用による耐性菌の増加