炎症を起こしたマウス腸管におけるサルモネラ・チフスムリウムの増殖は、活性酸素を介した微生物叢の溶解に由来するアスパラギン酸に依存する

2024年6月2日 10:16

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炎症を起こしたマウス腸管におけるサルモネラ・チフスムリウムの増殖は、活性酸素を介した微生物叢の溶解に由来するアスパラギン酸に依存する

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(24)00142-2

ウンジェ・ユー 8
ニコラス・G・シーリー 8
ジェイコブ・K・ジーバ
ノラ・J・フォージング
エリン・E・オルサン
マリアナ・X・ビンドロス 9
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脚注を表示オープンアクセス掲載:2024年05月27日DOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.05.001

ハイライト

サルモネラ・チフスムリウム（S. Tm）はマウスの大腸炎でアスパラギン酸を増殖に利用する

腸内細菌叢はS. Tm腸内感染におけるアスパラギン酸の主な供給源である

アスパラギン酸は嫌気性フマル酸呼吸を可能にすることでS. Tmの増殖をサポートする。

宿主由来の活性酸素が常在微生物を溶解し、アスパラギン酸の利用可能性を増加させる。
まとめ
炎症は腸管内腔における電子受容体の利用可能性を高め、病原性腸内細菌科細菌にとって好都合なニッチを形成する。しかし、腸内炎症が介在する内腔代謝産物の変化と病原体拡大との関連メカニズムは不明なままである。ここで我々は、Salmonella enterica serovar Typhimurium（S.Tm）感染によって誘発される粘膜炎症が、アスパラギン酸アミノ酸の腸内濃度を上昇させることを示した。S.Tmは炎症時にのみ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（aspA）依存的なフマル酸呼吸をマウス腸内での増殖に利用していた。AspA依存的な増殖の優位性は、無菌マウスの腸内では消失し、バクテロイデス属とクロストリジウム属にコロニー形成された無菌マウスでは回復した。宿主応答中に生じた活性酸素種（ROS）は、常在微生物の溶解を引き起こし、その結果、微生物叢由来のアスパラギン酸が放出され、S. Tmは硝酸塩依存的嫌気性呼吸と協調して、常在腸内細菌科細菌に打ち勝つために利用した。この結果は、大腸炎における呼吸依存的なS. Tmの増殖において、微生物叢由来のアミノ酸が果たす役割を実証するものである。
図解抄録
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キーワード
腸内細菌科
腸炎
微生物代謝
アミノ酸
マイクロバイオーム
コロニー形成抵抗性
サルモネラ菌
微生物間相互作用
はじめに
サルモネラ腸炎菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium：S.Tm）などの腸内病原菌は、腸炎（大腸炎）を誘発することで、微生物叢を介したコロニー形成抵抗性を克服するように進化してきた。常在細菌は腸管内腔におけるアミノ酸の利用可能性を低下させ、腸内病原体による初期の腸内定着を制限することができる。
アスパラギン酸というアミノ酸は、腸管内腔における病原性腸内細菌科細菌の増殖をサポートすることが示されている10,11。S. Tmと大腸菌のゲノムには、アスパラギン酸を代替電子受容体であるフマル酸に変換するアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（aspA）がコードされているからである12。S. Tmは、感染初期に宿主の腸内でフマル酸呼吸により増殖するために、嫌気的または低酸素条件下でfrdABCD遺伝子にコードされるフマル酸還元酵素を主に利用する13,14,15。しかし、アスパラギン酸依存性のフマル酸呼吸が、炎症腸内での病原性S. Tmの増殖を支えているかどうかは不明である。
宿主腸内細菌は、感染初期に炭素源20と電子受容体17,19の競合を介して、S. Tmに対するコロニー形成抵抗性に重要な役割を果たしている16,17,18,19。しかし、大腸炎後期における常在菌とS. Tmとの代謝的相互作用については、まだ解明されていない。aspAをコードする遺伝子は、腸内細菌科の非病原性細菌の間で保存されており、アスパラギン酸依存的なフマル酸呼吸を可能にしている11。このような知見は、S. Tmだけでなく常在腸内細菌科細菌も、炎症を起こした腸内で拡大するために、アスパラギン酸を新たな電子受容体として利用できることを示唆している。
本研究では、腸内炎症が微生物相依存的にアスパラギン酸量を増加させることを示す。無菌（GF）マウスモデルと食餌操作試験を用いて、宿主と食餌のアスパラギン酸が炎症時の腸内アスパラギン酸レベルの上昇に寄与しないことを証明した。宿主の炎症反応がバクテロイデスの溶解を誘導し、S. Tmが増殖に利用できるアスパラギン酸を増加させることを示した。さらに、S. Tmが腸管内腔で増加したアスパラギン酸プールを利用してフマル酸を生成し、これが他の電子受容体と協調して、大腸炎時にS. Tmが常在腸内細菌科細菌に勝ることを実証した。
結果
S. Tmは大腸炎時にアスパラギン酸に依存して増殖する
しかし、感染性あるいは非感染性の大腸炎が、病原性腸内細菌科細菌（S. Tmなど）が利用するアミノ酸（アスパラギン酸など）の腸内レベルに及ぼす影響については不明である。腸の炎症が腸管内腔におけるアスパラギン酸の利用可能性を増加させるという仮説を検証するために、感染性および非感染性大腸炎モデルマウスの糞便内容物中のアスパラギン酸レベルを測定した。感染性大腸炎のモデルとしてS. Tmに感染したCBA/Jマウスを用いた3,22,23。病原体とは無関係に大腸炎を誘発するため（非感染性大腸炎）、C57BL/6Jマウスに2.5％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を7日間飲水投与した。両モデルの糞便サンプルでアスパラギン酸レベルの上昇が観察された（図1Aおよび1B）。S. Tm感染時のアスパラギン酸値の上昇は、感染マウスの盲腸と結腸で起こったが、回腸では起こらなかった（図S1A）。さらに、S. Tm感染では、管腔内のフマル酸レベルは変化しなかった（図S1B）。これらのデータは、腸の炎症が未知のメカニズムを通して大腸におけるアスパラギン酸の利用可能性を増加させるという最初の証拠を示している。
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図1aspAを介したアスパラギン酸の利用が、大腸炎におけるS. Tmの増殖を促進する。
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S.TmにおけるaspAの役割を調べ、腸疾患に関連した条件下（嫌気的条件下）において、in vitroでアスパラギン酸利用がこの病原体にフィットネスアドバンテージを与えるかどうかを調べた。興味深いことに、嫌気的に増殖したS. Tmでは、炎症を起こした腸で見られるような高アスパラギン酸濃度下でのみ、aspAの発現が有意に増加した（図1C）。次に、40 mMのグリセロール（炭素源）、30 mMのアスパラギン酸、および／または40 mMの硝酸塩（電子受容体）を添加した最小培地で、S. Tm野生型（WT）とΔaspA同型変異体の嫌気的生育を測定した。アスパラギン酸のみではS. Tm株の増殖は促進されず（図1D）、硝酸塩とアスパラギン酸を培地に添加しても同様であった（図S1C）。S. Tmは増殖にグリセロールとアスパラギン酸を利用し、このような表現型はS. Tm ΔaspAアイソジェニック変異体では消失していた（図1D）。S. Tm ΔaspA変異体は、炭素源としてグルコースを与えた場合、WT株と同程度に生育した（図S1D）ことから、ΔaspA変異体は全体的な生育障害を持たないことが示唆された。さらに、S. Tm ΔaspA変異体のグリセロールおよびアスパラギン酸条件下での増殖能力は、トランス相補によりaspA遺伝子を再導入すると回復した（図S1EおよびS1F）。この結果から、S. Tmは発酵や嫌気性呼吸にアスパラギン酸を炭素源として利用しないことが示された。S. TmはaspAを介してアスパラギン酸を利用し、嫌気性呼吸によって炭素源（例えばグリセロール）を代謝し、嫌気条件下でこの腸内病原体の増殖を支えている。
アスパラギン酸がin vitroでS. Tmの嫌気性呼吸依存性増殖を支持することがわかったことから、S. Tmが炎症を起こした腸内で増加したアスパラギン酸レベルを利用するためにアスパラギン酸を利用できるかどうかを調べることにした（図1A、1B、S1A、S1B）。CBA/JマウスにWT S. Tmと同種のΔaspA変異体を1：1の割合で経口投与し、感染時の糞便中の株間競合指数を測定した。WT株S. TmがΔaspA変異株を凌駕する能力は、感染初期（3日目）に比べ、病状が進行するにつれて有意に増加し、腸内炎症が確立した感染後10日目（図1E）にはより高いレベルに達した（図1F-1H）（図1F）。この結果は、炎症を介した腸内環境の変化が、アスパラギン酸依存的なS. Tmの腸管拡大に必要である可能性を示唆している。
アスパラギン酸依存的なS. Tmの腸内膨張には腸内炎症が必要である。
以前の報告では、腸内細菌が炎症を起こす前に腸内に定着するには、アスパラギン酸の利用が必要であると示唆されていたからである10,11。アスパラギン酸依存的なS. Tmの増殖に腸管炎症が必要であるかどうかを評価するため、炎症欠損S. Tm株（Δinv）を用いた感染性大腸炎モデルマウス（CBA/Jマウス）を再度作製した。Tm株（ΔinvAΔspiB）はIII型分泌系（T3SS）を欠損している24,25,26。CBA/JマウスにΔinvAΔspiBとΔinvAΔspiBΔaspAを等量混合して感染させた。WT株のΔaspAに対する競争優位性はΔinvAΔspiBバックグラウンドでは消失し、腸管内腔でアスパラギン酸がS. Tmに有利に働くためには炎症が必要であることが明らかになった（図2A）。病理組織学的に、S. Tm ΔinvA ΔspiBによる感染は腸の炎症を誘導しないことが確認された（図2B）。WTまたはΔinvAΔspiBに感染させたマウスの糞便中のアスパラギン酸濃度を測定したところ、糞便中のアスパラギン酸濃度に有意差が認められた（図2C）。このことは、ΔinvAΔspiBがΔinvAΔspiBΔaspAに対して優位性を示さないのは、ΔinvAΔspiB感染マウスにおけるアスパラギン酸濃度の低下による可能性を示している。この懸念に対処するため、実験を繰り返し、実験中ずっと飲料水にアスパラギン酸塩を補給することで、ΔinvAΔspiB感染マウスの腸内アスパラギン酸塩濃度を増加させた（図2D-2F）。アスパラギン酸の補給は、腸内のアスパラギン酸濃度を増加させながら（図2F）、大腸炎を引き起こすことなく（図2Dおよび2E）、感染後10日目に、炎症欠損S. Tm株がΔaspA変異株を凌駕する能力を回復させた。この結果は、炎症を介したアスパラギン酸レベルの上昇が、腸管内腔におけるS. Tmの増殖を促進することを示している。
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図2S. Tmが腸内でアスパラギン酸を利用するためには腸の炎症が必要である。
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大腸炎時のS. Tmの増殖には、アスパラギン酸の輸送と走化性が必要である。
S. Tmゲノムは、アスパラギン酸への細菌の移動を促進するメチル受容性走化性タンパク質ΙΙ（tarによってコードされる）27と、外因性アスパラギン酸およびリンゴ酸の取り込みを担うC4-ジカルボン酸トランスポーター（dcuAによってコードされる）をコードする10。そこで、アスパラギン酸の走化性と取り込みに関連するS. Tm遺伝子が、嫌気条件下でアスパラギン酸存在下で影響を受けるかどうかを調べるため、WT S. TmのtarとdcuAの発現を測定した。S.Tmをアスパラギン酸単独またはグリセロールと組み合わせて生育させると、グリセロール単独で生育させたS.Tmと比較して、tarとdcuAの発現が増加した（図S2A）。さらに、グリセロール存在下でアスパラギン酸上でS. Tmを増殖させると、アスパラギン酸単独で増殖させた細菌と比較して、dcuAの発現が増加した（図S2A）。このことから、in vitroのアスパラギン酸依存性嫌気性呼吸条件下で、アスパラギン酸取り込み遺伝子の発現が誘導されることが確認された。
次に、アスパラギン酸の取り込みや走化性が、in vitroでS. Tmに適性上の優位性をもたらすかどうかを調べた。S. Tmのグリセロールとアスパラギン酸（図S2BとS2C）嫌気性増殖能力は、S. Tm ΔdcuA（図S2B）とΔtar（図S2C）変異体では消失した。S. Tm ΔdcuAおよびΔtar変異体は、炭素源としてグルコースを与えた場合、WT株と同程度まで増殖できた（データは示さず）ことから、ΔdcuAおよびΔtar変異体は全体的な増殖障害を持たないことが示唆された。この結果は、アスパラギン酸の取り込みと走化性が、嫌気的条件下でのin vitroにおける腸内病原体S. Tmの呼吸依存的増殖を支えていることを示している。
我々は、アスパラギン酸の取り込みとこのアミノ酸に対する走化性によって、S. Tmが炎症を起こした腸内で増加したアスパラギン酸レベルを利用できるかどうかについて、in vivo実験を行った（図1Aおよび1B）。CBA/JマウスにWT S. Tmと同種のΔdcuA変異体またはΔtar変異体を1：1の割合で経口投与し、感染後10日目における株間の競合指数を測定した。感染マウスの糞便サンプルにおいて、WT S. TmはΔdcuA変異株およびΔtar変異株と有意に競合した（図S2D）。この表現型は顕著な腸炎の存在と関連しており（図S2E）、外因性アスパラギン酸に対する走化性と輸送が、感染性大腸炎におけるS. Tmの増殖を促進することを示唆している。
アスパラギン酸は、嫌気性フマル酸呼吸を可能にすることでS. Tmの腸内拡大をサポートする。
腸内細菌科細菌は、frdABCD遺伝子にコードされるフマル酸還元酵素を用いて嫌気的条件下で増殖する。実際、アスパラギン酸存在下でのS. Tmの嫌気的増殖は、フマル酸還元酵素オペロンの遺伝子の一つであるfrdBの発現を誘導した（図S2A）。アスパラギン酸の利用が、フマル酸呼吸をサポートすることによってS. Tmにフィットネスアドバンテージを与えるかどうかを調べるために、アスパラギン酸存在下でのS. Tm WTおよびΔfrdABCD（Δfrd）アイソジェニック変異体のin vitroでの嫌気的成長を測定した（図3A）。アスパラギン酸単独ではS. Tmの増殖は促進されなかった（図3A）。S. Tmのグリセロールとアスパラギン酸を含む最小培地での増殖能力は、S. Tm Δfrd変異体では消失した（図3A）。これらの結果は、S. Tmがフマル酸の供給源としてアスパラギン酸を利用し、in vitroの嫌気的条件下で呼吸依存的な増殖を支えているという、以前の報告10,11を裏付けるものである。
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図3炎症腸内におけるS. Tmによるフマル酸呼吸を支えるアスパラギン酸の利用可能性の増加
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S.Tmが生体内でアスパラギン酸依存性のフマル酸呼吸を腸の拡張に利用できるかどうかは不明であった。この知見のギャップを解決するために、我々はCBA/JマウスにWT S. Tmと同種のΔaspA変異体、またはΔfrdと同種のΔfrdΔaspA変異体を1：1の割合で経口投与し、感染後10日目における株間の競合指数を測定した。腸内炎症が確立されると（図3C）、WT S. TmはΔaspA変異株を有意に上回ったが（図3B）、Δfrd変異株と同種のΔfrdΔaspA変異株をコロニー形成したマウスではこの表現型が消失した（図3B）ことから、炎症腸内ではアスパラギン酸がS. Tmのフマル酸呼吸を促進していることが示唆された。
次に、フマル酸依存的なS. Tmの大腸炎時の呼吸を支えるアスパラギン酸への走化性と輸入の役割を調べた。CBA/Jマウスに、WT S. Tmと同種のΔtar変異体、またはΔfrdと同種のΔfrd Δtar（図S3B）、あるいはWT S. Tmと同種のΔdcuA変異体、Δfrdと同種のΔfrd ΔdcuA（図S3C）変異体を1：1の割合で10日間感染させた。WTのS. Tmは、大腸炎の間、Δtar変異体（図S3B）とΔdcuA（図S3C）変異体を有意に上回った。この増殖の優位性は、Δfrdと同種のΔfrdΔtar変異体でコロニーを形成したマウス（図S3C）、あるいはΔfrdと同種のΔfrdΔducA変異体でコロニーを形成したマウスでは消失した。これらの結果から、S. Tmは感染性大腸炎の際に走化性を示し、フマル酸呼吸をサポートするために外因性アスパラギン酸へのアクセスを獲得する必要があることが明らかになった。
S.TmのΔfrd変異体が大腸炎時に腸管内腔へのコロニー形成を欠損していることを確認するため、CBA/JモデルでWT S.Tmと同種のΔfrd変異体を用いて単回感染を行い、実験を繰り返した。腸管内腔におけるWT S. Tmの増殖は病気が進行するにつれて有意に増加し、感染後7日目と10日目に高いレベルに達した（図3D）。しかし、S. Tm Δfrdは腸管内腔のコロニー形成（図3D）および大腸炎の誘発（図3C）に欠損を示したことから、S. Tmが腸内で増殖し、腸炎を誘発するためにはフマル酸呼吸が必要であることが示唆された。注目すべきことに、S. Tm Δfrd変異体が腸炎を引き起こさないのは、浸潤欠損によるものではなかった（図S3D）。WTまたはΔfrd感染マウスの糞便中のアスパラギン酸濃度を測定したところ、アスパラギン酸濃度に有意差が認められたことから（図3E）、S. Tm Δfrdの腸管内腔コロニー形成能の低下は、Δfrd感染マウスにおけるアスパラギン酸濃度の低下によるものである可能性が示された。この懸念に対処するため、図3Cで述べた競合感染実験を繰り返し、アスパラギン酸の経口補充によってΔfrd感染マウスの腸内アスパラギン酸濃度を増加させた（図3Fおよび3G）。アスパラギン酸の補充は、腸内のアスパラギン酸濃度を増加させたにもかかわらず（図3G）、感染後10日目において、フマル酸呼吸欠損S. Tm株が同種のΔaspA変異体に対抗する能力を増加させることはなかった（図3F）。この結果から、炎症を起こした腸において、フマル酸依存的なS. Tmの腸管拡大を支えるには、炎症を介したアスパラギン酸レベルの上昇が必要であることが示唆された。
腸炎症時のアスパラギン酸の主要供給源は食事ではない
しかし、炎症腸管におけるアスパラギン酸（図1Aおよび1B）の供給源は不明である。食餌由来のアスパラギン酸が腸の炎症時にアスパラギン酸依存的なS. Tmの増殖を促進するかどうかを調べるため、コントロール（Asp+）およびアスパラギン酸を含まない（Asp-）食餌を与えたCBA/Jマウスの腸内で、WT S. Tmが同種のΔaspA変異体に対抗する能力を測定した（図4A-4C）。驚いたことに、WT S. Tmは、Asp+およびAsp-食餌群のいずれにおいても、ΔaspA変異体よりも有意に成長優位であった（図4A）。この表現型は、いずれの餌を与えたマウスでも腸管内腔のアスパラギン酸レベルの上昇（図4B）と、両群で同程度の腸炎症（図4C）を伴っていた。DSS投与マウスでも同様の結果が得られた（図4Dおよび4E）。この結果は、食餌性アスパラギン酸が大腸炎時のこのアミノ酸の主な供給源ではなく、腸炎時のアスパラギン酸依存的な腸内細菌科細菌の増殖には寄与しないことを示している。
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図4炎症腸内細菌S. Tmにとって食事性アスパラギン酸は主要な供給源ではない
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微生物叢由来のアスパラギン酸は炎症腸内でS. Tmの増殖を促進する
次に、炎症腸内におけるアスパラギン酸の供給源が宿主なのか微生物叢なのかを評価しようとした。宿主の反応が腸炎中のアスパラギン酸の主な供給源であるかどうかを調べるため、感染性大腸炎および非感染性大腸炎時のGFマウスの糞便中のアスパラギン酸レベルを測定した。S.Tm誘発胃腸炎30,31およびDSS誘発大腸炎に感受性のGF Swiss-Webster（GF-SW）マウスを用いた。重要なことは、モック処理したGF-SWマウスの糞便中のアスパラギン酸濃度が低かったことである（図5A）。感染性大腸炎を誘発するため、GF-SWマウスにWT S. Tmを3日間経口投与した。病原体とは無関係に大腸炎を誘発するため、GF-SWマウスに2.5％DSSを7日間飲水投与した。興味深いことに、S. Tm感染GF-SWマウス（図5A）およびDSS処理GFマウス（図5A）の糞便サンプルでは、腸炎が発症しているにもかかわらず、模擬処理動物と比較してアスパラギン酸レベルの増加は観察されなかった（図S4A）。これらの結果は、宿主の炎症反応のみが大腸炎中の管腔アスパラギン酸増加の主因ではないことを示す最初の証拠となる。
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図5微生物叢由来のアスパラギン酸は腸炎時のS. Tmの増殖をサポートする
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S.Tmが常在細菌叢のないin vivoでaspA依存的なアスパラギン酸利用に依存しているかどうかを調べるため、GF-SWマウスにWT S.TmとΔaspA変異体を1：1の割合で感染させた。感染3日後に株間の競合指数を評価した。WT株のS. TmはGFマウスにおいて、強い腸内炎症が存在するにもかかわらず、同系統のΔaspA変異株と競合することができなかった（図5C）（図S4A）。この結果は、宿主由来のアスパラギン酸は大腸炎中のS. Tmの増殖を支持しないことを示唆しており、常在細菌叢が腸炎中のアスパラギン酸依存的な病原体の増殖を支持している可能性を提起している。
常在細菌叢が腸炎時のアスパラギン酸の主要な供給源であるという仮説をさらに検討するため、マウスの腸内に最も多く存在する常在細菌クラスを代表する常在微生物をGF-SWマウスにあらかじめコロニー形成させた（図5およびS4B）。上述の競合感染実験を繰り返した。興味深いことに、アスパラギン酸レベルの上昇（図5B）、およびΔaspA変異体に対抗するWT S. Tmの能力（図5C）は、バクテロイデス（Bacteroidia）またはクロストリジア（Clostridia）クラスの成分で前培養したGFマウスの腸管内腔では回復したが、バチルス（Bacilli）クラスの成分で前培養した場合は回復しなかった。バクテロイディア属またはクロストリジア属の存在は、S. Tm感染時にアスパラギン酸レベルを上昇させるのに十分であった（図S4C）。重要なことは、WT S. TmとΔaspA変異体との間の競争優位性の違いは、グループ間の腸内炎症の違いによるものではなかった（図5D）。同様の結果が、DSS処理したグノトビオティックマウスでも得られた（図5Eおよび5F）。以上の結果から、炎症腸内におけるS. Tmの呼吸依存的な増殖に、微生物叢由来のアスパラギン酸が関与していることが明らかになった。
宿主由来の活性酸素は、腸の炎症時に微生物叢由来のアスパラギン酸の増加を引き起こす
バクテロイデス属を含む腸内細菌叢は、部分的には腸管内腔におけるアミノ酸の隔離を介して、腸内病原体に対するコロニー形成抵抗性を提供する。しかし、炎症がどのようにして腸内細菌叢によるアミノ酸の放出を誘導するのかは、依然として不明である。ひとつの可能性として、S. Tm感染によって惹起される自然免疫応答が、有毒な活性酸素種（ROS）と抗菌ペプチドの産生を刺激し、微生物叢メンバーの細菌溶解を誘導することが考えられる33,34,35。
私たちの結果は、S. Tm腸内感染時に、バクテロイディア（Bacteroidia）およびクロストリジア（Clostridia）クラスの腸内細菌が内腔アスパラギン酸の主な供給源であることを示している（図5およびS4）。重要なことは、感染性大腸炎および非感染性大腸炎においてもバクテロイディアとクロストリジウムが高レベルで検出され、炎症時のアスパラギン酸源として十分な量であることがqPCRで確認されたことである（図S5A-S5C）。しかし、ClostridiaやBacteroidiaのほとんどの種では遺伝子操作ツールがないため、これらの生物を用いたメカニズム研究は困難である36。変異誘発法が開発されているBacteroidiaの1種に、腸内細菌叢の常在菌であるBacteroides thetaiotaomicron（B.シータ）がある36,37,38,39。B. thetaが我々の研究のモデル生物として使用できるかどうかを調べるため、B. thetaをあらかじめコロニー形成させたSW GFマウスでS. Tm経口感染を行った（図S5D-S5F）。S. Tmに感染させたB. theta前駆体マウスの糞便中のアスパラギン酸濃度は、モック処理マウスと比較して有意に上昇した（図S5D）。腸内アスパラギン酸濃度の上昇は、S. Tm感染マウスの腸内におけるB. theta負荷の有意な減少と関連していた（図S5E）。さらに、WT S. TmはΔaspA変異体を有意に凌駕し（図S5F）、バクテロイディアで見られた表現型を再現した（図5）。そこで、B. thetaを用いて、S. Tm腸内感染時のアスパラギン酸レベルの上昇が、活性酸素を介した微生物叢の死滅によるものかどうかを調べた。まず、B. thetaを嫌気的条件下で増殖させ、過酸化水素（H2O2）濃度を増加させながら暴露し、活性酸素暴露をモデル化した。B.シータを0.5-5 mMのH2O2にさらすと、細菌は著しく死滅した（図6A）。S. Tmが活性酸素を介したB. thetaの死滅から得たアスパラギン酸を利用できるかどうかを調べるため、グリセロールとH2O2に暴露したB. thetaの上清を添加した最小培地で、S. Tm WTとΔaspAアイソジェニック変異体の嫌気的生育を評価した。興味深いことに、S. Tm WTは、H2O2に曝されたB. thetaの上清で増殖した場合にはΔaspA変異体を上回ったが、曝されていないB. thetaの上清で増殖した場合にはΔaspA変異体を上回った（図6B）。このことは、H2O2によるB. thetaの死滅が、in vitroでS. Tmの嫌気性呼吸を支えるアスパラギン酸を供給したことを示唆している。
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図6宿主由来の活性酸素は、腸炎症における微生物由来のアスパラギン酸放出を促進する。
キャプション
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次に、腸内細菌叢によるアスパラギン酸放出誘導における食細胞由来活性酸素の特異的役割を調べた。NADPH オキシダーゼ2のCYBB鎖を欠損したマウス（Cybb -/-マウス）を使用した。Cybb -/-マウスは、S. Tmが胃腸炎を引き起こす能力が、抗生物質ストレプトマイシンの単回投与による微生物叢の初期障害に依存しているC57BL/6バックグラウンドで入手可能であることが重要である41,42,43。腸内細菌叢によるアスパラギン酸遊離の誘導における宿主由来の活性酸素の役割を評価するため、C57BL/6J WTマウスおよびCybb -/-マウスに抗生物質ストレプトマイシンを48時間飲水投与した。抗生物質を除去した24時間後に、経口経口投与でWT S. Tmと同種のΔaspA変異体を1：1の割合でマウスに感染させた。感染後3日目に、S. Tmの負荷と感染動物の大腸内容物中のアスパラギン酸レベルを評価した（図6Cと6D）。S.Tm感染はWT C57BL/6マウスの腸管内腔におけるアスパラギン酸レベルの有意な増加を引き起こし（図6C）、これはS.Tm WTがΔaspA変異体を有意に凌駕する能力を伴うものであった（図6D）。重要なことは、Cybb-/-マウスでは腸炎が発症しているにもかかわらず、この表現型が消失したことである（図6E）。このことは、S. Tmがin vivoで微生物叢由来のアスパラギン酸にアクセスするためには、宿主由来の活性酸素が必要であることを示唆している。
バクテロイデス属の溶菌がS. Tmによるアスパラギン酸利用を増加させるかどうかをさらに評価するために、自殺プラスミドを保有するB. theta株（B. theta 1XtetR::ssbfe-1またはssbte-1）を利用した36。B. theta 1XtetR::ssbfe-1に存在する自殺プラスミドは、TetRの構成的抑制下で、B. fragilis由来の2種類の細胞毒素のうちの1つを保有している。このため、これらの菌株をアンヒドロテトラサイクリン（ATC）に暴露すると、細菌膜に孔が形成され、毒素依存的な細胞溶解が起こる36。我々は、B. theta 1XtetR::ssbfe-1を経口投与でgnotobioticマウスに単コロニー化した。コロニー形成から7日後、マウスを模擬処置またはATCで飲料水処理した。48時間後、ATC投与は、B. thetaをコロニー形成したGF-SWマウスのS. Tm感染時に観察されたように（図6F）、マウスの腸内におけるB. theta 1XtetR::ssbfe-1負荷の100倍減少を引き起こし（図S5E）、この薬剤がin vivoでB. thetaの溶解を促進することを示唆した。S.Tmがin vivoでB. thetaの溶解により遊離したアスパラギン酸を利用できるかどうかを調べるため、ATCを投与したB. theta 1XtetR::ssbfe-1コロニー化GF-SWマウスと投与していないB. theta 1XtetR::ssbfe-1コロニー化GF-SWマウスに、ΔinvAΔspiBとΔinvAΔspiBΔaspAを1:1の割合で経口感染させた。S. Tm ΔinvAΔspiBバックグラウンドは、腸管内腔におけるアスパラギン酸レベルの上昇が、毒素依存性のバクテロイデスの直接的な溶解によるものであり、S. Tm誘発炎症によるものではないことを確認するために用いた。S. Tm ΔinvAΔspiBは、ATCを投与したマウスの腸内内容物では同系統のΔinvAΔspiBΔaspA変異体と有意に競合したが、ビヒクルコントロール動物の腸内では競合しなかった（図6G）。重要なことに、ATCはS. Tmに対して毒性を示さなかった（図S5G）。この結果は、腸内病原体が胃腸炎中に増殖するために利用できる微生物叢由来のアスパラギン酸の放出を媒介する宿主応答の重要性を浮き彫りにした。
S. Tmはアスパラギン酸依存性呼吸と嫌気性呼吸を併用し、常在腸内細菌科細菌に対抗する。
しかし、腸管内腔における病原体の拡大に必要なステップである、常在腸内細菌科細菌を介したコロニー形成抵抗性をS. Tmが克服するためのメカニズムは、ほとんど解明されていない。常在性腸内細菌科細菌はアスパラギン酸を利用してフマル酸呼吸を行うことができ11、炎症を起こした腸内でS. Tmとアスパラギン酸を奪い合う可能性がある。興味深いことに、CBA/Jマウスに常在性腸内細菌である大腸菌Mt1B1（モデル腸内細菌科）をコロニー形成させた場合とさせなかった場合のin vivo研究18では、常在性腸内細菌科が存在する場合、S. Tmは腸の炎症を引き起こし（図S6A）、同種のΔaspA変異体（図7A）に打ち勝ち（図7B）、炎症腸内でアスパラギン酸を利用して増殖することが示された。
図のサムネイルgr7
図7アスパラギン酸依存性フマル酸呼吸と硝酸依存性呼吸の相乗効果により、S. Tmは常在腸内細菌科細菌に打ち勝つことができる。
キャプション
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我々の結果（図7A、7B、S6A）を考慮すると、炎症によって腸管内腔の代謝ランドスケープ（例えば、電子受容体の利用可能性）が変化することで、S. Tmに有利なニッチ競争が変化し、病原体が常在性大腸菌を凌駕できるようになる可能性がある。この仮説を検証するため、S. Tmと大腸菌Mt1B1が同様にアスパラギン酸を利用できるかどうかを調べるin vitro実験を行った。S. Tmと大腸菌Mt1B118を、アスパラギン酸および／または硝酸塩存在下、グリセロールを含む最小培地中で、嫌気条件下で一晩培養した。硝酸塩の条件は、アスパラギン酸や宿主由来の電子受容体が利用可能な、炎症を起こした腸の環境を再現するために加えた。興味深いことに、アスパラギン酸と硝酸塩は相乗的に嫌気条件下での呼吸依存的なS. Tmの増殖を促進したが（図7C）、硝酸塩単独での細菌増殖と比較すると、アスパラギン酸の添加は大腸菌の増殖を促進しなかった（図7D）。硝酸依存性嫌気性呼吸を増加させるアスパラギン酸の能力は、アスパラギン酸をフマル酸に変換するS. Tmの能力に依存していた。アスパラギン酸と硝酸塩に同時に曝露した際のS. Tm増殖の増加は、同種のS. TmΔaspA（図7E）およびΔfrd（図S6B）変異体では消失していたからである。
次に、アスパラギン酸依存的な呼吸によって、S. Tmが腸炎を再現した条件下で試験管内で常在腸内細菌科細菌に対抗できるかどうかを調べた。そのために、WT S. TmとWT大腸菌Mt1B1を試験管内で競合させる実験を行った。この実験では、上記の培地条件にS. Tmと大腸菌を1：1で混合して接種した。一晩培養した後、マッコンキー培地に培養液をプレーティングし、各菌株の増殖を評価した。S.Tmは、硝酸塩とアスパラギン酸が培地中にaspA依存的に存在する場合にのみ、in vitroで大腸菌と有意に競合した（図7F、7G、S6C、S6D）。最後に、アスパラギン酸依存的なフマル酸呼吸が、炎症を起こした腸内で大腸菌に対するS. CBA/Jマウスに、WT大腸菌とWT S. Tmまたは同種のS. Tm ΔaspA変異体を1：1の割合で経口投与した。感染後10日までの感染動物の糞便中のS. Tm負荷を評価した（図S6E）。その結果、WT S. Tmは感染後3日目から感染マウスの腸管内腔で大腸菌と有意に競合し（図S6E）、感染後10日目にはS. Tmが大腸菌に対して顕著に競合優位に立つことが観察された（図7H、S6E、S6F）。このような病原体が常在性腸内細菌科細菌を凌駕する能力は、S. Tmがアスパラギン酸をフマル酸に変換する能力に依存しており、大腸菌に対するS. Tmのin vivoでの増殖優位性は、同種のS. Tm ΔaspA変異体を用いて競合感染を行った場合には消失した（図7H、S6E、S6F）。以上の結果から、S. Tmは嫌気性硝酸塩呼吸とアスパラギン酸依存性フマル酸呼吸を併用して、腸炎時に常在腸内細菌に対抗している可能性が示唆された。
考察
S. Tmは腸内環境を変化させ、腸内コロニー形成に必要なアミノ酸を獲得できるようにする戦略を開発しなければならない。我々のデータは、S. Tmがこの新たな外因性アスパラギン酸源を利用して、炎症を起こした腸内でフマル酸依存性の嫌気性呼吸をサポートできることを示している。このことは、アスパラギン酸に向かって移動・輸送し、アスパラギン酸依存的なフマル酸呼吸を行うことができるS. Tm株が、このアミノ酸を利用できない同系株よりも生体内で優位に立つことにつながる。アスパラギン酸依存性フマル酸呼吸は、S. Tmによる腸内コロニー形成の初期（そして炎症非依存性）には寄与しないことが、強毒性変異株を用いた我々の結果から示唆された。以上より、腸内病原体S. Tmが腸内細菌叢を利用してアミノ酸アスパラギン酸を獲得し、炎症腸内でアスパラギン酸依存性嫌気性呼吸をサポートするという、これまで未解明であったメカニズムが明らかになった。
これまでの文献によると、S. Tmは宿主に定着した当初はアスパラギン酸依存性のフマル酸呼吸に依存していた。10 しかし、炎症が始まると、S. Tmは硝酸塩や酸素といった電子ポテンシャルの高い電子受容体を利用して増殖するようになる。硝酸塩と酸素への曝露は、大腸菌のアスパラギン酸依存性フマル酸呼吸を行うのに必要な機械の発現を低下させることが示されている44。この機構は、常在性大腸菌が硝酸塩存在下でアスパラギン酸による増殖効果を示さない理由を説明できる（図7D）。常在性腸内細菌科細菌のaspAとfrdABCDの発現を制御する制御機構は、S. Tm45でも保存されているが、その制御ネットワークは保存されていない。実際、我々のデータは、腸内細菌科における硝酸塩を介したアスパラギン酸呼吸制御の既知のメカニズムが、S. Tmには当てはまらない可能性を示唆している。腸内細菌科の異なるメンバーが、好気的環境と嫌気的環境にどのように反応するのか、特に常在菌と病原性細菌の代表の間では、まだ不明な点が多い。S.Tmが硝酸塩呼吸とアスパラギン酸依存性フマル酸呼吸の両方を行えるのは、群集の不均一性による可能性がある。腸内細菌科細菌は、バイオフィルムのような密集した群集の中で呼吸戦略を多様化させることが示されている。
結論として、今回の研究結果は、腸内病原体S. Tmが炎症腸内で増殖するために、微生物叢由来の代謝産物を利用するように進化してきたことを理解する上で、基本的な前進をもたらすものである。腸内病原菌は、腸管炎症時に嫌気性呼吸を介して増殖するための電子受容体の供給源として微生物叢由来のアミノ酸に依存しており、常在腸内細菌科細菌に打ち勝つための資源としてアミノ酸を利用している可能性がある、という新たな像が浮かび上がってきた。他の病原性腸内細菌科細菌が、腸内感染時に微生物叢由来のアミノ酸を利用して嫌気性呼吸をサポートし、常在腸内細菌科細菌を凌駕するかどうかについては、さらなる研究が必要である。我々の知見は、感染性および非感染性胃腸炎に対する病原体の代謝的適応に焦点を当てた新たな治療戦略の開発に役立つ可能性がある。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
細菌およびウイルス株
S. Typhimurium, IR715 ATCC 14028 NalR Stojiljkovic et al.47 IR715
S. Typhimurium, IR715 ΔphoN::Tn10d-CmR Faber et al.48 FF176
S. Typhimurium, IR715 ΔphoN::KmR Kingsleyら.49 AJB715
S. Typhimurium, IR715 Δtar ΔphoN::KmR 本研究 WJ65
S. Typhimurium, IR715 ΔaspA ΔphoN:: KmR この試験 WJ66
S. Typhimurium, IR715 ΔdcuA ΔphoN:: KmR この試験 WJ57
S. Typhimurium, IR715 ΔfrdABCD ΔphoN:: KmR この試験 WJ29
S. Typhimurium, IR715 ΔfrdABCD この試験 WJ28
S. Typhimurium, IR715 ΔfrdABCD ΔphoN::Tn10d-CmR この試験 WJ30
S. Typhimurium, IR715 ΔfrdABCD Δtar ΔphoN:: KmR この試験 WJ67
S. Typhimurium, IR715 ΔfrdABCD ΔaspA ΔphoN:: KmR この試験 WJ68
S. Typhimurium, IR715 ΔfrdABCD ΔdcuA ΔphoN:: KmR この試験 WJ58
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB Rivera-Chávez et al.50 SPN487
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB ΔphoN::Tn10d-CmR この試験 WJ52
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB ΔphoN:: KmR この試験 WJ111
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB Δtar ΔphoN:: KmR この試験 WJ125
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB ΔaspA ΔphoN:: KmR この試験 WJ133
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB ΔdcuA ΔphoN:: KmR この試験 WJ135
S. Typhimurium, IR715 ΔinvA ΔspiB ΔfrdABCD ΔphoN::KmR この試験 WJ143
大腸菌 S17-1 λpir zxx::RP4 2-(TetR ::Mu) (KmR::Tn7) λpir recA1 thi pro hsdR (r-m+) Simon et al.51 S17-1 λpir
バクテロイデスイエシムリス DSMZ DSMZ 26085
Bacteroides thetaiotaomicron, VPI 5482 Δtdk Koropatkin52 N/A
Bacteroides thetaiotaomicron, VPI 5482 Δtdk 1XtetR; pNBU2-erm P1TDP-GH023-ssbfe1 Limら36 N/A
ラクトバチルス・ロイテリ DSMZ DSMZ 32035
クロストリジウム・クロストリジオフォルメ（Clostridium clostridioforme） DSMZ DSMZ 26114
クロストリジウム・イノキュウム DSMZ DSMZ 26113
クロストリジウム・マンゲノッティ DSMZ DSMZ 29133
クロストリジウム・コクレアリウム DSMZ DSMZ 29358
クロストリジウム・スポロゲネス DSMZ DSMZ 29420
黄色ブドウ球菌 DSMZ DMSZ 28566
ストレプトコッカス・ダニエリエ（Streptococcus danieliae） DSMZ DMSZ 22233
アッカーマンシア・ムチニフィラ DSMZ DMSZ 26127
大腸菌 Mt1b1 DSMZ DSMZ 28618
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
ギブソンアセンブリーマスターミックス NEB Cat# E2611L
LBブロス、ミラー（ルリアベルタニ） Becton Dickinson Cat# 244520
LB 寒天、ミラー（ルリアベルタニ） Becton Dickinson Cat# 244620
MRSブロス（DifcoTM 乳酸菌） Becton Dickinson Cat# 288130
コロンビア寒天（BBLTM） Becton Dickinson Cat#211124
バクトブレインハートインフュージョン Becton Dickinson Cat# 237500
ヒツジ血 Fisher BioReagents Cat# R54008
バクトトリプトン Becton Dickinson Cat# 211705
L-アスパラギン酸 Fisher Scientific Cat# BP374-100
グリセロール Fisher BioReagents Cat# G33-4
ブタ胃由来ムチン、II 型 Sigma Cat# M2378
デキストラン硫酸ナトリウム塩（DSS） Alfa Aesar Cat# J63606
硫酸ストレプトマイシン Fisher Scientific Cat# BP910-50
TRI 試薬 Molecular Research Cat# TR118
iQ SYBR Green スーパーミックス Bio-Rad Cat# 1708882
Platinum PCR Supermix High Fidelity Invitrogen Cat# 12532-016
PCR スーパーミックス Invitrogen Cat# 10572-014
酸性カゼインペプトン Fisher Scientific Cat# BP1424-500
ビタミンサプリメント ATCC Cat# MD-VS
微量ミネラルサプリメント ATCC Cat# MD-TMS
最小必須培地（MEM） Gibco Cat# 11090081
ウシ胎児血清（FBS） Gibco Cat# 10500064
GlutaMAXTM-I Gibco Cat# 35050
MEM 非必須アミノ酸溶液（NEAA） Corning Cat# 25-025
ピルビン酸ナトリウム Gibco Cat# 11360070
DPBS Gibco Cat# 14190144
HEPES ギブコ Cat# 15630080
ゲンタマイシン溶液 Sigma Cat# G1397
アンヒドロテトラサイクリン Cayman Chemicals Cat#10009542
過酸化水素 ThermoFisher Cat# L14000.AP
重要な市販アッセイ
アスパラギン酸比色／蛍光アッセイキット BioVision Cat# K552
フマル酸比色／蛍光アッセイ BioVision Cat#K633-100
パワーソイル DNA 分離キット Mo-Bio Cat# 12888
SurePrepTM TrueTotalTM RNA 精製キット Fisher BioReagents Cat# BP2800
Total RNA Purification Plus Micro Kit Norgen Cat# 48500
PureLinkTM mini RNA 精製キット Invitrogen Cat#: 12183020
iScript gDNA Clear cDNA 合成キット Bio-Rad Cat# 1725035
ZymocleanTM ゲル DNA 回収キット Zymo Research Cat# D4002
PureLinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit インビトロジェン Cat# K210011
DNeasy PowerSoil キット Qiagen Cat# 12888
実験モデル生物／株
マウス C57BL/6J ジャクソン研究所 Cat# 000664
マウス CBA/J Jackson Laboratory Cat# 000656
マウス Cybb -/- ジャクソン研究所 Cat# 002365
マウスジャームフリー Swiss Webster Byndloss Lab N/A
Caco-2 ATCC Cat# HTB-37
オリゴヌクレオチド
本試験で使用したプライマー、表 S1 参照本試験 N/A
組換えDNA
プラスミド: pRDH10, ori(R6K) mobRP4 sacRB CmR TetR Kingsley et al.53 pRDH10
プラスミド： pRDH10 タール（IR715）の上流および下流領域本研究 pWJ39
プラスミド：プラスミド: pRDH10 における aspA (IR715) の上流および下流領域本研究 pWJ40
プラスミド：プラスミド：dcuA（IR715）の上流および下流領域 pRDH10 本試験 pWJ41
プラスミド：プラスミド：pRDH10におけるfrdABCD（IR715）の上流および下流領域本試験 pWJ51
プラスミド: pKD46, SpecR PBAD-gam-beta-exo oriR101 repA101ts Datsenko and Wanner54 pKD46
プラスミド: pKD3, CarbR FRT CmR FRT PS1 PS2 oriR6Kγ Datsenko and Wanne54 pKD3
プラスミド: pKD13, CarbR FRT KmR FRT PS1 PS4 oriR6Kγ Datsenko and Wanner54 pKD13
ソフトウェアとアルゴリズム
GraphPad Prism 10 GrapPad Software N/A
新しいタブで表を開く
リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるMariana X. Byndloss (mariana.x.byndloss@vumc.org)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本研究で作成された全てのユニークな試薬は、リードコンタクトから制限なく入手可能である。
データおよびコードの利用可能性
本論文で報告されたデータは、要請があれば主担当者から提供される。本論文ではオリジナルのコードは報告しない。本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要求に応じて、主担当者から入手可能である。
実験モデルと被験者の詳細
マウス飼育
本研究におけるすべての動物実験は、Vanderbilt University Medical CenterのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。雌のCBAおよびC57BL/6マウスはJackson Laboratoryから入手した。無菌スイス・ウェブスター（SW）マウスは、Vanderbilt University Medical Centerの特定の病原体フリー施設で自家繁殖され、維持された。無菌マウスのサブセットは、定義された微生物叢でコロニー形成され、この研究で使用されたSWマウスを得た。実験開始時の年齢は、CBAマウス、C57BL/6マウス、SWマウスともに6～7週齢であった。従来型マウスは個別に換気したケージに入れ、水と餌（Envigo Global 16% Protein Rodent Diet）を自由に摂取できるようにした。無菌SWマウスは無菌陽圧ケージ（Allentown）に入れ、無菌水と飼料を自由に摂取できるようにした。
無菌SWマウスについては、図の凡例に特に断りのない限り、雌雄両方のマウスを分析したが、性差による有意な差は認められなかった。雌雄は各実験群に等しく含まれた。動物は実験の3日前に無作為にケージと治療群に割り付けられた。特に断りのない限り、以前の実験で観察されたばらつきに基づき、最低5匹のマウスを使用した。すべてのマウスを1日2回モニターし、ケージの寝具は2週間ごとに交換した。実験終了時、マウスは二酸化炭素吸入により人道的に安楽死させた。所定の時点に達する前に人道的な理由で安楽死させなければならなかった動物は解析から除外した。
細菌株
S. Typhimurium IR71547,48,49,50株および大腸菌Mt1B1株は、LBブロス（10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、10g/L塩化ナトリウム）またはLB寒天プレート（10g/Lトリプトン、5g/L酵母エキス、10g/L塩化ナトリウム、15g/L寒天）中、37℃で好気的に培養した。嫌気条件下での増殖には、No-carbon-E（NCE）最小培地（28 mM KH2PO4、28 mM K2HPO4・3H2O、16 mM NaNH4HPO4・4H2O）に1 mM MgSO4、0.1% Casamino acids、1% Vitamin and Trace mineral solution（American Type Culture Collection）を添加したものを用いた。唯一の炭素源としてグリセロール（40 mM）を添加し、嫌気性フマル酸呼吸のためのフマル酸源としてL-アスパラギン酸（30 mM）も使用した。S. Typhimurium IR715株および大腸菌Mt1B1株はすべて、嫌気チャンバー（酸素0％）内で37℃で培養した。必要に応じて、寒天平板および培地に30 μg/mLのクロラムフェニコール（Cm）、100 μg/mLのカルベニシリン（Carb）、50 μg/mLのカナマイシン（Km）、または50 μg/mLのナリジクス酸（Nal）を添加した。嫌気チャンバー（窒素85％、水素10％、二酸化炭素5％、Coy Lab Products社製）内で、定義された微生物叢（DM）株を培養した。Bacteroides caecimuris株（主要リソース表）は血液寒天培地（37 g/L脳心筋注入培地、15 g/L寒天培地、50 mMヒツジ血液）でルーチンに培養した。Lactobacillus reuteri株（主要資源表）は、MRS寒天培地プレート（55 g/L MRS培地、15 g/L寒天）で定常培養した。Clostridium clostridioforme株、Clostridium clostridioforme株、Clostridioides mangenotti株、Clostridium cochlearium株およびClostridium sporogenes株（主要資源表）は、BHI寒天培地プレート（37g/L脳心筋注入培地、15g/L寒天培地）で定常培養した。Staphylococcus xylosus株またはStreptococcus danieliae株（主要資源表）は、TSBブロス（40g/Lトリプティック大豆ブロス）で定常培養し、嫌気条件下で37℃、48時間培養した。のAkkermansia muciniphila（主要資源表）は、嫌気性Akkermansia培地（18g/L脳心筋注入培地、5g/L酵母エキス、15g/Lトリプシン酵素大豆ブロス、2. 5g/L K2HPO4、1mg/L ヘミン、0.5/L グルコース、0.4g Na2CO3、0.5g システイン塩酸塩、5mg/L メナジオン、3% 補体不活化ウシ胎児血清）を嫌気条件下、37℃で72時間培養した。Bacteroides thetaiotaomicron VPI5482株は、BHIS寒天培地（37g/L脳心筋注入培地、15g/L寒天、ビタミンK3、ヘミン）で培養した。必要に応じて、寒天プレートにゲンタマイシン（Gen）200μg/mLを添加した。
方法の詳細
プラスミドおよび菌株の構築
Salmonella Enterica serovar Typhimurium変異株の構築
S. Typhimurium IR715のΔtar、ΔaspA、ΔdcuAまたはΔfrdABCD欠失変異体について、上流および下流の約0. IR715-tar-del-F1/IR715-tar-del-R1 および IR715-tar-del-F2/ IR715-tar-del-R2、IR715-aspA-del-F1/IR715-aspA-del-R1 および IR715-aspA-del-F2/IR715-aspA-del-R2 を用いて、tar、aspA、dcuA または frdABCD 遺伝子を挟む 5 kb の上流および下流領域を PCR で増幅した、 IR715-dcuA-del-F1／IR715-dcuA-del-R1およびIR715-dcuA-del-F2／IR715-dcuA-del-R2、またはIR715-frdABCD-del-F1／IR715-frdABCD-del-R1およびIR715-frdABCD-del-F2／IR715-frdABCD-del-R2由来のS. Typhimurium IR715野生型ゲノムから作製した。pRDH10自殺プラスミド53をSalIで消化し、ギブソンアセンブリーマスターミックス（NEB）を用いて各遺伝子の断片とアセンブリーし、プラスミドpWJ39（pRDH10::Δtar）、pWJ40（pRDH10::ΔaspA）、pWJ41（pRDH10::ΔdcuA）またはpWJ51（pRDH10::ΔfrdABCD）を形成した。
組換えプラスミドpWJ39、pWJ40、pWJ41またはpWJ51を大腸菌S17-1 λpir51に形質転換し、S. Typhimurium IR715野生型に結合させた。自殺プラスミドを組み込んだクローンをスクロースカウンターセレクションにかけ、スクロース耐性でCmSを示すコロニーがS. Typhimurium IR715のΔtar、ΔaspA、ΔdcuAまたはΔfrdABCD欠失変異体であることをPCRで確認した。
組換えプラスミドpWJ39、pWJ40またはpWJ41を大腸菌S17-1 λpir51に形質転換し、大腸菌S17-1 λpirをドナー株としてS. Typhimurium IR715 ΔfrdABCD変異体（WJ28）にコンジュゲートした。自殺プラスミドを組み込んだクローンをスクロースカウンターセレクションにかけ、スクロース耐性でCmSを示すコロニーがS. Typhimurium IR715 ΔfrdABCD Δtar、ΔfrdABCD ΔaspAまたはΔfrdABCD ΔdcuA変異体であることをPCRで確認した。
組換えプラスミドpWJ39、pWJ40、pWJ41またはpWJ51を大腸菌S17-1 λpir51に形質転換し、大腸菌S17-1 λpirをドナー株としてS. Typhimurium IR715 ΔinvA ΔspiB変異体（SPN487）にコンジュゲートした。自殺プラスミドを組み込んだクローンをスクロース対選択し、スクロース耐性でCmSを示すコロニーがS. Typhimurium IR715 ΔinvA ΔspiB Δtar、ΔinvA ΔspiB ΔaspA、ΔinvA ΔspiB ΔdcuA、またはΔinvA ΔspiB ΔfrdABCD変異体であることが確認された。
ΔphoN::Tn10d-CmRおよびΔphoN::KmR変異体は、それぞれFF176およびAJB715からファージP22 HT int-10555によって形質導入された。細菌株の構築に使用したプライマーとプラスミド54は、それぞれ表S1とS2に示す。
In vitro 細菌増殖アッセイ
増殖アッセイは、No-carbon-E（NCE）最小培地（28 mM KH2PO4、28 mM K2HPO4・3H2O、16 mM NaNH4HPO4・4H2O）に1 mM MgSO4、0.1% Casamino acids、1% Vitamin and Trace mineral solutions（American Type Culture Collection）を添加し、唯一の炭素源としてグリセロール（40 mM）、フマル酸源としてL-アスパラギン酸（30 mM）の存在下または非存在下で行った。嫌気的増殖実験では、培地を接種の48時間前に嫌気チャンバーに入れた。一晩好気培養したS. Tm株または大腸菌株を回収し、PBSで洗浄後、NCE培地に再懸濁した。次いで、野生型S. Tm株または大腸菌を、炭素源（40 mMグリセロール）および／または電子受容体として使用されるアスパラギン酸またはフマル酸源（30 mM L-アスパラギン酸）を含む嫌気性培地に、最終濃度1 × 104 CFU/mLで添加した。細菌増殖は、10倍希釈液を適切な抗生物質を含むLB寒天培地またはマッコンキー寒天培地に連続散布し、18時間後に測定した。
グリセロールおよび/またはL-アスパラギン酸によるS. Tmおよび大腸菌の野生型および変異株の嫌気性増殖を測定するため、各菌株の一晩培養液を回収し、PBSで洗浄後、NCE培地に再懸濁した。96ウェルプレートで、菌株を40 mMのグリセロールまたは30 mMのL-アスパラギン酸を含むNCE培地、両者の組み合わせ、あるいは最終OD600=0.01のLB中のATC滴定に添加した。OD600はEpoch 2プレートリーダー（Bio-Tek）を用いて24時間測定した。In vitroでは、異なるコロニーを用いて細菌増殖アッセイを3連で行った。
活性酸素を介した常在細菌の死滅アッセイ
炎症由来の活性酸素がin vitroで常在菌を死滅させ、S. Tmによるアスパラギン酸の利用を可能にする能力を測定するために、1 mM MgSO4、0. 1%カザミノ酸、1%ビタミン・微量ミネラル溶液（American Type Culture Collection）に1x1011 CFUのBacteroides thetaiotaomicron52株を接種した。過酸化水素（Thermo Fisher）を濃度を変えて添加し、37℃で培養した。培養直後、ゲンタマイシンを添加したBHIS上に連続10倍希釈液を散布し、細菌負荷を測定した。一部の実験では、インキュベーションの直後に、S. Tmを最終濃度1x10 4 CFUで使用済み培地に添加し、18時間インキュベートした後、適切な抗生物質を含むLB寒天培地に10倍希釈液を広げて細菌増殖を測定した。
細菌RNA単離と定量的リアルタイムPCR
In vitroでの細菌遺伝子発現を測定するため、1 mM MgSO4、0.1% Casamino acids、1% Vitamin and Trace mineral solutions（American Type Culture Collection）を添加したNCE最小培地（28 mM KH2PO4, 28 mM K2HPO4・3H2O、16 mM NaNH4HPO4・4H2O）にS. Typhimurium IR715株を接種し、嫌気条件下37℃で培養した。グリセロール（40 mM）を唯一の炭素/エネルギー源とし、L-アスパラギン酸（30 mM）を嫌気性フマル酸呼吸のためのフマル酸源として添加した。SurePrepTM TrueTotalTM RNA Purification Kit（Fisher BioReagents）、Total RNA Purification Plus Micro Kit（Norgen）、またはPureLink mini-RNA Purification kit（Ambion Life Biosciences）を用いて、初期対数期（4 h p.i.）まで増殖させた細菌細胞から全RNAを抽出した。cDNAはiScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）を用いて作製した。リアルタイムPCRはiQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を用いて行った。データはCFX384 Real-Time System (Bio-Rad) で取得し、比較Ct法を用いて解析した。各サンプルの標的遺伝子転写は、16S rRNAまたはgyrB mRNAレベルのいずれかで正規化した。この実験で細菌遺伝子発現を決定するために使用したプライマーを表S3に示す。
微生物叢分析
CBAマウスの群に模擬感染またはS. Typhimurium野生型（IR715）を感染させ、感染10日後にサンプルを採取した。細菌ゲノムDNAは、PowerSoil DNA Isolation Kit（Mo-Bio社製）を用い、製造者の指示に従って抽出した。細菌DNAは5ng/uLに標準化し、4uLを鋳型として表S3に示すプライマーを用いてSYBR-greenベースのリアルタイムPCRを行った。各サンプルの遺伝子コピー数は、細菌の16S rRNA遺伝子の断片から作成した標準曲線を用いて決定した（真正細菌： R. productus [ATCC 27340D]、Clostridiales： R. productus [ATCC 27340D]、Lactobacillales/Bacillales： L. acidophilus [ATCC 4357D]、Bacteroidetes/Actinobacteria： B. fragilis [ATCC 25285D]、腸内細菌科：大腸菌[ATCC TOP10]）を鋳型としてpCR2.1（TOPO TA cloning kit, Invitrogen）にクローニングした。各集団の割合は、各集団の遺伝子コピー数をユニバーサルプライマーを用いて決定した全遺伝子コピー数で割って算出した。
2.5%DSS処理動物からのサンプルについては、PCRの阻害剤として知られているDSSのDNAを洗浄するために、微生物DNAのKCl沈殿を行った。つまり、DNAサンプルを100uLあたり0.04gのDNAと混合し、氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを4℃で30分間遠心し、過剰のKClを沈殿させた。上清を取り、1/10容量の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と混合し、その後2.5容量の純粋なエタノールと混合して溶液中のKClを沈殿させた。サンプルを氷上で10分間インキュベートし、遠心分離した。上清を除去し、残ったペレットを70%エタノールで繰り返し洗浄し、残ったKClを除去した。残ったDNAペレットは乾燥させ、超純水に溶解し、下流の用途に使用した。
定義された微生物叢（DM）株の増殖
豚ムチンを最終濃度0.5%(w/v)で1x NCE塩に溶解した。ムチンブロスにBacteroides caecimurisの新鮮なコロニーを植菌し、嫌気条件下で37℃、72時間培養した。Bacteroides thetaiotaomicronは新鮮なコロニーを用い、適切な抗生物質を含むBHISで37℃、24時間嫌気培養した。MRSブロスにLactobacillus reuteriの新鮮なコロニーを接種し、嫌気条件下で37℃、72時間培養した。BHIブロスにClostridium clostridioforme、Clostridium、Clostridioides mangenotti、Clostridium cochleariumまたはClostridium sporogenes株の新鮮コロニーを接種し、嫌気条件下で37℃、72時間培養した。TSBブロスにStaphylococcus xylosusまたはStreptococcus danieliaeの新鮮コロニーを接種し、嫌気条件下で37℃、48時間培養した。嫌気性Akkermansia培地にAkkermansia muciniphilaの新鮮なコロニーを接種し、37℃で72時間嫌気条件下で培養した。
動物実験
S. Typhimurium誘発大腸炎の動物モデル
CBAマウスモデル。CBAマウスに0.1mLのLBブロス（模擬感染）またはLBブロス中のS. Typhimurium IR715株を感染させた。6～7週齢のCBAマウス群（n=4～5）に1 x 109 CFUを胃内感染させ、単一株感染実験および競合感染実験を行った。感染後1、3、5、7、9日目に糞便サンプルを採取し、細菌プレーティングを行った。感染後10日目に、病理組織学的検査、大腸内腔内容物、S. Tmの定量およびアスパラギン酸測定用の糞便内容物を採取した。S.Tm菌数は、10倍希釈液を適切な抗生物質を含むLB寒天培地に連続プレーティングすることにより決定した。アスパラギン酸無添加食実験では、6～7週齢のCBAマウスの群（n=5）に、S. Tm感染48時間前から対照食A20073101（Research Diets）またはアスパラギン酸無添加食A20073102（Research Diets）を与え、実験期間中はこの食餌で飼育した。残りの実験手順は上記の通り行った。
C57Bl/6マウスモデル。C57Bl/6をストレプトマイシン（5g/L）で48時間前処理した後、LB（モック）または1x10 9 CFU S. Typhimurium IR715株を0.1mL感染させる前に通常の水に戻し、単一株感染実験および競合感染実験を行った。感染後 3 日目に糞便サンプルを採取し、S. Tm をプレーティング法で定量した。感染 3 日後に、病理組織学的検査、大腸内腔内容物、および S. Tm 菌定数とアスパラギン酸測定用の糞便内容物を採取した。S.Tmの数は、10倍希釈液を適切な抗生物質を含むLB寒天培地に連続プレーティングすることにより測定した。NADPHオキシダーゼ欠損トランスジェニックマウス（Cybb-/-）を用いて、上述の実験を繰り返した。
無菌スイス・ウェブスター（SW）マウス。6-7週齢のSW無菌マウスの群（n=5）に、3×109 CFUのバクテロイデス・カエシムリス、ラクトバチルス・ロイテリ、またはクロストリジウム・クロストリジオフォーメ、クロストリジウム・イノヌクム、クロストリジウム・マンゲノッティ、クロストリジウム・コクレアリウムおよび/またはクロストリジウム・スポロゲネスの組み合わせを胃内接種した。マウスのサブセットは事前にコロニー形成されず、無菌のままであった。あるいは、DM: Lactobacillus reuteri, Akkermansia muciniphila, Staphylococcus xylosus, Streptococcus danieliae; Bact： Bacteroides caecimuris, Bacteroides thetatiotaomicron; Clos： Clostridium clostridioforme, Clostridium innocuum, Clostridioides mangenotti, Clostridium cochlearium, Clostridium sporogenesを3×109で6-7SW無菌マウスに胃内接種した。7日後、前培養マウスおよび無菌対照マウスに1 x 109のSalmonella enterica serovar Typhimurium IR715株を感染させた。感染3日後、病理組織学的検査、大腸内腔内容物、S. Tm菌数測定およびアスパラギン酸測定用の糞便内容物を採取した。S.Tm数は、適切な抗生物質を含むLB寒天培地に連続10倍希釈液をプレーティングして測定した。
あるいは、マウスに1x10 9 CFUのBacteroides thetaiotaomicron株を接種した36。7日後、プレコロニー化および無菌状態の対照動物に1 x 109 Salmonella enterica serovar Typhimurium IR715株を感染させた。必要に応じて、100％EtOHに溶解した100ng/mLのアンヒドロテトラサイクリン（ATC、Cayman Scientific社製）を2日間、飲料水としてマウスに経口投与した。一部のマウスにはビヒクルコントロールを投与した。感染から2日後、病理組織学、大腸内腔内容物、S. Tmの定量とアスパラギン酸測定用の糞便内容物のサンプルを採取した。S.Tmは、適切な抗生物質を含むLB寒天培地に連続希釈液をプレーティングして測定した。
DSS誘発大腸炎の動物モデル
従来のマウス。雌雄6-7週齢の野生型C57BL/6マウスに、2.5％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS；Alfa Aesar）を7日間連続的に飲水投与した。DSS投与8日目に、アスパラギン酸測定用の病理組織学的検査用サンプル、大腸内腔内容物および糞便内容物を採取した。アスパラギン酸無添加食実験では、6～7週齢のC57Bl/6マウスの群（n=5）に、対照食A20073101（Research Diets）またはアスパラギン酸無添加食A20073102（Research Diets）をDSS処置の48時間前から与え、実験期間中はこの食餌で飼育した。残りの実験手順は上記のように行った。
無胚芽スイス・ウェブスター（SW）マウス。6～7週齢の無菌SWマウスの群（n=5）に、3×109 CFUのバクテロイデス・カエシムリス（Bacteroides caecimuris）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、またはクロストリジウム・クロストリジオフォーメ（Clostridium clostridioforme）、クロストリジウム・イノキュウム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・マンゲノッティ（Clostridioides mangenotti）、クロストリジウム・コクレアリウム（Clostridium cochlearium）および／またはクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）の組み合わせを胃内接種した。マウスのサブセットはプレコロニー化されず、無菌のままであった。7日後、プレコロニー化マウスに2.5％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS；Alfa Aesar社製）を7日間連続的に飲水投与した。DSS投与後8日目に、病理組織学、大腸内腔内容物、アスパラギン酸測定用の糞便内容物のサンプルを採取した。
Caco-2細胞培養
ヒト上皮性大腸腺癌細胞株Caco-2はAmerican Type Culture Collectionから入手した。Caco-2細胞は、1x Minimal Essential Media (Gibco)、10% Fetal Bovine Serum (Gibco)、1x GlutaMax (Gibco)、1x MEM Nonessential Amino Acids (Corning)、1 mM Sodium Pyruvate (Gibco)を用い、37℃、5% CO2で日常的に維持した。
浸潤アッセイ
Caco-2細胞を2.5 x 105 cells/wellに播種し、表示菌株を感染多重度（MOI）10で感染させた。細菌と細胞は、1x Minimal Essential Media (Gibco)、10% Fetal Bovine Serum (Gibco)、1x GlutaMax (Gibco)、1x MEM Nonessential Amino Acids (Corning)、1 mM Sodium Pyruvate (Gibco)を添加した1x Minimal Essential Media (Gibco)中で、37℃で1時間インキュベートしながら、加湿低酸素チャンバー（0.8% O2）で低酸素条件に曝した。各ウェルを滅菌PBS（2.7 mMのKCl、1.8 mMのKH2PO4、140 mMのNaCl、10 mMのNa2HPO4、pH 7.4）で3回洗浄して細胞外細菌を除去し、0.1 mg/mLの濃度のゲンタマイシンを含む培地を加え、上記の条件で90分間培養した。PBSで3回洗浄後、細胞を1mLの1% Triton X-100で溶解し、溶解液を滅菌チューブに移した。10倍連続希釈液をプレーティングし、細胞内細菌を計数した。
アスパラギン酸測定
本試験で使用したマウスの糞便内容物中のアスパラギン酸濃度は、アスパラギン酸比色/蛍光測定キット（BioVision社製）を用いて、製造元の説明書に従って評価した。
フマル酸測定
Fumarate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit（BioVision社製）を用い、製造元の指示に従い、本試験で使用したマウスの糞便内容物中のアスパラギン酸濃度を評価した。
病理組織学的スコアリング
盲腸および結腸組織を10％リン酸緩衝ホルマリンで48時間固定し、パラフィンに包埋した。切片（5μm）をヘマトキシリン・エオジンで染色した。染色切片は盲検化し、表S4に示す基準に従って獣医病理学者が評価した。
定量化および統計解析
統計データ解析はGraphpad PRISMを用いて行った。比の倍数変化（細菌競合指数およびmRNAレベル）および細菌数は、統計解析の前に対数変換した。グループ間の差が統計的に有意（p < 0.05）であるかどうかを判定するために、変換したデータに対して、対応のないスチューデントのt検定を使用した。2つ以上の治療法を用いた場合は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にTukey's HSD検定（＞2群間）を行い、群間の統計学的有意差を決定した。病理組織学的差異の有意性は、片側ノンパラメトリック検定（Mann-Whitney）により決定した。
謝辞
Bacteroides thetaiotaomicron, VPI 5482 Δtdk 1XtetR; pNBU2-erm P1TDPP-GH023-ssbfe1株を提供してくれたE. MartensとA. Goodmanに感謝する。W.Y.はNRF基礎科学研究プログラム（2020R1A6A3A03037326）および基礎科学研究所経費（2021R1A6A1A10042944）の助成を受けた。N.G.S.はNIH T32 Training Grant (T32ES007028-46)およびHHMI Gilliam Fellowship (GT15104)の支援を受けた。C.D.S.はNIH T32 Training Grant (T32AI112541)およびNIH Ruth L. Kirschstein Predoctoral Individual Fellowship (1F31AI161882-01A1)の支援を受けた。N.J.F.はNIH T32 Training Grant (T32DK007673)の支援を受けた。M.X.B.はHHMIフリーマン・フラボウスキー奨学生。M.X.B.の研究室での研究は、VDDRC Pilot and Feasibility grant P30 058404、BSF Foundation (2019136)、NIH (R01DK131104-01 and 1R01AI168302-01A1)、The Pew Charitable Trusts (2022-A-19568)、Burroughs Wellcome Fund (022792)の支援を受けた。
著者貢献
構想、W.Y.、N.G.S.、J.K.Z.、M.X.B.、方法論、W.Y.、N.G.S.、J.K.Z.、M.X.B.、調査、W.Y.、N.G.S.、J.K.Z.、M.B.、T.P.T.、J.D.T.、C.D.S.、A.G.M.、N.J.F、およびE.E.O.、執筆-原案、W.Y.、N.G.S.およびM.X.B.、執筆-総説および編集、W.Y.、N.G.S.、J.K.Z.、C.D.S.、N.J.F.、E.E.O.およびM.X.B.、資金獲得、M.X.B.、リソース、M.X.B.、監督、M.X.B.
利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
補足情報
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ドキュメントS1。図S1-S6、表S1-S4、補足文献
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Salmonella Enterica serovar Typhimuriumは、嫌気性呼吸を利用してプロピオン酸を介したコロニー形成抵抗性を克服する。
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ベラスケス E.M.
クター L．
アルカンタラ M.A.
バインドロス M.X.
ティファニーC.R.
他
日和見腸内細菌科細菌は酸素競合を通じてサルモネラのコロニー化を防御する。
Cell Host Microbe. 2019; 25: 128-139.e5
https://doi.org/10.1016/j.chom.2018.12.003
記事で見る
スコープス (131)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
エーベルC.
ワイス A.S.
ヨッフム L.M.
ドゥライ・ラージA.C.
リング D.
フサイン S．
ヘルプ S.
メン C.
クライグリューK.
ギグルM.
他
大腸菌はサルモネラ・チフス菌に対するコロニー形成抵抗性を、文脈依存的な制限炭素源であるガラクチトールの競合によって高める。
Cell Host Microbe. 2021; 29: 1680-1692.e7
https://doi.org/10.1016/j.chom.2021.09.004
論文で見る
日本農芸化学会誌(35)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
北本聡
アルテリ C.J.
ロドリゲス M.
長尾-北本
杉原和彦
ヒンプスル S.D.
バッツィ M.
三好正明
西岡毅
林 A.
他
食餌性l-セリンは、炎症腸内細菌科細菌に競争上の優位性を与える。
Nat. Microbiol. 2020; 5: 116-125
https://doi.org/10.1038/s41564-019-0591-6
論文で見る
スコープス (81)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
リベラ-チャベスF.
チャン L.F.
フェイバーF.
ロペス C.A.
バインドロス M.X.
オルサン E.E.
シュー・G．
ベラスケス E.M.
レブリラ C.B.
ウィンター S.E.
ほか
腸内細菌叢からの酪酸産生クロストリジウムの枯渇は、サルモネラの好気性小腔拡大を促進する。
Cell Host Microbe. 2016; 19: 443-454
https://doi.org/10.1016/j.chom.2016.03.004
論文で見る
スコパス (533)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
プラントJ.
グリン A.A.
マウスにおけるSalmonella typhimurium感染抵抗性の遺伝学的研究。
J. Infect. Dis. 1976; 133: 72-78
https://doi.org/10.1093/infdis/133.1.72
論文で見る
スコープス (202)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ガラン J.E.
カーティス3世、R.
Salmonella typhimuriumの組織培養細胞への侵入を可能にする遺伝子のクローニングとその産物の分子的特徴付け。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989; 86: 6383-6387
https://doi.org/10.1073/pnas.86.16.6383
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クームス B.K.
コバーンB.A.
ポッターA.A.
ゴミス S.
ミラカー K.
リー Y.
フィンレイB.B.
新規ウシ回腸ループモデルとマウス伝染性腸炎モデルを用いたサルモネラ病原性アイランド1および2の腸疾患進行への寄与の解析。
Infect. Immun. 2005; 73: 7161-7169
https://doi.org/10.1128/iai.73.11.7161-7169.2005
論文で見る
日本感染症学会誌 (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラファテル M．
ジョージ M.D.
秋山雄次
ホーンズビー M.J.
ヌッチオ S.P.
パイシャオ T.A.
バトラー B.P.
チュー H．
サントス R.L.
ベルガーT.
他
リポカリン-2耐性菌は、炎症腸管内での増殖と生存においてSalmonella enterica serotype Typhimuriumに優位性を与える。
Cell Host Microbe. 2009; 5: 476-486
https://doi.org/10.1016/j.chom.2009.03.011
記事で見る
スコパス (416)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
スローカム M.K.
パーキンソン J.S.
大腸菌におけるメチル受容性走化性タンパク質の遺伝学：tarおよびtap遺伝子のヌル表現型。
J. Bacteriol. 1985; 163: 586-594
https://doi.org/10.1128/jb.163.2.586-594.1985
論文で見る
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
アイバーソンT.M.
ルナ-チャベスC.
チェッキーニG.
リーズD.C.
大腸菌フマル酸還元酵素呼吸複合体の構造。
Science. 1999; 284: 1961-1966
https://doi.org/10.1126/science.284.5422.1961
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ノグラーディ N.
イムレA.
リヒリクI.
バローP.A.
ナギー B.
嫌気性フマル酸およびアルギニン代謝に関与する遺伝子は、in vitroではサルモネラ腸炎菌の増殖抑制に関与するが、in vivoではニワトリのコロニー形成抑制には影響しない。
Vet. Microbiol. 2003; 97: 191-199
https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2003.08.011
論文で見る
スコープス (10)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ギリス C.C.
ヒューズE.R.
スピガL.
ウィンター M.G.
Zhu W.
フルタド・デ・カルバーリョT.
チャニン R.B.
ベーレントC.L.
フーパーL.V.
サントスR.L.
他
サルモネラの増殖をサポートする乳酸を生成する宿主代謝におけるディスバイオシスに関連した変化。
Cell Host Microbe. 2018; 23: 570
https://doi.org/10.1016/j.chom.2018.03.013
記事で見る
スコパス (19)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
シェルトンC.D.
Yoo W.
シェルトンC.D.
ユー・W.
シーリー N.G.
トーレス T.P.
ジーバ J.K.
カルカット M.W.
フォージング N.J.
キム・D．
キム J.
リュウ S.
他。
サルモネラ・チフスムリウムは、プロピオン酸を介したコロニー形成抵抗性を克服するためにアネオールビン呼吸を利用する。
Cell Rep.
https://doi.org/10.1101/2021.05.25.445690
論文で見る
スコパス (0)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
笹部淳一
三好康弘
ラコフ・ナホウム S.
Zhang T.
Mita M.
デイビス B.M.
濱瀬和彦
ウォルドー M.K.
微生物のd-アミノ酸と宿主のd-アミノ酸オキシダーゼの相互作用が、マウス粘膜防御と腸内細菌叢を修飾する。
Nat. Microbiol. 2016; 1: 16125
https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.125
論文で見る
スコープス (140)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
滝石崇
フェネロ C.I.M.
カマラ N.O.S.
腸管バリアと腸内細菌叢：生涯を通じて私たちの免疫応答を形成する。
組織バリア。2017; 5e1373208
https://doi.org/10.1080/21688370.2017.1373208
記事で見る
スコープス (503)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リン L．
Zhang J.
腸内ホメオスタシスとヒト疾患における腸内細菌叢と代謝産物の役割。
BMC Immunol. 2017; 18: 2
https://doi.org/10.1186/s12865-016-0187-3
論文で見る
スコパス (479)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Li H.
Zhou X.
Huang Y.
Liao B.
Cheng L.
Ren B.
病原体除去における活性酸素：殺傷メカニズム、適応反応、副作用。
Front. Microbiol. 2020; 11: 622534
https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.622534
論文で見る
スコープス (110)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
リム B.
ツィンマーマンM.
バリー N.A.
グッドマン A.L.
ヒト腸内常在菌の遺伝子発現を制御する工学的制御系。
Cell. 2017; 169: 547-558.e15
https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.03.045
論文で見る
スコープス (128)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ガルシア-バヨナL.
コムストック L.E.
ヒト腸内細菌叢からの多様なバクテロイデスおよびパラバクテロイデス分離株の合理的遺伝子操作。
mBio. 2019; 10e01762-19
https://doi.org/10.1128/mBio.01762-19
論文で見る
スコープス (67)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ベンシベンガ-バリーN.A.
リムB.
エレーラ C.M.
トレント M.S.
グッドマン A.L.
野生ヒト腸内バクテロイデスの遺伝子操作。
J. Bacteriol. 2020; 202e00544-19
https://doi.org/10.1128/jb.00544-19
論文で見る
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Zhu W.
ウィンター M.G.
スピガ・L.
ヒューズ E.R.
チャニン R.
ムルガオンカーA.
ペニントン J．
マース M．
ベーレント C.L.
キム J．
et al.
Xenosiderophore Utilization Promotes Bacteroides thetaiotaomicron Resilience during Colitis.
Cell Host Microbe. 2020; 27: 376-388.e8
https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.01.010
論文で見る
スコープス (46)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
スピガL.
ウィンター M.G.
フルタード・デ・カルバーリョT.
Zhu W.
ヒューズ E.R.
ギリス C.C.
ベーレント C.L.
キム J．
チェッサ D．
アンドリュース-ポリメニスH.L.
他
サルモネラが微生物由来のコハク酸を利用できるようにする酸化的中心代謝。
Cell Host Microbe. 2017; 22: 291-301.e6
https://doi.org/10.1016/j.chom.2017.07.018
記事で見る
スコパス (100)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ボーンホフ M.
ドレイク B.L.
ミラー C.P.
サルモネラ菌感染に対するマウスの腸管の感受性に対する抗生物質の効果。
Antibiot. Annu. 1955; 3: 453-455
論文で見る
PubMed
グーグル奨学生
Dejea C.
ウィックE.
シアーズC.L.
大腸における細菌の発癌。
Future Microbiol. 2013; 8: 445-460
https://doi.org/10.2217/fmb.13.17
論文で見る
スコープス (66)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
バルテル M.
ハプフェルマイヤーS.
キンタニージャ-マルティネスL.
クレマー M.
ローデ M.
ホガード M.
プフェッファー K.
リュスマン H.
Hardt W.-D.
マウスをストレプトマイシンで前処理することで、病原体と宿主の両方を解析できるSalmonella enterica serovar Typhimurium大腸炎モデルを提供。
Infect. Immun. 2003; 71: 2839-2858
論文で見る
日本
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ゴー E.B.
ブレッドソー P.J.
チェン L.L.
ジャネーシュワール・P.
スチュワート V.
アイゴ M.M.
大腸菌K-12における嫌気性遺伝子発現の階層的制御：硝酸塩応答性NarX-NarL制御系はフマル酸塩応答性DcuS-DcuR制御系の合成を抑制する。
J. Bacteriol. 2005; 187: 4890-4899
https://doi.org/10.1128/jb.187.14.4890-4899.2005
論文で見る
日本細菌学会誌 (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スチュワート V.
カリ B.M.
Klebsiella pneumoniae M5alにおける硝酸同化の制御にはNarL機能は必要ないことを示す遺伝学的証拠。
J. Bacteriol. 1990; 172: 4482-4488
https://doi.org/10.1128/jb.172.8.4482-4488.1990
論文で見る
スコープス (8)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ビーバウト C.J.
エバリー A.R.
ワービー S.H.
リーゾナー S.A.
ブラノンJ.R.
デ・S．
フィッツジェラルド M.J.
ハギンズ M.M.
クレイトン D.B.
セゲルスキーL．
他
Uropathogenic Escherichia coli（尿路病原性大腸菌）における呼吸器系の不均一性がバイオフィルム形成と宿主コロニー形成を形成する。
mBio. 2019; 10e02400-18
https://doi.org/10.1128/mBio.02400-18
論文で見る
スコープス（54）
クロス
グーグル・スカラー
ストジルコヴィッチ I.
バウムラーA.J.
ヘフロン F.
Salmonella typhimuriumにおけるエタノールアミン利用：cchA cchB eutE eutJ eutG eutH遺伝子クラスターの塩基配列、タンパク質発現、変異解析。
J. Bacteriol. 1995; 177: 1357-1366
https://doi.org/10.1128/jb.177.5.1357-1366.1995
論文で見る
スコープス (266)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
フェイバー F．
トランL.
バインドロス M.X.
ロペス C.A.
ベラスケス E.M.
ケリンズ・T．
ヌッチオ S.P.
ワンディ T.
フィーン O．
ツォリスR.M.
他
宿主を介した糖の酸化は、抗生物質投与後の病原体の増殖を促進する。
Nature. 2016; 534: 697-699
https://doi.org/10.1038/nature18597
論文で見る
スコープス (121)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
キングズレー R.A.
ハンフリーズA.D.
ウィーニングE.H.
デ・ゾーテ M.R.
ウィンター S.
パパコンスタンティノプルー A．
ドウガンG.
バウムラー A.J.
Salmonella Enterica serotype typhimuriumのCS54アイランドの分子生物学的および表現型学的解析：腸内コロニー形成および持続性決定因子の同定。
Infect. Immun. 2003; 71: 629-640
https://doi.org/10.1128/iai.71.2.629-640.2003
論文で見る
スコープス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リベラ-チャベスF.
ウィンター S.E.
ロペス C.A.
ザビエル M.N.
ウィンター M.G.
ヌッチオ S.P.
ラッセル J.M.
ラフリン R.C.
ローホン S.D.
ステルツェンバック T．
他
サルモネラは腸炎から利益を得るためにエネルギータクシーを利用する。
PLoS Pathog. 2013; 9e1003267
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267
記事で見る
スコープス(125)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
サイモン R．
プライファーU.
ピューラーA.
in vivo遺伝子工学のための広範な宿主域動員システム：グラム陰性菌におけるトランスポゾン変異誘発。
Nat. Biotechnol. 1983; 1: 784-791
論文で見る
クロスリファレンス
グーグル奨学生
コロパトキン N.M.
マルテンス E.C.
ゴードン J.I.
スミス T.J.
著名なヒト腸内共生生物によるデンプン異化は、アミロースらせんの認識によって指示される。
Structure. 2008; 16: 1105-1115
https://doi.org/10.1016/j.str.2008.03.017
論文で見る
(260件)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
キングズレーR.A.
ライスブロートR.
ラブシュ W.
ケトリーJ.M.
ツォリスR.M.
エベレスト P．
ドウガン G.
バウムラー A.J.
ロバーツ M.
ウィリアムズ P.H.
サルモネラ菌によるフェリオキサミンを介した鉄（III）利用。
Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 1610-1618
https://doi.org/10.1128/aem.65.4.1610-1618.1999
論文で見る
スコープス (85)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ダツェンコ K.A.
ワナー B.L.
PCR産物を用いた大腸菌K-12の染色体遺伝子の一段階不活化
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97: 6640-6645
https://doi.org/10.1073/pnas.120163297
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シュミーガー H.
ファージP22-トランスダクション能力の増加または減少した変異体
Mol. Gen. Genet. 1972; 119: 75-88
https://doi.org/10.1007/bf00270447
論文で見る
(株)スコープス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ウィンター S.E.
ティエンニミットルP.
ウィンター M.G.
バトラーB.P.
ヒューズビーD.L.
クロフォード R.W.
ラッセル J.M.
ベビンズ C.L.
アダムス L.G.
ツォリスR.M.
他
腸の炎症はサルモネラに呼吸電子受容体を提供する。
Nature. 2010; 467: 426-429
https://doi.org/10.1038/nature09415
記事で見る
スコパス (929)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2024年5月27日
受理受理：2024年5月1日
改訂版受理 2024年3月20日
受理：2024年3月20日受理日：2023年8月8日
出版段階
インプレス、修正校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2024.05.001

著作権
© 2024 The Author(s). 発行：エルゼビア社
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図1AspAを介したアスパラギン酸利用が大腸炎におけるS.
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図2S. Tmによる腸でのアスパラギン酸利用には腸の炎症が必要である
図サムネイルgr3
図3炎症腸内におけるS. Tmによるフマル酸呼吸を支えるアスパラギン酸利用能の増大
図サムネイルgr4
図4炎症腸内のS. Tmにとって食事中のアスパラギン酸は主要な供給源ではない
図サムネイルgr5
図5微生物叢由来のアスパラギン酸は腸炎症中のS. Tmの増殖をサポートする。
図サムネイルgr6
図6宿主由来の活性酸素は腸炎症中の微生物叢由来のアスパラギン酸放出を促進する
図サムネイルgr7
図7アスパラギン酸依存性フマル酸呼吸と硝酸依存性呼吸の相乗効果により、S. Tmは常在細菌である腸内細菌科細菌に打ち勝つことができる。
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