社会的ネットワークの位置は、アリの行動、微生物叢組成、脳遺伝子発現の主要な予測因子である
研究論文
社会的ネットワークの位置は、アリの行動、微生物叢組成、脳遺伝子発現の主要な予測因子である
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002203
トーマス・ケイ、ジョアニート・リベルティ、トーマス・O・リチャードソン、ショーン・K・マッケンジー、チェルシー・A. Weitekamp, Christine La Mendola, [...view 6 more...], Laurent Keller
バージョン2
要旨
社会的生物の生理と行動は、その社会的環境と相関している。しかし、社会的環境は通常、年齢や物理的環境（すなわち、空間的位置や関連する生物学的要因）によって混同されるため、これらの相関関係を解釈することは通常困難である。例えば、個体の社会的環境とその遺伝子発現パターンとの間の関連は、両因子が年齢や行動によって引き起こされた結果である可能性がある。関連する変数を同時に測定し、これらの変数間の相関を定量化することで、関係が直接的（そしておそらく因果的）か間接的かを示すことができる。ここでは、人口統計学的および自動行動追跡とマルチオミクスアプローチを組み合わせ、オオアリCamponotus fellahにおける社会的・物理的環境、年齢、行動、脳内遺伝子発現、微生物叢組成の相関構造を明らかにした。生理と行動の変動は、社会環境と最も強い相関があった。さらに、脳内遺伝子発現と微生物叢組成、物理的環境、年齢、行動の間の一見強い相関は、社会的環境をコントロールすると弱くなった。これと一致して、機械学習による解析では、脳遺伝子発現データから、個人の社会的環境を他のどの行動指標よりも正確に予測できることが明らかになった。これらの結果は、社会的環境が行動と生理学の重要な調節因子であることを示している。
引用 Kay T, Liberti J, Richardson TO, McKenzie SK, Weitekamp CA, La Mendola C, et al. (2023) Social network position is a major predictor of ant behavior, microbiota composition, and brain gene expression. PLoS Biol 21(7): e3002203.
学術編集者 ラース・チトカ、ロンドン・クイーンメアリー大学、イギリス
受理された： 2023年1月21日受理： 受理：2023年1月21日; 受理：2023年6月16日; 掲載：2023年7月24日 2023年7月24日発行
Copyright: © 2023 Kay et al. 本論文は、Creative Commons Attribution Licenseの条件の下で配布されたオープンアクセス論文であり、原著者および出典を明記することを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可する。
データの利用可能性 遺伝子発現データはNCBI Gene Expression Omnibus（Project ID: GSE232770）で、微生物叢データはNCBI Short Read Archive（BioProject ID: PRJNA967220）で、メタデータとコードはZenodo（doi.org/10.5281/zenodo.8043085）で入手可能。
資金提供 L.K.は、スイス国立科学財団および欧州研究評議会（European Research Council Advanced Grants ߢ, No.249375およびߢ, No.741491）からの資金提供を受けた。J.L.は、欧州連合（EU）のHorizon 2020研究・革新プログラム（Marie Skłodowska-Curie）のBRAIN（No.797113）、P.E.はNCCRのマイクロバイオームとERCのスターティンググラント（MicroBeeOme、No.714804）からの資金提供を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。
競合利益： 著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。
略語 ASV、amplicon sequence variant；LMER、linear mixed effects regression；PCA、principal component analysis；RT、room temperature
はじめに
高度に社会的な種では、生理と行動は社会的環境と深く相互に絡み合っている。様々な生物種における研究から、社会環境と遺伝子発現[1-3]、微生物叢組成[4]、行動[5,6]の間に複雑な関係があることが示されている。微生物叢の組成は行動[4,7-10]や遺伝子発現[11,12]と相関し、遺伝子発現は行動[13,14]やその他多くの形質と関連している。さらに、社会的環境はしばしば物理的環境や人口統計学的過程と混同される[15-17]。したがって、これらの変数間の相関構造を解明することは困難である。さらに、ほとんどの研究は1つまたは少数の変数に焦点を当てており、社会環境データの解像度は限られている。
社会性昆虫コロニーは、生物学と社会環境の関係を研究する上で非常に扱いやすいシステムである [18]。コロニー内では通常、産卵や採餌などの行動に特化した個体による顕著な分業が見られる [19] 。個体は同じ行動をする他の個体と最も頻繁に相互作用し、コロニーの社会的ネットワークにおける行動に関連したコミュニティ構造をもたらす [16,20]。若い個体は通常授乳行動をとり、年齢とともに採餌行動に移行する [21-27]。行動と年齢の両方が、脳内遺伝子発現 [28,29] や微生物叢組成 [30,31] と関連している。ここでは、自動行動追跡とマルチオミクスアプローチを組み合わせて、社会環境、物理環境、行動、年齢、脳遺伝子発現、腸内細菌叢組成の相関構造を同時に調べた。大工アリのCamponotus fellahをモデル系として用いたのは、この種の社会環境がよく特徴付けられており、社会環境、年齢、採食行動との関連性がすでに定量化されているからである[16,20]。
結果と考察
それぞれ約100頭の年齢が判明している働き蜂を含む4つの女王蜂コロニーを追跡した（図1）。自動追跡データから、すべてのペアごとの社会的相互作用を推測し、全個体の空間分布を決定し、最も頻繁で識別可能な6つのタスク行動（女王蜂の世話、採餌、授乳、警護、トロファラクシング、掃除）を定量化した。行動追跡の直後に、全個体の脳でRNA配列決定を行い、表面滅菌した個体の腹部で16S rRNA遺伝子の配列決定を行った。
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図1. システムの概要。
(A) アリにはユニークな1.4 mm2のマトリックスバーコードが付けられ、年齢を示すペイントマークが付けられた。(B）各タグの周囲に頭部と胴体の領域を定義した。(C）4つのコロニーにおける働きアリの年齢分布。コロニーごとの等価分布はS1本文の図Aを参照。この図で使用したコードとデータはZenodoで公開されている（doi.org/10.5281/zenodo.8043085 - data: "Fig 1C&S1.csv"; code: "02-Main.R"）。
doi:10.1371/journal.pbio.3002203.g001
詳細 "
C. fellahの社会的ネットワークは、2つの重複したコミュニティ（個体が頻繁に相互作用するグループと、個体間でめったに相互作用しないグループ）で構成される。1つは女王と子ガエルと相互作用する傾向のある個体で構成され、もう1つは採餌のために巣を離れる傾向のある個体で構成される[20]。社会的ネットワークにおける個体の位置は「社会的成熟度」で表すことができる。これはコミュニティ検出に基づく指標で、0から1の範囲にあり、個体がどの程度養育者社会コミュニティと採餌者社会コミュニティに関連しているかを定量化する（材料と方法および[20]を参照）。これまでの結果と一致し、社会的成熟度は年齢および採餌時間の割合と正の相関があった（図2；コロニーのアイデンティティをランダム因子とした社会的成熟度対年齢の線形混合効果回帰（LMER））： R2 = 0.483, t = 20.23, p < 0.001. 社会的成熟度対採餌時間の割合：コロニーの同一性をランダム因子とした線形混合効果回帰（LMER）： R2 = 0.528, t = 22.45, p < 0.001).
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図2. 社会的ネットワークの位置、採餌に費やした時間、年齢。
(A)4つのコロニー（行）ごとの社会的ネットワークで、ワーカーは採餌に費やした時間（1列目）、社会的成熟度（2列目）、年齢（3列目）によって色分けされている。最も低い値は黄色、最も高い値は紺色。女王はマゼンタ色。エッジの色の強さと幅はエッジの強さに対応する。レイアウトはRパッケージ "iGraph" [33]を用いてFruchterman-Reingoldアルゴリズム [32]で計算した。(B) 採餌に費やす時間の割合、社会的成熟度、年齢に関する散布図。この図で使用したコードとデータはZenodoで公開されている（doi.org/10.5281/zenodo.8043085 - data: 4つの "Fig 2A... "csvファイルすべてと "Fig 2B.csv"、code： コード："02-Main.R"）。
doi:10.1371/journal.pbio.3002203.g002
詳細 "
脳内遺伝子発現プロファイル、微生物叢組成、物理的環境、社会的ネットワークの位置、行動プロファイルの関係を調べるために、まず5層の多重ネットワークを構築した（図3A）。このアプローチでは、ノードはワーカーを表し、層内エッジは社会層におけるペアワイズ相互作用頻度、または他の層におけるペアワイズ類似度（プロファイル間のユークリッド距離で測定）を表す。複数の層は同じノード間の異なるタイプの関係を示す。これらの多重ネットワークを調べると、層間に顕著な類似性があることがわかった。似たような行動をとる個体は、似たような脳遺伝子発現プロファイル、微生物叢組成、似たような物理的環境、社会的成熟度も示していた。これら5つの層と年齢との関係の強さを比較するため、各層を単一の次元に縮小した（社会的層には社会的成熟度を、その他の層には主成分分析（PCA）を使用）。これら6つの変数間のR2値を計算し、相関関係をネットワーク形式で表した（図3B；値は4コロニー間の平均。） この "ネットワーク・オブ・ネットワーク "では、社会的成熟度が中心的な "ハブ "として際立っている。物理的環境は行動と最も相関が高く、社会的成熟度とは2番目に相関が高かった。重要なことは、生理的指標（腸内細菌叢と脳内遺伝子発現）の両方が、行動、年齢、物理的環境よりも社会的成熟度とかなり相関していたことである。脳内遺伝子発現と社会的成熟度の間の平均R2値は0.36であり、脳内遺伝子発現と物理的環境や行動の間の平均R2値よりも33％大きく、脳内遺伝子発現と年齢の間の平均R2値よりも50％大きかった。同様に、微生物叢組成と社会的成熟度の間の平均R2値は0.32であり、微生物叢組成と行動の間の平均R2値より3％大きく、微生物叢組成と物理的環境の間の平均R2値より52％大きく、微生物叢組成と年齢の間の平均R2値より88％大きかった。
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図3. ソーシャルネットワークの位置、物理的環境、微生物叢、脳遺伝子発現、行動、年齢の類似性。
(A）行動、脳内遺伝子発現、微生物叢、物理的環境、社会的相互作用から構築された5層の多重ネットワーク。各層において、各ノードはワーカーを表す。ノードは行動によって色分けされている（シアン＝授乳、イエロー＝掃除、マゼンタ＝採食、ブラック＝警護）。層内エッジは重み付けされておらず、相互作用の強さがエッジ重み分布の上位4分の1を超えるペアを接続する。層間エッジは各ワーカーと隣接する層のワーカー自身を結ぶ。(B) 5つの層と年齢（青）の間の相関（R2値）のグラフ表示。エッジ幅はエッジ強度に比例する。レイアウトはFruchterman-Reingoldアルゴリズム[32]で計算され、頂点はパネル(A)の層ラベルに従って色付けされ、その強さ（すなわち、重み付けされた接続の合計）に従って大きさが決められる。この図で使用したコードとデータは、Zenodoで公開されています（doi.org/10.5281/zenodo.8043085 - data: 11個の "Fig 3A... "txtファイルと "Fig 3B.csv"、code： コード："Multiplex.py "と "04-InterlayerCorr.R"）。
doi:10.1371/journal.pbio.3002203.g003
詳細 "
脳遺伝子発現と社会的成熟度の関係の強さは、社会的相互作用が脳機能に直接的かつかなりの影響を及ぼす可能性を示唆しているため、特に興味深い（すなわち、これらの関連は、脳遺伝子発現が行動や年齢と関連することによる間接的な結果ではない）。遺伝子発現データのPCAは、少数の高発現遺伝子に強く影響される可能性があるため、次に遺伝子発現の差分解析を用いて、行動、物理的環境、年齢、微生物叢組成、社会的成熟度によって発現が異なる遺伝子の数を調べた。前回の解析と同様、社会的成熟度が最も多くの遺伝子の発現差と関連していた（コロニー全体の平均で33％の遺伝子）。個々の行動プロフィールは30％の遺伝子の発現差と、物理的環境は29％の遺伝子と、年齢は27％の遺伝子と、微生物叢組成は13％の遺伝子の発現差と関連していた（表1）。つまり、社会的成熟度の関数として差次的に発現する遺伝子の数は、ペアのt検定で行動によって差次的に発現する遺伝子の数よりも有意に多かった（p = 0.024；各コロニーにおける各変数によって差次的に発現する遺伝子の割合については、S1テキストのFig Cを参照）。この差は、他の各変数をコントロールしたときに、各変数で差次的に発現した遺伝子の数を考慮すると、さらに大きくなった。行動を統制した場合、社会的成熟度は依然として遺伝子の7.3%の発現差を説明したが、社会的成熟度を統制した場合、行動は遺伝子の0.034%しか発現差を説明しなかった。このパターンは4つのコロニーすべてで独立に当てはまり（すべてのコロニーで10倍以上の差があった；完全なコロニーレベルの解析についてはS1本文の図Cを参照）、脳のトランスクリプトーム変異は行動よりも社会的ネットワークの位置とより深く関連しているという考え方を強く支持した。
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表1. 社会的成熟度、行動、年齢、物理的環境、腸内細菌叢組成のそれぞれによって脳内で差次的に発現する遺伝子の数（合計14,664遺伝子のうち）（第1列）、および他の各変数でコントロールしても差次的に発現する遺伝子の割合（第2～6列）。
社会的成熟度をコントロールしても、行動、年齢、物理的環境、腸内細菌叢組成によって発現に差が残る遺伝子はほとんどなかった。
doi:10.1371/journal.pbio.3002203.t001
詳細 "
脳遺伝子の発現パターンが、社会的成熟度、年齢、行動（全体的な行動プロファイルと特定のタスクの実行の両方）とどのように関連しているかをさらに調べるために、上記の相関的アプローチよりも非線形な関連に敏感な機械学習アプローチを用いた。ワーカー集団の半分をランダムに繰り返しサブサンプリングし、その遺伝子発現値と対象変数についてサポートベクターマシンモデルを学習させた。次に、このモデルを用いて、ワーカー集団の残り半分の脳遺伝子発現データから対象変数を予測し、予測値を観測値に対して回帰することで、予測精度、ひいては対象変数が脳トランスクリプトームに反映される程度を定量化した。予測値と観測値の平均R2が最も高かったのは社会的成熟度（0.76）であった。予測値と観察値の間の平均R2値は、分析した個体生態の他の7つの側面では有意に低かった（図4；行動空間のPC1に沿った予測値と観察値の間の平均R2値＝0.63；年齢＝0.59；採餌に費やす時間の割合＝0.53；授乳＝0.33；女王の世話＝0.23；警護＝0.05；掃除＝0.02；社会的成熟度のR2値と他のすべてのR2値との間のt検定p値はすべて＜0.01）。これらの結果は、社会的ネットワークの位置と脳遺伝子の発現との間に基本的な関連性があるという示唆を補強し、この関連性が課題行動と脳遺伝子の発現との間の関連性よりも強いことを確認した。
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図4. 予測精度の検証。
(A）各行動を個別に行う時間の割合、行動空間のPC1に沿った位置、年齢、社会的成熟度について、観測値と予測値の間のR2値の箱ひげ図。黒線は中央値、箱とひげはそれぞれ上下4分位値と1.5×IQ範囲を示す。(B)無作為に選択した10反復における社会的成熟度の予測値と観察値の散布図。色は反復を示す。この図で使用したコードとデータは、Zenodoで公開されている（doi.org/10.5281/zenodo.8043085 - data: "Fig 4A.csv"; code: "05-ML.R"）。
doi:10.1371/journal.pbio.3002203.g004
詳細 "
全体として、脳内遺伝子発現と微生物叢組成は、行動、物理的環境、年齢よりも、社会的ネットワークの位置と強く相関していた。さらに、我々の実験では、これらの関係における因果関係や方向性を立証することはできないが、ここで示された相関構造は、起こりうる因果的相互作用の範囲を制約している。例えば、社会的相互作用が単に労働者の空間的分布（すなわち物理的環境）の結果であり、物理的環境が脳遺伝子発現を形成しているとすれば、物理的環境と脳遺伝子発現の間には、社会的環境と脳遺伝子発現の間よりも強い相関関係が見られると予想される。したがって、行動に関連する生理学の複数の側面が、物理的環境、行動、年齢よりも社会的相互作用とより強く相関しているという事実は、社会的相互作用が生物生物学の多くの側面で観察される相関関係を媒介し、社会的生物における個体差の中心的な役割を果たしている可能性があることを示唆している。
様々な要因が、種や文脈を超えたこれらの結論の一般性を制限している可能性がある。第一に、我々の実験は真社会性の種を用いて行われた。この結果は高度に社会性の高いすべての動物に当てはまると予想されるが、この点についてはまだ検証されていない。第2に、物理的環境はアリが自然に経験する環境よりもはるかに複雑でなかったため、この変数によって説明される生物学的変異の量が減少した可能性がある。第三に、Camponotusの腹部微生物叢の構成は、Blochmanniaに大きく支配されているという点で非典型的であり、一部の働きアリではBlochmanniaのみで構成されていた。C.fellahに好発する種を代表する他のアンプリコン配列バリアント（ASV）の相対的な存在量を比較するのに十分な深さまで塩基配列を決定し、微生物叢組成と他の生物学的変数との間に相関を観察したところ、採食者では酢酸菌科や他の種の存在によってほとんど左右されるようであったが、保育者ではそうではなかった（S1本文のFig G）。しかし、多くの個体でブロッホマンニアが優勢であり、他の細菌が存在しないため、微生物叢組成と生物学の他の測定項目との関連性が、他の種に比べて低くなっている可能性がある。
結論として、本研究は社会的環境と行動の密接な関連性を浮き彫りにするだけでなく、社会的環境が生理学の行動に関連する側面とどのように関連しているかを説明し、個体が互いの行動に影響を与えうるメカニズムを示唆している。
材料と方法
アリのコロニー
C. fellahの女王アリは2007年にイスラエルのテルアビブで交尾飛行後に採集された。コロニーは27℃で12時間／12時間の明暗サイクルのもとで飼育され、水と糖液を自由に与えられ、毎週ハエと人工アリ餌[34]を与えられた。実験の1年前から（C. fellahの働きアリは一般に1年以上生きない[20]）、新たに羽化した働きアリには毎週、生まれた週を示すカラーコードをペンキでマーキングした（図1）。C. fellahの女王は一度しか交尾しないので、コロニー内ではすべての働きアリが完全な姉妹である[35]。
2018年は1コロニー、2020年は3コロニーを分析した。分析から2年を隔てる間に技術的進歩があったため、使用した方法は若干異なっていた。2020年の方法を以下に報告し、その違いはSupporting informationに詳述する。
行動追跡
各コロニーはラボストックコロニーから無作為にワーカー約100頭（ワーカー集団の約20％）をサブサンプリングし、女王蜂とブルードの約20％を加えて作成した。巣箱（170×123mm）はプラスチックチューブ（内径19mm）を介して採餌場（170×123mm）に接続され、12時間／12時間の明暗サイクルのもと、常に暗闇に保たれた。ARTagライブラリー[36]のユニークな1.4 mm2マトリックス・バーコードを、SAUER皮膚接着剤を用いて各アリの胸部に固定した（図1）。これらのタグはアリが持ち運べる重さのほんの一部であり、その存在によって行動が変化することはない[37]。
コロニーは毎秒6フレームで7日間連続ビデオ録画された。追跡システムはビデオ・ファイルを保存し、各フレームにおける各タグの位置と向きを記録する。完全な技術仕様とソース・コードはhttps://github.com/formicidae-tracker。
追跡データの処理
コロニー平均より2標準偏差下（コロニーあたり5～6頭）の少ないフレームで検出されたワーカーは解析から除外した（"01-MergeData.R"）。各ワーカーの物理的環境は、アリの平均体長をセル内径としてアリーナを正六角形のグリッドに離散化し、各ワーカーが各六角形で検出されたフレーム数をカウントすることで定量化した("spatial fidelity.ipynb")[38]。各ワーカーの社会的環境を定量化するために、[10]と同様にトラッキングデータから一対の社会的相互作用を推測した。各アリについて頭部と胴体部に注釈を付け、2匹のアリの頭部が重なった場合に相互作用が発生したと定義した。ペアワイズ相互作用の総数を用いて、重み付けされたソーシャルネットワークを作成した（図2；"interaction network.ipynb"）。この近接度に基づく社会的相互作用の定義では、2個体が互いを通り過ぎたり、隣同士で一時停止したりする場面（相互作用の約42％）だけでなく、栄養補給（相互作用の約16％）、グルーミング（相互作用の約8％）、触角イベント（相互作用の約35％）を捉えている。このような高率の「偽陽性」相互作用はデータ解析には影響しない。というのも、ペアごとの偽陽性の頻度は実際のペアごとの相互作用の頻度とよく相関しており、また解析中に相互作用のカウントはコロニー内で効果的に正規化されるため、絶対数は重要ではないからである。この点を説明するために、頭部領域の重なりのみを考慮した場合の一対の相互作用数（図1Bの青）と、胴体領域の重なりも考慮した場合の相互作用数（図1Bの緑）を比較することで、偽陽性相互作用の割合を人為的に増加させた。これは一対の相互作用の平均数を96から260に増加させ、偽陽性率を大幅に増加させた（例えば、胴体と胴体が重なっている例が多い）。これら2つの方法で測定された一対の相互作用スコア間のR二乗値は0.812であった。
社会的ネットワークにおける個人の位置（「社会的成熟度」）を定量的に特徴付けるために、ソフトコミュニティ検出FacetNet（https://c4science.ch/source/facet_unil）[20,39,40]を使用した。このアプローチは、与えられたノードが与えられたコミュニティに属する程度（すなわち、与えられたワーカーが看護師コミュニティと採集者コミュニティの中間に位置づけられる）を示す0から1の範囲の連続的な数値を出力することによって、重複する社会コミュニティを可能にする。この分析では、C. fellahの社会的ネットワークに関する過去の分析 [20]に基づき、コミュニティの数を2つに固定した。この分類に沿い、以前の結果と一致して、社会的成熟度のスコアはU字型に分布し、ほとんどのワーカーはどちらか一方のコミュニティに深く入り込んでいた（S1テキストの図D; "02-Main.R"）。
行動アノテーション
最も重要でよく行われる6つの行動について、個体ごとのパフォーマンスを定量化した。採餌頻度は、採餌アリーナで個体が検出されたフレーム数を、個体が検出されたフレームの総数で割った値として自動的に定量化した（"02-Main.R"）。他の5つの行動は手動で定量化し、2時間ごとに1フレーム（合計約80フレーム）を選択し、検出されたすべてのワーカーのアイデンティティを手動で注釈した：
女王蜂の世話をしている： 女王の世話：女王の近くに位置し、女王の方を向いている。
巣を守る：巣の入り口の近くに位置し、そちらを向いて静止。
子房の世話： 子房の上に立っている、あるいは触角や口器が子房に接触している。
掃除： ゴミの山の上に立つか、触角や口脚をゴミの山に接触させるか、アリの死骸やゴミを運ぶ。
トロファラクシスに関与している： 他の個体と目に見える液体を共有した。
これらの手動注釈付き行動は検出頻度では正規化されていない。なぜなら、選択したフレームで個体の同一性が検出されなかった場合、同一性が解決されるまでその個体をビデオを通して追跡したためである。したがって、採餌は0と1で、その他の行動は0と80で、分布は異なる。次元削減時にすべての行動に等しい重みを与えるため、各行動はコロニー内で0と1の間で正規化された（"02-Main.R"）。正規化された行動データのPCAでは、4つのコロニーで独立に、またコロニー間でデータをプールした場合でも、同様のV字型プロットが得られた（S1本文の図E；"02-Main.R"）。微分発現解析を含む相関分析では、行動空間のPC1を各コロニーのワーカーについて別々に計算した。機械学習に基づく解析では、行動空間のPC1は全コロニーの個体をまとめて計算した。注釈付けされた6つの行動のパフォーマンスは、一貫した方法で社会的ネットワークにマッピングされた（S1テキストの図F；"02-Main.R"）。
RNA抽出、ライブラリー調製、塩基配列決定
追跡実験の直後に、すべてのワーカーを瞬間凍結し、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れて個別に-80℃で保存した。その後、脳を1×PBSで解剖し、PRECELLYS Evolution SUPERホモジナイザーを用いてセラミックビーズ入りTRIzol試薬1ml中でホモジナイズした。ホモジナイズしたサンプルを室温（RT）で5分間インキュベートした後、クロロホルム（200μl）を加え、ボルテックスし、さらに室温（RT）で5分間インキュベートした。サンプルを遠心分離し（12,000rpm、4℃で25分間）、上層の水層（約500μl）をイソプロパノール（650μl）とグリコーゲンブルー（1μl、RNAseフリー、Invitrogen、15mg/ml、#AM9516）を加えた新しいチューブに移した。サンプルをボルテックスし、-20℃で一晩インキュベートした。次にサンプルを遠心分離し（4℃で全速力で30分）、上清を捨て、EtOH（80％で1ml）を加えた。サンプルをボルテックスし、再度遠心した（4℃で全速力で5分間）。上清を捨て、EtOH（70％で1ml）を加えた。サンプルをボルテックスし、最後の遠心分離を行った（12,000rpm、5分間、4℃）。すべての上清を除去し、ペレットを室温で乾燥させた（10～15分）。ペレットをヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。ライブラリー調製にはKAPA Stranded mRNASeq Library Preparation Kit（#KK8421）を使用し、サンプルはローザンヌ大学Genomic Technology FacilityのNovaseq 6000でフルS4 FlowCell（4レーン）を用いてシーケンス（150bp、ペアエンド）し、サンプルあたり42±700万リード（平均±SD）を得た。
遺伝子発現解析
トランスクリプトームリードは、STAR v2.7.8aを用いてC. fellah参照ゲノム（BioProject: PRJNA901066）にマッピングし、FeatureCountsを用いてすべてのステップでデフォルトパラメータ（転写産物レベルではなく遺伝子レベルでのマッピング）を用いてカウントした[41,42]（"Mapping.sh"; "Counting.sh"）。マッピングとカウントの結果、個体あたり3,870±830万リード（平均±SD）が得られた。
微分発現解析を実行する前に、全サンプルで100リード未満の遺伝子（すなわち、14,664遺伝子のうち1,667遺伝子）をフィルターで除外した。DESeq2[43]を用いて、行動、微生物叢、物理的環境データの年齢、社会的成熟度、PC1のそれぞれで差次的に発現した遺伝子、および他の各変数でコントロールした場合に前述の各変数で差次的に発現した遺伝子を、4つのコロニーのそれぞれについて別々に同定した（"03-GeneExpression.R"）。DESeq2では、有意な差次的発現をWald検定で評価し、Benjamini and Hochberg法を用いて多重検定で調整したp値を求めた。調整p値が<0.05の時、遺伝子は差次的に発現しているとみなされた。
微生物叢
95%エタノールに浸漬し、5%漂白剤に1分間浸漬した後、滅菌水ですすいで表面滅菌した。その後、腹部を取り出し、PowerBeadチューブの中で破砕し、DNeasy PowerSoilキットを用いて、製造元のプロトコールに従ってDNAを抽出した（https://www.qiagen.com/de/resources/download.aspx?id=91cf8513-a8ec-4f45-921e-8938c3a5490c&lang=en）。DNA抽出の各バッチについて、組織を加えないブランクDNA抽出も行い、試薬中の汚染物質の可能性をコントロールした。16S rRNA遺伝子プラスミドからなる模擬群集[10]は、PCRと塩基配列決定中に導入されたバイアスをチェックするために、実験サンプルとともに処理され、塩基配列決定された。微生物叢の特徴を明らかにするため、16S rRNA遺伝子のV4超可変領域を、Illumina 16Sメタゲノムシーケンス調製ガイド（https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b. pdf）に従い、プライマー515F-Nex（TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACCGCGTAA）および806R-Nex（GTCCGTGGGCTCGGAGATGTTAAAGAGACGGGACTACHVGGGTWTCTAAT）を用いて、Nextera XTインデックス用のアダプター配列と16S rRNA遺伝子のV4領域用のプライマーを含む16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅した[44]。2.5μlの鋳型DNA、12.5μlのInvitrogen Platinum SuperFi DNA Polymerase Master Mix、5μlのMilliQ水、および2.5μlの各プライマー（5μM）を用いて、総量25μlでPCR増幅を行った。PCR条件は以下の通りである： 98℃、30秒の後、98℃、10秒、55℃、20秒、72℃、20秒のサイクルを25回行い、最後に72℃で5分間伸長した。増幅は2%アガロースゲル電気泳動で確認した。PCR産物をClean NGS purification beads (CleanNA)でPCR産物とビーズを1:0.8の割合で精製し、27.5 μl Tris (10 mM, pH 8.5)で溶出した。Nextera XTインデックスキット（Illumina）を用いて、各サンプルにデュアルインデックスを付加するために2段階目のPCRを行った。セカンドステップPCR増幅は、ファーストPCRからの産物2.5μl、Invitrogen Platinum SuperFi DNAポリメラーゼマスターミックス12.5μl、MilliQ水5μl、および各Nextera XTインデックスプライマー2.5μlを用いて、総容量25μlで行った。熱サイクル条件は以下の通りであった：95℃で3分間の最初の変性ステップ、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間の8サイクル、そして72℃で5分間の最終伸長ステップ。再びClean NGS精製ビーズを用いてPCR産物とビーズを1:1.12の割合で精製し、27.5 μl Tris (10 mM, pH 8.5)で溶出した。アンプリコン濃度をPicoGreenで定量し、ネガティブコントロールとブランクDNA抽出液を除き、アンプリコンを等モル濃度でプールし、10倍に希釈した。これらのコントロールは、バックグラウンドノイズやコンタミネーションを示すことを目的としているので、同じシーケンス深度は不要である。最終プールが適切なサイズであることをFragment Analyzer（Advanced Analytical）を用いて確認し、ローザンヌ大学Genomic Technology FacilityのIllumina MiSeqシーケンサーでシーケンシングを行い、2×250 bpのリードを作成した。
289の腹部サンプル、4つの陰性PCRコントロール、4つの模擬コミュニティサンプル、および16のブランクDNA抽出から、合計11,552,825の生配列を得た。生シーケンスデータは、LEADING:3、TRAILING:3、SLIDINGWINDOW:4:15、MINLEN:180を用いてTrimomatic [45]で品質フィルターした。品質フィルターされたデータは、Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2（DADA2）パイプライン（Rの "dada2 "パッケージバージョン1.20.0）[46]で解析された。learnErrorsステップでrandomize = TRUEとnbases = 3e8を設定し、sample inferenceステップでpool = TRUEを設定した以外は、すべての関数を推奨パラメータ（https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html）を使用して実行した。SILVAデータベースv.138を、同定されたASVの分類学的割り当てに使用した。ミトコンドリア、葉緑体、真核生物（"phyloseq "パッケージv1.36.0 [47]、"subset taxa "関数）に分類されたASVはすべて削除しました。次に、Rパッケージ "decontam "v.1.12.0 [48]の "prevalence "と "frequency "の両手法（method = "どちらか"）を用い、ネガティブPCRコントロールとブランクサンプルをリファレンスとして、ウェットラボ手順中に混入したコンタミネーションを同定・除去し、14種のASV（Renibacterium sp、 Ralstonia sp.、Microbacterium sp.、Leifsonia sp.、Cutibacterium sp.、Enhydrobacter sp.、Gordonia sp.、Sphingomonas ASV 2種、Methylobacterium-Methylorubrum ASV 3種、Comamonadaceae、Finegoldia）。最終的なデータセットは、79のASVに属する10,459,506リードから構成された（"Microbiota ABC.csv"; S1 TextのFig G）。
この解析では、必須アミノ酸を供給し、窒素リサイクルに関与していると考えられる[49,50]、Camponotusアリの偏性細胞内共生細菌であるBlochmanniaを除外した。この細菌はすべての個体（「02-Main.R」）に存在した。
多重ネットワークの可視化と解析
ユークリッド距離を用いて、行動、脳内遺伝子発現、腸内細菌叢プロファイル（異なるASVの相対量を使用）、および物理的環境におけるペアワイズを計算した。多重ネットワークの各レイヤーのレイアウトを生成するために、Rパッケージ "multinet" [51]を使用した。層内エッジは、類似度/相互作用頻度が上位四分位値以上のノードを接続し、層間エッジは同類のノード（すなわち、層aのノードiと層bのノードi）を接続する。gravity（1に設定）とiterations（1,000に設定）以外のすべてのパラメータはデフォルト値を使用した。ネットワークは python パッケージ "mnet" を使ってプロットした。レイヤー間の相関を比較するため、各レイヤーは一変量になるように複雑度を下げた。社会層には社会的成熟度を用い、年齢は事実上一変量とした。他の4つの層については、PCA（"02-Main.R"；"04-InterlayerCorr.R"）を用いた。微生物叢、行動、物理的環境データのPC1を抽出した。すべての生物学的変数がこの主成分と最も相関していたため、遺伝子発現データのPC2を抽出し、一方PC1は分子ラボからの抽出バッチと最も相関していた（S1テキストの図H）。
機械学習による予測
遺伝子発現データを社会的成熟度、行動、年齢の予測にどの程度正確に利用できるかを調べるため、まずDESeq2を用いて、全サンプルを用い、コロニーの同一性をコントロールしながら、目的の変数について差分発現解析を実行した（モデル：コロニー＋社会的成熟度；モデル：コロニー＋行動データのPC1；モデル：コロニー＋年齢；モデル：コロニー＋採餌スコアなど；「05-ML.R」）。全個体でカウント数が100未満の遺伝子は、差次的発現解析の前に除去し、Benjamini-Hochberg調整p値が<0.05のとき、差次的発現遺伝子とみなした。サポートベクターマシンモデル（Rパッケージ "e1071"、type = "eps-regression"、esp = "linear"）は、目的の変数によって差次的に発現した遺伝子のみを用いてトレーニングした。すべてのワーカーの半分をトレーニングに、残りの半分をテストに使用し、この手順を100反復繰り返した。各反復において、予測値と観測値の間のR2を計算し、反復におけるこれらのスコアの分布を予測精度の評価に使用した。変数間の100回の反復におけるR2値の分布を比較するために、2標本のt検定を使用した。
参考情報
S1 テキスト。
図A 年齢分布。4つのコロニーそれぞれについて。図B. 4つのコロニーごとの層間相関ネットワーク。エッジ幅はエッジの強さに比例し、レイアウトはFruchterman-Reingoldアルゴリズムで計算した。図C. 差異発現遺伝子数。4つのコロニーそれぞれについて、社会環境、行動、年齢、物理的環境、微生物叢のそれぞれ単独、および他の4つの変数のそれぞれをコントロールした場合に、差次的に発現した遺伝子の数。調整p値が＜0.05の場合、遺伝子は有意に発現が異なるとみなされる。図D. 社会的成熟度スコアのU字型分布。以前の結果と同様、4つのコロニーすべてにおいて、社会的成熟度スコアが中間より極端に高いワーカーが多かった。図E. 行動データのPCA。左：4コロニーそれぞれの行動データのPCA。右： ワーカーを社会的成熟度によって色分けした。図F. 社会的ネットワーク上に一貫してマッピングされた行動。各行動のパフォーマンスはコロニー内で0から1の間で正規化され、ワーカーは正規化されたスコアが最も高かったタスクに従って色分けされている。女王の世話をする（紫）に分類されたワーカーは女王に最も近く（マゼンタ）、その周りをブルードの世話をする（オレンジ）に分類されたワーカーが囲んでいる。掃除（黄）、トロファラクシス（灰）m、警護（赤）に分類されるものは一般に2つの社会的共同体の間に位置し、採餌（青）は女王から最も遠い。エッジの色の強さと幅はエッジの強さに対応する。レイアウトはRパッケージ "iGraph "を用いてFruchterman-Reingoldアルゴリズムで計算した。図G. 腸内細菌叢の組成の概要。(A）コロニー1。（B）左からコロニー2、3、4。サンプルは社会的成熟度順に並んでいる。図H. 遺伝子発現データのPCA。遺伝子発現空間の第1主成分は、技術的バッチ効果（抽出グループ）とよく相関し、生物学的変数とは相関しなかった。R2値を報告。
doi:10.1371/journal.pbio.3002203.s001
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