免疫グロブリンG依存的な炎症性骨リモデリングの抑制にはパターン認識受容体Dectin-1が必要だ

2023年3月22日 09:55

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2023年3月21日オンライン公開
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記事
免疫グロブリンG依存的な炎症性骨リモデリングの抑制にはパターン認識受容体Dectin-1が必要だ

著者リンク open overlay panelMichaela Seeling 1, Matthias Pöhnl 2, Sibel Kara 1, Nathalie Horstmann 1, Carolina Riemer 1, Miriam Wöhner 1, Chunguang Liang 3, Christin Brückner 1, Patrick Eiring 4, Anja Werner 1, Markus Biburger 1, Leon Altmann 1, Martin Schneider 1, Lukas Amon 5, Christian H. K. レーマン 5、イ・スヨン 6、マイク・クンツ 3 7 8、ダイアナ・ドゥジアック 5、ゲオルグ・シェット 9、トビアス・ボイエル 10...ファルク・ニマーヤーン 1 13 14
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https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.02.019Get 権利と内容
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IgG依存的に関節と骨の炎症が消失する経路は別々である。

IVIgによる破骨細胞形成抑制にDectin-1が必要である。

IVIgはDectin-1/FcγRIIb軸を介して単球を再プログラムする

デクチン-1は、低親和性阻害型FcγRIIbへの単量体IgGの結合を促進する
概要
免疫グロブリンG（IgG）抗体は、感染症や自己免疫疾患における炎症の主要なドライバーである。しかし、プール血清IgG（IVIg）では、抗体は強力な免疫調節および抗炎症活性を有するが、これがどのように媒介されるかは不明である。我々は、サイトカインおよび自己抗体駆動型関節リウマチモデルにおいて、IgG依存的な炎症消失の開始を研究し、IVIgのシアル酸が関節炎症を抑制する一方、破骨細胞形成の抑制はシアル酸に依存しないことを見出した。一方、破骨細胞形成の抑制はシアル酸に依存せず、受容体Dectin-1やFcγRIIbを欠損したマウスではIVIgによる破骨細胞形成の抑制が消失した。原子論的分子動力学シミュレーションと超解像顕微鏡により、Dectin-1がFcγRIIbの膜構造を促進し、生産的なIgG結合を可能にし、マウスおよびヒトIgGサブクラスとの相互作用を強化することを明らかにした。IVIgは、Dectin-1を必要とするFcγRIIb依存的なシグナル伝達を介して、単球を再プログラムした。本データは、マウスおよびヒトの破骨細胞形成をIgG依存的に抑制するための共抑制チェックポイントとして、Dectin-1の病原体非依存的な機能を同定した。これらの知見は、自己抗体やサイトカインによって引き起こされる炎症の治療標的として重要であると考えられる。

図解抄録
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キーワード
IgG
炎症
骨
破骨細胞
グリコシル化
Fcレセプター
デクチンワン
かんせつリューマチ
はじめに
自己組織に大きな損傷を与えることなく、侵入してきた微生物と戦うバランスのとれた免疫反応を作り出すことは、宿主にとって重要な意味を持ちます。感染症の場合、病原体の減少や除去は炎症の解消を開始する自然なシグナルであるが、自己抗原の継続的な存在は、様々な自己免疫疾患において常に炎症を煽っている1、2、3。自己免疫反応を制限するために、いくつかのチェックポイントが設けられ、自然免疫細胞や適応免疫細胞のプライミングや活性化を防いでいる。例えば、適応免疫のレベルでは、制御性T細胞やIL-10を分泌するB細胞が自己反応性細胞の活性化を制限し、自己免疫の炎症を抑制することができる。8,9 自然免疫系のレベルでは、活性化受容体と抑制受容体が同時に存在することにより、過剰または早期の細胞の活性化が制限される。免疫グロブリンG（IgG）依存性の自然免疫エフェクター細胞の活性化に関しては、活性化Fcレセプターと抑制Fcレセプターの共発現が、IgG活性の調節に中心的な役割を果たします9、10、11。この受容体依存的な炎症性IgG活性の調節とは別に、IgG自体が活性な抗炎症または免疫調節活性を有することがある。9,12,13 この抗炎症活性は、臨床的には、免疫グロブリン静注製剤（IVIg）という形で、様々な慢性炎症性および自己免疫疾患の抑制に用いられている 14,15,16 。前臨床モデル系におけるIgGおよびIVIgの活性の研究により、IgG抗体が定常状態および炎症時の免疫応答を調節する分子および細胞経路がいくつか同定されました9,12。これらの経路には、IVIgによる自己抗体依存性の補体およびFcγR系の活性化の阻害、制御性T細胞の誘導、自己抗体の半減期の調節、活性化FcγRの遮断、または阻害性FcγRIIbのアップレギュレーションなどが含まれる14,15,17,18)。さらに、IVIg製剤に含まれる高シアリル化IgG糖鎖は、C型レクチンファミリーに属する細胞表面受容体を介して少なくとも部分的に炎症を抑制することが実証された9,19,20,21。IVIgがマウスで炎症を抑制する経路のいくつかは、ヒト化マウスモデルやヒト臨床試験で検証されており、ヒトシステムに対する前臨床試験の価値が証明されています22,23,24,25。しかし、IVIgの活性を支えるメカニズムは複雑であり、臓器環境におけるIVIgの免疫調節活性に関する詳細な理解はほとんど得られていないことが明らかになっています。これは、関節リウマチ（RA）の骨内のように、自己免疫疾患が大規模な組織損傷やリモデリングを引き起こす組織において、特に関連性があると考えられます26。
関節リウマチは、関節と骨を標的とする慢性的な自己免疫疾患であり、欧米では人口の1％が罹患していると言われています26,27,28。例えば、炎症性サイトカインの中和やB細胞の枯渇に焦点を当てたいくつかの標的療法は、非常に良好な臨床効果を示しています29。また、IVIgは若年性関節炎患者において臨床的に有効で、炎症を抑制することが実証されています15。動物モデルを用いたこれまでの研究で、IVIgは関節内への好中球の動員を効率的に抑制し、関節の炎症を抑えることが実証されています30,31。これらの研究では、IVIgによる好中球の動員抑制を担う経路が、治療開始時期によって異なることも明らかになりました。例えば、疾患の初期段階では、IVIgの活性はSignR1に依存していたが、確立した疾患におけるIVIg依存的な炎症消失の開始はSignR1に依存しなかった。20,32 さらに重要なことは、炎症プロセスが進行する中でIVIgが骨破壊を抑制する方法はまだ十分に解明されていないことである。
今回、自己抗体またはヒトTNF-α駆動のRAモデルを用いて、IVIgによる関節炎症と骨破壊の抑制には、異なる経路が関与していることを明らかにした。IVIgによる炎症性自然免疫エフェクター細胞の関節内への動員抑制はIVIgのシアル酸化に依存していたが、IVIgを介した骨リモデリングの抑制はシアル酸に依存しなかった。機構的には、IVIgの注入はin vitroおよびin vivoで破骨細胞形成の直接的な抑制をもたらし、これはDectin-1とFcγRIIbに依存していた。原子分子動力学シミュレーションと超解像顕微鏡を含む実験的研究により、デクチン-1がFcγRIIbの構造変化と膜クラスター化を介してIVIgとの相互作用能力を調節するというモデルがさらに支持され、デクチン-1はFcγRIIb機能の調節因子として機能していることが示唆された。
研究成果
IgGシアリル化は関節炎症を抑制するが、炎症性骨リモデリングの抑制には必要ない
炎症性サイトカインや自己抗体によって引き起こされる関節の炎症は、破骨細胞の新規発生を引き起こし、炎症が生じた関節の過剰な骨吸収の原因となる。IVIgが生体内でどのように関節の炎症と骨吸収を阻害するかを理解するために、ヒトサイトカインTNF-αの全身過剰発現または関節炎を起こしたKBxNマウスの血清注入（血清移植関節炎［STA］）により、関節炎症と骨吸収が生じる2つの独立したマウスモデル系を選択しました（図1およびS1）33, 34 さらにヒト臨床治療状況を模して確立した疾患を持つマウスを扱うことに焦点を合わせました。予防および治療スキームを用いた先行研究と同様に、IVIgはSTAまたはヒトTNF-α駆動関節炎を治療する際に効率的に炎症の消失を誘導し、ほとんどの先行研究と同様に両モデル系においてIVIg依存性の関節炎症抑制に末端シアル酸残基が必要であることを証明しました（図1A-1F、S1A～S1C）。 30,31,32,35 しかし、IVIgを介した自己抗体による骨破壊からの保護および炎症性破骨細胞形成の抑制は、両モデル系においてIgGのシアル化とは無関係に阻害された（図1G、1H、S1D、およびS1E）。IVIg製剤にはヒトサイトカイン特異的抗体が含まれている可能性があるため、TNF-αトランスジェニックマウスにおいてIVIg注入によりヒトTNF-α血清濃度が変化するかどうかを検討した（図S1F）12，13。しかし、TNF-αトランスジェニックマウスのヒトTNF-α血清濃度は減少せず、IVIgによる骨破壊抑制にはTNF-α中和やIgGシアル化とは別の経路で貢献していると考えられる。
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図1. IgGのシアリル化は関節炎症の抑制に必要だが、炎症性骨リモデリングの抑制には必要ない
(A-H）マウスにKBxN血清を注射して炎症性関節炎を誘発し、炎症性関節炎誘発3日後にPBS、IVIg、ノイラミニダーゼ処理IVIg（NeurIVIg）で治療した。
(AおよびB）PBS（n＝5）またはIVIg（n＝5）でそれぞれ処置したマウスの関節炎誘発後6日目および10日目のMRIスキャンにおける矢状方向の代表的MR画像（A）およびT2 STIR高強度領域の体積の定量化（B）を示している。矢印は、(B)で定量化された炎症を伴う例示的な領域を示す。2回の独立した実験のうち1回が描かれている。
(C）PBS（n＝28）、IVIg（n＝31）、またはノイラミニダーゼ処理IVIg（NeuIVIg）（n＝27）で処置したマウスにおける炎症性関節炎の臨床スコアの時間経過を示す。表示されているのは、3つ以上の独立した実験のうち、平均±SDである。統計的検定は、Bonferroni post-testを伴う二元配置ANOVAによって行われた。
(D）KBxN血清注入10日後のパンヌス形成（ヘマトキシリン・エオシン［H＆E］染色）、軟骨（サフラニン-O染色）、および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色による骨破壊を示す中足骨関節の代表組織片を示す。炎症性浸潤のある部位は赤の破線とアスタリスクで示し（A）、軟骨破壊（暗赤色染色の消失）のある模範的な部位は黒の点線で、骨表面のTRAP陽性破骨細胞の模範的な部位は白矢印で示す。スケールバーは100 µMを示す。
(E-H) 炎症関節の炎症部位（E）、軟骨破壊（F）、骨びらんの面積（G）、びらん部の破骨細胞数（H）の定量化。描かれているのは、3回以上の独立した実験（n = 17-24）のうち平均±SDである。統計学的検定は、一元配置分散分析と試験後のTukeyまたはBonferroni補正によって行われた。
(IおよびJ）PBS、IVIg、またはNeurIVIgを注射した7日後の関節炎C57BL/6マウス（治療開始：KBxN血清移植3日後、C参照）の血清（I）および関節（J）中のヒトIgG濃度の定量化．描かれているのは、≧2の独立した実験（n≧9）のうち中央値である。統計学的検定は、Kruskall-Wallis検定とDunnの後検定で行われた。
(KおよびL）7日前にPBSまたはIVIgで処理したC57BL/6マウスの骨髄細胞からin vitroで生成した破骨細胞数の代表画像（K）および定量化（L）を示す。スケールバー、100μm。(2回の独立した実験からn≧9)。
(M-O) FcγRIIb-(n=7-8)（N）またはDectin-1-(n=5-6)（O）欠損マウスから作製したヒト末梢血由来（n=8）（M）またはマウス骨髄由来の破骨細胞のin vitro生成に対するIVIgの影響。破骨細胞分化開始後4日目に、指示量のIVIgまたはPBSを補充した破骨細胞培養物における視野あたりの破骨細胞の定量化を示す。
(L-O）同じヒトドナーまたはマウスに由来する破骨細胞培養物からのPBSおよびIVIgのデータポイントを連結している。赤線と数字は、3回以上の独立した実験のうち、成熟破骨細胞の平均を示す。統計的有意性は、paired t test、Mann-Whitney test、またはWilcoxon matched-pairs signed rank test（2mg用量）で解析した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、n.s.は有意差なしを示す。
図S1および図S2もご参照ください。
IVIgが破骨細胞形成を直接抑制できるかどうかを調べるために、IVIgが骨髄前駆体の破骨細胞への分化能にどのような影響を与えるかを評価した。このため、IVIgをin vitroでマウスやヒトの破骨細胞培養液に添加するか、in vivoでマウスをIVIgでプライミングした後、ex vivoで単球を破骨細胞へ分化させました。in vitro培養でin vivoの状況を模倣するために、IVIgの静脈注射時に血清（2 mg/mL）または関節液（1 μg/mL）に存在するIVIgの濃度を選んだ（図1I、1J、およびS1G）。いずれの実験環境においても、骨髄前駆体から多核破骨細胞への破骨細胞分化の抑制が明らかになり、IVIgがin vitroおよびin vivoでマウスおよびヒトの破骨細胞形成に直接影響を与えることが示唆された（図1K-1M、S1H、S1I、S2A、およびS2B）。
デクチン-1とFcγRIIbはIgG依存的な破骨細胞形成の抑制に必要である。
予防治療モデルにおいてIVIgの活性に必要であることが示唆されている古典的なFcγRまたはSignR1やDCIRなどのC型レクチンファミリーのメンバーは、破骨細胞形成に対するIgGのこの抑制効果に関わる細胞表面受容体と考えられる19、20、36、37。図1N、1O、S2C、S2Dに示すように、抑制性FcγRIIbまたはDectin-1を欠損したマウスでは、IVIgはin vitroまたはin vivoで破骨細胞形成を抑制することができなくなった。一方、活性化FcγRもSignR1やDCIRもIVIgによる破骨細胞形成の抑制にin vitroやin vivoでは必要なかった（図S2E-S2J）。
デクチン-1は真菌の細胞壁成分を認識するパターン認識受容体で、細胞質領域に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ITAM）様シグナル伝達モチーフを持つ。38,39 しかし、デクチン-1は補体依存性炎症モデルマウスにおいてC5a受容体の活性を調節し、ガレクチン3を介して経口耐性を制御することが知られており、自己抗体駆動型炎症などの無菌免疫応答の制御にも関わる可能性がある。41, 41 IVIg が生体内の炎症条件下での破骨細胞形成抑制に FcγRIIbおよびDectin-1を必要とするかどうかを検討するため、FcγRIIb-またはDectin-1欠損マウスに炎症性関節炎を誘発し、関節炎の成立後にIVIg投与を行いました（図2）。IVIgはFcγRIIb-およびDectin-1欠損マウスの両方で炎症の消失を誘導することができたが（図2A、2B、2D-2F、および2H）、IVIgはin vivoでどちらの受容体も存在しない場合に破骨細胞形成および骨破壊を抑制できなかった（図2Dおよび2H）ことから、in vivoでのIVIgによる破骨細胞形成の抑制にいずれかの受容体を必要とするということが分かった（図1N、1O、S2C、およびS2D）。重要なことは、C57BL/6野生型マウスと比較して、Dectin-1欠損マウスもFcγRIIb欠損マウスも、骨塩化、骨または海綿体積、骨厚などの定常状態の骨パラメータに重度の系統固有欠損を示さなかった（図S3A-S3J）。さらに、in vitroにおける単球前駆体からの破骨細胞の生成は、すべてのマウス系統で等しく効率的であった（図S3K）。このことは、Dectin-1-欠損マウスもFcγRIIb欠損マウスも、定常状態における破骨細胞生成に本質的な欠陥または変化を持たないことを示唆している。
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図2. デクチン-1とFcγRIIbがIVIg依存的に関節炎症と炎症誘発性破骨細胞形成を抑制することを媒介する
(A-H）FcγRIIb（A-D）およびDectin-1欠損（E-H）マウスにおけるIVIg依存的な確立炎症性関節炎の抑制。炎症性関節炎の誘発3日後にPBS（n = 10-17）またはIVIg（n = 10-20）を注射したマウスの3回以上の独立した実験からの平均±SDを描写しています。臨床スコア（AおよびE）、KBxN血清注入10日後のヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）、サフラニン-OおよびTRAP染色した関節切片の代表組織像（BおよびF）、およびそれぞれの炎症領域の定量化（DおよびH）（FcγRIIb-/-：n＝14〜18、Dectin-1-/-．n＝4-7）、軟骨破壊の割合（FcγRIIb-/-：n＝14-18、Dectin-1-/-：n＝7-8）、骨びらん面積（FcγRIIb-/-：n＝10-15、Dectin-1-/-: n＝8-9）、PBSまたはIVIgで治療したFcγRIIbまたはDectin-1欠損マウスの骨びらん部位の破骨細胞数（FcγRIIb-/-：n＝10-15；Dectin-1-/-：n＝8-9）である。組織像において、炎症性浸潤のある部位は赤の破線とアスタリスクで、軟骨破壊（暗赤色染色の消失）のある例示的な部位は黒の点線で、骨表面のTRAP陽性破骨細胞の例示的な部位は白い矢印で示す。統計学的検定は、二元配置ANOVAとBonferroni post-test（AおよびE）、非対t検定（D）、またはMann-Whitney検定（H）のいずれかによって行われた。スケールバー（BおよびF）は100μMを示す。
(CおよびG）20mgのIVIgまたはPBSの適用7日後にELISAで決定した、関節炎FcγRIIb-/-およびDectin-1-/-マウスの血清および関節液におけるヒトIgGの定量化。描かれているのは、4回以上の独立した実験（n≧7）のうち中央値である。データの統計解析には、Welchの補正を加えた非対称t検定（血清Dectin-1-/-）またはMann-Whitney検定が用いられた。
(I）K/BxN血清移植10日後のC57BL/6、FcγRIIb-、Dectin-1-欠損マウスの血清中のグルコース6-リン酸イソメラーゼ（αGPI）抗体に対するIVIgの効果を描いた（n ≥ 7）。統計解析のため、PBSおよびIVIg治療群は、各系統について、無対t検定、Welch補正付き無対t検定（αGPI-IgG1 C57BL/6）、またはマン・ホイットニー検定（αGPI-IgG Dectin-1-/- ）で個別に比較した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、n.s.は有意差なし。
図S2および図S3もご参照ください。
IVIgが炎症の解消を引き起こす重要なメカニズムとして、新生児のFcRnを自己抗体と競合させることにより、血清自己抗体のクリアランスをより迅速にすることが挙げられる13,22,42）。しかし、IVIgによる血清中の自己抗体濃度の低下は、C57BL/6、Dectin-1欠損マウス、FcγRIIb欠損マウスで同等であったことから、Dectin-1とFcγRIIbはいずれもFcRnと協調して自己抗体の半減期を調節していないと考えられた（図2I）。さらに、IVIgはFcγRIIb欠損動物とDectin-1欠損動物の両方の血清と関節に存在し、関節へのIgG輸送を制御する上でどちらの受容体の役割も否定した（図2Cおよび図2G）。
IVIgはDectin-1とFcγRIIbを介して破骨細胞前駆体を再プログラムする。
IVIgによるDectin-1およびFcγRIIb依存的な破骨細胞形成抑制のメカニズムをさらに理解するために、破骨細胞形成のどの発生段階（単球前駆細胞から初期および後期/成熟破骨細胞まで）で両受容体が共発現するかを調べた（図3およびS4）。図3A〜3Cに示すように、破骨細胞の前駆細胞であるLy6Chigh単球では、FcγRIIbだけでなく、Dectin-1も高発現していた43。このことは、単球が炎症性刺激にさらされるとDectin-1やFcγRIIbの発現が低下することを示した最近の研究と一致している43,44。このことから、IVIgが作用する主要な標的細胞は破骨細胞の前駆細胞であるLy6Chigh単球であることが示された。Dectin-1がLy6Chigh単球のFcγRIIbシグナルを調節しているかどうかを調べるために、FcγRIIbの細胞質免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ITIM）ドメインのリン酸化を検討した。図3Eに示すように、Dectin-1非存在下では、単球においてFcγRIIbのITIMリン酸化の定常レベルが低下した（B細胞では低下しなかった）ことから、Dectin-1はFcγRIIbの抑制性シグナル伝達能力の維持に関与していると考えられた。さらに、ITIMドメインを変異させたFcγRIIb変異体のノックインを導入したFcγRIIb欠損マウスでは、IVIgは単球の破骨細胞への分化を抑制できなかった（図3F）ことから、ITIM依存性のシグナル伝達経路がIVIgによるin vivoでの単球の破骨細胞への分化抑制に実際に関係していることが明らかになった。IVIgがin vivoで単球のトランスクリプトームを調節しているかどうかを調べるために、マウスをIVIgでプライミングし、単離した単球のRNAシーケンス（RNA-seq）解析を実施した（図4）。さらに、遺伝子セットの濃縮解析により、炎症反応、JAK-STAT、TNF-αシグナルなどの経路に関与する遺伝子が、IVIgのプライミングにより単球でダウンレギュレーションされることが明らかになった（図4Aおよび4B）45，46，47，48）。注目すべきは、Dectin-1欠損マウスおよびFcγRIIb欠損マウスでは、IVIgはこれらの遺伝子や破骨細胞形成に関わる主要経路を抑制しなかったことである（図4Eおよび図4F）。したがって、RNA-seqデータから、IVIgは破骨細胞の単球前駆細胞を、両受容体を介して破骨細胞分化を好まない表現型に再プログラムすることが示唆された。以上のことから、IVIgはDectin-1依存的にFcγRIIb依存的なシグナル伝達を介してLy6Chigh単球の可塑性に影響を与えることが示唆された。
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図3. Ly6Chigh単球がIVIgを介した破骨細胞形成抑制のターゲットとなる
(A）C57BL/6、FcγRIIb-/-、Dectin-1-/-マウスの脾臓骨髄性免疫細胞におけるFcγRIIbとDectin-1の不偏共発現解析（複合tSNEによる）とその後のDectin-1とFcγRIIbを発現ヒートマップで可視化する。
(B）フローサイトメトリーによって決定されたC57BL／6マウスの脾臓骨髄細胞上のΔ平均蛍光強度（ΔMFI）としてのFcγRIIbおよびDectin-1の共発現分析を示す。ΔMFIは、染色したサンプルからアイソタイプコントロールサンプルのそれぞれの検出チャンネルで測定したシグナルを差し引くことによって算出した。 n＝1グループあたり4〜5匹。
(C）フローサイトメトリーで評価したDectin-1およびFcγRIIbの発現をΔ平均蛍光強度（ΔMFI）としてプロットした。n＝4〜5；統計解析には、正規分布の検定にサフィロ・ウィルク検定を使用した。すべてのサンプルが正規分布を示すわけではないので、データは四分位範囲を持つ中央値としてプロットした。統計的有意性については、ダンの補正を用いたKruskal-Wallis検定が利用された。αの誤差/信頼性の閾値は0.05（5％）に設定された。∗p ≦ 0.05; p ≦ 0.01; p ≦ 0.001.
(D）M-CSFとreceptor acivator of nulcear factor kappa-B ligand（RANKL）の添加（上図）から6日後の破骨細胞培養における多核成熟破骨細胞（白丸）および単核前駆体上のFcγRIIb（赤で示す）、細胞核（青で示す）またはDectin-1（緑で示す）の発現を検出する免疫蛍光分析結果を示している。培養中の全細胞を検出できるようにするため、位相差画像を追加し、位相差の有無にかかわらず、すべての免疫蛍光チャンネルのオーバーレイを表示した（下パネル）。スケールバー、50μM。
(E）C57BL/6（野生型［WT］）またはDectin-1欠損マウス（n = 8）から単離したLy6Chigh単球またはB細胞におけるFcγRIIb ITIMリン酸化を描写する。統計学的評価には、対にならないt検定を使用した。∗∗p＜0.01、n.s.は有意差なしを示す。
(F）7日前にPBS（n＝4）またはIVIg（n＝4）で処理したFcγRIIb-NOTIMマウス（変異ITIMドメインを有する）の骨髄細胞からin vitroで生成したTRAP染色破骨細胞分化培養（スケールバー、100μm）および破骨細胞数（視野あたり3核以上の破骨細胞）の定量化を示す代表写真である。描かれているのは、3つの独立した実験のうちの1つの代表であり、統計的有意性は、マン・ホイットニー検定によって評価された。
図S4も参照されたい。
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図4. IVIgは単球の転写リプログラミングを誘発する
(A）IVIg（C57BL/6-IVIg）またはPBS（C57BL/6）処理したC57BL/6マウスから単離した単球における発現量の異なる遺伝子のヒートマップを示したものである。列は各群の複製（3回の独立した実験からn = 3）、行は個々の遺伝子を表す。赤または青のカラーコードで、発現が強い（赤）または弱い（青）遺伝子を示している。左側のツリーは、遺伝子の階層的なクラスタリングを示している。
(B) IVIg投与によりC57BL/6マウスの単球の遺伝子が有意にアップ（赤）またはダウン（オレンジ）制御された転写物を示すボルケーノプロットである(in vivo)。カットオフ値（点線）は、log2 fold change（logFC、x軸）が1以上または-1以下、かつp値（y軸）が0.01以下である。破骨細胞分化に関連する選択された遺伝子は黒色でハイライトされている。
(C) 過剰発現解析によるパスウェイの濃縮をドットプロットで示した。アップレギュレートとダウンレギュレートされた遺伝子の濃縮された用語は、2つの別々の列に記載されている。ドットの色は統計的p値を表し、ドットの大きさは対応するエンリッチ遺伝子セットにおける遺伝子比率を反映している。
(D-F) IVIgまたはPBSでin vivo処理したC57BL/6 (D), Dectin-1-/- (E), またはFcγRIIb-/- (F) マウス由来の単球の遺伝子セグメント濃縮解析結果を正規化濃縮スコアとして可視化したバープロット。有意に濃縮された遺伝子セット（濃紺）は、正規化濃縮スコア（NES）≧1.5または≦1.5、p値＜0.1の閾値で特定し、非濃縮遺伝子セット（0.1 ≦ p値＜0.25）は水色で示した。
マウスとヒトのDectin-1はFcγRIIbへのIgG結合を調節する
RNA-seqデータから、IVIgはDectin-1/FcγRIIb軸を介して単球機能を調節することが示唆されたため、次にIVIgが両受容体とどのように相互作用するのかについて検討した。単量体IgGがFcγRIIbに低親和性で結合することはよく知られているが、IVIgがDectin-1に結合できるか、あるいはDectin-1がFcγRIIbへのIgG結合を何らかの形で調節するかは不明である。このことを実験的に評価するために、FcγRもDectin-1も発現しないチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用い、Dectin-1のマウスまたはヒト変異体（Dectin-1aおよびDectin-1b）を発現する安定CHO株を作成した39、49。図5A～5Dに示すように、これらのマウスまたはヒトDectin-1変異体はいずれもバックグラウンド以上のIVIgに対する検出できる結合は見られなかった。この知見と一致して、4つのヒトIgGサブクラス（IgG1-IgG4）のいずれも、単量体または免疫複合体の形でマウスまたはヒトDectin-1aまたはDectin-1bに結合しなかった（図5E-5HおよびS5A-S5D）。これは、Dectin-1にマウスIgG1が結合しなかったという以前の研究とも一致している。 40 しかし、両方のDectin-1アイソフォーム、特にC57BL/6マウスで発現する主要なDectin-1アイソフォームであるマウスDectin-1bの存在により、マウスFcγRIIbを共発現する細胞株へのIVIgおよび個々のヒトIgGサブクラスの結合が増強された（図5A、5B、5Gおよび5H). この知見がヒトのシステムにも当てはまることをさらに検証するために、ヒトのDectin-1aおよびDectin-1bの変異体がヒトIgGのヒトFcγRIIbへの結合を増強するかどうかをテストした。実際、ヒトDectin-1bだけでなくDectin-1aもヒトFcγRIIbへのIVIg結合を増強した（図5Cおよび図5D）。同様の方法で、両方のデクチン-1アイソフォームは、ヒト単量体（図5Eおよび5F）または免疫複合体IgGサブクラスのヒトFcγRIIbへの結合を増強した（図S5CおよびS5D）。個々のヒトIgGサブクラスのFcγRIIbへの結合を増強する能力に関して、ヒトDectin-1aは、より大きな広がりを示し、ヒトFcγRIIbに対するすべてのヒトIgGサブクラス（単量体または免疫複合体）の結合を増強した。一方、ヒトDectin-1bは、特定のIgGサブクラス（単量体IgGとしてIgG2およびIgG3、免疫複合体としてIgG1、IgG2およびIgG3）のFcγRIIbへの結合を増強するように見えた。個々のレセプター数に関しては、FcγRIIbとDectin-1の両方がLy6Chigh単球と比較してCHO細胞株で過剰発現していたが、Dectin-1とFcγRIIbの発現比は同等だった（図S6A）。まとめると、これらの結果は、Dectin-1はIVIgに直接結合できないが、ヒトおよびマウスのDectin-1アイソフォームの両方が、それぞれの阻害性FcγRIIbへのIgG結合を増強できることを示唆している。
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図5. デクチン-1はFcγRIIbへのIgGの結合を調節する
(A-D）マウス（AおよびB）またはヒト（CおよびD）のDectin-1a、Dectin-1b、またはFcγRIIb単独、またはDectin-1aとFcγRIIb、Dectin-1bとFcγRIIbの組み合わせ、を発現するCHO細胞へのIVIg結合をフローサイトメトリにより示す（3つの独立した実験からn＝9）。これらの受容体のいずれも発現していないCHO細胞をコントロールとして使用した（ブランク）。
(EおよびF）マウスDectin-1a（E）またはDectin-1b（F）を単独またはマウスFcγRIIbと組み合わせて発現するCHO細胞株への単量体ヒトIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4の結合（2つの独立した実験からn = 6）。非トランスフェクトCHO細胞（ブランク）またはマウスFcγRIIbを単独で発現するCHO細胞をコントロールとして使用した。
(GおよびH）フローサイトメトリーにより決定された、ヒトDectin-1a（G）またはヒトDectin-1b（H）を単独またはヒトFcγRIIbと組み合わせて発現するCHO細胞株へのモノマーのヒトTNP特異的7B4-IgG1、-IgG2、-IgG3および-IgG4 Fcスイッチ変種の結合（2つの独立した実験からn = 6）。さらなるコントロールとして、非トランスフェクトCHO細胞株またはFcγRIIbを発現するCHO株も使用された。
描かれているのは、IgG結合の蛍光強度の中央値から、PBSでインキュベートした後のそれぞれの細胞の蛍光強度の中央値を引いたものである（δ中央蛍光強度[dMFI]）。データの統計的評価は、一元配置分散分析に続くTukeyの多重比較テスト、またはKruskal-Wallisテストに続くDunnの多重比較テストにより行った。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001。
図S5、S6もご参照ください。
デクチン-1はFcγRIIbをIgG結合に有利なコンフォメーションで安定化させる
デクチン-1に依存するFcγRIIbへのIgG結合の調節について、細胞膜内の原子レベルの分解能でより深く理解するために、膜環境におけるデクチン-1bとFcγRIIbの膜貫通（TM）ドメインの自発的自己集合シミュレーションを行い、次にそれぞれのTMドメイン上の受容体のエクトドメインをモデル化した（図6、S6B-S6D）。この解析から、FcγRIIbの立体障害によるホモ二量化（図6A、6D、6F）と、デクチン-1とFcγRIIbのエネルギー的に有利なヘテロ二量化（図6B〜6F）の両方が示唆されました。FcγRIIb-Dectin-1の二量化は、TMドメインの会合と相対的なドメインの再調整を含む2段階のプロセスを経て進行し、特異的な結合様式を示唆した（図6F、S6B-S6D）。さらに、FcγRIIb/Dectin-1ヘテロ二量化は、FcγRIIbのIgG結合能のある配置を支持した（図6D）。このように、10回の独立した原子論的1μsシミュレーションでサンプリングされた単量体FcγRIIbのすべてのエクトドメイン配置のうち、立体的にFcドメインを介してIgGと結合できるのは51%だけだった（図6D左パネルと6E）。この値は、IgGの結合を可能にする理論的なコンフォメーションの最大量として見る必要があり、最適な相互作用を可能にするコンフォメーションと最適でない相互作用を可能にするコンフォメーションとを区別する必要はないことに注意されたい。したがって、FcγRIIbに対するIgGの親和性が低いことを考えると、生産的なIgGの結合を可能にするコンフォメーションの量はさらに少なくなる可能性が非常に高い。一方、FcγRIIbのエクトドメインはDectin-1とのヘテロ二量体内で直立配置をとり、その結果、サンプリングしたヘテロ二量体構成の93%がIgG結合に適合した（図6D右パネルと図6E）。さらに、ヘテロ二量体構成のアンサンブルは、エクトドメインの傾斜角が小さい方に大きくシフトしていた（図6D）。このような直立したエクトドメインの配置は、FcγRIIbモノマーで優先的に観察されるような膜側に向いた配置（傾斜角が大きい）と比較して、IgGにアクセスしやすいと考えられる。
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図6. デクチン-1はFcγRIIbの膜配向とリガンド結合を制御する
FcγRIIbとDectin-1bの膜貫通ドメインの自発的な結合を粗視化したシミュレーションと、それに続くエクトドメインを含む原子論的シミュレーションを示したものである。
(A) FcγRIIb膜貫通型ホモダイマー構造とモデル化されたFcγRIIbエクトドメインの組み合わせ．モデル化されたエクトドメインサブユニット間の衝突は赤い球で強調されている。
(B) FcγRIIb-Dectin-1ヘテロ二量体の構造モデル（詳細はSTAR Methodsを参照）。
(C）IgG分子が結合したFcγRIIb-Dectin-1bヘテロ二量体の構造モデル。
(D) FcγRIIb単量体（左図）とFcγRIIb-Dectin-1bヘテロ二量体（右図）のシミュレーションで観察されたFcγRIIbエクトドメインの配置．赤い点は、それぞれ1μsの長さの10回の独立した原子論的分子動力学シミュレーションで観察された配向を示す。灰色の斜線部内のコンフォーメーションはIgGの結合に適合している（FcγRIIb単量体のコンフォーメーションの51％、FcγRIIb-Dectin-1bヘテロ二量体のコンフォーメーションの92.8％が観察される）。
(E) FcγRIIbエクトドメイン配座の傾斜角(θ)と回転角(γ)の定義を視覚化したスケッチ。
(F）1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）膜中のFcγRIIbホモ二量体、POPC膜中のFcγRIIb-デクチン-1bヘテロ二量体、複合膜中のFcγRIIb-デクチン-1bヘテロ二量体のシミュレーション時間に対する膜透過ペプチド間の干渉エネルギー．各時刻において、分布は金銀点（5％）により特徴づけられる。分布の中央値は赤で描かれ、中央値から離れた金銀点は虹色のグラデーションで色付けされている。灰色の線は平均相互作用エネルギーの推移を示し、黒い破線はフィットしたモデルを示し、水平の黒い破線は推定されたプラトーを示しています。非結合型ヘリカル間相互作用エネルギーは、粗視化解像度で500回以上の不偏ドッキングシミュレーションから決定された。
(G) FcγRIIbホモ二量体（ライトグレー）とFcγRIIb-Dectin-1bヘテロ二量体における膜貫通ヘリの交差角の確率密度を示す。データは、各セットアップの500回を超えるドッキングシミュレーションの最後のマイクロ秒の間に、すべての二量体構造について取得されました。
(H）FcγRIIb-Dectin-1bヘテロ二量体の膜貫通界面を示している。それぞれのタンパク質内の界面に並ぶアミノ酸がラベルされている。界面遮断変異体のDectin-1b膜貫通ドメインで交換されたアミノ酸は、赤で描かれている。
(I)Dectin-1b界面遮断型-FcγRIIbヘテロ二量体の構造モデル。B）と比較して、FcγRIIb細胞外ドメインのコンフォメーションが変化していることに注意。
(J）組み立てられたDectin-1binterface interruption-FcγRIIb heterodimer（薄い灰色）とDectin-1b-FcγRIIb heterodimerの膜貫通ヘリの交差角の確率密度を示す。データは、各セットアップの500回を超えるドッキングシミュレーションの最後のマイクロ秒の間に、すべての二量体構造について取得された。
(K）FcγRIIb-Dectin-1bヘテロ二量体の膜貫通型界面が描かれている。Dectin-1b膜貫通ドメインのフェニルアラニン55の後に追加された4つのロイシン残基は赤で描かれている（tilt variant）。
(L）Dectin-1btilt-FcγRIIbヘテロ二量体の構造モデル。B）と比較して、FcγRIIb細胞外ドメインのコンフォメーションが変化していることに注意。モデル化されたエクトドメインサブユニット間の衝突は赤い球で強調されている。
(M) マウスFcγRIIb単独またはDectin-1bインターフェース中断またはチルトバリアントと組み合わせて発現させたCHO細胞におけるFcγRIIbの発現（上パネル、n＝3〜4）およびIVIgの結合（下パネル、n＝3〜4）をdMFIとしてフローサイトメトリにより示したものである。つの独立した実験のうち、1つを示す。統計解析のために、一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を使用した。 n.s.は、有意差なしを示す。
図S6も参照されたい。
モデリングデータをさらに検証するために、TMドメインを変更した2つのデクチン-1変異体をシミュレーションしたところ、FcγRIIb/デクチン-1 TM二量体がよりコンパクトでエネルギー的に不利になるか（図6G-6J；インターフェイス中断変異体）、FcγRIIbとデクチン-1のエクトドメインと互換性がないTM構成になる（図6Kと6L；バックボーン回転変異体）ことが明らかになった。実際、これらのDectin-1変異体のいずれかをFcγRIIbと安定に共発現させても、FcγRIIbへのIVIg結合が増加することはなく、シミュレーションデータを実験的に検証した（図6M）。以上、インシリコモデリングデータと野生型または変異型デクチン-1変異体を共発現する細胞株での実験的検証の組み合わせは、デクチン-1が細胞膜内のFcγRIIbコンフォメーションを安定化し、IgG結合を促進するという考えを支持するものであった。
デクチン-1は細胞膜におけるFcγRIIbのクラスタリングを制御する
細胞膜内のFcγRIIbの組織化に対するDectin-1の影響について、1分子の分解能でさらなる実験的洞察を得るために、初代免疫細胞、およびFcγRIIbのみ、あるいはFcγRIIbとともにDectin-1aまたはDectin-1bの両方を発現する細胞株で、直接確率光学再構成顕微鏡（dSTORM）と近接ライゲーションアッセイ（PLA）実験を行った（図7、S6E、S6F）。 50,51 超解像dSTORM解析により、マウスDectin-1aの存在、さらに強くマウスDectin-1bの存在により、CHO細胞の細胞表面上のマウスFcγRIIbクラスターが増加した（図7Aおよび図7B）。マウスでの結果と同様に、ヒトDectin-1aおよびDectin-1bもヒトFcγRIIbクラスターを増加させ（図7Cおよび7D）、この結果がヒト系に関連することを実証した。dSTORMのデータをさらに確認するために、近接ライゲーション実験を行ったところ、特にマウスDectin-1bの存在がCHO細胞上のFcγRIIb分子のクラスタリングを促進することが明らかになった（図7E-7I）。CHO系での結果を関連する初代単球サブセットで確認するために、C57BL/6野生型マウスおよびDectin-1欠損マウス由来のLy6Chigh単球でデュアルカラーdSTORMを行った。図S6EおよびS6Fに示すように、我々はマウス単球上でFcγRIIb/Dectin-1クラスターを観察した。さらに、Ly6Chigh単球上のDectin-1非存在下でFcγRIIbクラスターの数が減少していることを確認し（図7Jおよび7K）、CHO細胞で得られたデータと一致した。
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図7. デクチン-1はFγRIIbの細胞表面クラスター化を調節する
(A-D）FcγRIIbを単独またはDectin-1aまたはDectin-1bと組み合わせて発現するCHO細胞株の細胞膜上のμm2あたりのマウス（n＝6-10）（B）およびヒト（n＝7-9）（D）の代表的なdSTORM画像（AおよびC）および定量化（BおよびD）をそれぞれ示している。3つの独立した実験からのデータを示す。統計的有意性の評価は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）テストにより行った。スケールバー、5μm。
(E-I) マウスFcγRIIb特異的抗体を2つの異なるオリゴヌクレオチド配列に結合させ、2つのFcγRIIb抗体が近接した場合にペアリングとローリングサークル増幅産物（赤で着色）を可能にした近接ライゲーションアッセイ（PLA）の代表免疫蛍光画像（E）と定量（I）である。FcγRIIbもデクチンも発現していないCHO細胞でのFcγRIIbのPLA染色を示したものである。 1アイソフォーム（CHO）（E）マウスFcγRIIb単独（CHO FcγRIIb）（F）またはマウスFcγRIIbとマウスDectin-1aの組み合わせ（CHO FcγRIIb＋Dectin-1a）（G）またはDectin-1b（CHO FcγRIIb＋Dectin-1b）（H）を発現するCHOセル．をそれぞれ測定した。細胞核はDAPIでカウンターステインした。データは、2つの独立した実験（n = 5）の代表である。スケールバー、10μm。
(JおよびK）C57BL/6（n≧9）またはDectin-1欠損（Dectin-1-/-）（n≧7）マウスの単球上のFcγRIIb（緑で描写）およびDectin-1（紫で描写）クラスターの代表合成および単一チャンネルdSTORM画像（J）と定量化（K）である。白い点線は細胞の外側の境界を示す。スケールバー、2μm。
統計解析には、一元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を使用した。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001。
図S6もご参照ください。
以上のことから、超解像顕微鏡とPLAデータは動的自己組織化シミュレーションと一致し、デクチン-1がリガンド結合に最適な受容体コンフォメーションでのFcγRIIb膜クラスター化を促進することにより、FcγRIIbへのIgG結合をコントロールしていることを強く示唆した。
考察
IVIgの形でIgGを使用することで、マウスやヒトの様々な慢性炎症性疾患や自己免疫疾患において、効率的に炎症を抑制することができます13,14,16,22,52。しかし、IVIgが、過剰な破骨細胞形成によって引き起こされる骨の再構築など、進行中の臓器内在性炎症にどのように影響するかは、まだほとんど明らかになっていません。そこで本研究では、IVIgがどのような分子・細胞経路で炎症による破骨細胞新生と骨破壊を抑制するかを明らかにすることを主な目的とした。ヒトでは、TNF-αなどの炎症性サイトカイン分泌の増加と自己抗体の両方が関節の炎症と骨リモデリングのドライバーとなり得るため、本研究では2つの独立したマウスモデルを用いた。
その結果、IVIgによる関節炎症の解消と、進行中の炎症性骨量減少の抑制には、別々の経路が関与していることが明らかになりました。多くの先行研究と同様に、TNF-αおよびKBxN血清駆動型RAモデルにおいて、IVIgによる関節炎症の抑制はIVIgのシアル化によってもたらされていることがわかった。むしろ、Dectin-1やFcγRIIbを欠損したマウスでは、IVIg依存的な破骨細胞形成の抑制が阻害された。シアル酸非依存的な作用機序と同様に、SignR1やDCIR1といった他のC型レクチン受容体が存在しないことは、IgGを介した炎症抑制のシアル化依存性経路に関与することが示されており19,20、破骨細胞新生と骨リモデリングの抑制には必要でなかった。IVIgによる炎症性骨リモデリングの抑制は、Ly6Chigh単球のリプログラミングを介して進行し、単球の破骨細胞への分化に関与する主要遺伝子の発現が低下したことが注目される。このIVIgによる単球のリプログラミングは、Dectin-1欠損マウスで大きく、FcγRIIb欠損マウスで最も完全に失われたことから、IVIgはDectin-1およびFcγRIIb依存的に破骨細胞形成を抑制するシグナル経路を引き起こすと考えられた。実際、カルドランやβ-グルカンなどのデクチン-1アゴニストはin vitroで破骨細胞分化を抑制することが示されている54,55,56。しかし、今回の結果は、マウスもヒトIgGもデクチン-1に直接結合できないことを明確に示しており、少なくとも我々の実験系ではデクチン-1はFcγRIIbと独立して作用するというシナリオを否定する。注目すべきは、デクチン-1が直接リガンドに結合することなく、むしろFcγRIIbのシグナル伝達ドメインに組み込まれるか存在することによって、FcγRIIb依存のシグナル伝達に寄与する可能性があるということである。このことは、FcγRIIbへの免疫複合体の結合を介したデクチン-1依存性の好中球活性化抑制について示されている40。後者のモデルを支持し、FcγRIIb-ITIMリン酸化は、デクチン-1非存在下でLy6Chigh単球において減少し、デクチン-1は、定常状態でFcγRIIb抑制シグナル機能の維持に関わっているらしいことを示していた。さらに、IVIgは、Dectin-1欠損マウスおよびFcγRIIb欠損マウスのいずれにおいても、in vivoでのLy6Chigh単球の破骨細胞分化促進プログラムを阻害する能力を失っていた。重要なことは、IVIgによるLy6Chigh単球の再プログラミングがFcγRIIb欠損マウスで最も強く阻害されたことであり、IVIgによる破骨細胞形成の阻害にはFcγRIIbシグナル経路がより優位に関与していることが示唆された。このシナリオは、機能的なITIMモチーフを持たないFcγRIIbの変異体を発現するマウスの骨髄培養において、IVIg依存性の破骨細胞発生抑制が消失したことからも裏付けられる。破骨細胞分化に関与する遺伝子のダウンモデュレーションにつながる正確な下流シグナル経路はまだ解明されていないが、今回の知見は、IVIgがFcγRIIbと生産的に相互作用し、Dectin-1を介した阻害性シグナル経路を促進するというモデルを支持している。
しかし、FcγR依存のシグナル伝達の現在のモデルでは、活性化FcγRの追加的な共架橋によってFcγRIIbを介した抑制性シグナル伝達経路を引き起こすことができるのは、単量体IgGではなく免疫複合体のみであるとされているため、この生産的相互作用を説明するには簡単ではない。10、57 デクチン-1はITAM様モチーフを持つが、今回の結果は、マウスおよびヒトのデクチン-1がIVIg、単量体のマウスまたはヒトIgGサブクラス、IgG免疫複合体に直接結合できないことを示し、デクチン-1がIgG結合に直接寄与するモデルを除外し、以前の結果と一致した40。さらにこの線に沿って、大部分が単量体として存在するヒト血清IgG（IVIg）のFcγRIIbに対する親和性は非常に低く、この低親和性FcγRとの安定した相互作用を許さない58、59。
この難問に対する可能な解決策は、デクチン-1が細胞膜のFcγRIIbと直接相互作用する可能性を示す原子論的モデリングとシミュレーションの研究によってもたらされるかもしれない。このことは、抑制性シグナル伝達経路の開始を可能にするために、活性化（ITAMを含む）FcγRの共トリガーまたは共募集の必要性を回避することになる。さらに重要なことは、分子動力学シミュレーションにより、デクチン-1が存在しない場合、FcγRIIbはIgGと効率的に相互作用できないコンフォメーションで大部分が存在するが、デクチン-1の存在により、FcγRIIbはIgGとの結合を可能にするコンフォメーション状態で安定化することも示唆される。重要なことは、デクチン-1と阻害型FcγRIIbを共発現している細胞株では、IVIgとヒトIgGサブクラスのマウスまたはヒトFcγRIIbへの結合が増強され、デクチン-1のFcγRIIbへの結合を阻害するTMドメインを持つデクチン-1変異体はもはやFcγRIIbへのIgG結合を調節しない、という実験結果によりインシリコデータが支持されていることです。さらに、Dectin-1が存在しない場合、単球やCHO細胞株でFcγRIIbクラスターの減少が観察され、Dectin-1がFcγRIIbクラスターの形成を制御しているという概念がさらに支持された。マウスとヒトのシステムの違いは、マウスではDectin-1bアイソフォームがFcγRIIbへのIgG結合をより強力に増強したのに対し、ヒトシステムではDectin-1aがヒトFcγRIIbへのIgG結合をより強力に増強するようであることである。
この結果は、FcγRIIbが細胞表面受容体プラットフォームの中心的な構成要素であり、活性化FcγR活性の調節をはるかに超えて免疫・非免疫細胞の活動を制御していることを強調するものであった。例えば、マウスIgG1免疫複合体は、マウスIgGがDectin-1に直接結合しなくても、好中球上のDectin-1とFcγRIIbの会合を促進することが実証されたが、これは我々の観察と一致するものであろう。デクチン-1/FcγRIIb相互作用は、デクチン-1を含むITAM様モチーフの共召集によるFcγRIIb依存の抑制的シグナル伝達経路の誘導をもたらし、FcγRIIbのITIMモチーフのリン酸化を可能にし、補体成分C5aによる好中球活性化を阻害した40。さらに、Dectin-1/FcγRIIb軸は、MUC2/Galectin-3が腸の樹状細胞上のFcγRIIbに結合し、炎症シグナルを弱め、制御性T細胞の拡大を促進することによって、口腔耐性を調節することが示された41。さらに、FcγRIIbは、アンジオテンシンII 1型受容体（AT1R）と協調して平滑筋細胞上のAT1Rの内在化を調節し、それによって高血圧を制御することが示された60。FcγRIIb以外にも、デクチン-1は、テトラスパニンCD37と相互作用して、IL-6産生の阻害につながることが指摘されており、デクチン-1の阻害機能がさらに強調されている61。
最後に、我々の結果は、Dectin-1、Mincle、SignR1などの古典的なパターン認識受容体が、無菌／自己免疫と病原体依存性の炎症時に二重の役割を果たす可能性を強調している。長期的には、無菌/自己免疫炎症時のDectin-1-FcγRIIb軸の阻害活性を治療標的とすることで、自己免疫主導の組織病理を改善するための代替治療戦略を開発することができるかもしれない。
本研究の制限事項
本研究では、Dectin-1がFcγRIIbのIVIgとの相互作用能力を調節し、Ly6Chigh単球のリプログラミングと炎症性破骨細胞形成の阻害をもたらすことを明らかにした。一般に、マウスにヒトIgGを使用すると、マウスFcγRや新生児Fcレセプターとの異種間相互作用が生じ、自己の設定での相互作用とは異なる。さらに、受動的なマウス関節炎モデルにおける炎症消失の基礎となる経路は、ヒトの疾患を完全に反映しない可能性がある。これらの違いを説明するために、少なくとも部分的には、ヒトTNF-α駆動関節炎モデルや、ヒトDectin-1やFcγRIIb発現細胞株を用いたin vitroの研究により、主要な知見を再現しています。今後、ヒト化マウスを用いた研究を行うことで、ヒトの免疫系を想定した検証を行うことができるかもしれません。
STAR★メソッド
キーリソース表
試薬またはリソース識別子抗体CD45R/B220BioLegendCat# 103209CCR2BioLegendCat# 150605CD3εBD BiosciencesCat#。553057CD4BioLegendCat# 100567CD11bBioLegendCat# 101222CD11cBD BiosciencesCat# 751222CD45BD BiosciencesCat# 563053CD88BioLegendCat# 135812CD90. 2BioLegendCat# 140313CX3CR1BioLegendCat# 149031Dectin-1BioLegendCat# 355405Dectin-1eBiosciencesCat# 17-5859-82Dectin-1BioLegendCat# 144305Dectin-1InvivoGenCat# mabg-mdectFcγRIIbBioLegendCat# 156403FcγRIIbIn house productionLy17. 2（クローン）FcγRIIbBioLegendCat# 303207FcγRIIb/FcγRIIIBioXCellCat# BE0307FcγRIIb/FcγRIIIBioLegendCat# 101301FcγRIVBioLegendCat# 149515IgG-FcJackson ImmunoCat# 115-005-008Isotype Rat IgG2a, κBioLegendCat# 402305Isotype Rat IgG2b、κBioLegendCat# 400607Ly6CBioLegendCat#128005PDCA-1BioLegendCat# 127019Ter119BioLegendCat#116203生物試料K/BxN血清In houseN/AIVIgPharmacyGamunexChemical、Peptides。および組換えタンパク質グルコース-6リン酸イソメラーゼCUSABIOCSB-YP009717MOMurine M-CSFPeprotechCat# 315-02Human M-CSFPeprotechCat# 300-25Mouse RANKLPeprotechCat# 315- 11ヒトRANKLPeprotechCat# 310-01重要なコマーシャルアッセイDuolink® In Situ Probemaker PLUS KitMerckCat# DUO92009-1KTDuolink® In Situ Probemaker MINUS KitMerckCat# DUO92009- 1KTDuolink® In Situ Detection Reagents FarRedMerckCat# DUO92013-100RXNLeukocyte Acid Phosphatase (TRAP) KitMerck386A-1KTQuantum Simply Cellular anti-mouse IgGBangs laboratoriesCat# 815Quantum Simply Cellular anti-ratIgGBangs laboratoriesCat#817出典データRNAseqGEO omnibusGSE224775実験モデル。細胞株CHO-K1ATCCATCC # CCL-61実験モデル。生物・系統C57BL/6J（JAX Mice Strain）Charles RiverStrain code: 632Dectin-1-/-In houseN/ADCIR-/-In houseN/AFcγRIIb-/-In houseN/AFcγRIIb NoTIMIn houseN/AFcRγ-/-In houseN/ASignR1-/-In houseN/AhTNFα-tgIn houseN/ARecombinant DNAMouse Dectin-/In house 1aOrigeneNM_020008マウスDectin-1bInvivoGenpuno1-mdectin1bHuman Dectin-1aInvivoGenpuno1-hdectin1aHuman Dectin-1bInvivoGenpuno1-hdectin1bSoftware and algorithmsFlowJo (version 10. 8.1)BD Bioscienceshttps://www.flowjo.comGraphPad Prism (version 9. 4.1)Dotmaticshttps://www.graphpad.comOsteomeasureOsteoMetricswww.osteometrics.comGromacs 2018 & 2019Free Softwarehttps://www.gromacs.orgModellerFree Softwarehttps://salilab.org/modeller/RFree Softwarehttps://r-project.orgPython 3Free Softwarehttps://www.python.orgPyMOLSchrödingerhttps://pymol.org/2LoCanFree Softwarehttps://doi.org/10.1093/bioinformatics/btac160NReconBrukerhttps://www.bruker.comCTanBrukerhttps://www.bruker.comCTVoxBrukerhttps://www.bruker.com
リソースの確保
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さらに詳しい情報やリソースのリクエストは、リードコンタクトであるFalk Nimmerjahn (falk.nimmerjahn@fau.de)までお願いしますし、それによって対応させていただきます。
資料の入手方法
本試験では、新規のユニークな資料の作成はありませんでした。
実験モデルおよび被験者の詳細
マウス
C57BL/6マウスはElevage Janvier (Le Genest-Saint- Isle, France)から入手した。KRNマウスは、Diane Mathisから提供された。C57BL/6バックグラウンドのFcRγ-/-およびFcγRIIb-/-マウスは、Jeffrey Ravetch（Rockefeller University, New York, USA）により提供された。Dectin1-/-マウスはClarissa Prazeres da Costa、SignR1-/-はA. McKenzie (Medical Research Council, UK)、DCIR1-/-マウスは Consortium for Functional Glycomicsによって生成されBernd Lepenies (Tierärztliche Hochschule Hannover) によって、そしてC57BL/6バックグラウンドのhTNFtgマウスは Georg Schettによって提供された。ITIM配列が変異したFcγRIIbのノックインを有するFcγRIIb-NOTIMマウスは、Bernhardt Nieswandt (University of Würzburg)から提供された。8〜12週齢の雄雌マウスをすべての実験に組み入れた。すべての動物は、特定の病原体を含まない条件で維持された。すべての実験は、倫理的自治体（ニーダーフランケン州政府）の承認を得て、ドイツおよび米国の動物施設の規則に従って行われた。
細胞株
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（性別：雌）は、ATCC（CHO-K1）から入手し、10％胎児子牛血清、1％グルタミン、1％ペニシリン・ストリプトマイシン、1％ピルビン酸ナトリウム、1％非必須アミノ酸を補充したRPMI-1640培地（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）で37℃、5％ CO2で培養した。CHO細胞はそれ以上認証されなかった。
メソッドの詳細
K/BxN血清移植関節炎
関節炎は、K/BxNマウスのプール血清200μlを腹腔内注射することで誘導した43。疾患活動性（臨床スコア）は、0（炎症なし）から3点（高炎症）まで0.5段階で各手足を独立して採点し、毎日測定した。関節炎発症10日後にマウスを犠牲にし、両後肢の足首からPBSを注入・回収することで関節液を採取した。前脚と後脚は組織学的解析のために入手した。K/BxN血清移植の3日後、IVIg（20mg）を200μl PBS中の1回の単回i.p.注射として適用した。コントロールとして、200μlのPBSを使用した。
磁気共鳴画像法（MRI）
後肢のMRIによるin vivo撮像は、前臨床用の7テスラ超高磁場スキャナー（ClinScan 70/30, Bruker, Ettlingen, Germany）で、専用の表面コイル（Bruker）を用いて実施した。撮像プロトコルは、T1強調スピンエコーシーケンス［繰り返し時間（TR）/エコー時間（TE）。556/9ms、ボクセルサイズ：0.068×0.068×0.7mm、スライス厚：0.7mm、取得時間（TA）：6分16秒］とT2強調STIRシーケンス（TR/TE：7472/54ms、ボクセルサイズ：0.137×0.137×0.5mm、スライス厚：0.5mm、TA：4分44秒）。中足骨腔の浮腫（結合組織水）の体積は、以前に行ったように、STIR画像で信号強度が200a.u.を超える中足骨腔のすべてのボクセルを分割することによって定量化した67。
骨組織形態計測
組織学的分析は、4%ホルマリンで固定した前脚または後脚について、記載されたとおりに行った43。完全な前脚をギ酸骨脱灰剤（Immunocal、Decal Chemical Corp）で7日間脱灰し、5μmのパラフィン切片を、炎症領域の定量化にはヘマトキシリン・エオシン（H&E）、軟骨破壊の定量化にはサフラニン Oで染色した。骨浸食と破骨細胞数を定量化するために、後脚からすべての組織を取り出し、14％EDTA（水酸化アンモニウムの添加によりpHを7.2に調整）中で14日間脱灰した。肉球の5μmのパラフィン切片を、386A-1KT白血球酸ホスファターゼ（TRAP）キット（Merck）を用いてTRAP用に染色した。異なるパラメータの定量化は、デジタル画像解析（OsteoMeasure；OsteoMetrics、Decatur、GA）により行った。
ELISA
ヒトIgGの定量化
ヒトIgGの定量には、Bethyl Human IgG ELISA Quantitation Kit（Biomol社）を製造者の説明書に従って使用した。ヒトTNFαは、Quantikine ELISA Human TNF-α Immunoassay（R&D社）を用いて、製造者の指示に従い測定した。光学密度は、VersaMax tunable microplate reader（Molecular Devices社製）を用いて450nmおよび650nmで測定した。
グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（GPI）特異的自己抗体の検出
GPI 特異的自己抗体の検出は、既報の通り行った。43 簡潔に言えば、エリサプレートにグルコース6-リン酸イソメラーゼをコーティングした。ブロッキングの後、血清はPBS/3%BSAで1:100に希釈して添加した。結合した抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG、IgG1およびIgG2b検出抗体（Mouse IgG ELISA Quantification Kit, Bethyl laboratories）で検出した。
破骨細胞培養
大腿骨および脛骨からマウス骨髄細胞を分離した。赤血球溶解後、30ng/ml M-CSFを添加した10％熱不活性化FCS、1％グルタミン、1％ペニシリン、1％ストレプトマイシン（すべてInvitrogen社製）を添加したαMEM培地で一晩培養した（37℃、5％CO2）。翌日、30ng/mlのM-CSFとRANKL（いずれもPeproTech社製）を添加した24ウェルプレートに、ウェルあたり750000個の非固着細胞を播種した。培養4日目に、細胞をIVIgまたはPBSとともに室温で20分間インキュベートした。PBSで広範囲に洗浄した後、新鮮な培地を添加した。細胞分離の7日前にマウスがすでにIVIgまたはPBSをin vivoで投与されていた場合（20mg IVIgを200μl PBSで腹腔内投与）、培地は広範囲に洗浄せずに交換された。さらに2日間培養した後、細胞をフローサイトメトリーで分析するか、白血球酸性ホスファターゼキット386A（Sigma）を用いてTRAPを染色し、成熟破骨細胞（TRAP+、核数3以上）の数を決定した。ヒト破骨細胞を得るために、Buffy Coatsから細胞を分離した。破骨細胞の分化は、IVIgとのインキュベーションを培養5日目に行い、TRAP発現の染色を7日目に行ったことを除き、マウス細胞について述べたように実施した。
フローサイトメトリー
血液、骨髄、脾臓を分離し、赤血球を溶解し、濾過後、細胞を染色した。破骨細胞をフローサイトメトリーで解析するため、0.5mM EDTAと室温で15分間インキュベートしてウェルから分化した細胞を剥離し、濾過してから染色した。ジョイントフラッシュを遠心分離し、細胞を直接染色した。染色前に細胞をFcブロック（2.4G2+9E9または9E9のみ、Dectin-1を染色した場合）と4℃で20分間インキュベートした。FcγR発現を直接染色する場合は、追加のFcブロックは加えなかった。抗体の混合物による染色を4℃で20分間行い、その後、死細胞をマークするためにDAPIで洗浄した。蛍光強度の中央値を求めるには、特異抗体を含まないが他のすべての抗体で染色した細胞の蛍光強度の中央値を、特異抗体を含む抗体ミックスで染色した細胞の蛍光強度の中央値から差し引いた値である。未熟な破骨細胞は、F4/80およびOSCAR陽性細胞としてゲーティングされた。Fab2断片を得るために、非標識抗体をペプシン（Thermo Fisher社製）で消化した。
FcγRIIbのITIMリン酸化を測定するために、脾臓細胞を分離し、ACK溶解バッファーで5分間処理することにより赤血球を減少させた。細胞を数え、Zombie-NIR（Thermofisher）で染色し、等倍で播種し、10％FCSを含むRPMI培地中で37度、5％C02で1時間インキュベートした。2xCytofix/wash/perm bufferを培養物に加え（1.2ml BD 554723 +4.5ml Formalin +0.3ml miliQ H2O）、細胞をRTで15分間インキュベートし、その後30分間氷上に置いた。次に、細胞を1xPerm/wash buffer（BD 554723）で2回洗浄し、一次フローサイトメトリー染色用に同じバッファーに再懸濁し、そのために細胞をRTで少なくとも30分間インキュベートした。さらに1回洗浄した後、前と同様に2次染色を加え、Northern Light Spectraアナライザー（Cytec）を用いて細胞を分析した。
データの取得と解析は、FACS Canto（BD Biosciences）、FACS Fortessa（BD Biosciences）およびFACS Diva（BD Biosciences）ソフトウェアで行うか、Northern Lights Spectral analyzer（Cytek）を用いて行った。データの評価には、tSNE解析用プラグイン68を含むFlowJoソフトウェア（10.8.1）を使用した。
CHO細胞へのトランスフェクションおよびIVIg結合の解析
マウスFcγRIIbを安定的に発現するCHO細胞、またはhFcγRIIbを発現する細胞は、前に記載した通りである59,69．マウスまたはヒトDectin-1アイソフォームを単独またはマウスまたはヒトFcγRIIbと組み合わせて安定に発現するCHO細胞を作製するために、CHO細胞またはマウスまたはヒトFcγRIIb発現CHO細胞を、ヒトまたはマウスDectin-1a（OriGene）または-1b（InvivoGen）アイソフォーム、ならびにマウスDectin-1bインターフェース中断および背骨回転（tilt）変種と安定的にトランスフェクトした。細胞をDectin-1a/bの発現について染色し、FACSARIA III Cell Sorter (BD Biosciences)を用いてソーティングした。少なくとも95％の細胞で受容体の安定発現に達するまで、このステップを4～5回繰り返した。mFcγRIIb（α-CD16/CD32、クローン：2.4G2、当研究所で作製、FITC標識キット（Thermo Fisher Scientific）で標識）、hFcγRIIb（α-CD32-Alexa Fluor 647、クローン：FUN-2、BioLegend）ならびにmDectin1a/b（α-CD369、クローン。R1-8g7, InvivoGen, Alexa Fluor 647 labeling kit (Thermo Fisher Scientific)) および hDectin-1a/b (α-CD369, clone: 15E2, BioLegend, Alexa Fluor 647 labeling kit (Thermo Fisher Scientific)) は、それぞれの実験において指示した抗体で染色しフローサイトメーター解析により発現量を検出することで確認しました。
ヒト抗2-,4-,6-トリニトロフェニル（TNP）特異的抗体（クローン：7B4）は、無血清培地でHEK293T細胞を一過性にトランスフェクションし、その上清からプロテインGを介して、先に述べたようにIgGを精製することにより製造した70．免疫複合体は、10μg/mlのヒト抗TNP 7B4-IgGと5μg/mlのTNP結合BSA（BioCat）を室温で穏やかに振盪しながら3時間共インキュベートすることにより生成した。1.5μgの免疫複合体を、1ウェルあたり1x105個のCHO細胞とともに、4℃で穏やかに振とうしながら1時間インキュベートした。結合したICは、0.5μg/mlのPE結合ヤギα-ヒトIgG F(ab′)2 フラグメント（Jackson ImmunoResearch）を用いて、FACSCanto II Cell Analyzer（BD Biosciences）を用いたフローサイトメトリにより検出した。あるいは、CHO細胞を、同じ実験条件を用いて、1μgのIVIgまたは個々のマウスもしくはヒトIgGサブクラスとインキュベートした。
超解像イメージング
CHO細胞または初代単球の顕微鏡解析のために、1x105～1,5x105個の細胞をポリ-D-リジンプレコートしたチャンバースライド（8 Chambered cover glass; 1.5H; Cellvis）に移した。湿度室での細胞接着後、細胞をα-FcγRIIb-Alexa Fluor 532およびα-Dectin-1-Alexa Fluor 647抗体で氷上で30分間染色し、PBSで洗浄した。最後に、細胞を2％ホルムアルデヒドと0.25％グルタルアルデヒドで室温で15分間固定し、1xPBSで洗浄し、既述のようにdSTORMイメージングで解析した51。局在密度は、DBSCAN（「Density Based Spatial Clustering of Applications with Noise」）に基づくアルゴリズムを用いてLOCANで求めた71、72。
インサイチュプロキシミティライゲーションアッセイ
In situ PLA検出は、製造者の指示に従って、適切なDuolink in situアッセイ成分（Merck, Darmstadt, Germany）を用いて実施した。簡単に言うと、細胞をPBSで洗浄し、診断用8ウェル顕微鏡スライド（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）上にコーティングした。湿度室（5％CO2、95％相対湿度）で2時間インキュベートした後、細胞を4％PFAで室温で15分間固定した。その後、Duolinkブロッキング溶液を用いて、37℃で60分間湿式培養し、非特異的結合部位をブロックした。その後、スライドをPBSで5分間2回洗浄し、Duolink PLAリボプローブ結合抗体（Duolink In Situ Probemarker plusおよびDuolink In Situ Probemarker minus, Ly17.2）と4℃にて一晩インキュベートした。その後、スライドをPBSで5分間2回洗浄し、続いてライゲーション溶液を添加し、湿度室内で30分間インキュベートした。その後、スライドをPBSで5分間2回洗浄し、増幅溶液を加え、湿度室内で100分間インキュベートした。その後、スライドを洗浄バッファー（200mM Tris-HCL, pH7.5）で10分間2回、0.1×洗浄バッファーで1分間1回洗浄した。最後に、サンプルをDAPIを含むFluoromount-G（Invitrogen, Carlsbad, California, USA）でマウントしてから顕微鏡で分析した。
画像は、Zenソフトウェアを使用して、Axio Observer 7 Zeiss顕微鏡（Carl Zeiss, Jena, Germany）を用いて得た。同一の顕微鏡およびカメラ設定を使用することにより、各実験で条件ごとに2～3枚の画像を撮影し、赤（PLA）および青（核、DAPI）チャンネルで同一画像の取得を行った。定量化のために、対応するTIFFファイルをCellProfiler（Version 4.1.3）で解析した。定義された領域内のすべてのPLAシグナルをカウントし、核の数で割って、細胞あたりのシグナルの平均値を得た。これらのデータに基づいて、平均値と標準偏差を計算し、プロットした。
FcγRIIbおよびDectin-1表面発現の定量的解析
Ly6Chigh単球およびFcγRIIbとDectin-1を安定的に発現するトランスフェクトCHO細胞におけるマウスFcγRIIbとDectin-1の細胞表面発現の定量分析は、先に述べたように実施した73。簡単に説明すると、FcγRIIbまたはDectin-1に特異的な抗体の抗体結合能（ABC）は、フルオロクロム標識抗体の結合時の中央蛍光強度（MFI）を抗体結合部位の数と相関させた参照曲線を用いて計算した。これらの参照曲線は、抗体結合部位の数が既知の市販のQuantum Simply Cellular（QSC）ミクロスフェア（Bangs Laboratories Ltd., Fishers, IN, USA）を用いて作成した。リファレンスビーズと細胞を同じ濃度のそれぞれの抗体で染色し、細胞とビーズの両方への抗体結合ができるだけ完全に飽和する濃度を使用した。FcγRIIb結合部位の定量化には、PE標識FcγRIIb特異的抗体AT130-2（マウスIgG2a、Invitrogen）とQuantum™ Simply Cellular® anti-Mouse IgG microspheresを組み合わせて使用しました。デクチン-1結合部位は、PE標識デクチン-1特異的抗体クローンbg1fpj（ラットIgG2a、eBioscience）とQuantum™ Simply Cellular® anti-rat IgG microspheresで決定しました。FcγRIIbのABC参照曲線は、AT130-2染色マウスIgG QSC参照ビーズのセットから、結合部位と蛍光の両方の対数値の線形フィットを用いて得られ、Dectin-1の参照曲線は、bg1fpj染色ラットIgG QSC参照ビーズから、結合部位数と蛍光強度の線形フィットにより得られました。それぞれの細胞のバックグラウンド蛍光に対応するABCバックグラウンド値を差し引くことができるように、各実験で「蛍光マイナス1」（FMO）コントロールを使用しました。
マイクロコンピューテッドトモグラフィー(microCT)
12週齢の雌マウスの大腿骨を採取し、マイクロCT装置（Skyscan 1176, Bruker, Kontich, Belgium）を用いて解析した。画像は、50kVのX線電圧、500μAの電流、1°の回転ステップで0.5mmのアルミニウムフィルターを用いて、9μmのボクセル分解能で取得された。NReconとDataViewer（Bruker Corporation, Billerica, MA, USA）を用いて再構成した後、成長板の近位0.88mmと4.84mmにおいて、それぞれ2.64mmと0.88mmの関心領域を用いて海綿骨と皮質骨の解析を実施した．構造解析と骨密度（BMD）解析は、CTAnソフトウェア（Bruker Corporation, Billerica, MA, USA）を用いて実施した。3次元画像はCTVox（Bruker Corporation, Billerica, MA, USA）を用いて作成した。すべての測定は、米国骨代謝学会（ASBMR）のガイドラインに従って行われた。
RNAシークエンス
RNAseqのために、C57BL/6、Dectin-1-/-、またはFcγRIIb-/-マウスにIVIg（20mg）またはPBSをi.p.して、3日後にRNA分離（RNease Mini Kit、Quiagen）用にLy6Chigh単球をソートした。単離されたRNAの品質は、Experion RNA HighSens Kit（BIORAD）を備えたEXPERIONアナライザーを用いて制御した。劣化の兆候のないサンプルのみが、その後のcDNAライブラリー調製に使用された。すべての配列決定されたcDNAライブラリーは、ドイツ・ハイデルベルクのEMBLのGeneCoreで直接作成されました。各サンプルから単離された全RNAは、Illumina TruSeq Stranded messenger RNA LT Sample Prep Kit（Illumina）を用いて、製造元の提供するプロトコルでシーケンスライブラリーを調製するための入力となった。簡単に説明すると、ポリ-T-オリゴを付着させた磁気ビーズにより、ポリ-A-テイルmRNA分子を抽出した。その後、逆転写酵素を使用してmRNAを断片化し、ランダムプライマーを使用して相補的なDNAにコピーした。2本目のcDNA合成では、RNase HとDNAポリメラーゼIを使用し、dUTPをdTTPに置き換えた。最終的なライブラリーは、cDNAにアダプターをライゲーションした後、PCRで拡張して作成した。得られたライブラリーはプールされ、その後Illumina NextSeq 500シーケンサーでシーケンスが行われた。RNAseqリードは、STARアライナー（バージョン2.0.2）を用いてMus musculusの参照ゲノム（GRcm39バージョン104）にマッピングし、ソートしたbamファイルをFeature Countsで処理してカウントマトリックスを得ました。品質管理後、edgeR（バージョン3.36）を用いて遺伝子発現差分解析を行い、正規化法TMMが適用された。p値≦0.01、log2 fold change ≧1または≦-1の閾値を用いて、制御された遺伝子を特定した。全サンプルの遺伝子発現は、pheatmapパッケージを用いて階層的クラスタリング可視化のためのヒートマップで示された。統計スコアを調べるために、ggplot2 を用いてボルケーノプロットを作成した。さらに、clusterProfilerを用いて過剰発現解析を行い、結果をドットプロットおよびコンセプトネットワークで可視化した。最後に、hallmarkとc2-KEGGの遺伝子セットを集めた分子シグネチャーデータベース（MSigDB）をfgseaパッケージにインポートしてGSEA解析を行い、濃縮遺伝子セットを特定した。
モデリングとシミュレーション
マウスFcγRIIbのホモ二量化とFcγRIIb-Dectin-1のヘテロ二量化について、純粋な1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（POPC）脂質二重膜に埋め込まれた膜貫通ドメイン（TMD）を粗視化した自然ドッキング分子力学シミュレーション（MD）で比較研究（homoとheterodimerization）、プラズマ膜模造品でのヘテロ二量化の研究。詳細は下記参照）。さらに、TMD-エクトドメインモデルをTM二量体構造にマッピングし、マイクロ秒単位の原子間分子動力学シミュレーションで評価した結果、好ましいTM二量体は原子間分子動力学シミュレーションでさらに改良した。FcγRIIb TM ホモダイマーと FcγRIIb-Dectin-1 TM ヘテロダイマーのモデルは、Docking Assay For Transmembrane (DAFT) components 法を使用して構築した。74 簡単に言うと、DAFT は膜内の TMD の初期配置を非相互作用にして TMD 会合シミュレーションのアンサンブルを行う。粗視化された解像度で大規模なシミュレーションを行うことで、形成された二量体のエネルギー分布を反映した偏りのない特徴付けが可能となります。マウスFcγRIIb（残基K204-K237）とDectin-1（残基S40-S73）のTMDについて、二量体化を研究した。FcγRIIbのホモ二量化は1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（POPC）脂質二重層で、FcγRIIbとDectin-1のヘテロ二量化はさらに非対称なプラズマ膜模倣（外側リーフレット．POPC：コレステロール：スフィンゴミエリン1：1：1；細胞質リーフレット。細胞質リーフレット：POPE：POPC：POPS：PIP：コレステロール、モル比4：3：2：1：5）。TMヘリックスは、質量中心（COM）距離4.5nmで配置した。INSANEで周囲の膜と溶媒を構築する前に、TMDを膜の法線周りにランダムに回転させた75。その結果、CG解像度で約230の脂質と約3,500の溶媒分子を含み、Na+Cl-は0.15Mの生理的濃度に設定された。3つの系それぞれについて、510のシミュレーションが設定された。
二量体化シミュレーションにはMARTINI力場76,77を使用した。500ステップの最急降下エネルギー最小化を2回行った後，NVTアンサンブルで3回のシミュレーションを行い，0.1fs，1fs，2fsと時間ステップを増やし，それぞれ1,000積分ステップで処理した．最小化の後、NPTアンサンブルで20fsの時間ステップで5μsの生成分子動力学（MD）シミュレーションを行いました。320Kへの温度結合は，v-rescaleアルゴリズムと1psの時定数で実現した．1気圧までの半等方性圧力結合は，Parrinello-Rahmanアルゴリズム，時定数12ps，圧縮率3×10-4bar-1で行われた．静電気はParticle-Mesh Ewald（PME）アルゴリズムで処理し、カットオフは1.1 nmとした。Lennard-Jones相互作用は、1.1 nmのカットオフでゼロにシフトされました。分極性水モデルを用い、比誘電率を2.5とした。システムの座標は500psごとに書き込まれた。すべてのCGシミュレーションは、GROMACS 2018を使用して実施した。
各アンサンブルの代表的なTM二量体構造を原子論的解像度に変換した78。バックマップした原子論的モデルをエネルギー最小化（1000ステップの最急降下）し、タンパク質の重原子と脂質のリン原子（コレステロールの酸素原子）を拘束して平衡化し、それぞれ1μs（2fs時間ステップ）シミュレーションして安定性を検証。温度は、Nose-Hooverサーモスタットを用いて310Kに結合させた。圧力は、Parrinello-Rahmanバロスタットを用いて1barに維持した。圧力と温度の結合の時定数は、5psと1psに設定された。長距離静電気はPMEで処理し、Lennard-Jones力は1.0nmと1.2nmの間でゼロに切り替えた。
それぞれのTM二量体構造に基づくFcγRIIbホモ二量体およびFcγRIIb - Dectin-1ヘテロ二量体の安定性と実現可能性は、FcγRIIbおよびDectin-1モノマーのTMドメインとそれぞれのエクトドメインを含むホモロジーモデルとDALT由来の膜透過二量体の配置を合わせることで対処した（詳細は下記「ホモロジーモデルの配置」の項参照）。
FcγRIIbとDectin-1モノマーのホモロジーモデルはMODELLERで構築した。79 ヒトFcγRIIbの結晶構造（PDB entry: 2FCB, resolution 1.7 Å）エクトドメイン残基A46-A218をFcγRIIbモデルのテンプレートとして使用した。マウスFcγRIIbとのエクトドメインの配列同一性は64%であった。モデルには、マウスFcγRIIbの残基D32-K237が含まれ、エクトドメインとTMヘリックス（残基K204-K237）をつないだ。エクトドメインとTMDの相対的な向きによって生じる膜とエクトドメインの間の立体的な衝突がある場合は、モデルを無視した。残りのモデルのうち、離散最適化タンパク質エネルギー（DOPE）スコアが最も良いものが選ばれた80。
同様に、Dectin-1については、マウスDectin-1の細胞外ドメイン（PDBエントリに基づくモデル：2BPD、分解能1.5Å、残基Q117-E243）をらせん状のTMD（残基S40-S73）に連結し、茎の少ないDectin-1bアイソフォームを構築しました49 。この場合も立体障害配置は無視し、DOPEスコアが最も高いモデルを選びました。
両モノマーモデルをCHARMM GUIで溶媒和したPOPC二重膜にTMDとともに挿入したところ81、約115,000原子のシステムサイズが得られ、約250の脂質と約26,000の溶媒分子で構成されました。この系はエネルギー最小化され、その後、タンパク質の重原子と脂質のリン原子を拘束して平衡化されました。平衡化は、1fsの時間ステップで375ps、その後2fsの時間ステップで1.5ns行った。長さ1μsのプロダクションランは、原子論的二量体に使用したものと同じパラメータ（拘束を除去したもの）で実行した。すべての原子論的シミュレーションは、GROMACS 2019とCHARMM36力場を用いて実施した。
ホモロジーモデルのアライメント
ステップ1．CG分解能で最も人口の多いTMダイマー界面の代表的な構造の安定性を、原子レベルの分解能でのシミュレーションで調べた。この目的のために、結合位置βと結合位相Φの分布から好ましいCGダイマー構成を特定した（図S5AおよびS5B）。それぞれのクラスターの中心に最も近い構造をバックマップし、原子論的解像度で1μsのシミュレーションを行った。
ステップ2. 平衡化された原子レベルのTM二量体構造は、gromosアルゴリズムを使用してクラスタリングされ、それによって、最も人口の多いクラスタの中心の構造を、エクトドメインを含むFcγRIIbとDectin-1のモデリングの出発点として特定しました。
ステップ3. TMドメインとエクトドメインを含む単量体Dectin-1とFcγRIIbのホモロジーモデルを原子論的シミュレーション（上記参照）で平衡化し、クラスタリングして最も人口の多いクラスタの中心を選択した。これらの構造のTMドメインを原子論的TM二量体構造（ステップ2）にフィットさせ、FcγRIIbホモ二量体またはFcγRIIb-Dectin-1ヘテロ二量体のフルモデルを得ることができました。
ステップ4. FcγRIIbホモおよびFcγRIIb-Dectin-1ヘテロダイマーのフルモデルは、エクトドメイン間およびエクトドメインと膜との間の立体的な重なりの解析によって実現可能性を確認した。
FcγRIIbモノマーおよびヘテロダイマーとIgG1の結合
IgG1（PDBエントリー：1IGYR12、分解能3.2Å）とFcγRIIb（PDBエントリー：5VU0、分解能2.3Å）の立体的結合を、単量体のFcγRIIbと細胞膜に埋め込まれたFcγRIIb-デクチン1ヘテロダイマーのシミュレーションスナップショットに分けて解析しました。両システムとも、模造細胞膜に埋め込まれた10個の受容体のレプリカを、上記で使用したシミュレーションパラメータで1μsの間、原子レベルの分解能でシミュレーションした。
IgG1の結合解析では、IgG1-FcγR結晶複合体構造（PDB entry: 5VU0）で観察された配置に従って、抗体をFcγRIIbエクトドメインにアラインした。IgG1のFcγRIIbへの結合は、すべてのIgG1原子が外膜リーフレットの脂質のコリン基の平均位置から少なくとも7Å上にある場合に可能とみなされた。レプリカシミュレーションで観察されたFcγRエクトドメインの配置は、傾きと回転角の観点から特徴づけられた。結合解析は、各シミュレーションの最後の900ナノ秒の間に1ナノ秒ずつ区切られたスナップショット（すなわち、FcγRIIb単量体とFcγRIIb-Dectin-1 heterodimersの合計9000個の配置）に対して行われました。
定量化および統計解析
統計的有意差の算出には、GrapPad Prismを使用した。2つのグループは、正規分布の場合はt検定（不等分散の場合はWelch補正）、正規分布でない場合はMann-Whitney検定を用いて分析した。3群以上の比較には、ガウス分布でない場合はKruskal-WallisとDunns検定、一元配置分散分析とTukey検定、不等分散の場合はBonferroni検定が用いられた。臨床スコアの経過は、二元配置のANOVAを用い、Bonferroniを後検定として分析した。データは、正規分布でない場合は中央値、ガウス分布の場合は平均値±SDで表した。0.05以下のp値は有意とみなした（＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.001）。
謝辞
Heike DanzerとHeike Albertの専門的な技術支援に感謝するとともに、Erlangen Regional Computing Center (RRZE) とNHR@FAUによる計算資源の支援に謝意を表します。さらに、Preclinical Imaging Platform Erlangen (PIPE)とOptical Imaging Centre Erlangen (OICE)が提供するイメージングサービスを利用できたことを感謝します。この研究は、ドイツ研究財団からの助成金（CRC1181-A01 to G.S.、CRC1181-A07 to F.N. and D.D.、CRC1181-Z02 to T.B. ）（CRC1181プロジェクト番号DFG-261193037）、RTG2599 to D.D （プロジェクト番号DFG-421758891）、IZKF advanced project A80 to D.D. によって支援されています。CRC1027-C6、RTG1962からR.A.B.（DFG-200049484）、CRC1525（プロジェクトID 453989101）からB.N.、（CRC 1149-C02 [project ID 251293561] から J.T. 、BMBF [grant 13N15986 から P.E. and M. Sauer] 、CRC TR 221/324392634から M.K.).
著者貢献
M. Seeling, M.P., S.K., M.W., C.L., C.R., C.H.K.L., C.B., P.E., A.W., M.B., L.Altmann, M.Schneider, L.Amon, N.H., S.L.,M.K., M.Sauer, J.T. and T.B. による実験およびデータ解析が行われました．M. Seeling, M. Sauer, A.L., D.D., G.S., F.N., and R.A.B. が実験を計画した。M. Seeling, F.N., S.K., M.P., and R.A.B. wrote the manuscript. G.S.、T.V.およびB.N.は必須試薬を提供した。
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引用元: (0)
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