細菌外膜ベシクルの腸内恒常性制御における多様性

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細菌外膜ベシクルの腸内恒常性制御における多様性
XINYUE WANG HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-5848-8358, SISI LIN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-2027-8993, [...], AND JINYAO LIU HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-6044-2033+5 authors著者情報・所属先
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2023年3月15日
第9巻 第11号
DOI: 10.1126/sciadv.ade5079
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外膜小胞（OMV）は、細菌の種内・種間コミュニケーションに重要な役割を担っている。しかし、腸内細菌叢由来のOMVの腸内における細胞外メカニズムについては、まだ十分に解明されていない。我々は、Akkermansia muciniphilaから放出されたOMVが、（i）膜融合により選択的に善玉菌の増殖を促進し、乱れた腸内細菌叢のバランスを回復する、（ii）パイエル板へ移動し、その後B細胞や樹状細胞を活性化して粘膜免疫グロブリンA反応を誘発する、（iii）腸上皮細胞へ侵入しタイトジャンクションや粘液発現を刺激し腸のバリアを完全に維持できることを報告した。腸内細菌に関連するOMVを腸に移植することで、腸のホメオスタシスを調整することにより、大腸炎を緩和し、大腸がんに対する抗プログラム細胞死タンパク質1療法を強化できることを実証しました。本研究は、腸内生態系における腸内細菌叢由来のOMVの重要性を明らかにし、疾患介入および治療のための代替ターゲットを提供するものです。
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腸内細菌叢は、腸内および全身の恒常性維持に極めて重要な因子として浮上している(1)。腸内生態系では、上皮障壁の存在により、微生物と宿主の双方向のコミュニケーションは、細胞間の直接接触によって媒介されることはほとんどありません（2）。数多くの研究により、細菌の代謝物が微生物と宿主の相互作用を媒介することが証明されている（3-5）。例えば、クロストリジウムが産生する酪酸は、大腸制御性T細胞を刺激し、それによって宿主の炎症反応を抑制することが報告されている(4)。また、腸内細菌によって修飾された胆汁酸は、肝腫瘍におけるナチュラルキラーT細胞の蓄積を制御できることが証明されている（5）。腸内細菌と宿主の間の複雑なクロストークは、間違いなく多方向かつ相互作用的であり、細菌から分泌される最も特徴的な誘導体がそれらの相互作用に関与している可能性を示唆している。グラム陰性菌は通常、増殖中に外膜小胞（OMV）を放出する。OMVは、大きさが20〜400nmの二層膜のナノ構造で、核酸、タンパク質、酵素、リポポリサッカライド（LPS）などの複数の親成分を含んでいる（6）。このような特徴を持つOMVは、微生物-微生物間、宿主-微生物間の相互作用において重要な役割を果たす可能性があります。近年、マウスを用いた研究により、病原性細菌や操作された常在菌が産生するOMVが、宿主のバリアーを通過して免疫賦活反応を引き起こすという役割が明らかになりました（7, 8）。ファージによる捕食や抗菌剤の侵入など、活性物質の輸送や外膜に作用するストレス要因に対する防御以外にも生物学的機能が拡張されているにもかかわらず、細菌のOMVが免疫系からの一方的な防御以外の宿主応答を媒介できるかどうかはまだ十分に理解されていません（6、9）。長期的な進化により、腸内細菌叢と宿主の高度な相互作用が育まれてきたことは広く認められている(10)。しかし、OMVが腸のホメオスタシスを効果的に制御する細胞外メカニズムになり得るという実質的な証拠は、まだ報告されていない。ここでは、腸内細菌叢、粘膜適応免疫応答、物理化学的バリアを総合的に調節することにより、腸内障害の回復を助ける常在菌由来OMVの基本的な役割について説明します（図1）。その治療ターゲットとして、生きた細菌の代わりにOMVをマウスの腸に移植することで、腸のホメオスタシスを維持することで大腸炎を救い、大腸がん（CRC）に対する抗プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）免疫療法を強化できることを示しました（概念実証済）。
図1. 腸内ホメオスタシスを制御する細菌性OMVの汎用性を示す模式図。
常在菌由来のOMVは、膜融合を介して有益菌の増殖を選択的に促進することでアンバランスな腸内細菌叢を修復し、PPに転移してB細胞やDCを活性化することで粘膜IgA反応を誘発し、腸管上皮細胞に進入してタイトジャンクションや粘液の発現をアップレギュレートすることで腸のバリアの完全性を維持する。Treg、制御性T、TH、Tヘルパー、MHC、主要組織適合性複合体、TCR、T細胞受容体。
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結果
腸内細菌叢の制御
我々は、腸管粘膜層に生息するAkkermansia muciniphila（Akk）株をモデル常在菌として選び、腸内生態系におけるOMVの多面的な役割について検討した。Akk株由来のOMVは、細菌の繁殖後に採取され、その後、一連の遠心分離手順により精製されました。ナノ粒子追跡分析（NTA）により、得られたOMVの平均サイズは108.60±48.90 nmであることがわかった（図S1）。OMVが腸内細菌叢に与える影響を評価するため、腸内障害モデルであるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発マウスに、総タンパク質20μgを含むAkk OMVを毎日5日間連続経口投与し、大腸内容物を抽出して16SリボソームRNA遺伝子配列決定による微生物組成分析を行った。なお、胃の滞留時間を模した期間である37℃で4時間、模擬胃液（pH1.2）とインキュベートしてもOMVのサイズと数に大きな変化はなく、経口摂取後の胃腔通過への安定性が満たされていることが示された（図S2）。図2A（上）に示すように、レアファクション曲線の急激な上昇はなく、サンプルシーケンス量がデータ解析に十分であることを示唆し、OMV処理マウスの運用分類単位（OTU）数はリン酸緩衝食塩水（PBS）処理群より有意に多かった。また、OMV投与マウスのシャノン指数も大きく上昇し、健常対照群と同程度になった（図2A、下）。全体として、OMV処理群はPBS処理マウスと比較して、腸内細菌叢の豊かさと多様性の両方で顕著な改善を示した。PBSとは対照的に、Akk OMVは、Bacteroides、Lactobacillus、Alistipes、Lachnospiraceae NK4A136グループ、bacterium f Lachnospiraceaeなどのいくつかのプロバイオティックまたは常在菌属の相対存在量を増やした（図2B）（11-14）。特に、OMV処理群では、Bacteroides属の有益なメンバーの発現が有意に増加した（図2、C〜E、および図S3A）。Bacteroides acidifaciensとBacteroides thetaiotaomicronの相対量は、それぞれ0.47±0.16%から1.99±0.44%、0.02±0.02%から0.64±0.11%と増加した（図2、DおよびE）。B. acidifaciensは、免疫グロブリンM（IgM）をIgAに切り替え、腸内IgAの産生を促進することで粘膜免疫機能を改善することが報告されており、B. thetaiotaomicronは、粘液やIgAの産生を促進し上皮の損傷を回復することで腸のバリア機能を維持し大腸炎症を改善させる（15-17）。また、OMVは、潰瘍性大腸炎や大腸炎に伴う腫瘍形成の緩和に関連するBacteroides stercorirosorisとBacteroides caecimurisの相対量を、それぞれ0.14 ± 0.14% から 2.21 ± 0.54% と 0.10 ± 0.01% から 0.45 ± 0.13% まで増加させた（図S3A）（18、19）。しかし、上記のBacteroides属とは異なり、プロテアーゼ活性に依存した腸管バリア機能障害や潰瘍性大腸炎を誘発する能力を持つBacteroides vulgatusの相対量は減少した（図2C）（20）。さらに、OMVは、多数の病原性細菌を含む最大の門であり、腸内細菌叢のディスバイオシスの微生物シグネチャーとみなされるプロテオバクテリア門に属する細菌の相対量を減少させた（図2Bおよび図S3B）（21）。これらの結果は、Akk OMVが日和見病原菌を減らしながら、有益な細菌、特にバクテロイデス種をアップレギュレートすることによって、腸内細菌のアンバランスを強固に逆転できることを示唆しました。
図2. 腸内細菌叢の制御。
(A～E）腸内細菌叢の16SリボソームRNA遺伝子配列解析。DSSマウスに、総タンパク質20μgを含むAkk OMV懸濁液100μlを5日間毎日投与し、サンプリングのために安楽死させた（n = 5）。健康なマウスおよびPBSで処置したDSSマウスを別途コントロールとして使用した。(A）レアファクション曲線（上）およびシャノン曲線（下）。(B)細菌属と(C)Bacteroides属の種数分布。(D)B.アシディファシエンスと(E)B.テタイオタミクロンの相対的な存在量。(FおよびG）対数期細菌溶液50μlとAkk OMV懸濁液100μlを含む培養液1mlを37℃で直接インキュベートすることによるAkk OMVとBacteroides属の相互作用。PBSでインキュベートした細菌をコントロールとして使用した。(F）指示された時点のインキュベーション後のBacteroidesの3D CLSM画像およびフローサイトメトリーヒストグラム。スケールバー、25μm。(G）600nmでのOD値を記録することによって測定した成長曲線（n = 3）。データは平均値±SEMである。有意性は、一元配置または二元配置のANOVA検定を用いて評価し、P値を与えた。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, および ****P < 0.0001.
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そこで、Akk OMVが腸内細菌叢の特定の細菌種と選択的に相互作用する可能性はないかと考え、その潜在的なメカニズムを探ることにした。そこで、OMVの外膜をCy5.5で共有結合させ（図S4）、内部の核酸をHoechstで染色しました。検証には、B. acidifaciens、B. thetaiotaomicron、B. vulgatus、B. fragilisなど、Bacteroides属の代表的な菌株を選択した。対数期にあるバクテロイデスを標識OMVとインキュベートし、分析のために指示された時点で細胞を収集した。共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）画像から、取り込みレベルは種によって異なるものの、Akk OMVはこれらすべてのバクテロイデス種と融合していることがわかった（図2Fおよび図S5〜S8）。1.5時間培養後、B. acidifaciensとB. fragilisはCy5.5で強く染色され、B. thetaiotaomicronとB. vulgatusは比較的低い蛍光信号で観察された。これらの増殖バクテロイデスのCy5.5の蛍光強度は、培養時間と共に増加し、Akk OMVの連続的な取り込みが示唆された。3次元CLSM画像から、同時培養後、これらのバクテロイデスにはCy5.5で標識された細胞膜と細胞内のHoechst蛍光シグナルが現れ、Akk OMVとバクテロイデスが良好に融合していることが示された。OMV融合の特異性を調べるため、代表的なプロバイオティクス菌株であるEscherichia coli Nissle 1917と一般的な病原菌であるSalmonella typhimurium SL1344を選び、Akk OMVの取り込みを検討しました。予想に反して、25時間培養してもS. typhimuriumでは蛍光シグナルが観察されなかったが、少数の大腸菌では弱いシグナルが観察され（図S9、S10）、Akk OMVが特定の属と優先的に融合できることが支持された。CLSMイメージングの結果とよく一致するように、フローサイトメトリー解析では、S. typhimuriumとは対照的に、これらの常在菌は著しく多くのAkk OMVと融合することがさらに定量的に確認された（図2F、右、および図S11）。さらに、600nmでの光学密度（OD）値を記録して対応する成長曲線を測定することにより、細菌の増殖に対するOMV融合の影響を探った。図2Gに示すように、Akk OMVはB. acidifaciens、B. thetaiotaomicron、B. fragilisの増殖を著しく促進したが、B. vulgatusには効果がなかった。これは、腸内細菌叢における特定の菌株の増殖に対する選択的な刺激であり、Akk OMVとの有効な融合によって説明できる。なお、同程度のOMV融合レベルが存在するにもかかわらず、B. vulgatusの増殖に有益な効果は見られなかった。これは、DSS誘発腸内障害において、日和見性のあるバクテロイデス種の増殖を動機付けるAkk OMVの効果がないことを示唆している。予想通り、Akk OMVと同時培養した大腸菌とS. typhimuriumは、OMVが融合しないか非効率的であるため、ほとんど増殖しなかった（図S12）。さらに、プロバイオティック大腸菌とB. thetaiotaomicronから放出されたOMVは、B. acidifaciensとB. vulgatusの増殖に対して限定的な効果を示し、Akk OMVのBacteroidesに対する特異性をさらに示唆した（fig. S13）。これらのデータを総合すると、バランスのとれた腸内細菌構造を回復させるAkk OMVのメカニズムの1つは、選択的融合による有益な種の増殖の直接的なアップレギュレーションであることが示されました。
粘膜免疫応答の調節
In vivo試験において、Cy5.5標識Akk OMVは、腸管内腔への直接投与から2時間後にパイエル板（PP）に入り、投与後の時間が4時間に及ぶと腸間膜リンパ節（MLN）へ移動した（図3Aおよび図S14）。この観察から、OMVが粘膜の免疫調節反応を引き起こして腸の不調を整えることができるかどうかを調べることになった。腸内細菌叢がIgA産生に影響を与え、一次IgA産生は主にPPで起こることから、Akk OMVの侵入が、病原体の侵入を防ぐ腸管免疫バリアに不可欠なIgA応答を誘導するのではないかと推測された（22-24）。粘膜免疫応答の解析のため、腸管障害を誘発したマウスにAkk OMVを5日間連続経口投与した後、腸管からPPとMLNを採取した。IgA産生には、PPの上皮下DCとB細胞の相互作用が必要であることから（22）、まず樹状細胞（DC）の活性化に対するAkk OMVの役割を解析した。予想通り、OMVを投与したマウスのPPでは、DC上のCD80の発現が有意に増加した（図3C）。骨髄由来DC（BMDC）とのin vitro共培養により、Akk OMVが内在化後にCD80+ DCの高生産を誘導できることがさらに確認された（図3、BおよびD）。続いて、採取したPPにおけるB細胞（B220+CD138-）の活性化とプラズマ細胞（B220-CD138+）の産生を解析した。OMV投与群は、CD69+B細胞およびIgA+プラズマ細胞の産生を全B細胞とともに有意に増強し、腸内IgA濃度を18.71 ± 1.52 から 29.47 ± 2.73 mg/mlに増加させた（図3、E～G）。Akk OMVが粘膜IgA反応に直接影響を与えることに加え、腸内微生物の構造が改善されることで、活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（＝B. acidifaciens）やIgAを上皮を越えて輸送できる高分子免疫グロブリン受容体（＝B. thetaiotaomicron）の発現量が上昇しIgMからIgAにスイッチしてIgA生産を刺激するかもしれません（15、16）。一方、腸管内腔に存在するIgAは、抗体コーティングを介して病原性種を中和・排除することができる（23, 24）。OMV投与群のIgA+糞便細菌数は、IgAの産生が促進されたことにより、有意に増加した（図3H）。このことも、Akk OMVが腸内細菌叢における有害な病原体の相対的な存在量を減少させた理由であると考えられる。さらに、腸内常在菌はIgAを利用して粘膜に定着することができ、健全な微生物構成を回復するための宿主-微生物共生の頑健性を示唆している（25）。その結果、Akk OMVは、粘膜のIgA応答と腸内細菌叢との複雑な相互作用において、必須かつ双方向的な役割を果たし、腸のホメオスタシス異常を制御している可能性があることがわかった。
図3. 粘膜免疫応答の変調
(A）両端を縛ったPP配置の腸管セグメントに25μlのCy5.5標識Akk OMV（0.1 mg/ml）またはPBSを経腸投与した後2時間および4時間にサンプリングしたマウスPP（上）およびMLN（下）のIVISイメージ。(B）Cy5.5標識Akk OMV（0.1mg/ml）またはPBSとともに37℃で24時間インキュベートした後のBMDCのCLSM画像。スケールバー、10μm。(C）総タンパク質20μgを含むAkk OMV懸濁液100μlまたはPBSを5日間毎日経口投与した後の、腸管障害を誘発したマウスのPPにおけるCD80+ DCの割合（n≧5）。(D）Cy5.5標識Akk OMV（0.1mg/ml）またはPBSと37℃で24時間インキュベートした後のBMDCsのフローサイトメトリー分析（左）およびCD80+パーセント（右）（n = 3）。(E〜I）20μgの総タンパク質を含むAkk OMV懸濁液100μlまたはPBSを5日間毎日経口摂取した後の、腸管障害を誘発したマウスの腸における粘膜免疫応答（n≧5）。(E）PPにおけるB細胞（B220+CD138-）およびプラズマ細胞（B220-CD138+）の代表的なフローサイトメトリー散布図（左）を、B細胞の割合（右）とともに示す。(F）PPにおけるCD69+ B細胞およびIgA+形質細胞の定量的解析。 G）腸内のIgA濃度を示す。(H）フローサイトメトリーによるヒストグラムとIgA+糞便菌の定量化。コントロールとして裸の細菌を用いた。(I）MLNにおけるIFN-γ+CD4+T細胞、IL-4+CD4+T細胞、IL-17+CD4+T細胞、およびIL-4+/IFN-γ+CD4+T細胞およびFOXP3+CD25+/IL-17+CD4+T細胞の比の定量的解析。MFI、平均蛍光強度。データは平均±SEMである。有意性はt検定を用いて評価し、P値を与えた。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, および ****P < 0.0001.
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これらの知見から、Akk OMVは、リンパ管を通じての移動を考慮し、MLNにおける細胞性免疫応答を同時に制御している可能性があると推論された。これまでの研究で、粘膜免疫細胞は腸内環境を構成的に調査していることが証明されている。例えば、DCは抗原を捕捉してT細胞応答を調整する(26)。PPのCD80+ DCが増加していることから、MLNにおけるT細胞反応を調査することにした。フローサイトメトリー分析の結果、Akk OMVで治療したマウスから採取したMLNにおいて、インターロイキン4（IL-4）+/インターフェロンγ（IFN-γ）+CD4+ T細胞およびFOXP3+CD25+/IL-17+CD4+ T細胞の比率が増加した（図3I）。MLNにおける比較的低いレベルの免疫応答とともに、T細胞が示す抗炎症表現型への極性化は、Akk OMVが粘膜免疫恒常性を維持するために宿主を支援できることを示した（図3Iおよび図S15）。しかし、BMDCsと脾臓CD4+ T細胞を共培養したin vitroの研究では、Akk OMVsが直接引き起こす免疫活性化効果が示された（図S16）（27、28）。メカニズム的には、サイトカインストームを引き起こす可能性のある腸内病原体は、OMVによる腸の生物学的バリアの回復と粘膜IgA応答の誘導によって大幅に減少し、最終的に宿主免疫恒常性を維持した。
腸の物理化学的バリアの維持
次に、Akk OMVが物理化学的バリアの形成に与える影響について調べた。腸管上皮表面を覆う粘液は、腸のバリア機能を強化するための最初の保護ラインであり、腸内細菌叢によって大きく調節される (29, 30) 。ゴブレット細胞は、消化管で粘液を分泌する優勢な上皮細胞であり、その分布は結腸で最大密度に達する（29, 30）。分泌型ムチンの代表格であるMuc2のO-グリコシル化体の主要形態は、マウスの近位結腸に分布する杯細胞で主に産生されていた（29）。そこで、OMVを投与したマウスの大腸近位部組織を採取し、アルシアンブルーで染色したところ、OMV投与マウスの大腸近位部では、酸性粘液で完全に満たされた杯細胞が著しく増加していることが確認されました。PBS投与腸管障害マウスでは、個々に散在する杯細胞が病的な空洞を持つのに比べ、OMV投与マウスの近位結腸の杯細胞は、量的にも機能的にも著しく改善し、腸管内腔に厚い粘液層を形成していた（図4Aおよび図S17）。さらに、杯細胞の割合は、腸上皮の5.11 ± 2.34から19.89 ± 3.57に大きく増加した（図4B）。粘液バリアを修復するAkk OMVのかなりの有効性は、OMVの内在化に続いて、粘液を産生する杯細胞の刺激（図S18）および粘液産生を担う有益な細菌種（すなわち、B. thetaiotaomicron）の存在量がOMVを介して増加したことに起因すると考えられる（16、17、31）。
図4. 腸の物理化学的バリアの維持。
(A〜D）総タンパク質20μgを含むAkk OMV懸濁液100μlまたはPBSを5日間毎日経口投与したDSSマウスの腸の物理化学的バリアの修復に関するin vivo効果。(A）近位結腸のアルシアンブルー染色像。黒と黄色の矢印はそれぞれ、病的な空洞を有する杯細胞および肥厚した粘液層を示す。スケールバー、600μm。(B) 腸管上皮における杯細胞の割合。(C) 腸管上皮細胞の3D CLSM画像。赤色蛍光はCy5.5で標識したAkk OMVを示す。スケールバー、50μm。(D) 近位結腸の上皮細胞に発現するタイトジャンクションZO-1およびオクルディンの免疫蛍光画像。スケールバー、20μm。(EおよびF）LPS（5μg/ml）と共にAkk OMV（0.1mg/ml）を37℃で24時間処理した後のCaco-2細胞に対するインビトロの効果。Cy5.5で標識したOMVをCLSMに使用した。(E）免疫蛍光および（F）CLSMの画像。スケールバー、25μm。(G）結腸組織におけるIL-10、IL-13、およびACE2のサイトカインレベルと、血清中のIFN-γおよびCRPをELISAで測定した。サンプルは、Akk OMVまたはPBSで処理した後のDSSマウスから収集した。データは平均値±SEMである（n≧5）。有意性はt検定を用いて評価し、P値を与えた。*P < 0.05.
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体積の大きな細菌とは異なり、Akk OMVは粘液層を通過して腸管上皮細胞に内在化することができ（図4Cおよび図S19）、OMVと物理化学的バリアの直接的な相互作用を提唱している。バリア機能と腸管透過性は、副細胞経路のゲートキーパーとして機能するタイトジャンクション複合体と密接に関連している(32)。タイトジャンクションの主要構成要素であるオクルディンは、上皮のバリア機能の低下に比例して減少する。一方、必須のタイトジャンクション関連タンパク質であるZO-1は、上皮の増殖を促進して粘膜の修復と恒常性に寄与することができる（33、34）。近位結腸の上皮細胞におけるオクルディンおよびZO-1の発現量は大幅に増加し、それに伴い、OMV投与群では、正常な形態を持つ腸上皮の外形に、より多くの蛍光シグナルが重なり、一体化して観察されたことから、腸上皮障害の回復が認められた（図4D）。さらに、LPS処理した上皮細胞株Caco-2のin vitro免疫蛍光研究では、Akk OMVとの共培養後、オクルディンおよびZO-1の発現が直ちに増強することが示された（図4E）。Akk OMVが細胞内在化後に腸のタイトジャンクションを上昇させるメカニズムの一つは、アデノシン5′-一リン酸活性化プロテインキナーゼ（AMPK）経路の活性化によるタイトジャンクションの再組立と安定性の制御であると考えられる（図4F）（35）。さらに、OMVを介した腸内細菌異常症の回復と免疫恒常性の維持は、IL-10やIL-13などの抗炎症性サイトカインの大幅な上昇と、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）、IFN-γ、C反応タンパク質（CRP）などの炎症性サイトカインの減少に共同で貢献し、タイトジャンクションを制御して腸のバリアの健全性を強化する重要な役割を果たす（図4G）。
腸内細菌関連OMVの移植による治療効果
Akk OMVが腸内細菌叢、粘膜免疫応答、物理化学的バリアの調節に万能であることを確認した我々は、OMVを介した腸内恒常性の調節異常の逆転が、疾患の介入や治療に応用できるかどうかに着目した。クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（IBD）は、病因が完全に解明されていない自己免疫疾患群であり、依然として従来の治療の大きな障害となっている（36、37）。治療可能性を検討するため、DSSにより急性大腸炎を誘発したマウスに、Akk OMVを経口投与した。これまでの研究で、Akkが大腸炎とそれに伴う腫瘍形成を抑制することが示されているため、ここではAkkとPBSで処理した大腸炎マウスをコントロールとして使用した（38, 39）。毎日5日間連続で経口投与した結果、OMV処理マウスの増体重はAkk処理マウスと同等であり、PBSコントロールよりも顕著に多かった（図5A）。一方、Akk OMVの経口投与は、大腸炎マウスの結腸長の減少および結腸重量対長比の上昇の両方を改善した（図5Bおよび図S20）。好中球の浸潤はIBDの特徴の一つであり、好中球の細胞内タンパク質であるミエロペルオキシダーゼ（MPO）の濃度はIBDの活動性と正の相関があることが示されている（40）。図5Cに示すように、切開した結腸組織のMPO染色は、OMVまたはAkkによる処理が、PBSと比較して対応する結腸組織におけるMPO陽性細胞浸潤を大幅に減少させたと主張した。ヘマトキシリン・エオシン（H＆E）染色では、DSS誘発マウスの近位結腸において、白血球浸潤が原因となる粘膜浮腫や陰窩の腫脹・破壊などの病理症状が、OMV処理後に顕著に減少していることが強調された（図5D）。IBDのマウスモデルにおいて、炎症性サイトカイン、例えばIFN-γは、炎症性細胞の過剰な浸潤と粘膜上皮の損傷を増強する一方、抗炎症性サイトカイン、例えばIL-10は重要な抗炎症の役割を果たすことが報告されている（41、42）。その結果、Akk OMVが有益な微生物叢のアップレギュレーション、腸内日和見病原体の開花の回避、およびT細胞の抗炎症表現型への偏向を促進する役割を果たし、炎症性病変とともに大腸組織への炎症性細胞の浸潤が緩和されることが分かりました。さらに、OMVはタイトジャンクションを強化することで、上皮の増殖を促進し、粘膜の修復を促すことができる（34, 43）。これらの結果から、Akk OMVの経口投与は、DSS誘発大腸炎を症状的にも病理学的にも改善することができ、OMVによる病原体量の減少、免疫恒常性の維持、タイトジャンクションの強化によって構成される腸の恒常性が寄与している可能性が示唆された。
図5. DSSで誘発された大腸炎を改善するための治療効果。
DSSで誘発された大腸炎マウスに、総タンパク質20μgを含むAkk OMV懸濁液を5日間毎日100μl摂取させ、効果評価のために安楽死させた。108CFUのAkkを投与したDSSマウスとPBSをそれぞれコントロールとして使用した。(A）治療中の体重変動。(B）治療後の平均結腸長（左）および盲腸から直腸まで切除した結腸組織のデジタル写真（右）。スケールバー、1cm。(C）近位結腸の代表的なMPO染色像（左）およびMPO陽性細胞の定量分析（右）。黒矢印はMPO陽性細胞を表す。スケールバー、100μm。(D) 近位結腸の典型的なH&E染色像。緑、黄、青の矢印はそれぞれ炎症性細胞の浸潤、粘膜浮腫、陰窩の腫脹と破壊を表す。スケールバー、625μm。データは平均値±SEMである（n = 5）。有意性は、一元配置または二元配置のANOVA検定を用いて評価し、P値を与えた。*P < 0.05 および ****P < 0.0001.
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最も広く使われている免疫チェックポイント阻害剤の一つである抗PD-1/リガンドPD-L1モノクローナル抗体（mAbs）は、免疫細胞や腫瘍細胞上の阻害受容体やそのリガンドに競合的に結合し、抗腫瘍免疫応答を発揮させます（44）。しかし、ほとんどのCRC患者は、PD-1遮断に対する一次抵抗性を有していることが確認されている(45)。最近の臨床研究により、腸内細菌叢の構成とPD-1ベースの免疫療法に対する腫瘍反応の関連性が明らかになった(46)。AkkやEnterococcus hirae 13144などのいくつかの種は、抗PD-1療法の効果を改善する上で重要な役割を果たすことが報告されている（47）。特に、経口投与されたAkk OMVによって濃縮された常在菌群（B. acidifaciens、Alistipes属、Clostridium属、Ruminococcus属、Lachnospiraceae属を含む）は、PD-1ベースの免疫療法反応者やがん患者に多く、無増悪生存期間が3ヶ月以上である（46-49)。そこで、Akk OMVによる腸内細菌叢の有益な制御が、CRCのマウスモデルにおいてPD-1を標的とする免疫療法の有効性を高める可能性について検討した。マウスにAkk OMVを2日間連続で毎日経口摂取させた後、PD-1 mAbs（aPD-1）を3日間おきに腹腔内注射した。注目すべきは、OMVの助けを借りて、aPD-1は、すべての治療群の中で最も強力な腫瘍増殖抑制を達成したことである（図6Aおよび図S21A）。フローサイトメトリーおよび免疫蛍光イメージングにより分析した免疫学的変化は、aPD-1とOMVを共投与したマウスの腫瘍細胞（CD45-）および免疫細胞（CD45＋）の両方でPD-L1の著しい上昇を示し、これはAkk処理マウスと同等で、aPD-1反応者から糞便微生物叢移植（FMT）を受けたアバターマウスの以前の結論と一致した（Fig．6, B and C, and fig. S21B）（46）．これらの結果は、Akk OMVが、CRC担癌マウスにおけるPD-1遮断の当初微弱だった効力を逆転させたことを指摘した。さらに、OMVとaPD-1の組み合わせは、CD8+細胞傷害性Tリンパ球の浸潤を拡大し、PD-1遮断に対する腫瘍の応答を改善した（図6D）（50）。また、H&E染色画像から、OMVとaPD-1による治療後の腫瘍組織における壊死領域の拡大が明らかになり、腫瘍増殖に対する有効性の向上が示された（図6Eおよび図S21C）。すなわち、Akk OMVは、有益な腸内細菌構造を維持することによって、腫瘍免疫療法におけるPD-1遮断に対する一次抵抗性を克服した。
図6. CRCの鈍化における治療値。
CRCを有するマウスに、3日間の間隔で腹腔内注射によりaPD-1を3回投与する前に、20μgの総タンパク質を含む100μlのAkk OMV懸濁液を2日間、毎日投与した。同じ実験条件下で108CFUのAkkおよびPBSで処理したCRCを有するマウスを、それぞれ対照として使用した。(A) 個々の腫瘍の成長曲線。(B）腫瘍におけるPD-L1+細胞、PD-L1+CD45-細胞、およびPD-L1+CD45+細胞の定量的解析である。(C）腫瘍床におけるPD-L1およびCD45の浸潤の免疫蛍光画像。スケールバー、50μm。(D）腫瘍床におけるCD3およびCD8浸潤の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー、50μm。(E）腫瘍組織の代表的なH&E染色画像。スケールバー、300mm。データは平均値±SEMである（n≧5）。有意性は、一元配置または二元配置のANOVA検定を用いて評価し、P値を与えた。P値：*P < 0.05 および **P < 0.01.
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ディスカション
本研究では、Akk OMVを例にとり、腸内細菌叢由来のOMVが微生物-微生物間および宿主-微生物間の相互作用を制御することにより、腸内障害を回復させるという複数の役割の基礎メカニズムを検討した。その結果、Akk OMVは腸内細菌叢の豊かさと多様性を著しく改善し、有益な種の存在量を増やし、日和見病原体の拡大を抑制することによって、腸内細菌叢のディスバイオシスを調節することを発見しました。また、Akk OMVは粘膜のIgA反応を活性化し、免疫の恒常性を維持するとともに、炎症反応を排除し、病原性細菌を追い出すことを確認しました。さらに、このベシクルは、グローバル細胞を刺激して粘液を分泌させ、上皮細胞を活性化してタイトジャンクションの発現を高めることにより、腸の物理化学的バリアを回復させることを明らかにした。腸内細菌叢、粘膜免疫応答、物理化学的バリアーの多面的な相互作用を操作する汎用性を考慮すると、Akk OMVは、腸の恒常性を維持することにより、マウスの大腸炎やCRCのPD-1ベースの免疫療法に介入することに成功しました。
腸内細菌叢における天然OMVの役割に関する数十年にわたる研究は、主に2つの細菌種間の物質移動と、病原体由来のOMVが細胞外ストレス因子に対して受動的に保護する機能に焦点を当てています（6、9）。しかし、腸内細菌の生態における常在性OMVの役割はそれ以上に大きく、特に微生物叢の組成を選択的かつ文脈的に調節することにあります。本研究では、Akk OMVが、ファーミキューテス門に属する有益な常在菌（すなわち、Lachnospiraceae spp.、Lactobacillus spp.、Ruminococcaceae spp.）の存在量を改善することを明らかにした。やバクテロイデス属、アリスティペス属に属する有用な常在菌を増やす一方、プロテオバクテリア属に属する潜在的な病原性細菌（クレブシエラ属など）を減らした（11-13、21、46）。OMVが介在する腸内細菌叢の制御は、膜融合に伴うOMVによる特定の有益菌の増殖促進によって証明されるように、常在菌との選択的かつ直接的なクロストークを介して行われるのかもしれない。なお、膜融合は細菌の取り込みメカニズムの一つであり、OMVのゼータ電位と流体力学的直径に依存する(51)。また、OMVの細菌増殖促進能力は、細菌の取り込み効率と一致しないことがわかった。これは、細菌の分裂速度が一定でないことや、OMVの固有の特性に関連している可能性がある。細菌とOMVの特異的な融合選択の基礎となるメカニズムについては、さらなる研究が必要である。
腸管バリアーの維持と病原体の排出に不可欠な粘膜IgA産生は、腸内細菌叢によって調節されることが証明されている（23、24、52）。DCとB細胞の相互作用をサポートするニッチとして機能するPPは、IgA産生に不可欠である（22）。本研究では、PPに進入したAkk OMVは、粘膜のIgA産生を増強し、DCの活性化やB細胞のプラズマ細胞への分化など、局所的に関連する免疫応答を惹起した。さらに、細菌組成の改善（すなわち、B. acidifaciensとB. thetaiotaomicronの存在量の増加）は、IgMをIgAに切り替え、上皮を越えてIgAを輸送することにより、IgAの生産と分泌を促進すると考えられます（15、16）。腸管病原体は腸管免疫系を刺激して病原体特異的で親和性の高いIgAを産生する一方、常在菌によって惹起される恒常性IgAは一般的な多反応性と低親和性を有することが報告されている（23）。腸管障害が起こると、粘膜免疫系は腸の恒常性を維持するために常在菌に対して寛容であり続け、腸常在菌は粘膜コロニー形成のためにIgAを利用できるため、IgAコーティングは優先的に炎症性病原体を識別するようになる（25、27、28、53）。このことから、OMVは宿主と微生物の共生を促進する重要な役割を担っており、他の攪乱要因によって新たな障害が発生するまで、効果的に維持することができることが指摘されています（53）。さらに、今回の結果と、IgAが恒常性維持に重要な役割を果たすという事実（24）に基づき、OMVによる恒常性維持によって引き起こされるIgA産生の促進が、病原体の減少による減少を補う可能性があると推測されました。つまり、OMVは粘膜のIgA応答を調節し、乱れた腸内細菌叢のバランスを回復させることで、粘膜免疫のホメオスタシスを制御できることが示された。
粘液、統合された粘膜上皮細胞、細胞間タイトジャンクションから主に構成される物理化学的バリアは、循環系への有害物質の侵入に対して重要な保護を提供する（54）。しかし、特に大腸では、上皮ベースのバリアが、微生物と宿主の密接な接触を妨げ、相互作用を抑制している(2, 55)。今回のデータから、Akk OMVは粘液層を通過して上皮細胞に入り、粘液分泌とタイトジャンクションの発現を促進し、腸管上皮の障害を軽減するという二重の役割を果たし、相互作用があることが示された。また、小胞は、腸の障害によって傷ついた杯細胞を量的にも機能的にも修復した。より厚い粘液層が形成されたのは、腸内環境の異常が回復し、OMVの内在化によって杯細胞が直接刺激されたことに起因しているのかもしれない。具体的には、増加したB. thetaiotaomicronは杯細胞の分化を促進し、その結果、粘液の分泌を刺激することができます（16、17）。その結果、近位結腸杯細胞から分泌される粘液は、腸内細菌を含む糞便を包み込み、潜在的な病原性感染を回避することができる（29）。物理的バリアに関しては、Akk OMVはAMPK経路を活性化し、タイトジャンクションの再組み立てと安定性を調節する可能性がある（35）。Akk OMVは、IL-10やIL-13などの抗炎症性サイトカインを増加させ、ACE2、IFN-γ、CRPなどの炎症性サイトカインを減少させた。粘膜免疫細胞から産生されるIL-10は、感染に対する免疫を司るサイトカインであるが、炎症性サイトカインのアップグレードは、腸の透過性を高め、同時に上皮のアポトーシスをエスカレートさせバリア破壊を加速させることは注目に値する（41、42、56）。さらに、B. thetaiotaomicronは、腸内組織におけるACE2の発現を減少させた(57)。これらのことから、Akk OMVが物理化学的バリア機能を回復させるメカニズムには、病原体による炎症反応を抑えることによる免疫恒常性の調節、善玉菌の量を増やすことによる腸内環境の異常の回復、上皮細胞の増殖促進、およびタイトジャンクションのアップレギュレーションが含まれると考えられる。
明らかに、腸のホメオスタシスを回復させるOMVの3つの役割は、相互補完的であることが、腸の障害を共同で制御し、経口投与したAkk OMVが腸の炎症を改善し、抗PD-1免疫療法に対するCRCの感受性を高める効果を示すことから明らかである。制御不能な微生物免疫反応は、IBDの極めて重要な特徴の一つと考えられています（37）。我々は、Akk OMVが宿主を支援し、病原体を減少させ、上皮ベースのバリア機能を強化することによって、消化管の粘膜免疫系を操作して抗炎症表現型への極性を促進し、DSS誘発大腸炎を軽減することを発見した。一方、Akk OMVとの併用により、aPD-1は腫瘍細胞と免疫細胞の両方でPD-L1をアップレギュレートすることにより、CRC担ぎマウスの腫瘍成長を著しく遅らせました。Akk OMVがCRCにおけるPD-1/PD-L1遮断の効果を回復させたメカニズムは、PD-1ベースの免疫療法の効果や腸内生態系の恒常性を維持するために重要な役割を果たす有益な微生物種をアップレギュレートすることにある可能性がある。胃酸、胆汁酸、粘液など、消化管内のさまざまな環境の脅威にさらされることの多い生菌と比較して、OMVはこれらの刺激に比較的敏感で、細胞間相互作用によって宿主とコミュニケーションをとることができるため、強力な治療効果を発揮する。FMTの臨床応用における安全性の問題を考慮すると、Akk OMVがこれらの治療に成功したことは、FMTの代替手段として腸内細菌叢由来のOMVを使用する可能性を浮き彫りにした（58）。
この研究により、腸内細菌叢、粘膜免疫、物理化学的障壁を調節する補完的かつ相互的なメカニズムを介して、腸のホメオスタシスを制御する細菌OMVの多様性が明らかになりました。腸内細菌叢由来のOMVは、腸内における微生物-微生物間および宿主-微生物間の相互作用において、包括的かつ重要な位置を占めていると言えるでしょう。OMVを介した腸内環境の恒常性は、大腸炎に伴う腸の炎症を緩和し、PD-1ベースの免疫療法に対するCRCの感受性を向上させる能力をマウスで実証しています。これらの知見は、腸内細菌叢の背後にある大量の細菌性OMVの存在の意義と、これらの小胞を疾患介入および治療の治療標的として使用することへの期待に焦点を当てたより革新的な考えを刺激すると予想されます。
材料と方法
細菌・細胞株
Akk (DSM 22959) と B. thetaiotaomicron (VPI-5482) は脳心筋梗塞 (BHI) ブロスで培養した。B. vulgatus [American Type Culture Collection (ATCC) 8482] は、システイン-HCl (1 mg/ml), ヘミン (0.015 mg/ml) および酵母エキス (BHI+) (5 mg/ml) を添加したBHI brothで培養した。B. acidifaciens（JCM 10556）は、岐阜県嫌気性培地（GAM）で培養した。B. fragilis（ATCC 25285）は、改変GAMで培養した。E. coli（Nissle 1917）およびS. typhimurium（SL1344） はLBブロスで培養した。Akk、B. thetaiotaomicron、B. vulgatus、B. acidifaciens、B. fragilisは37℃の嫌気的環境下で、大腸菌とS. typhimuriumは正常毒性環境下で培養した。Caco-2細胞およびHT-29-MTX-E12細胞は、10％牛胎児血清（FBS）、ストレプトマイシン（100mg/ml）、ペニシリン（100U/ml）および1％非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて培養した。CT-26細胞は、10％FBS、ストレプトマイシン（100mg／ml）、およびペニシリン（100U／ml）を含むDMEMで培養した。
OMVの精製
AkkをBHIブロスで37℃、4～7日間、嫌気室で培養した。15,000gで30分間遠心分離した後、上清を4℃で0.45μmフィルターで濾過し、細菌ペレットを除去した。OMV上清を滅菌PBSで1回洗浄し、170,000g、4℃で60分間の遠心分離により1mlに濃縮した。その後、濃縮液を0.45μmフィルターでろ過し、-80℃で保存し、さらに使用した。Akk OMVの平均サイズは、NTAにより測定した。
OMVの蛍光標識
OMVの外膜をCy5.5-N-hydroxysuccinimide（NHS）で共有結合により標識した。簡単に言うと、OMV（0.1mg/ml）をCy5.5-NHS（1μg/ml）を含むPBSに懸濁し、続いてサーモシェーカーで600rpm、37℃、2時間インキュベートした。OMVの核はHoechstで室温で10分間染色した。PBSで2回洗浄した後、標識したOMVを可視化し、CLSMおよびフローサイトメトリーでそれぞれ分析した。
SGFに対するOMVの抵抗性
100μlのPBSに懸濁した等量のAkk OMVを、1mlのPBSと模擬胃液（SGF）（pH1.2、塩化ナトリウム0.2g、ペプシン0.32g、塩酸700μlを含む水1000mlあたり）中で37℃、穏やかに振盪しながらインキュベートした。指示された時点で、SGFに対するOMVの抵抗性を評価するために、培地中のOMVの平均サイズおよび濃度をNTAによって測定した。
腸内障害モデルマウス
ここで使用した動物はすべて6～8週齢の雌のBalb/cマウスで、Charles River Laboratories（中国・北京）およびJiesijie（中国・上海）から購入したものである。すべての動物実験は、上海交通大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（A2020033）の倫理委員会によって評価・承認されたガイドラインの下で行われた。腸障害を誘発するために、マウスに5％DSS（60316ES60、YEASEN）を含む蒸留水を10日間毎日与えた。その後、前処理したマウスに、20μgのタンパク質を含むOMV懸濁液100μlを5日間連続で経口ガベージにより摂取させた。OMVの経口摂取については、ビシンコニン酸アッセイ（P0010、Beyotime Biotechnology）を用いて、OMVの20μgのタンパク質を含むサスペンションを測定した。コントロールとしてPBSを使用した。
微生物叢の16SリボソームRNA遺伝子配列決定
まず、20μgのタンパク質を含むAkk OMV懸濁液またはPBSを毎日100μlずつ5日間経口投与した腸管障害マウスの大腸試料から、全菌DNAを抽出した。16S全長プライマーは、Solexaポリメラーゼ連鎖反応増幅（10μl系）用の保存領域27F-1492R（フォワードプライマー27F：AGRGTTTGATYNTGGCTCAG、リバースプライマー1492R：TASGGHTACCTTGTTASGACTT）により設計しました。形成されたシークエンスライブラリーに対して品質検査を行うことで高品質なサーキュラーコンセンサスシーケンス（CCS）配列が得られ、それを加工して最適化CCSを生成し、類似度97％のレベルでクラスタリング（USEARCH、バージョン10.0）した。さらに、操作上の分類単位の配列構成に基づいて、種分類を求めた。SilvaデータベースとRDP Classifierにより、種のアノテーションと分類に沿った腸内細菌叢の多様性を解析した。1つのサンプルにおける種の豊富さと多様性をアルファ多様性分析で調べ、異なるサンプルのコミュニティ構成と構造の違いを比較するためにベータ多様性分析を実施した。
OMVの細菌による取り込み
対数相の細菌溶液50μlの量を、対応する培養液1ml中で37℃、OMV（0.1mg/ml）を含むPBS100μlとともにインキュベートした。インビトロでの腸内障害をシミュレートするために、高い初期量のB. vulgatus（600nmでのOD値は約0.1）を選択して、OMVと共培養した。指示された時点で、100μlの混合物を7000gで5分間遠心分離することにより回収した。その後、回収したものをPBSで3回洗浄し、遊離した標識OMVを除去した。OMVの細菌取り込みは、CLSMで可視化し、フローサイトメトリーで解析した。さらに、細菌の成長曲線をマイクロプレートリーダーで測定した。指示された時点で、培地から200μlを採取し、600nmでのOD値を記録した。コントロールとしてPBSを使用した。
OMVの腸管リンパ節への進入
上皮細胞や腸管リンパ節へのナノ粒子の侵入を観察するために広く用いられている既報の方法(59)に従って、OMVのPPおよびMLNへの侵入を評価した。Cy5.5で標識したAkk OMV（0.1mg/ml）を含む溶液を、両端を縛ったPP配置の腸管セグメントに注入した。指示された時点で、処理したマウスからPPとMLNを抽出した。IVISシステムを用いて、OMVのPPおよびMLNへの進入を画像化した。
In vitro免疫反応
BMDCsはマウスの骨髄から抽出し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（20 ng/ml; 51048-MNAH, Sino Biological）、10%FBS、ストレプトマイシン（100 mg/ml）、ペニシリン（100 U/ml）を加えたRPMI1640培地で3日間インビトロ培養を行った。その後、上清の半分を新鮮な培養液と交換し、さらに3日間細胞を培養した。Akk OMVのBMDCによる取り込みを観察するために、OMV（0.1mg/ml）を含む100μlのPBSを、BMDCと37℃で24時間インキュベートした。細胞を3回洗浄した後、Hoechstで室温で10分間染色してからCLSMで観察し、フローサイトメトリー分析を行った。BMDCの活性化を評価するために、抗CD11b（M1/70）、抗CD11c（N418）、抗CD80（16-10A1）、抗CD86（24F）で染色をした。T細胞応答の解析のために、Akk OMV（0.1mg/ml）を供給した100μlのPBSをBMDC培地に添加した。2日間の同時培養後、マウス脾臓から抽出したCD4+ T細胞を添加し、さらに4日間培養した。細胞はまず、抗CD3（17A2）、抗CD4（GK1.5）、抗CD8（53-6.7）、抗CD25（3C7）抗体などの細胞外抗体で染色し、洗浄、固定、透過処理をしてから細胞内染色をした。細胞内抗体には、抗FOXP3（FJK-16s）抗体、サイトカイン［抗IL-17（TC11-18H10.1）抗体、抗IFN-γ（XMG1.2）抗体、抗IL-4（11B11）抗体］を用いた。Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Kit (00-5521-00, eBioscience)を用いて、細胞の固定と透過を行った。すべての抗体はBioLegend社およびeBioscience社から購入した。データはFACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences, USA）で取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）で解析した。
粘膜免疫応答
タンパク質20μgを含むAkk OMV懸濁液を経口投与した5日後に、腸管障害マウスからPPとMLNを抽出した。組織を70μmのセルストレーナーを通して潰し、PBS緩衝液中の単細胞懸濁液を生成した。精製した抗CD16／32（93）と4℃で15分間インキュベートした後、得られた細胞を抗体で染色した。DCおよびB細胞の活性化および成熟を測定するために、細胞を抗CD11b（M1/70）、抗CD11c（N418）、抗CD80（16-10A1）、抗CD86（24F）、抗B220（RA36B2）、抗CD138（281-2）、抗CD69（H1・2F3）および抗IgA（mA-6E1）で染め分けた。T細胞応答を解析するために、まず細胞を抗CD3（CD3-12）、抗CD4（GK1.5）、抗CD8（53-6.7）、抗CD25（3C7）抗体を含む細胞外抗体で染色し、洗浄、固定、透過化してから細胞内染色をした。細胞内抗体には、抗FOXP3抗体、抗IL-17（TC11-18H10.1）抗体、抗IFN-γ（XMG1.2）抗体、抗IL-4（11B11）抗体が含まれていた。細胞の固定と透過には、Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Kit (00-5521-00, eBioscience)を使用しました。IgAの産生を測定するために、OMVの経口投与から5日後に処理マウスから腸液および糞便サンプルを採取した。腸液サンプルを希釈し、IgA酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キット（EK274、マルチサイエンス社製）を介して測定し、Synergy H1上で読み取った。糞便サンプルからのIgA結合細菌は、記載されたように測定した（32）。簡単に言うと、新鮮な便サンプル100mgを滅菌PBS1mlに溶解し、その後1分間ホモジナイズした。複数回の勾配遠心分離の後、サンプル中の大きな粒子を除去し、糞便細菌を収集した。フローサイトメトリー分析のために、細菌サンプルは抗IgA抗体（mA-6E1）で染色された。すべての抗体は、BioLegendおよびeBioscienceから購入した。データはFACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences, USA）で取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）で解析した。
物理化学的バリア機能
タンパク質20μgを含むAkk OMV懸濁液を経口投与した5日後に、腸管障害マウスから近位大腸を抽出した。粘液バリアを解析するために、サンプルを製造者の指示に従いアルシアンブルー染色（C0155S、Beyotime Biotechnology）に処理した。Fiji（ImageJ）を用いて、染色された細胞の面積と腸管上皮の杯細胞の割合を定量的に分析した。物理的バリアを解析するために、オクルディン（sc-133256、Santa Cruz Biotechnology）およびZO-1（AF5145、Affinity Biosciences）を含む免疫蛍光染色に、製造者の指示に従ってサンプルを処理した。大腸組織中のIL-10（EK210/4、マルチサイエンス）、IL-13（EK213/2、マルチサイエンス）、ACE2（EK1188、Boster Biological Technology）を含むサイトカイン、および血清中のIFN-γ（EK280/3、マルチサイエンス）、CRP（EK294/2、マルチサイエンス）レベルは市販のELISAキットにより測定した。Akk OMVの腸管上皮細胞への取り込みを観察するため、Cy5.5標識OMV（0.1mg/ml）の溶液を両端を縛った腸管セグメントに注入し、処置マウスを安楽死させて2時間後に腸管組織を回収した。その後、組織をCLSM観察用に処理した。
Caco-2細胞およびHT-29-MTX-E12細胞への取り込みと活性化作用
Cy5.5標識Akk OMV（0.1mg/ml）を含む100μl容量のPBSを、Caco-2細胞およびHT-29-MTX-E12細胞とそれぞれ37℃、24時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、Hoechstで染色した後、CLSM下でOMVの取り込みをそれぞれ可視化した。同様に、Akk OMV（0.1mg/ml）を含む100μl容量のPBSを、LPS（5μg/ml）と共にCaco-2細胞と共に37℃で24時間培養した。その後、オクルディン（sc-133256、Santa Cruz Biotechnology）、ZO-1（AF5145、Affinity Biosciences）などの免疫蛍光染色を行い、Hoechstで染色した後にCLSM観察を行う処理をした。Akk OMV（0.1mg/ml）を含む100μl容量のPBSを、HT-29-MTX-E12細胞と37℃で24時間培養した。その後、細胞をアルシアンブルー染色（C0155S、Beyotime Biotechnology）用に処理した。
DSS誘発大腸炎の治療におけるOMVの有効性
Balb/cマウスに、5％DSS（60316ES60、YEASEN）を飲料水に溶解したものを用いて、記載（60）に従って7日間、大腸炎を誘発した。炎症の発症は、体重の変化と血便の出現によって評価した。大腸炎マウスには、毎日、Akk OMVを含む100μlのPBS（0.2mg/ml）を5日間経口投与した。Akkの108コロニー形成単位（CFU）（OD600値1の細菌懸濁液100μl、3回濃縮）とPBSで処理したDSSマウスをコントロールとして使用した。次に、有効性評価のために、マウスから結腸組織を抽出した。結腸の長さは、盲腸から直腸まで記録した。近位結腸は、製造者の指示に従って、MPO染色（Abcam、ab208670）およびH＆E染色（C0105M、Beyotime Biotechnology）のために処理した。
CRCマウスの治療におけるOMVの有効性
Balb/cマウスにCT-26細胞1.5×106個を皮下移植した。腫瘍サイズが100〜400mm3に達した時点で、マウスは、100μgの抗aPD-1の腹腔内注射とともに、Akk OMV（0.2mg/ml）を含む100μlのPBSのガベージで処理された。マウスは、3日ごとに3回抗aPD-1の治療を受け、腹腔内注射の前に2日間連続してOMVを摂取した。腫瘍の大きさを毎日ルーチンにモニターし、処置の10日後にサンプリングのためにマウスを安楽死させた。サンプルは、PD-L1 (64988, Cell Signaling Technology), CD45 (20103-1-AP, Proteintech), CD3 (CD3-12, Abcam), CD8 (EPR20305, Abcam) 抗体を用いた免疫蛍光染色にメーカーの指示に従い処理し、Hoechstで染色してからCLSMで観察された。また、サンプルはH&E染色（C0105M, Beyotime Biotechnology）にも対応した。フローサイトメトリー定量分析のために、腫瘍サンプルを外科器具で小片に切断し、コラゲナーゼタイプIV（100U／ml）およびデオキシリボヌクレアーゼI（100μg／ml）を添加したDMEMにより37℃で30分間振とうしながら消化し、その後70μmのセルストレーナーで摩砕した。得られた単細胞懸濁液を洗浄し、0.5%ウシ血清アルブミンを含むPBSで再懸濁した。腫瘍床におけるPD-L1の発現を測定するために、細胞を抗CD45（QA17A26、BioLegend）及び抗PD-L1（10F.9G2、BioLegend）で染めた。データはFACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences, USA）で取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）で解析した。
統計解析
すべての統計解析はGraphPad Prism 9ソフトウェアで行った。すべての実験データは、Student's unpaired t test、一元配置分散分析（ANOVA）テスト、または二元配置分散分析テストを使って分析し、平均値±SEMとして表した。統計的仮説検定による多重比較の補正には、Dunnettのt検定を使用した。差は、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001のとき、統計的に有意とみなされた。Q検定（Dixon基準）は、異常データの判定と排除に使用された。
謝辞
資金援助を受けている。本研究は、中国国家重点研究開発計画（2021YFA0909400）、中国国家自然科学基金（32201144、32101218、52101289）、国家トランスレーショナル医学インフラ（上海）基金（TMSK-2021-119）、仁慈病院振興プログラム（RJTJ22-RC-002）、上海ハイレベル地方大学革新研究チーム（SHSMU-ZDCX20210900）から財政的支援を受けました。
著者の貢献 J.L.は、このプロジェクトの構想および監督を行った。J.L.とX.W.は実験をデザインした。X.W.、S.L.、L.W.、Z.C.、M.Z.、Y.Z.、R.L.はすべての実験を行った。すべての著者がデータを分析し、議論した。X.W.とJ.L.は論文を執筆した。
競合する利益。J.L.とX.W.は、本研究に関連する出願中の特許出願（第2022115325829号、2022年12月1日出願）の発明者です。著者らは、他に競合する利害関係がないことを宣言する。
データおよび資料の入手 本論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、本論文および/または補足資料に記載されています。
補足資料
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1
P. Kundu, E. Blacher, E. Elinav, S. Pettersson, Our gut microbiome: 進化する内なる自己。Cell 171, 1481-1493 (2017).
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2
H. 芦田、小川、金、三室、笹川、腸管上皮バリアにおける細菌と宿主の相互作用. Nat. Chem. Biol. 8, 36-45 (2011).
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3
W. Yang, Y. Cong, 宿主免疫応答および免疫関連炎症性疾患の制御における腸内細菌叢由来代謝物. Cell. Mol. Immunol. 18, 866-877 (2021).
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4
Y. 古澤、小幡、福田、遠藤、中藤、高橋、中西、植竹、加藤、高橋、福田、村上、宮内、日野、アタラシ、大縄、藤村、T.A.T.S．Lockett, J. M. Clarke, D. L. Topping, M. Tomita, S. Hori, O. Ohara, T. Morita, H. Koseki, J. Kikuchi, K. Honda, K. Hase, H. Ohno, Commensal Microbe-derived butyrate induce the differentiation of colonic regulatory T cells. Nature 504, 446-450 (2013).
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