腸肝軸チップにおける腸内細菌由来代謝物および細胞外小胞の肝細胞機能への影響
公開日：2023年1月16日
腸肝軸チップにおける腸内細菌由来代謝物および細胞外小胞の肝細胞機能への影響
Seong Goo Kang, Yoon Young Choi, ...Bong Geun Chung 著者を表示する。
Nano Convergence 10巻 記事番号: 5 (2023) この記事を引用する
171 アクセス数
2 Altmetric
メトリクス詳細
概要
代謝は、腸と肝臓の組織が関与する複雑なプロセスであり、従来の単一細胞培養システムでは試験管内で再現することが困難であった。この課題に取り組むため、我々は、腸上皮細胞チャンバーと3次元（3D）均一サイズの肝臓スフェロイドチャンバーからなる腸肝軸チップを開発した。2つの細胞培養チャンバー区画は、微生物がチャンバーを通過するのを防ぐために、多孔質膜で仕切られました。このhepG2スフェロイドを微生物由来の代謝物で培養したところ、肝スフェロイドの生理機能の変化が観察され、アルブミンと尿素の分泌活性が有意に向上することが示されました。さらに、微生物由来のエキソソームで処理したhepG2スフェロイドの機能検証を行ったところ、腸肝軸チップのhepG2スフェロイドのアルブミンと尿素が有意に増強されることが評価されました。したがって、この腸肝軸チップは、微生物と宿主細胞の相互作用を研究するための強力な共培養プラットフォームとなる可能性がある。
図解要旨
はじめに
腸-肝臓軸は、腸由来産物の処理制御、代謝恒常性の調節、免疫機能の安定化を可能にする生理的な連結システムである。ここ数年、消化管と肝臓のin vitro培養モデルが独立して確立されている[1, 2]。しかし、単一臓器系では、特定の臓器の再現にのみ焦点が当てられており、複雑な細胞間情報伝達を模倣することはできません。さらに、現在のin vitroの細胞ベースのモデルシステムは、in vivoの組織の微小環境を再現することができません。これらの限界を克服するために、多くの研究者が最近、多臓器間の相互作用を研究するための臓器オンチップシステムに注目している[3, 4]。オルガン・オン・チップシステムは，生体組織の環境を模倣することで，高度なin vitroモデルを開発することを目的としている．また，organ-on-a-chipのもう一つの大きな利点は，異なる臓器間の相互作用を実現することである[5]．近年では，腸-肝臓オンチップが統合され，吸収と代謝反応のプロセスが模倣されています[6, 7]．これらの研究の多くは、特定のシグナル経路に基づく特定疾患の炎症反応に焦点を当てたものである。これらの先行研究は、疾患を再現するために適用されたが、腸内細菌由来の代謝物や細胞外小胞（EVs）の影響についてはほとんど調べられていない。現在までに、腸内細菌由来の代謝産物や細胞外小胞を探索するためにorgan-on-a-chipを研究した研究はごくわずかである[8,9,10]。したがって、このような代謝産物やEVがin vivoのような微小環境において細胞機能にどのような影響を与えるかを理解する必要がある。
腸内細菌叢には、約1015個の微生物細胞と2200万以上の微生物遺伝子が存在すると推定されています[11, 12]。これらの遺伝子により，腸内細菌叢は外来性の食事基質や内因性の宿主化合物から多くの酵素を合成することができる[13]．その結果、腸内細菌叢は、幅広い生物活性スペクトルを持つ様々な代謝産物を産生することができる [13] 。これらの微生物代謝産物は、宿主と微生物叢のクロストークにおける重要なアクターである。さらに、これらの分子は、複数の臓器や組織に作用することができます[14]。メタボロミクス解析（質量分析など）の進歩により、短鎖脂肪酸（SCFA）、胆汁酸、コリン代謝物など、多くの腸内細菌叢代謝物が同定されています[15]。これらの代謝産物は，宿主や他の細菌に対して，エネルギー代謝，栄養吸収，腸内細菌叢組成の調節など，一連の生理的・病理的機能を誘導することができる．また、微生物由来の可溶性因子に関する最近の証拠から、様々な代謝産物を含むEVは、微生物コミュニティの他のメンバーとの相互作用に寄与することが示唆されている[16, 17]。ナノサイズのEVは、膜に封入された細胞内物質（例えば、タンパク質、核酸、代謝物）を細胞外環境に拡散させることができる、新しい分泌システムである[18]。EVは，分泌細胞の近傍の細胞に大きな影響を与えることが知られている．EVは、下流シグナルを引き起こすだけでなく、標的細胞に遺伝物質を伝達し、それによって抗炎症、抗アポトーシス、免疫抑制効果を発揮し、組織の修復を促進する[19]。さらに、EVは、広範な種類のシグナルを隣接する細胞に伝達する極めて重要な細胞間輸送担体として機能する[20]。
腸と肝臓は門脈で密接に結ばれており、腸由来の生産物の輸送は小腸と相互作用している[21]。また、腸由来の生産物は、腸管上皮を越えて輸送され、血液中に吸収された後、門脈によって肝臓に到達する[22]。したがって，腸内細菌由来産物が肝細胞に及ぼす影響を理解するためには，organ-on-a-chipシステムによる肝機能の調査が必要である．ここでは、腸内細菌叢由来代謝物およびEVの肝細胞機能への影響を調べるためのgut-liver axis chip systemを開発したことを報告する。腸肝軸チップシステムは、マイクロウェルアレイ内の腸内細菌叢培養チャンバーから3次元均一サイズヘップG2スフェロイドチャンバーへ培養液が移動できるカスケードデザインで構成されていた。セルロース膜で仕切られた2つのチャンバーでは、腸内細菌叢と均一サイズのhepG2スフェロイドを同時に培養することが可能である。そのため、hepG2スフェロイドは、膜で分離されたチャンバー区画の構造により、腸内細菌叢に由来する分子の影響を受けるだけであった。また、均一サイズのhepG2スフェロイドの機能に対するEVの影響をアルブミンと尿素の分析で検討したところ、EVはhepG2スフェロイドの機能に対して影響を与えることがわかった。このように、我々の腸-生体軸チップシステムは、組織化された肝スフェロイド形成のみならず、in vivo-like な微小環境における微生物-宿主細胞相互作用効果の理解にも広く利用できるものと思われる。
材料と方法
腸肝循環軸チップの作製と実験セットアップ
腸肝循環軸チップは Autocad (Autodesk, CA, USA) を用いて設計した。腸と肝臓を埋め込んだオンチップマスターモールドは、既報[23, 24]と同様に2段階のリソグラフィプロセスで作製した。まず，SU-8 100 フォトレジスト（MicroChem Corp., MA, USA）を4インチシリコンウェハ上に2000rpmで30秒間堆積・スピンコートし，65℃ 20分，95℃ 1時間でそれぞれベークした．UVアライナー（MDA-400LJ, Midas System Co. Ltd, Daejeon, Korea）を用いてフォトマスクを介して40秒間紫外線を照射し，未露光フォトレジストを12分間現像してマイクロチャネルを作製した．次に，パターン化したウェハー上にSU-8 100フォトレジストを蒸着し，1000rpmで30秒間スピンコートした後，60秒間紫外線を照射し，現像してマイクロウェルアレイを作製した．ポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースの腸肝軸チップモールドは、シリコーンエラストマーと硬化剤（Sylgard 184、Dow Corning Corp.、MI、米国）の10：1混合物を使用して調製された。このエラストマー混合物を真空デシケーター（Lab Companion, Daejeon, Korea）に30分間入れて気泡を除去した後、80℃で1時間重合させた。浸透圧ポンプは，既報の通り，従来のプロトコルでセルロース膜1面を持つPDMS立方体チャンバー（1×1×1cm）を作製し，浸透圧ポンプを作製した[25]．PDMSチャンバーとセルロース膜の接着は、PDMS溶液を接着剤として使用した。予備実験として、浸透圧ポンプのポンプ能力を評価するために、浸透圧実験を行った。緩衝液には脱イオン水を用い、駆動剤にはポリエチレングリコール（PEG）（Sigma-Aldrich, MO, USA；分子量2000）溶液を使用した。
計算流体力学的解析
COMSOL Multiphysics 6.0（COMSOL, MA, USA）の計算流体力学モジュールを用いて構築した計算機支援有限要素解析（FEA）により、浸透圧送液中の流動分布をシミュレートした。この FEA では，AutoCAD（Autodesk, CA, USA）を用いて 2 次元スケッチを層ごとに設計し，それを COMSOL のモデルビルダーにインポートして 3D モデルを構築しました．この 3 次元モデルの幾何学的パラメータは，Additional file 1: Table S1 に示している．シミュレーションの支配方程式は，非圧縮性 Navier-Stokes 方程式と連続性方程式[26]である．
∂t+(uu⋅∇)uu=-1ρ∇P+μρ∇2uu,
(1)
∇・uu=0
(2)
ここで、uは速度ベクトル、Pは圧力、ρとμはそれぞれ密度と動粘度である。浸透圧はVan't Hoffの式[27]で求めた。
π=CRT,
(3)
ここで，πは溶液の浸透圧，Cは溶液中の溶質のモル濃度，Rはモル気体定数 [≒ 0.082 (L∙atm)/(K∙mol)] であり，Tは絶対温度である。モル濃度0.36MのPEG溶液を採用したため、室温で出口に-8.654atmの浸透圧がかかることになった。
腸肝軸チップの作製と細胞播種
オートクレーブ滅菌（120 ℃、30 分間）した後、オーブン中で乾燥させた。腸肝軸チップの腸チャンバーには1 mg/mL Poly-D-lysine（Sigma Aldrich, MO, USA）を一晩コーティングして細胞接着性を改善し、肝チャンバーには3%(wt/vol) bovine serum albumin (BSA) blocking solutionを一晩コーティングして均一サイズのヘプタG2スフェロイド生成と底面のPDMS表面への細胞接着を抑制した。コーティング後、腸肝軸チップを脱イオン水で3回以上洗浄し、80℃のオーブン中に24時間以上置いた後、培養液を各チャンネルに静かにゆっくりと充填した。ヒト腸管上皮細胞（Caco-2）（ATCC clone HTB-37）およびHepG2細胞は、10％牛胎児血清、非必須アミノ酸、L-グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシンを含む改変イーグル培地で、カルシウムの非存在下で培養された。Caco-2細胞およびHepG2細胞懸濁液（30 μL、7.5 × 105 cells/mL）をマイクロピペットを用いてマイクロチャネルにロードした。浮遊液中の細胞は重力によってマイクロチャネルに流れ込み、自然にマイクロチャネルに捕捉された。細胞懸濁液は均一な密度でマイクロチャネルに供給されるため、各マイクロチャネルに一定量の細胞が配置される。マイクロチャネル内の細胞を安定化させるために、何も処理せずに一晩インキュベーター内に放置した。細胞がマイクロチャネルに付着した後、付着していない細胞を洗浄した。腸チャンバーの出口はフィルターチャネルの入口に接続され、このフィルターチャネルは肝臓チャンバーの入口に戻って接続される。それぞれの入口と出口は、柔軟性のあるポリウレタンチューブで接続した。
免疫蛍光染色
腸肝軸チップで培養した細胞を4% (wt/vol) パラホルムアルデヒドで30分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の 0.1% BSA で5分間2回洗浄し、0.2% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma Aldrich, MO, USA) で30分間透過化させた。その後、一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、3回洗浄した後、二次抗体と90分間インキュベートし、0.1% BSA in PBSで3回洗浄した。以下の抗体を免疫組織化学に使用した：ウサギ抗アルブミンポリクローナル抗体（Invitrogen CA、米国、1:500）、Alexa Fluor 594標識ファロイジン（Invitrogen、米国、1:250）、およびロバ抗ウサギAlexa Fluor 488（Invitrogen、米国、1:1000）。次に、サンプルを4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI；Molecular Probe, OR, USA）とインキュベートして細胞核を可視化してから共焦点顕微鏡画像を撮影した（Olympus, Japan）。
スフェロイド生存率アッセイ
HepG2細胞を腸肝軸チップのマイクロウェルアレイ内に播種し、インキュベーター内で5日または10日間培養して、均一なサイズの3Dスフェロイドを作製する。スフェロイドの生成後、Live/Dead Cell Assay kit (Sigma-Aldrich, Bayswater, Australia) を用いて37℃で20分間染色し、生存率を測定した。カルセイン-AMは細胞膜を透過し、細胞質内のエステラーゼにより加水分解され、蛍光を発することができるカルセイン-AMとなる。ヨウ化プロピジウム（PI）は核酸を染色する色素であり、細胞膜を透過することができない。染色したhepG2スフェロイドを蛍光顕微鏡（IX73、Olympus、日本）で画像化した。
機能評価
微生物由来のエキソソームとhepG2スフェロイドで培養して調整した培地中のアルブミンと尿素の濃度を測定することにより、アルブミンと尿素の分泌を解析した。hepG2スフェロイドは、流体ベースの腸肝軸チップのマイクロウェルアレイ内で培養した。5日および10日間培養後、浸透圧ポンプへのコイル状チューブに回収された培地をアルブミンと尿素の濃度を分析した。
バクテリアの細胞培養とライブ染色
Lactobacillus paracasei HY7014 (HY7014) および Lactobacillus casei HY7207 (HY7207) プロバイオティクスは、hy Co, Ltd. (Yongin-si, Korea) から供給された。(Yongin-si, Korea)から供給された。American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)のLactobacillus paracasei type strain ATCC25302（ATCC25302）およびLactobacillus casei type strain ATCC393（ATCC393）を参照菌株として使用した。L. paracaseiおよびL. casei株をMan, Rogosa and Sharp (MRS) broth (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) で37℃、24時間培養し、その後、遠心分離（4000rpm、10分、4℃）により菌体を採取、PBSで3回洗浄、細胞培養液に再懸濁し、各測定の前に109 CFU/mLで培養を行った。遠心分離（5000 g、15分）により細菌細胞を採取した場合、細胞は2 mLの生培地で再懸濁された。懸濁後，SYTO® 9とPIの等量（各1 mlに対して3 μL）の色素混合物（LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit, L7012, Thermo Fisher Scientific）を添加した。色素混合物を添加した細胞を室温、暗所で15分間インキュベートした。2回の遠心分離と洗浄を行った後、Caco-2セルチャンバーにロードした。
細菌由来EVsの精製。タンジェンシャルフローろ過(TFF)
L. paracasei HY7014およびL. casei HY7207を37℃の1L MRSブロスで24時間培養し、15,970g×10℃で15分間の連続遠心分離によりペレット化した。
で15分間遠心分離した。HY7014とHY7207の培養上清を0.45μmフィルター膜でろ過した。Repligen社製KrosFlo® KR2i TFF System（Spectrum Labs, Los Angeles, CA, United States）と500 kDa cutoff TFF filter module（C02-E500-10-N, Spectrum Labs., MicroKros）を用いて細菌由来EVsの分離を実施した。簡単に言うと、供給流量と膜貫通圧（TMP）はそれぞれ400 mL/minと0.5 barで一定に保たれた。リテンション液は、50倍濃縮のために最終容量20 mLに濃縮された。
チューナブル抵抗パルスセンシング評価
EVの定量とサイズ特性は、Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS) 装置 (Exoid; IZON Science Ltd, Christchurch, New Zealand) を用いて測定した。サイズ範囲での評価には、2種類のナノポア（NP250、NP400、IZON Science Ltd.）を使用した。カルボキシレートポリスチレン校正粒子（CPC200およびCPC500、IZON Science Ltd.）をNP200およびNP400ナノ穴とともに使用して、条件（例：サイズ、濃度）の最適化を図った。すべてのキャリブレーションとサンプル測定は、メーカーが推奨する同条件で実施し、3つの異なる圧力で最低500個の粒子を記録した。取得したデータは、Izon Control Suiteソフトウェア（Izon Control Suite version 3.2.2.268, Izon Science Ltd.）を使用して解析した。
EVの調製・処理および細胞毒性試験
両微生物由来のEVを10×1010粒子/mLストック溶液として培養液に作り上げた。その後、両EVを適切な最終濃度となるように培養液で希釈した。マイクロウェルアレイ内で培養したhepG2スフェロイドに、0.1、1、10×109粒子/mL濃度で10日間まで処理した。培養後、細胞培養液は96ウェル平底プレートで光学的に透明な対応するウェルに移した。LDH活性はCytotoxicity Detection Kit (ThermoFisher, MA, USA)を用いて、製造者の手順に従って測定した。最後に、各サンプルの基準波長を690 nmとした490 nmにおけるODを測定した。LDHは可溶性の細胞質酵素であり、膜の完全性が失われた後、培養液中に放出される。LDH活性は、細胞生存率の指標として用いることができる。LDH放出の割合は、2％Triton X-100で処理できた細胞に提示されたLDHの総量と比較して、培地中に放出されたLDHの割合として表された。それは以下の方法で見積もられた。
細胞毒性(%)=Treatedgroup-LowcontrolHighcontrol-Lowcontrol×100
(4)
統計解析
データは平均値±標準誤差(SEM)で示した。P値は、Studentのt検定または一元配置分散分析に続いてTukeyのポストホック検定を使用して分析した（GraphPad Prism version 8.0, GraphPad Software Inc.サンディエゴ、カリフォルニア、USA）。対照群と実験群との間の差は、統計的に有意であるとみなした（*p < 0.05, **p < 0.01）。野生型と実験用プロバイオティクス間の差は、統計的に有意であるとみなした（†p < 0.05, †p < 0.01）。さらに、微生物叢由来EV間の差は、統計的に有意であるとみなした（§p < 0.05）。
結果および考察
腸肝軸チップの開発と数値流体力学的解析
ヒト腸管微小環境における微生物叢由来低分子の肝臓への相互作用を調べるため、腸肝軸チップを開発した（図1A）。腸-肝臓軸チップは、腸細胞チャンバー、膜埋め込み型物質輸送チャンネル、hepG2スフェロイドチャンバーの3つのコンパートメントから構成されています。腸管チャネル（幅 6 mm、長さ 20.5 mm、高さ 100 μm）は Caco-2 細胞培養用に設計され、マイクロピラーは細胞が均一に分布するように設計されている。腸管内の流れは膜付き物質移動チャネルに導かれる。腸内細胞や微生物叢はセルロース膜で遮断される。一方、培養液と代謝物は膜を通過し、hepG2スフェロイドチャンバーに移動する。hepG2 スフェロイドチャンネル（幅 6 mm、長さ 20.5 mm、高さ 100 μm）においても、細胞が均一に分布するようにマイクロピラーを設計し、均一なサイズの hepG2 スフェロイドを生成するために 297 枚のマイクロウェルアレイ（直径 200 μm、高さ 150 μm） を設計しています。培養液の流路には浸透圧ポンプを使用し、生体内のヒト腸管内腔と肝臓の相互作用から生じる流体の流れを模倣した。
図1
図1
A 腸肝軸チップの実験セットアップの模式図。左側のチャンバーは、ヒト上皮細胞であるCaco-2細胞を用いて腸管内腔を構築するために使用された。右側のチャンバーにはマイクロウェルアレイがあり、3次元均一サイズのhepG2スフェロイドを作製するために使用された。培養液は浸透圧ポンプで連続的に供給される。B 腸と肝臓のスフェロイドチャンバーの模式図、および微生物と3D hepG2 スフェロイドがセルロース膜で分離された腸肝軸チップの左腸チャンバーと右肝臓チャンバーに存在することを示す代表的な免疫蛍光の結果です。スケールバーは100μm
フルサイズ画像
浸透圧ポンピング時の流量分布をFEAで推定しました。FEA の結果、腸チャンバーと肝チャンバー間の流速分布が類似していることが分かりました（図 2A）。腸チャンバー(図2B)と肝チャンバー(図2C)において、線a、b、c、dの速度プロファイルをプロットしたところ、両チャンバーとも1行目の速度プロファイルは、腸チャンバーと肝チャンバーで異なっていました。両チャンバーとも、流体が流入する最初のラインは、他のラインと比較して、端部でスパイクアップするような異なるプロファイルを示したが、これはその最初のラインの流体が非定常状態であったためである。定常状態になると、速度分布はライン間でかなり均一化された。また、今回の FEA で注目すべきは、速度分布の大きさがほとん ど変わらない平坦な領域が存在することです。ポアズイユの法則によれば、円管や無限壁の平行平板の速度分布は放物線になり得ます[28, 29]。しかし、我々の腸肝軸チップの両チャンバーは、アスペクト比が大きい（600：1）長方形の形状をしている。矩形断面（w > h）の速度分布の理論解は、Navier-Stokes方程式をフーリエ級数で展開することにより導き出すことができた[30]。
vx(y,z)=4h2ΔPπ3μL∑∞n,odd1n3[1-cosh(nπyh)cosh(nπwh)]sin(nπzh),
(5)
ここで、L, h, w はそれぞれ矩形流路の長さ、高さ、幅を意味する。有限壁によるエッジ効果が速度分布の放物線状発展を阻害するため、矩形チャネル内の速度分布は長幅では中央部に平坦な領域を示し、短高では放物線状になることが明らかにされた。多くのマイクロ流路はアスペクト比が大きいため、この腸肝軸チップは、流路の位置によらず均一な流量を供給できる利点がある。また、流体層間に膜を介在させると、両培養槽内の流量が約23%減少することが確認された（Fig.2D）。浸透圧ポンプは圧力による流れを発生させるため、膜の挿入による流路抵抗の増大は、流量の低下につながる可能性がある。興味深いことに、膜の孔径や気孔率といった膜の特性は流量に影響を与えず（Additional file 1: Fig.S1A, B）、膜の種類は流量分布の一面において重要ではないことが示された。さらに、肝臓チャンバーでは腸チャンバーよりも流量が少なかったことから、液体の一部がマイクロウェルアレイに流れ込んでいることが示された。それは、マイクロウェルアレイ上部の速度プロファイル（Fig. 2E）およびマイクロウェルアレイの深さ方向の平均流量プロファイル（Fig. 2F）により示された。特に、マイクロウェルアレイの上部の滑り速度が類似していることから、ほぼ均一な流体がそれぞれのマイクロウェルに流入していることが示された。
図2
図2
腸肝軸チップシステムにおける浸透圧ポンプ作動中の流動分布解析のための計算流体力学シミュレーションモデル。A 腸肝軸チップ内の流動分布。B 腸チャンバー内の速度プロファイル。各データセットは、Aでマークしたそれぞれのカットラインa、b、c、dから抽出したもの。D メンブレンを挿入した場合としない場合の平均流速の差を示す比較グラフ。メンブレンの挿入により、平均流速が約23%減少している。E マイクロウェルアレイの上部の速度プロファイル。F マイクロウェルアレイ内部の上部から下部にかけての平均流速プロファイル
フルサイズ画像
プロバイオティクスに対する生理的流速の影響
腸肝軸チップシステムの長期培養に対する安定性を明らかにするために、フロー培養条件下での常在細菌の付着とコロニー形成を検討した。細菌の過剰増殖は急速に起こり（～1日以内）、上皮層を損傷する[31, 32]。そのため、微生物と宿主細胞の相互作用をより確実に再現するために、長期培養を実現し、細菌の過剰繁殖を回避することが求められている。我々は、Caco-2細胞と微生物叢を生理的に適切な管腔流の存在下で培養することができる腸肝軸チップを採用した。本研究では、L. paracase HY7014 プロバイオティクスと L. casei HY7207 プロバイオティクスを採用し、コントロールとして各株の野生型も使用しました。最初の2時間は流体の流れを遮断し、細菌細胞を絨毛の頂膜表面に付着させた。2時間後、生理的関連性のある流れをマイクロチャネルを通して再開し、未コロニー化のプロバイオティクスを除去した。緑色蛍光染色したプロバイオティクスの実験室株を静置状態で2時間絨毛の先端面に付着させると、その後、菌細胞がコロニーを形成し、生息域が自然に形成された（Fig.3）。当研究グループ[33]で報告したように、あらかじめ最適化したフロー条件（21μL/h）でプロバイオティクスを絨毛上皮層に培養したところ、すべてのプロバイオティクス群で5日目までコロニー化した安定型が観察された。しかし、野生型プロバイオティクスは、実験型プロバイオティクスと比較して、フロー条件下で培養した場合、内腔流量は一定であったものの、10日後には上皮層から剥離し、洗い流されたようであった。上皮層への接着はすべての種で見られた。しかし、実験用プロバイオティクスは、10日目には野生型プロバイオティクスよりも上皮層への接着が大きくなった。これらの結果から、我々の腸肝軸チップでは、流体フローにより、細菌の過剰繁殖を防ぎながら、上皮細胞およびコロニー形成された微生物叢の連続培養が可能であることが示された。
図3
図3
腸肝軸チップにおけるヒト腸管上皮層への微生物共培養。腸肝軸チップ内で培養した上皮層の表面に野生型と実験型両方の微生物を培養した（HY7014とHY7207プロバイオティクス；野生型のコントロールとしてHY7014wとHY7207w；播種密度1 × 109 CFU/mL）。5日および10日間共培養したプロバイオティクスとCaco-2細胞を低倍率および高倍率（白点線の四角）で上から見た緑色蛍光図。連続的な流動性に曝した後も上皮層の頂膜表面にしっかりと付着している微生物のマイクロコロニー（緑の点）を示している。スケールバーは100 μm
フルサイズ画像
流動培養条件下で培養したHepG2スフェロイドの形態観察および生存率
腸肝軸チップのマイクロウェルアレイ内で均一なサイズのHepG2スフェロイドの生物学的特徴を検討した。マイクロウェルアレイにHepG2細胞を懸濁液として均一に充填し、その後、マイクロウェルアレイ内で均一なサイズのHepG2スフェロイドが形成されるように、細胞を流動灌流なしでインキュベーター内で一晩培養した。マイクロウェルアレイで培養されたhepG2細胞は、物理的に拘束され、均一な大きさで自発的にスフェロイドを形成しており、これは他の先行研究 [34, 35]と一致していました。図 4 に示すように、流体フローにより、表面が滑らかな hepG2 スフェロイドが形成され、10 日後もその形態的特徴が維持されていることが光学画像で確認されました。流体培養状態でのスフェロイドの生存率を確認するために、5 日間と 10 日間の生死細胞生存率アッセイを実施した。(図4）5日間および10日間培養した後の流動培養条件下でのhepG2スフェロイドの生存率は、それぞれ約100％および91％でした（追加ファイル1：図S2）。また、流体培養したhepG2スフェロイドの生存率は、静置培養したスフェロイドの生存率（静置培養ではそれぞれ94％、24％）よりも高く、流体培養により、均一なサイズの3DヘプタG2スフェロイドの生存率を高めることができることが示唆されました。さらに、静置培養したhepG2スフェロイドは、10日間培養してもスフェロイドの形状を維持することができませんでした。この結果は、この腸肝軸チップが、長期灌流培養において、スフェロイドの損失を最小限に抑え、細胞の形態と生存率を維持できることを明確に示しています。
図4
図4
腸肝軸チップで5日および10日間培養した後のマイクロウェルアレイ内のHepG2スフェロイド形成。マイクロウェルアレイ内に形成されたhepG2スフェロイドの光学顕微鏡写真。フローおよび静置培養後のスフェロイド像（生細胞は緑、死細胞は赤で染色）。スケールバーは50μm
フルサイズ画像
腸内細菌叢を介した代謝培地の肝スフェロイド機能への影響
腸内細菌叢および腸内細菌叢由来の代謝産物は、宿主の生理機能の維持に重要な役割を担っている。特定の微生物叢由来代謝物の有益または有害な効果は、文脈と宿主の状態に依存する[36]。hepG2スフェロイドと腸内細菌叢由来代謝物の関係を明らかにするため、（1）コントロール（N.T）、（2）HY7014、（3）HY7014野生型（HY7014w）、（4）HY7207、（5）HY7207野生型（HY7207w）の5実験群を設定しました。腸内細菌叢共培養区画とhepG2スフェロイド培養区画を多孔質膜で分離し、代謝された物質のみによる影響を受けることが可能なようにした。様々な種類の腸内細菌叢由来代謝物質添加培地で培養したhepG2スフェロイドの性能を、分泌アルブミン濃度および尿素濃度の測定により比較し、マイクロビオタの種類に依存した有意な差異を示しました。5つのモデルのうち、コントロールと両ワイルドタイプ群は、5日間で最も急速に肝細胞特異的な機能を喪失した。hepG2スフェロイドのアルブミン分泌は10日目にある程度回復したが、有意な差はなかった。一方、HY7014およびHY7207群は、対照群および野生型群よりも長期間にわたって機能が改善された。HY7014およびHY7207の両実験プロバイオティクス群の肝臓スフェロイドは、培養10日後に対照スフェロイドよりも大きなアルブミン産生量を示した（Fig.5A）。さらに、HY7207グループは、10日後に最高のアルブミンおよび尿素産生を示した（それぞれ、**p < 0.01, *p < 0.05）（Fig. 5B）。実験グループと野生型グループを比較すると、実験グループでアルブミンと尿素の分泌量が有意に増加した。その結果、HY7207群は他の群と比較して、優れた肝機能を示すことが実証されました。近年、ポストバイオティクスとして知られるプロバイオティクス二次代謝産物は、疾病予防のようにヒトに有益な物質である可能性があるため、大きな関心を集めている[37]。したがって、HY7207プロバイオティクスは、肝細胞のアポトーシスおよび肝細胞における脂質の蓄積を抑制し、肝細胞を保護することができた[38]。したがって，これらの結果は，異なる種類の微生物叢から駆動される代謝物が，様々なメカニズムを介して肝細胞の機能維持に影響を与える可能性があることを実証した．
図5
図5
A 10日間共培養した微生物スフェロイドの血清アルブミン（緑色）の免疫染色。核はDAPI（青）で染色した。スケールバーは50μm。B 微生物共培養スフェロイドの機能を、アルブミン（左）および尿素（右）の分泌量で測定した分析。データは3つの独立した実験の平均±標準誤差（SEM）として表される。対照対各群で *p < 0.05, 対照対各群で **p < 0.01, そして野生型対各実験微生物群で ††p < 0.01
フルサイズ画像
腸内細菌叢由来EVのキャラクタリゼーション
腸内細菌叢の上清を採取し、TFF法によりEVを単離した。HY7014とHY7207の培養上清に250nmサイズのナノ多孔質膜（NP250）を通して、異なる圧力をかけながら試料を駆動するTRPSシステムで、実際に得られる粒子の数とサイズを評価した。その結果、HY7014では50～600 nm、HY7207では50 nm～550 nmのサイズの粒子が検出された。HY7014は、培養液中で少なくとも2×1011個/mLの50 ~ 600 nmのサイズの細胞質膜からなるEVを生成した。HY7207は、50～550 nmの大きさの細胞質膜からなるEVを少なくとも5×1011個/mL生産した（図6A）。Lactobacillus acidophilus ATCC 53544，L. casei ATCC 393，L. reuteri ATCC 23272は，各培地中で3 × 109から1 × 1010個/mLのEVを生成することが以前に報告されている[39]．培養液中で検出された両微生物のEVの濃度は、これらの乳酸菌のEVの濃度よりも高いことが確認された。さらに、エクソソームのサイズ分布を解析したところ、HY7014とHY7207の平均ベシクル直径はそれぞれ100.7 nmと97.3 nmであることが示された。さらに、各微生物由来のEVのモード径は、それぞれ79.7 nmと71.3 nmであることが明らかになった（表1）。真核生物のEVに対して、細菌由来のEVのサイズは、既報の通り、直径300 nm以下が専らである[40]。我々は、韓国HY社から提供された細菌由来のEVのサイズは、以前の結果と一致することを確認した。
図6
図6
微生物叢由来の細胞外小胞の特性評価。A TRPSシステムで解析したエクソソーム濃縮EVサンプルのサイズ分布解析。B様々な濃度のEV（0.1×109〜10×109粒子/mL）で処理した後、LDH放出として測定した生存細胞の割合、データは4つの独立した実験の平均±SEMとして表されている。コントロールと各グループの比較では、*p < 0.05。
フルサイズ画像
表1 EVのSze分布解析
原寸大表
腸内細菌叢由来EVのhepG2スフェロイドの機能に対する影響
現在、EVの毒性や免疫原性については、まだ理解が不十分である[41, 42]。そのため、EVの安全性と毒性プロファイルを深く理解する必要がある。肝細胞の生存率に影響を及ぼす微生物由来のEVの潜在的な生物学的特性を明らかにするために、HepG2細胞を様々な濃度のEV（0.1 × 109から10 × 109粒子/mL）で処理し、細胞生存率と肝機能を分析しました。EVと5日および10日間培養した後、放出されたLDHで評価したHepG2細胞の生存率は、異なるEV用量間で同程度であった（図6B）。実際、EV処理はHepG2細胞の生存率に有害な影響を与えなかった。しかし、10日間のEV最高濃度（10×109粒子/mL）では、コントロールと比較して、適度な毒性効果が観察された。次に、異なる種類の微生物由来EV処理後のHepG2細胞の機能活性を、免疫染色とアルブミンおよび尿素分泌の定量化により評価した。EVs処理したhepG2スフェロイドは、培養10日後にEVsなし（コントロール）スフェロイドよりも高いアルブミン産生量を示した（図7A）。この結果は、アルブミンと尿素の分泌量の定量分析でも確認され、EVs処理hepG2スフェロイドでは、EVsなし（コントロール）スフェロイドよりもアルブミンの分泌が多いことが分かりました（Fig.7B）。また、全てのEVs処理スフェロイドのアルブミン分泌量は、培養5日目よりも10日目の方が有意に向上した（**p < 0.01）が、異なる種類のEVsを処理した場合のアルブミン分泌量に有意差はなかった。さらに、5日目および10日目の尿素濃度において、微生物叢由来EVで処理したhepG2スフェロイドは、EVを含まないスフェロイドと比較して、尿素合成量が有意に高い値（5日目で最大5.1mg/dL、10日目で最大5.5mg/dL）を示した。さらに、HY7207由来EVで処理したhepG2スフェロイドの尿素濃度は、HY7014由来EVで処理したスフェロイドと比較して有意に高かった（*p < 0.05）。EVs処理したhepG2スフェロイドが尿素合成の高い値を示したことは、EVsを含まないスフェロイドと比較して、より高い機能性を示していることを示しています[43]。微生物由来のEVは、細胞間の生物活性化合物の移動に有用なトランスポーターとして知られています[44,45,46]。エンドソーム由来の小膜小胞であるエクソソームは、細胞間コミュニケーションのメディエーターとして重要な役割を持ち、受容細胞の多くの経路に影響を与えることが知られている[47,48]。しかし、EVは、その生合成を通じて、様々な細胞由来の生物活性カーゴを含むことができ、毒性および免疫刺激などの受信細胞における望ましくない効果を引き起こす可能性を有する[49, 50]。我々の結果は、EVの存在下では、EVの濃度に関わらずhepG2スフェロイドの機能が損なわれず、10日間の処理後も細胞毒性の兆候がないことを明確に示していた。これらの結果は、微生物叢由来のEVが、生存率や機能といった細胞の挙動や反応に積極的に関与している可能性を示唆するものであった。
図7
図7
A 各種微生物由来EVで10日間処理したhepG2スフェロイドの血清アルブミン（緑）に対する免疫染色。核はDAPI（青）で染色した。スケールバーは50μm。B アルブミン（左）および尿素（右）の分泌の観点から測定した微生物共培養スフェロイドの機能の解析。データは3回の独立した実験の平均±SEMで表される。コントロール対各グループでは*p < 0.05、コントロール対各グループでは**p < 0.01、HY7014 Exo 対 HY7207 Exoでは§p < 0.05
フルサイズ画像
結論
腸肝軸チップにおいて、微生物叢由来の低分子化合物処理により、細胞生存率および肝機能が有意に向上することを実証した。また、微生物由来のEVを単離し、hepG2細胞の生存率や肝機能の維持に好影響を与えることを確認した。また、これらの微生物叢由来低分子は、レシピエント細胞内のアルブミンや尿素の分泌を変化させることが確認された。したがって、我々の腸肝軸チップは、微生物叢由来小分子とレシピエント細胞との相互作用を研究するための有用かつ効率的な共培養プラットフォームを提供することができるであろう。
データ・資料の公開
すべてのデータは提出原稿に記載されているため、著者らが共有するデータはない。
略語
GI:
Gastrointestinal（消化管
EVs:
細胞外小胞（Extracellular vesicle
SCFAs:
短鎖脂肪酸
Caco-2：腸管上皮細胞
腸管上皮細胞
TFF:
タンジェンシャルフローろ過
TRPS:
チューナブル抵抗パルスセンシング
LDH:
乳酸脱水素酵素
参考文献
A. Bein, W. Shin, S. Jalili-Firoozinezhad, M.H. Park, A. Sontheimer-Phelps, A. Tovaglieri, A. Chalkiadaki, H.J. Kim, D.E. Ingber, Cell Mol. Gastroenter. 5, 659 (2018)
Google Scholar
C. Beaurivage, A. Kanapeckaite, C. Loomans, K.S. Erdmann, J. Stallen, R.A.J. Janssen, Sci. Rep. 10, 21745 (2020).
論文
Google Scholar
A. スカーダルら、Sci.Rep.7, 8837 (2017)
論文
Google Scholar
C. Zhang, Z.Q. Zhao, N.A.A. Rahim, D. van Noort, H. Yu, Lab Chip 9, 3185 (2009).
論文
CAS
Google Scholar
C. オレアガら、Sci.Rep.6, 20030 (2016)
論文
キャス
Google Scholar
V. De Gregorio, M. Telesco, B. Corrado, V. Rosiello, F. Urciuolo, P.A. Netti, G. Imparato, Front. Bioeng. Biotechnol. 8, 163 (2020)
論文
Google Scholar
S.Y. Lee, J.H. Sung, Biotechnol. Bioeng. 115, 2817 (2018)
論文
キャス
Google Scholar
E. Garcia-Gutierrez、P.D. Cotter、Crit. Rev. Microbiol. 48, 463 (2022)
論文
Google Scholar
F. Siwczak, E. Loffet, M. Kaminska, H. Koceva, M.M. Mahe, A.S. Mosig, Front. Immunol. 12, 798552 (2021)
論文
CAS
Google Scholar
G.H. Wu et al., Bio-Des. Manuf. 5, 437 (2022)に掲載されました。
論文
CAS
Google Scholar
E. Thursby, N. Juge, Biochem. J. 474, 1823 (2017)
論文
キャス
Google Scholar
J.J.Qinら、Nature 464, 59 (2010)。
論文
CAS
Google Scholar
J. Xu, H.B. Chen, S.L. Li, Med. Res. Rev. 37, 1140 (2017)に掲載されました。
論文
Google Scholar
J. Liu, Y. Tan, H. Cheng, D. Zhang, W. Feng, C. Peng, Aging Dis. 13, 10.14336 (2022)
Google Scholar
T.S. Postler, S. Ghosh, Cell Metab. 26, 110 (2017)
論文
キャス
グーグル スカラー
M. Yáñez-Mó et al., J. Extracell. Vesicles 4, 27066 (2015) に掲載されました。
論文
グーグル スカラー
E. ホッセイニ・ベヘシュティら、Oncotarget 7, 14639 (2016)
Article
Google Scholar
Y. Zhang, Y.F. Liu, H.Y. Liu, W.H. Tang, Cell Biosci. 9, 19 (2019)
記事
グーグル スカラー
M. 柿崎ら、Cell Death Dis. 12, 1010 (2021)
論文
Google Scholar
G. Cesi, G. Walbrecq, C. Margue, S. Kreis, Cell Commun. シグナル 14, 13 (2016)
Article
Google Scholar
A. Albillos, A. de Gottardi, M. Rescigno, J. Hepatol. 72, 558 (2020)
論文
キャス
グーグル スカラー
L. Tomasova, M. Grman, K. Ondrias, and M. Ufnal, Nutr. Metab. 18 (2021).
H.K. Choi, C.H. Kim, S.N. Lee, T.H. Kim, B.K. Oh, Nano Converg. 8, 40 (2021)
論文
CAS
Google Scholar
H.N. Lee, Y.Y. Choi, J.W. Kim, Y.S. Lee, J.W. Choi, T. Kang, Y.K. Kim, B.G. Chung, Nano Converg. 8, 35 (2021)
論文
CAS
Google Scholar
J.Y. Park, C.M. Hwang, S.H. Lee, S.H. Lee, Lab Chip 7, 1673 (2007)
論文
CAS
Google Scholar
L. Quartapelle, Numerical solution of the incompressible Navier-Stokes equations (Springer Science & Business Media, 1993), Vol.113.
T. Ghosh, A. Ghosh, J. Appl. Pharm. Sci. 1, 38 (2011)
Google Scholar
E. Gabrys, M. Rybaczuk, A. Kedzia, Chaos Solitons Fractals 27, 1 (2006).
論文
Google Scholar
S.A. Lee, Y. de No, E. Kang, J. Ju, D.S. Kim, S.H. Lee, Lab Chip 13, 3529 (2013)
論文
CAS
Google Scholar
H. ブルース、Lab Chip 11, 3742 (2011)
論文
CAS
Google Scholar
H.J. Kim, D. Huh, G. Hamilton, D.E. Ingber, Lab Chip 12, 2165 (2012).
論文
CAS
Google Scholar
L. Sardelli, S. Perottoni, M. Tunesi, L. Boeri, F. Fusco, P. Petrini, D. Albani, C. Giordano, Biotechnol. Bioeng. 118, 2886 (2021)
論文
CAS
Google Scholar
M.S. Jeon et al., Nano Converg. 9, 8 (2022)
論文
CAS
Google Scholar
Y. 酒井宏樹, 中澤一彦, Acta Biomater. 3, 1033 (2007)
論文
CAS
Google Scholar
Y. Sakai et al., J Biosci. Bioeng. 110, 223 (2010)
論文
CAS
Google Scholar
P. Sittipo, J.W. Shim, Y.K. Lee, Int. J. Mol. Sci. 20, 5269 (2019)に掲載されました。
論文
Google Scholar
M. Chávarri, L. Diez-Gutiérrez, I. Marañón, and L. J. R. Barron, in Advances in Probiotics (Elsevier, 2021), pp.259.
H. 大久保ら、Am. J. Physiol. Gastrointest. 肝臓 Physiol. 305, G911 (2013)
論文
CAS
Google Scholar
S.N. Dean, D.H. Leary, C.J. Sullivan, E. Oh, S.A. Walper, Sci. Rep. 9, 877 (2019).
論文
Google Scholar
L. Brown, J.M. Wolf, R. Prados-Rosales, A. Casadevall, Nat. Rev. Microbiol. 13, 620 (2015)
論文
キャス
Google Scholar
X. Zhu et al., J. Extracell. Vesicles 6, 1324730 (2017) に掲載されました。
論文
Google Scholar
S. Maji, I.K. Yan, M. Parasramka, S. Mohankumar, A. Matsuda, T. Patel, J. Appl. Toxicol. 37, 310 (2017)
論文
キャス
Google Scholar
M.T. Donato, A. Lahoz, S. Montero, A. Bonora, E. Pareja, J. Mir, J.V. Castell, M.J. Gomez-Lechon, Cell Transplant 17, 1211 (2008).
論文
Google Scholar
M.C. Deregibus, V. Cantaluppi, R. Calogero, M. Lo Iacono, C. Tetta, L. Biancone, S. Bruno, B. Bussolati, G. Camussi, Blood 110, 2440 (2007).
論文
CAS
Google Scholar
H. ヴァラディ、K. エクストローム、A. ボシオス、M. シェストランド、J.J. リー、J.O. ロットバール、Nat. Cell Biol. セルバイオロジー 9, 654 (2007)
論文
CAS
Google Scholar
G. Raposo, W. Stoorvogel, セルバイオロジー誌 200, 373 (2013)
論文
CAS
Google Scholar
C. Bang, T. Thum, Int. J. Biochem. Cell B 44, 2060 (2012)
論文
CAS
Google Scholar
L.M. Doyle, M.Z. Wang, Cells 8, 727 (2019).
Article
キャス
Google Scholar
X.T.T. Dang, J.M. Kavishka, D.X. Zhang, M. Pirisinu, M.T.N. Le, Cells 9, 2191 (2020).
論文
CAS
Google Scholar
N. Diaz-Garrido, C. Cordero, Y. Olivo-Martinez, J. Badia, L. Baldoma, Int. J. Mol. Sci. 22, 2213 (2021)
論文
CAS
Google Scholar
参考文献のダウンロード
謝辞
該当事項はありません。
資金提供
本研究は、韓国hy社（助成番号2022-00035）の支援を受けて実施した。
著者情報
著者ノート
Seong Goo KangとYoon Young Choiは、この研究に等しく貢献した。
著者および所属
西江大学校医用工学部，04107，Korea
Seong Goo Kang
西江大学統合バイオテクノロジー研究所（韓国ソウル市、04107
Yoon Young Choi & Bong Geun Chung
R&Bセンター、HY社、韓国、ヨンイン・シ
Sung Jun Mo, Dong Ki Hong, Hayera Lee, Soo Dong Park, Jae-Jung Shim & Jung-Lyoul Lee.
西江大学校機械工学科，04107 韓国ソウル市
Tae Hyeon Kim, Jang Ho Ha & Bong Geun Chung
貢献度
SGKとYYCが実験設計とデータ解析を行い、この研究に均等に貢献した。さらに、SGK、YYC、SJM、DKH、JHHが原案作成にあたった。SGKは細胞株と微生物細胞の維持管理を行った。SJM、DKH、HLは、微生物由来のEVを分離し、EVの分布を解析した。THKは、腸肝軸チップの計算機シミュレーションとデータ解析を行った。JHHは腸肝軸チップの作製を行った。SDP、J-JS、J-LLはプロジェクトの運営を行った。BGCはプロジェクトの監督とデータ解析を行った。原稿は全著者が読み、投稿を承認した。
共著者
Bong Geun Chungにご連絡ください。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
該当なし
競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル1.
表S1. 3次元数値流体力学モデルの幾何学的パラメータ。図S1.膜の(A)孔径と(B)孔隙率による比較グラフ。図S2. hepG2スフェロイドの生存率に対する流体の流れの影響。
権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
CrossMarkで通貨と真正性を検証する
この記事の引用
Kang, S.G., Choi, Y.Y., Mo, S.J. et al. Effect of gut microbiome-derived metabolites and extracellular vesicles on hepatocyte functions in a gut-liver axis chip (腸肝軸チップにおける腸内細菌由来代謝産物と細胞外小胞の肝細胞機能への影響). Nano Convergence 10, 5 (2023). https://doi.org/10.1186/s40580-022-00350-6
引用元をダウンロード
受付終了
2022年10月18日
Accepted
2022年12月01日
公開日
2023年1月16日発行
DOI
https://doi.org/10.1186/s40580-022-00350-6