唾液中のSARS-CoV-2スパイク1サブユニットに対する交差反応性IgAの検出

唾液中のSARS-CoV-2スパイク1サブユニットに対する交差反応性IgAの検出
槻ノ木敬一、山本達夫、半田圭介、岩宮真理子、猿田樹里、井野聡、櫻井孝志
doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.29.21253174
PLOS ONEに掲載中 doi: 10.1371/journal.pone.0249979
0000109
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要旨
粘液、母乳、唾液中に豊富に含まれる分泌型IgA（sIgA）は、粘膜表面の感染を防ぐ免疫を提供する。プレパンデミック母乳中のsIgAがSARS-CoV-2と交差反応することが報告されているが、唾液中にも存在するか、存在するとすればSARS-CoV-2と交差反応するかは、これまで不明であった。我々は、唾液中のsIgAが、このウイルスに感染していない人のSARS-CoV-2スパイク1サブユニットと交差反応を示すかどうかを明らかにすることを目的とした。対象は神奈川歯科大学附属病院の歯科医師および医師137名（男性：n=101，女性：n=36，平均年齢38.7［24-65］歳）であった．唾液検体と血液検体をそれぞれPCR法とイムノクロマト法でIgGとIgMを分析した．そして，唾液検体がCOVID-19のPCR-およびIgM-陰性であることが確認された患者を同定した．SARS-CoV-2交差反応性IgA陽性者の割合は、SARS-CoV-2の受容体結合ドメインを覆うビオチン標識スパイクS1-mFc組み換えタンパク質を用いた酵素結合免疫吸着法によって測定された。SARS-CoV-2交差反応性IgA陽性者の割合は46.7％であり、これは年齢と負の相関があった（r = -0.218, p = 0.01）。全患者の唾液からsIgAを精製し，唾液中のsIgAがSARS-CoV-2 spike proteinのACE-2 receptorへの結合を抑制していることを確認した．また、SARS-CoV-2感染経験のない被験者の唾液からもSARS-CoV-2交差反応性sIgAが検出され、sIgAがSARS-CoV-2感染予防に役立つことが示唆された。

はじめに
分泌型IgA（sIgA）は、免疫システムの一つである粘膜免疫を介した感染症の予防を行う。sIgAは、IgAの二量体、J鎖、分泌成分からなり、唾液腺や乳腺などの腺組織から粘膜表面に分泌され、粘膜からの抗原の侵入を防ぐ中心的役割を担っている[1]。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）は、口腔、鼻腔、肺を経由してヒトに感染する[2]。舌の扁平上皮や歯周組織には、SARS-CoV-2の受容体であるangiotensin converting enzyme-2 (ACE-2) や、感染を促進するプロテアーゼである transmembrane protease serin 2 (TMPRSS2) や furin が発現し［3］、唾液は SARS-CoV-2 を保持します［4］。また、唾液には感染を抑制する物質（ラクトフェリン、リゾチーム、最も多く含まれるsIgAなど）がいくつか含まれており、ウイルスが口腔内に侵入するのを防いでいます[5]。

SARS-CoV-2に対する交差反応性sIgA（CRsA）は、COVID-19のパンデミック以前に母乳中に確認されている[6, 7]。さらに、SARS-CoV-2反応性CD4+T細胞もパンデミック前に非被曝者の約40%〜60%で検出され、T細胞が感冒コロナウイルスとSARS-CoV-2に交差反応することが示唆された[8]。その後の知見[9, 10]は、コロナウイルスへの先行感染が、sIgA交差反応性と関連する免疫学的記憶を作り出すことを示唆した。

SARS-CoV-2に感染すると、無症状から致死的な急性呼吸不全に至るまでユニークな症状のスペクトルを示すCOVID-19を引き起こします[11]。SARS-CoV-2感染の重症度と有病率は、それぞれ年齢層と国によって顕著な差があります[12]。免疫機構がこの大きな格差を説明するかもしれないが、まだ十分に解明されていない。免疫グロブリンG（IgG）はSARS-CoV-2を排除することができ、このウイルスに対するワクチン開発が緊急に必要である[13]。しかし、SARS-CoV-2感染からの回復とその予防の観点から、sIgAによる粘膜免疫については、これまで検討されていない。この領域で新たな知見が得られれば、COVID-19の特性をより深く理解できる可能性がある。

そこで、SARS-CoV-2と交差反応を示すsIgAを検出する酵素免疫測定法（ELISA）を作成し、非感染者においてSARS-CoV-2スパイク1サブユニットと交差反応を示す唾液中sIgAがあるかどうかを明らかにすることを目的とした。

調査方法
被験者の選択
唾液サンプルと血液サンプルをそれぞれPCRとイムノクロマト法で検査した。PCRとIgM検査でCOVID-19が陰性であることが確認された唾液サンプルを持つ個人を対象とした。対象者は神奈川歯科大学附属病院の医師5名、歯科医師132名である。IgA腎症，選択的IgA欠損症，自己免疫疾患を有する者，過去2週間以内に風邪様症状を呈した者は除外した．137名（男性：n=101，女性：n=36，平均年齢：38.7［24-65］歳）の検体を，十分なインフォームドコンセントのもとに解析した。本研究は，神奈川歯科大学研究倫理審査委員会の承認（承認番号：#690）のもとで実施した．本研究は、ICMJE の基準を満たす日本の臨床試験 UMIN-CTR（承認番号：#R000046461）レジストリに登録された。

ELISA用唾液の採取
2020年8月の午前9時から午後12時の間に、感染管理のもと、病院の決まった部屋でSalivettes®（Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, Germany）を用いて検体を採取しました。サンプル採取の1時間以上前から飲食や歯磨きを控えるよう指示した。唾液サンプルは直ちに2,000×gで15分間遠心分離した後、-80℃で保存した。

スパイク蛋白に対する交差反応性sIgA(CRsA)のELISA法の設計
山本ら[14]が報告したヒト IgA ELISA 定量セット (#E88-102; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) を用いて、インフルエンザウイルスに対する IgA 交差反応性を検出できる ELISA システムを改良した。唾液サンプルは炭酸-重炭酸バッファーで500倍に希釈し、25℃で1時間インキュベートした。ウェルは洗浄液で5回洗浄した。抗原は、SARS-CoV-2のスパイク1サブユニットとスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）からなるリコンビナントスパイク1-mFcタンパク質（#40591-V05H1；Sino Biological, Beijing, China）を使用した。この抗原は、製造元に記載されたキット（#BK01; 同仁堂研究所、日本、熊本）を用いてビオチンで標識した。ビオチン標識したスパイク1を1μg/mLの濃度でウェルに添加し、25℃で1時間インキュベートした。ウェルを洗浄液で5回洗浄した。次に、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（SA202; Millipore, USA; 希釈度1:1000）を使用し、25℃で1時間反応させた。TMB基質溶液を加え、25℃で15分間反応させた後、停止液でクエンチした。マイクロプレート吸光光度計（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を用いて、450 nmでスパイク1タンパク結合IgAを定量した。PBSを含むネガティブコントロールによるバックグラウンド吸光度は、すべての唾液サンプルの吸光度から差し引いた。

IgAの精製
IgA精製キット（#20395；Thermo Fisher Scientific K.K., Waltham, MA, USA）を用いて製造者の記載に従ってsIgAを精製し、1次抗ヒトIgAウサギモノクローナル抗体（ab184863；Abcam Plc, Cambridge, UK）1：500希釈および2次抗ラビットポリクローナル抗体（#P0448；Dako A/S., Glostrup, Denmark；1：1000希釈）による標準ウェスタンブロッティングにより分子量の確認が行われました。

ACE-2のスパイクタンパク質への結合は、精製sIgAによって阻害された。ELISAの結果に基づいて、抗体陽性の上位20サンプルと、抗体陰性の下位20サンプルを選択し、プールした。プールされた陽性および陰性唾液サンプル中の抗体の最終濃度は、それぞれ93.6および63.3 µg/mLであった。

sIgA抗体のACE-2スパイク蛋白結合阻害能力
SARS-CoV-2スパイクタンパク質へのACE-2の結合を阻害するsIgAの能力は、SARS-CoV-2スパイク-ACE-2結合アッセイキット (#COV-SACE2-1; RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) を用いて、製造業者にしたがって評価された。陽性対照として用意したSARS-CoV-2スパイク中和ウサギIgG mAb (#40592-R001; Sino Biological) に、0, 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 μg/mL の濃度で中和抗体を添加した。

質問票
参加者は唾液採取前に自記式アンケートに答え、過去1年以内にBCG、B型肝炎、インフルエンザのワクチン接種を受けたことがあるかどうかを確認した。

統計解析
陰性値を0としてCRsAの相対的ELISA値を求め、スピアマン順位相関を用いて年齢との関連を解析した。ELISAにおけるCRsAの相対的な陽性（＞0）、陰性（0）とバイナリデータ、年齢層、性別、BCG接種状況、B型肝炎接種状況、インフルエンザワクチンとの関連を検討した。ワクチン接種歴との関連は，カイ二乗検定またはフィッシャー正確検定を用いて検討した．B型肝炎ワクチンとインフルエンザワクチンの変数については，接種回数とIgA陽性・陰性との関連を調べるために，どちらでもない，どちらか一方，または両方としてまとめた．BCG，B型肝炎ワクチン，インフルエンザワクチンの変数については，0，1，2，3としてまとめ，接種回数とIgA陽性・陰性との関連を検討した．有意水準は5％とした。すべてのデータはSPSS version 26 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)を用いて統計的に分析された。

結果
スパイク蛋白に対する交差反応性sIgA(CRsA)
ELISAで測定したCRsAの相対値を0とし、陰性とした。CRsAは64（46.7%）の検体で陽性、73（53.3%）の検体で陰性であった。

図2に年齢と交差反応性IgAとの関連性を示した。年齢は相対的CRsAと有意かつ負の相関を示した（r = -0.218, p = 0.01）。CRsAの陽性率は、49歳以上の参加者に比べ、50歳以下で有意に低かった（p＝0.008）。ワクチンとCRsA陽性・陰性との関連は有意ではなかった。

インラインで見る
表1.
年齢、性別、ワクチン接種とCRsA陽性との関連性。
図1.
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図1.
唾液中のスパイク蛋白に対する交差反応性抗体の検出割合（%）。
137名の参加者の唾液中の交差反応性抗体をELISA法で検出した。比率は陽性または陰性（吸光度0以下）として計算した。

Fig.2.
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図2.
参加者の年齢とCRsA陽性の関連性。
縦軸はCRsA陽性者の吸光度から求めたIgAの相対量、横軸はCRsA陽性者の吸光度から求めたIgAの相対量、縦軸はCRsA陽性者の吸光度から求めたIgAの相対量。陰性は0として示した。吸光度は49歳以下の多くの参加者でかなり高い値を示した。

CRsA阻害試験
ウエスタンブロットにより、精製IgAは約60kDaの単一バンドであり、sIgAであることが確認された（データ未掲載）。

陽性対照では、異なる濃度（0-0.2μg/mL）のスパイク中和抗体添加による吸光度の範囲は2.155-0.493であり、濃度依存的に減少して中和活性が確認された。スパイクタンパク質に対する中和抗体は、抗体濃度0 µg/mLで2.155の吸光度を示しました。この吸光度は、ELISA法においてACE-2とスパイクタンパク質が最も結合するときの吸光度を示している。CRsA陰性唾液サンプルは2.402と2.155以上の吸光度を示したため、ACE-2とスパイクタンパク質の結合は阻害されていないことが確認された。CRsA陽性唾液サンプルは吸光度が1.678であり、ACE-2とスパイクタンパク質の結合は一部阻害された。

考察
本研究では、137名の唾液サンプルの46.7%にSARS-CoV-2 spike 1に対するCRsAが検出された。調べたspike 1領域には、SARS-CoV-2の受容体ACE-2と結合するRBDが含まれていた。この領域は感染予防に重要であるため、ワクチン開発のターゲットとなる可能性がある[14]。過去に行われた母乳中のSARS-CoV-2 CRsAのELISAでは、全スパイクタンパク質とRBDを抗原として、それぞれ100%と80%の陽性率が得られた[6]。しかし、本研究における唾液中の値は、この両者よりも低いものであった。これは、唾液よりも母乳の方がより多くの sIgA が産生されるためと思われる[15]。母乳中のCRsAが豊富なことは、ワクチン接種後の反応として証明されており[16]、CRsA陽性率が母乳よりも唾液で低かった理由を説明できるかもしれない。

PCRと抗体検査で判定されたCOVID-19が陰性の唾液検体を持つ参加者は、本論文投稿時にCOVID-19を発症していなかった。したがって、彼らはSARS-CoV-2に曝露されていなかったと考えられる。このように、SARS-CoV-2の感染歴のない人のSARS-CoV-2のスパイク1蛋白に対するsIgA抗体を明らかにした。COVID-19のパンデミック以前にSARS-CoV-2のスパイク蛋白と交差反応する唾液中IgA抗体を見出した研究は他に1件のみであった[17]。コロナウイルスのヌクレオキャプシド蛋白は相同性が高いが、スパイク蛋白はほとんど共通性がない[18]。HCoV-OC43や他のコロナウイルスへの感染歴のある患者は、それぞれSARS-CoV-1に対する抗体とSARS-CoVのヌクレオキャプシド蛋白に交差反応する抗体を持っています[19]。さらに、HCoV-NL63はACE-2を受容体としているのに対し、そのスパイクタンパク質はSARS-CoV-2とほとんど相同性がない[20]。しかし、最近、NL63の受容体結合モチーフ3とSARS-CoV-2のCOV2-SPIKE421-434の交差反応が報告されている[20]。過去の一般的なコロナウイルス感染症では、スパイクやヌクレオカプシド蛋白に交差反応する抗体が誘導されることから、唾液中にSARS-CoV-2に交差反応する唾液中sIgAなどの抗体が存在することは妥当であると考えられる。しかし、唾液中 CRsA の交差反応性の背景にあるエピトープについては、まだ解明されていない。

本研究では、加齢に伴いCRsA濃度が低下することを見出した。これは、IgA量が加齢に伴い減少することに起因していると考えられる[21]。また、SARS-CoV-2流行前の1-16歳、17-25歳、26歳以下の血清検体では、それぞれ62％、43.75％、5.72％のIgG抗体が確認された[9]。小児は一般的なコロナウイルスに感染する頻度が高いため、より多くの曝露により、より多くの人が交差反応性抗体を持つことになることを示していると思われる。さらに、SARS-CoV-2に対する交差反応性T細胞は、高齢者では稀である[22]。これらの結果は、CRsA が若年者に流行し、高齢者にはまれである理由を説明することができる。COVID-19が小児[23]や青年[12]では重症化しにくく，無症状であることが多いことの背景には，このようなメカニズムがあるのかもしれない．

今回、CRsAを持たない個体では、ACE-2とスパイク蛋白の結合が阻害されないことを明らかにした。一方，交差反応性IgAがACE-2とスパイク蛋白の結合を阻害したことから，唾液中のCRsAがSARS-CoV-2に対する中和抗体として機能し，中和反応によりSARS-CoV-2感染を防いでいる可能性が考えられた[24]．唾液にはSARS-CoV-2が含まれているが、感染抑制因子も含まれている[3]。唾液中のラクトフェリンは、SARS-CoV-2と結合する感染抑制因子である[25]。sIgA はラクトフェリン、リゾチーム、ペルオキシダーゼと相乗効果のある抗原処理機能を持っているため、唾液中の抗菌・抗ウイルス因子が CRsA の作用を増強する可能性がある[26]。

初期のSARS-CoV-2特異的体液性反応はIgA抗体によって支配されており、これらがSARS-CoV-2感染後の免疫に重要な役割を果たすことが示されている[27]。一方、SARS-CoV-2に対する中和IgA抗体は、症状出現後49〜73日間、唾液中に残存する[27]。唾液中のスパイク1-CRsAは、COVID-19における肺炎の重症度とも関連している[17]。唾液は簡便かつ非侵襲的に採取でき、sIgAは劣化しにくく輸送条件も厳しくないため、実用的な検体である。唾液中のsIgAを簡便かつ非侵襲的に測定する方法の開発は、将来的にSARS-CoV-2感染の診断やリスク予測、ワクチンへの反応に重要であると思われる。

本研究の限界の一つは、参加人数が少ないことである。ワクチンは交差反応性抗体の産生を刺激するが[7]、ワクチンと交差反応性抗体の間に有意な関連は見いだせなかった。今後の研究では、医療に携わっていない（ワクチン接種の経験のない）個人を比較する必要がある。

結論
本研究では、COVID-19未経験者の唾液からSARS-CoV-2交差反応性IgAスパイク蛋白を同定した。高齢者は青少年よりSARS-CoV-2スパイク蛋白-CRsAが低値であった．唾液中のIgAがACE-2とスパイク蛋白の結合を阻害している可能性が示唆された．口腔内におけるSARS-CoV-2感染抑制因子としてIgAの重要性を明らかにした．口腔はウイルスの複製場所であるにもかかわらず、この区画における抗SARS-CoV-2抗体を調べた研究はほとんどないため、我々の知見は新規のものである[28]。

データの利用可能性
データへのアクセスはできません。

著者による貢献
コンセプト立案。月乃木希典。

データ解析。山本達夫.

サンプル収集。サンプル収集：半田圭佑、岩宮真理子。

調査。猿田樹里。

プロジェクト管理。猪野聡。

監修：櫻井隆 櫻井隆。

資金調達 資金獲得：鹿島勇。

執筆・原案作成。原案作成：月乃木希典

執筆-レビュー 山本達夫、半田圭介、猿田樹里。

謝辞
神奈川歯科大学大学院中央研究支援センターの山田真紀子氏には，貴重な技術的支援をいただいた。

脚注
要旨のP値を0.008に修正し、本文と一致させた。また、著者を1名追加しました。本文に変更はありません。

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