腸内細菌叢の一塩基変異体プロファイリングが新たな腸内健康評価法を示唆する

2023年11月2日 08:40

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腸内細菌叢の一塩基変異体プロファイリングが新たな腸内健康評価法を示唆する

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37905808/

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研究論文
2023年10月31日
腸内細菌叢の一塩基変異体プロファイリングによるクロスコホート解析は、新たな腸内健康評価法を示唆する
著者 Chenchen Ma https://orcid.org/0000-0003-0449-1911, Yufeng Zhang, Shuaiming Jiang https://orcid.org/0000-0002-9384-9200, Fei Teng, Shi Huang https://orcid.org/0000-0002-7529-2269 shihuang@hku.hk, Jiachao Zhang https://orcid.org/0000-0001-8099-6749 zhjch321123@163.comAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/msystems.00828-23
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概要
はじめに
材料と方法
結果
考察
謝辞
補足資料
参考文献
情報と貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
表
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要旨
適応進化的変化は、宿主の絶え間ない淘汰圧のもとでの腸内微生物群集の生態学的変化に先行する可能性があるが、宿主の疾患状態との関連は十分に検討されていない。多様なヒト疾患にまたがる腸内微生物の疾患関連一塩基変異（SNV）を探索する。12のヒト疾患にまたがる16の症例対照研究から得られた1,711の腸内メタゲノムサンプルのメタ解析を行い、検証のために446人のコホートを追加した。全体として、健康な人はより多くの変異した腸内常在菌を保有しており、主に短鎖脂肪酸（SCFAs）産生菌が関与するSNVが多かった。さらに、腸内細菌の塩基変異の偏りには、健康な人とそうでない人の間で広範な違いが観察され、宿主の病状によって腸内細菌の進化の方向性が異なることが示唆された。さらに、非健常者集団において、非同義変異が4つのSCFA産生遺伝子の機能喪失につながる可能性があることを見出した。その後、全変異株のSNV率に基づいて新規の腸内細菌叢健康指標を開発し、74.23％の精度で宿主の健康状態を分類し、高い精度（AUROC = 69.28％）で検証した。我々の研究は、ヒトの慢性疾患を予測することもできる腸内微生物の適応を特徴付けるために、腸内細菌叢の遺伝的変異を用いることの重要性を強調している。
重要性
本研究では、微生物の遺伝的変化が宿主の生理学的変化に伴う生態学的変化に先行する可能性があり、したがってメタゲノムデータから疾患の予測モデリングのための新たな情報層を提供することができると主張する。興味深いことに、SCFA産生に関するいくつかの遺伝的バイオマーカーが、メタアナリシスに含まれる慢性疾患のほとんどをカバーできることを事前に発見した。今後、宿主の健康状態に関連する腸内細菌叢の適応進化と生態系とのダイナミックな相互作用をさらに探求することは、科学的にも臨床的にも重要である。
はじめに
腸内細菌は、宿主の生理的変化、食生活の変化、抗生物質の使用、プロバイオティクスの介入などに由来する腸管の選択圧に応答して、適応的なSNVや構造変異体（SV）を獲得することによって常に進化している(1 - 5)。この10年間で、腸内細菌叢のSNVやSVが数多く報告され、微生物自身や宿主の表現型の変化に関連しうる微生物機能遺伝子の適応的進化の基盤となっている(6, 7)。しかし、広範な宿主の健康状態における腸内細菌叢の集団レベルの遺伝的プロセスを理解するためには、さらなる研究が必要である(8)。
最近、さまざまなメタゲノム研究が宿主腸内微生物の遺伝的変異を評価し、いくつかの慢性疾患に関連する特徴的なSNVを報告した。例えば、Faecalibacterium prausnitziiやEubacterium rectale［大腸がん（CRC）（9）、肝硬変（LC）（10）、バセドウ病（GD）（11）、炎症性腸疾患（IBD）（12）］、Bacteroides vulgatus［結核（13）、GD（11）］などである。これらの細菌は通常多数のSNVを保有しており、そのSNVプロファイルは健常群と非健常群で異なっていた。多くの研究はまた、微生物ゲノムにおける少数の遺伝子変異、あるいは単一のSNVが、腸内細菌の病原性挙動を著しく変化させ、宿主の健康に影響を及ぼす可能性を示唆している。例えば、T2D患者はしばしばBacteroides coprocolaのグリコシルヒドロラーゼ遺伝子に濃縮されたSNVを有しており、これはT2Dの重要な腸内細菌由来の治療標的として認識されていた(14)。さらに、大腸菌の単一のSNP（G84E）が腸のリゾリン脂質ホメオスタシスを乱し、上皮バリア破壊によって宿主の炎症を誘発することが明らかになっている（15）。それにもかかわらず、ヒトの幅広い慢性疾患に関連する微生物SNVシグネチャーのコンセンサスは、これまで試みられたことがない。さらに、複数の疾患から得られた腸内細菌叢におけるこれらの広範なSNVが、宿主の健康に関連する中核的な機能に関連するかどうかを系統的に評価した研究はない。例えば、食物繊維の腸内細菌発酵によって産生される短鎖脂肪酸（SCFA）は、宿主の免疫応答や抗炎症因子を制御する重要な細菌代謝産物と広く考えられている（16, 17）。COVID-19(18)、2型糖尿病(T2D)(19)、大腸がん(20)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)(21)、パーキンソン病(22)、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)(23)、糖尿病性腎症(24)、脳炎(25)などの様々な疾患において、糞便中のSCFAレベルと宿主の健康との関連性が広く見出されている。われわれは、疾患関連データセットのメタゲノム解析によって、宿主の健康を調節する中核的な微生物機能遺伝子にもつながる疾患横断的な微生物SNVシグネチャーが同定されるだろうと仮定した。
SNVの知見を統合し、腸内微生物のSNVが非健康宿主に及ぼす潜在的影響をさらに明らかにするためには、メタ解析における大規模な集団サイズが必要である。現在、リポジトリに公開されているメタゲノム数は飛躍的に増加している(26)。公開されているショットガンメタゲノムデータのメタ解析は、複数の慢性疾患に対する普遍的な腸内細菌叢由来のバイオマーカーを同定するための、経済的で強力な方法である(27)。重要なことは、従来のアバンダンスデータにとどまらず、腸内微生物の遺伝子変異をプロファイリングすることで、疾患発症の根底にある腸内の進化的・生態学的プロセスについての理解を深めることができることである。しかしながら、サンプル間のシーケンスの深さやカバレッジのばらつきを厳密に考慮することによって、サンプル間のSNVプロファイルを比較することは技術的にまだ困難である。
上記の課題を解決するために、我々は、ヒトの12の病態下で宿主の選択圧と関連しうる腸内常在微生物株のSNVを系統的に研究した。個々の腸内微生物の進化の方向性が、健常者と非健常者で異なるかどうかを検証しようと試みた。ほとんどの先行研究では、健康でない人ではSCFA産生腸内菌株の相対量が減少していることが報告されている。さらに重要なことは、非健康な個々の腸管におけるSCFA産生は、コドンをターミネーターに変えやすい関連遺伝子の適応変異体によって不活性化され、消化管内のSCFA濃度全体をさらに抑制していることがわかった。最後に、SNVプロファイルを用いて "Gut Microbiome Health Index"（GMHI）を確立し、その予測性能を、過去の多くの研究で従来用いられてきた種レベルの存在量プロファイルから得られる予測性能と比較した。特に、個々の腸内微生物のSNVプロファイルは、ヒト宿主の健康状態を評価する上で強い予測力を示した。
材料と方法
メタゲノミクスデータセットの収集とキュレーション
ヒトの疾患と関連する腸内微生物の遺伝子変異のコンセンサスを同定するための包括的なメタゲノム解析メタアナリシスを行うため、PubMedおよびISI Web of Science（2021年10月現在）において、さまざまなキーワード（「ショットガン」、「腸内マイクロバイオーム」、「メタゲノム」、「全ゲノム配列」など）を用いて、一般にアクセス可能なメタゲノム研究データセットを広範囲に検索した。食事、薬物、抗生物質の介入に関するメタゲノム研究は除外した。また、コホートには健常者と非健常者の両方を含める必要があり、これによりコホート間の比較が確実になる。特に、複数の時点から非健常者のサンプルを収集した研究では、最初のサンプルまたはベースラインのサンプルのみを対象とした。最終的に、メタ解析のために15件の研究を絞り込み、非健康人919人と健康人792人からの合計1,711のメタゲノムサンプルを、12種類の宿主表現型（Cov19、Covid-19、SCZ、統合失調症、SF、結石形成者、AS、アテローム性動脈硬化症、PCOS、多嚢胞性卵巣症候群、GD、バセドウ病、T2D、2型糖尿病、CRC、大腸がん、BC、乳がん、UC： ulcerative colitis; CD, Crohn's disease; LC, liver cirrhosis)、ヒトの健康状態を包括的に表している。公開されている生配列（.fastq）と対応するメタデータはNCBI SRAデータベースからダウンロードした。ショットガンメタゲノミクスのシーケンスプラットフォーム、平均シーケンス深度、ターゲットリード長、その他のプロファイルなど、各研究の詳細な技術情報を表1に示した。注目すべきは、UCとCDのコホートは同じ健常対照群を共有していることである。2つのバリデーションコホート（AVCD：アテローム性動脈硬化性心血管疾患、TB：結核）は、ディスカバリーコホートに用いたのと同じ一貫した技術標準を用いて収集した。
表1
表1 本メタ解析に含まれる糞便メタゲノム研究
国健康でないサンプル数健康なサンプル数合計シークエンシングプラットフォーム平均ターゲット深度ターゲットリード長シークエンシングデータ
Cov19 中国 15 15 30 イルミナ NextSeq 550 4.39 GB 150 bp PRJNA624223
SCZ 中国 90 81 171 イルミナ HiSeq X 10.94 GB 150 bp PRJEB29127
SF イタリア 5 5 10 イルミナ NextSeq 500 1.57 GB 150 bp PRJNA418941
AS 中国 97 114 211 イルミナ HiSeq 2000 3.73 GB 100 bp PRJNA375935
PCOS 中国 14 14 28 イルミナHiSeq 4000 6.22 GB 150 bp PRJNA549764
中国 50 43 93 イルミナHiSeq 2500 8.78 GB 150 bp PRJNA530971
GD 中国 102 62 164 イルミナHiSeq 2500 8.07 GB 100 bp PRJNA602729、PRJNA602731、PRJNA602732、PRJNA638403、PRJNA638404、PRJNA638405
T2D 中国 71 74 145 イルミナGAIIxおよびHiSeq 2000 2.51 GB 175 bp PRJNA422434
CRC 中国 8 12 20 lllumina HiSeq 2500 6.45 GB 150 bp PRJNA663646
日本 40 40 80 llumina HiSeq 2500 6.42 GB 150 bp DRA006684
イタリア 32 28 60 lllumina HiSeq 2500 3.89 GB 100 bp SRP136711
オーストリア 46 63 109 lllumina HiSeq 2000 4.84 GB 100 bp ERP008729
BC 中国 62 71 133 ION_TORRENT 10.94 GB 150 bp PRJNA718520
UC American, Holland 76 56 220 lllumina HiSeq 2500 4.01 GB 101 bp PRJNA400072
CD アメリカ、オランダ 88 4.34 GB
LC 中国 123 114 237 イルミナ HiSeq 2000 1.74 GB 100 bp PRJEB6337
919 792 1,711
a
Cov19、Covid-19；SCZ、統合失調症；SF、結石形成；AS、動脈硬化；PCOS、多嚢胞性卵巣症候群；GD、バセドウ病；T2D、2型糖尿病；CRC、大腸がん；BC、乳がん；UC、潰瘍性大腸炎；CD、クローン病；LC、肝硬変。
メタゲノム生データの品質管理
Sratoolkit 2.10.7ソフトウェア（https://github.com/ncbi/sra-tools）を用いて、生のsraファイルをペアまたは単一のfastqファイルに分離した。生のリードはSickle (https://github.com/najoshi/sickle)を用いてトリミングし、その後Bowtie2 (28)をデフォルト設定で用いて宿主ゲノム(GRCh38)にアライメントし、宿主DNA断片を除去した。
種の分類学的プロファイリング
まず、データベース(mpa_v29_CHOCOPhlAn_201901)(29)に基づくデフォルトパラメーターを用いて、MetaPhlAn 2.8を用いて各便サンプル中の微生物種を同定し、それらの相対量を推定した。次に、種の存在量プロファイルに基づいてアルファ多様性を計算した。
常在腸内細菌叢のSNVコーリング
この解析は主にinStrainを用いて行った。まず、204,938ゲノム、4,644株の代表ゲノムを含むinStrainのデフォルトリファレンスゲノムにBowtie2を適用してリードをマッピングし、bamファイルを作成した。次に、samファイルをsamtools (30)を用いてソートし、インデックスを付けた.bamファイルに変換した。最後に、inStrainを使用してSNVをコールし、変異ゲノム、スキャフォールド、遺伝子のシーケンスカバレッジと幅を解析し、デフォルトのパラメータで種レベルの塩基多様性を推定した(31)。特に、リードからゲノムへの最小ANI（-min_read_ani）はデフォルトで95%に設定されており、すべてのリードは、種を代表するゲノム（すなわち、株レベル、https://instrain.readthedocs.io/en/latest/index.html）に対して実際に95%のANIを持つことが期待される。遺伝子のpN/pSとゲノムのバリアントバイアスは、参照ゲノムとの関係ではなく、少なくとも2つの対立遺伝子が存在する位置で計算した。次に、あるゲノム上のSNVの相対頻度（すなわちSNV率）を計算し、他のゲノムと比較することを試みた。シーケンスの深さや幅は変異ゲノム間で大きく異なる可能性があるため、生のSNV数は理想的な測定値ではない。そこで、SNV数を正規化した新しい指標、SNV率を以下のように導出した：
SNV rate=SNV numberg_len×breadth_minCov
(1)
SNV数は、メタゲノムサンプル中の変異ゲノムから呼び出されたSNVの数を示す。g_lenは、この変異ゲノムのゲノム長を示す。breadth_minCovは、典型的なinStrainの出力で、少なくともmin_covカバレッジを持つスキャフォールド/ゲノム中の塩基の割合を示す。特に、塩基多様性の値を持ち、SNVを呼び出すことができる最小配列決定深度を満たす塩基の割合を指す。したがって、SNV率は、微生物ゲノム中のSNVコール可能な全塩基のうち、一塩基バリアントをコールできる塩基の割合として計算した。
次に、inStrain出力の "mapping_info.tsv "にある選択ペアリングフィルターを通過した個々のリードの相対数を用いて、変異ゲノムの相対配列量を推定した。各ゲノムのGffプロファイルはSNVをコールするために必要であり、https://doi.org/10.5281/zenodo.4441269。
シーケンシングの深さによるSNV数の正規化
seqkit 2.1.0 (32)を用いて、全1,711サンプルのシーケンス深度を調べた。注目すべきは、我々の以前の研究で、生のSNV数とシーケンス深度の間に強い相関があることが示されていることである（3）。確かに、シミュレーションデータでこの関係を再確認し、他のプロファイル（例えば、変異ゲノム数）とシーケンス深度の関係を明らかにしたい。上記の問題を解決するために、まず、1,711サンプルから異なるコホートから6サンプル（健常者3サンプル、非健常者3サンプル）を選択し、それらのシーケンス深度は10Gよりわずかに高いものとした。次に、seqtk 1.3を適用し、fastqファイルからシーケンシングデータをランダムに抽出した（https://github.com/lh3/seqtk）。そして、1Gから10G（ステップサイズ：1G）までのシミュレートデータを3回（seed = 11, 12, 13）取得した。その結果、変異ゲノム数およびSNV数とシーケンス深度の間に特に強い正の相関があることが示唆された（Supplementary file 1; Fig.）シーケンシング深度10Gの範囲におけるシミュレーション結果は、ほとんどのサンプルに当てはまる（補足1；図S2）。そこで本研究では、変異ゲノム数とSNV数をシーケンス深度に基づいて正規化した。
SNVプロファイルとゲノムレベルの配列存在量に基づくGMHIの確立
種の相対存在量に基づくGMHIは、健康なグループとそうでないグループを区別するために以前に提案され(33)、宿主の健康のための新しい診断ツールとして開発できる可能性がある。ここでは、ゲノムレベルの存在量プロファイルと比較して、宿主の健康状態を評価するために、各生物種内の遺伝子組成のばらつきを用いて予測精度が向上するかどうかを検証しようとした。そこで、健康状態の予測指標（すなわち、GMHI）を構築するための3つの特徴テーブルを作成した：(i)すべての変異ゲノムの配列存在量プロファイル、(ii)すべての変異ゲノムのSNV率（式1）、および(iii)各サンプルのSCFAを産生するすべての変異遺伝子のSNV数。
変異ゲノムのSNV率に基づくGMHI．
1.
各特徴表について、健康マーカーと非健康マーカーを複数のWilcoxon rank-sum検定を用いて同定した。構成データは統計検定前に中心対数比変換した。各特徴表はさらに、それぞれ健常者濃縮マーカー（MH）と健常者枯渇マーカー（MN）によりフィルタリングした（すべてのマーカーはhttps://github.com/HNUmcc/Meta_SNV_2157/tree/main/data）。
2.
MHまたはMNのいずれかのサブテーブルで、各サンプルのマーカーに基づくシャノン多様性（HsまたはNs）とリッチネス（HrまたはNr）を計算する。
3.
さらに、（HpまたはNp）から上位（下位）ランクのサンプルの1%からHr（またはNr）の中央値を算出した。
4.
次に、各メタゲノミックサンプルについて、健康に富んでいるマーカー（すなわちpsi_H）または健康に富んでいないマーカー（すなわちpsi_N）について、「集団的」配列存在量、変異ゲノムのSNV率、またはSCFAを産生する遺伝子のSNV頻度を計算した。
psi_H=HrHp×Hs
(2)
psi_N=NrNp×Ns
(3)
5. 各サンプルの GMHI を計算する、
GMHI=log10(psi_Hpsi_N)
(4)
必要なスクリプトと3つのプロファイルのマーカーは、https://github.com/HNUmcc/Meta_SNV_2157。
統計解析
統計解析はRソフトウェアを用いて行った。様々なプロファイルの存在量の差は、必要に応じてfdrで調整したWilcoxon rank-sum検定で検定し、有意差はP < 0.05の公称レベルで考慮した。α多様性分析は、"picante "および "vegan "パッケージを用いて行った。β多様性解析は、"vegan"、"plyr"、"ggExtra "パッケージを用いて実施した。Bray-Curtisおよびユークリッド非類似度行列に基づくPCoAは、腸内微生物または腸内変異ゲノム構成に基づくサンプルのクラスタリングを可視化するために使用した。パッケージ "ggplot "と "ghalves "を用いて、ボックスプロット、バイオリンプロット、密度プロット、フィット曲線を作成した。ヒートマップの作成には "pheatmap "パッケージを用いた。
結果
データセット収集とメタ解析のワークフロー
このメタアナリシスでは、12種類の宿主表現型にまたがる16のメタゲノム研究から1,711サンプルを収集し、その中には919人の非健康なヒトと792人の健康なヒトが含まれていた（図1A；補足ファイル2および表S1）。注目すべきは、被験者は元の研究に従って「健常人」と「非健常人」に分類されたが、過体重や肥満だけの人は非健常人グループには分類されなかったことである。予想通り、正規化データに基づくBray-Curtis非類似度（R = 0.002、P < 0.001、Adonis、図1B、95％信頼領域）を用いて、健常群と非健常群との間で、種レベルの糞便微生物量に基づくβ多様性の違いが観察され、多くの研究における過去の結果と一致した。
図1

図1 データセットの統合とメタ解析のワークフロー。(A）本研究では、16のマイクロバイオーム研究（919人の健常人と792人の非健常人を含む）から得られた1,711のメタゲノム試料を、腸内細菌叢における遺伝的変異のコール、検出、プロファイリングのためのメタ解析に統合した。本研究の16のコホートには、それぞれ健常者と非健常者の両方が含まれている。まず、異なる健康状態間の比較は、1つの非健康表現型に限定され、さらに重要なことは、グローバルな比較であった。次に、健康状態に対するSNVの影響を評価するために、特定の変異ゲノム、遺伝子、SNVに言及した。(B）Bray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（PCoA）プロットは、非健康（円、n＝919）と健康（三角、n＝792）群間の腸内微生物組成のサンプル間差を示した。(C）ユークリッド距離に基づくPCoAは、非健常群と健常群の腸内細菌叢における変異ゲノムの多様性に有意差があることを示した。各PCoAプロットにおいて、各ドットはサンプルに対応し、ドットの形は健康状態に対応し、ドットの色は疾患表現型に対応する。楕円は95％信頼領域に対応する。
その後、メタゲノミクスのリードを腸内細菌参照ゲノムの包括的なセットにマッピングすることで、腸内細菌叢の疾患関連遺伝的変異を探索しようとした。ある微生物参照ゲノムからSNVが同定された場合、この「変異ゲノム」またはSNVを保有する微生物株をさらに解析してSNVプロファイルを特徴付け、疾患の状態と関連づけられるかどうかを検証する（補足ファイル2および表S2）。その結果、1,711サンプルで合計2,740の変異ゲノムが同定された。ここでは、サンプル間のゲノム変異を比較するために、有病率が高い（10％以上）233（8.5％）ゲノムに注目した。サンプル間のゲノム変異を有意義に比較するには、各ゲノムについてシーケンスの幅と深さの両方が必要である(6)。この研究では、各SNVのシーケンスカバレッジは、ゲノムをカバーできる最小限の5であることが要求された（5以上の158ゲノムの平均カバレッジ、67.81％）（補足ファイル1および図S1）。次に興味深いことに、ユークリッド非類似度行列に基づき、SNV保有株（N = 2,740）の構成に基づくベータ多様性の違いが、健康なグループとそうでないグループの間で観察された（R = 0.003, P < 0.001, Adonis, 図1C, 95%信頼領域）。このことから、宿主の病状は、集団レベルの存在量の変化だけでなく、腸内細菌叢の遺伝的組成の変化とも関連しうることが示唆された。次に、特定の菌株、遺伝子、SNVに注目し、腸内微生物のSNVと宿主の健康状態との関連を示した。
健康な腸内細菌叢には、より幅広いSNV保有株が存在する
共起するゲノム集団を解析するためのinStrainパイプライン（「材料と方法」参照）に従って、我々は健康なコホートとそうでないコホートの両方について、腸内細菌叢の包括的なSNVプロファイルを得た。なお、本研究では、メタゲノムシーケンスの深さに基づいて、菌株数とSNV数を正規化した（「Materials and Methods」、「Supplementary file 1」および「Fig. S2」参照）。
まず、変異株の豊富さ、およびSNVの総数の健常者と罹患者の違いを調べた。まず、健常者（19.48±7.38株）は疾患者（17.39±6.84株）よりも変異株が多いことが観察され（図2A；補足ファイル2および表S3、P＜0.001）、健常者の腸内細菌叢は株レベルの多様性が高いことが示唆された。このような差は、AS（16.92±5.64 vs 21.93±7.23、P＜0.001、平均±SD）、CD（17. 33±6.87対24.76±5.77、P＜0.001）、GD（14.78±3.75対17.61±3.37、P＜0.001）、LC（19.51±6.01対23.77±6.51、P＜0.001）、SF（17.56±3.81対25.51±3.0、P＝0.016）であった。対照的に、CRC患者は健常対照者よりも株レベルの多様性が高かった（22.26±6.80 vs 20.73±7.11, P = 0.025）。BC（11.10±2.66対11.83±2.83）、Cov19（14.29±7.41対16.28±10.84）、PCOS（15. 32±3.87対15.6±14.67）、SCZ（11.56±3.71対11.29±3.45）、T2D（19.13±5.61対19.78±5.18）、UC（22.91±8.62対24.76±5.77）であった。
図2

図2 変異ゲノム数とSNV数の正規化評価と比較。(A) 全データセット（N = 1,711）および各疾患表現型における正規化変異ゲノム数の比較をボックスプロットで示す（ウィルコクソン順位和検定）。(B）種レベルでの腸内細菌プロファイルに基づくアルファ多様性（シャノン指数とシンプソン指数）の比較。(C）変異ゲノム数とシャノン指数との強い相関（スピアマン相関）。(D）健常群と非健常群からα多様性が同じ個体をマッチングしてα多様性を比較し、変異ゲノム数が同じ個体も変異ゲノム数で比較した（Wilcoxon符号順位検定）。(E）全データセット（N = 1,711）および各疾患表現型における健常者と非健常者の腸内微生物のSNV数を正規化し、Boxplotで比較した（Wilcoxon順位和検定）。P値はfdr法で補正し、有意差は*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001の名目レベルで考慮した。すべての箱ひげ図において、非健康群を左、健康群を右とした。
ほとんどの研究は、健康なコホートとそうでないコホートの種レベルでのアルファ多様性の違いを報告している。ここで我々の統合解析は、アルファ多様性（シャノン指数またはシンプソン指数のいずれかを使用）が宿主の病状によって異なることを示した（図2B、P < 0.001、ウィルコクソン順位和検定）。興味深いことに、変異ゲノムの豊かさは、シャノン指数（R = 0.652、P < 0.001）またはシンプソン指数（R = 0.596、P < 0.001）と有意に相関していた（図2C）。一つの可能性として、腸内微生物の多様性が低いと、変異ゲノムの数が少なくなることが考えられる。このような懸念に対処するため、α多様性が0.01（Shannon index）または0.001（Simpson index）以内の健常者と非健常者をマッチングさせ、正規化した変異ゲノム数を比較した（92.87％と92.69％のサンプルが含まれた）ところ、Shannon indexとSimpson indexは、非健常者群の方が健常者群よりも0.01または0.001高かった。このように、α多様性がほぼ同じ場合、変異ゲノム数が異なることがわかった（Wilcoxon順位符号検定、Shannon indexが等しいサンプルではP < 0.001、Simpson indexが等しいサンプルではP = 0.023）。したがって、ほとんどの場合、健康な個体はそうでない個体よりも株レベルの多様性が高いと考えられる（図2D；補足ファイル2および表S4）。同時に、変異ゲノムの正規化数が0.01未満の個体もマッチングさせ、そのα多様性（27.47％のサンプルが含まれる）を宿主グループ間で比較した。興味深いことに、シンプソン指数には依然として疾患と関連した差が種レベルで観察され（P = 0.032）、健常群では微生物種が少なかった（図2D; 補足ファイル2および表S4）。
次に、健常者と非健常者の腸内細菌叢の変異ゲノムすべてについて、MkbシーケンスデータあたりのSNV数を推定したところ、健常者の方が非健常者よりもSNV数が多いことが示された（23.44 ± 9.93 vs 25.20 ± 10.11、図2E、P < 0.001）。AS（212.85±67.13対264.80±65.15、P＜0.001）、CD（211.48±81.11対301.02±61.23、P＜0.001）、GD（213.46±54.13対241.71±56.14、P＝0.012）、UC（257.86±107.20対301.02±61.23、P＝0.002）を含む合計4つの疾患／コホートにおいて、このような違いが検証された。対照的に、CRC患者は健常対照者よりもSNVが多い（260.39 ± 75.34 vs 241.52 ± 71.09、P = 0.045）。BC（148.22±40.47対156.71±49.76）、Cov19（190.14±125.20対260.43±238.00）、LC（270.74±77.99対289. 17±64.32）、PCOS（214.99±73.86 vs 216.58±65.64）、SCZ（148.39±62.71 vs 135.49±58.73）、SF（604.81±280.69 vs 781.80±83.49）、T2D（371.49±78.86 vs 339.52±79.23）であった。病態間でこのような高いレベルでの遺伝子組成の違いが見られることから、特定の菌株／変異ゲノムにおけるSNVプロファイルをさらに明らかにする必要がある。
複数の宿主の健康状態に関連する菌株レベルの多様性
疾患状態が個々の微生物株のSNVプロファイルや腸内細菌叢の他の重要な進化パターンとも関連しうるかどうかをさらに調べるために、1,711人のメンバー集団で変異頻度が30％以上の75株すべてを網羅的に解析した（図3）。まず、これらの菌株の有病率を比較したところ（Supplementary file 2およびTable S2）、健常群、不健康群ともに有病率上位4株は、Bacteroides dorei（非健常群：87.16％、健常群：91.92％、全員：89. 36％）、Bacteroides uniformis（非健常者：76.50％、健常者：86.87％、全員：81.30％）、Faecalibacterium prausnitzii G（非健常者：65.18％、健常者：77.90％、全員：71.07％）、Parabacteroides distasonis（非健常者：69.42％、健常者：71.21％、全員：70.25％）であった。健常群では46株（46/75、61.33％）が多く、非健常群では5株（5/75、6.67％）が多かった。菌種レベルでは、バクテロイデス（Bacteroides）属の多くの菌株が、一貫して健常者の腸内で高頻度にSNVを発現していた。株レベルでは、Faecalibacterium prausnitzii G、Faecalibacterium prausnitzii D、Faecalibacterium prausnitzii C、Faecalibacterium prausnitzii K、Faecalibacterium prausnitzii Eも健常者と非健常者で多様なパターンを示した。全体として、上記の結果は、健常者集団がゲノムに幅広い変異を持つことも裏付けている（図2A）。
図3

図3 宿主の健康状態に関連する菌株レベルの全体的な多様性。合計75の変異ゲノムが、1,711人のヒトの30％以上で同定された。これらの75の変異株それぞれについて、全体的な特徴［すなわち、変異ゲノム頻度、SNV率（材料と方法を参照）、塩基配列の多様性］を、ウィルコクソンの順位和検定とフィッシャーの正確検定を用いて、健康なコホートとそうでないコホートの間で比較し、有意差は公称レベルP < 0.05とした。P値はfdr法で補正し、有意差は*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001の公称レベルで考慮した。
次に、これらの腸内細菌株のSNV率（材料と方法、式1参照）とヌクレオチド多様性が疾患状態と関連するかどうかを調べた。「SNV率」とは、あるゲノム上のSNVの相対的な頻度として定義され、他のゲノムと比較することができる。ヌクレオチド多様性は、腸内細菌叢における微生物種の集団内遺伝的多様性の測定値である（補足ファイル1および図S3）。明らかに、SNV率とヌクレオチド多様性は微生物種間、さらには菌株間（Faecalibacterium prausnitziiなど）でも大きく異なっていた。我々は、病態間でSNV率に差があった15株（75株中、20％）を同定した。この15株のうち、8株（8/75、10.67％）は非健常群で高く、7株（7/75、9.33％）は健常群で高かった。注目すべきは、15株中8株（8/15、53.33％）が主にLachnospiraceae由来であったことである。その内訳は、Blautia wexlerae、Agathobacter rectalis、Anaerostipes hadrus、Lachnospira eligens、Blautia sp900066165、Faecalicatena torques、Roseburia intestinalis、KLE1615 sp900066985であり、SCFA（酢酸および酪酸）を産生する代表的な細菌群であった。一方、Bacteroides属は、Bacteroides dorei、Bacteroides uniformis、Bacteroides xylanisolvens、Bacteroides sartorii、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides massiliensisの6株（6/20、30％）で、非健常群では3株（3/75、4％、2株はBifidobacterium）に富み、17株（17/75、22. 67％）に濃縮されていた。全体として、これらの結果から、健康な人の腸内微生物ゲノムにはより多くのSNVが存在することが確認された（図2E）。
宿主の健康状態に関連する普遍的塩基変異の偏り
次に、75の腸内菌株のSNV率とヌクレオチド多様性が疾患状態と関連していたことから、単一SNVレベルでのバリアントタイプの特異的パターン（すなわち、ヌクレオチド多様性）に絞り込んだ。まず、全1,771サンプルの6つのバリアントタイプをプロファイリングし（補足ファイル2および表S5）、バリアントタイプのプロファイルに基づくα多様性とβ多様性をサンプル間で比較した。興味深いことに、バリアントタイプのシャノン多様性（P = 0.03）は、2つのグループ間で有意差があった（図4A）。さらに、75の腸内細菌株のバリアントタイプ組成は、主に宿主の疾患状態によってクラスター化していた（R 2 = 0.004, P < 0.001, PCoA1 = 50.72%, PCoA2 = 12.36%）（図4B）。具体的には、2つの変異型（A > G|T > C, P = 0.006、A|T > T > A, P = 0.011, Wilcoxon rank-sum検定）が健常者群で濃縮され、非健常者群では1つ（C > G|G > C, P < 0.001, Wilcoxon rank-sum検定）であった（図4C; 補足ファイル2および表S5）。また、各株の宿主状態間の変異型を示し、比較した（補足ファイル2および表S6）。全体として、微生物株間で多様な変異型の分布パターン（割合）が観察された（図4D）。多くの菌株でC > G|G > Cが非健常者で有意に高い傾向にあった（31/75、41.33％）が、このような変異型は健常者ではわずか3株（3/75、4％）であった。一方、A > G|T > C変異型は健常者では複数の株で多かった（16/75、21.33%）。
図4

図4 宿主の健康状態に関連した普遍的塩基変異の偏り。(A）変異型プロファイルのShannon indexとSimpson indexを健常群と非健常群で比較した（Wilcoxon rank-sum検定）。(B）PCoAプロットは、6塩基バリアントタイププロファイルのBray-Curtis非類似度に基づく標本間差を示す。バリアントタイプに対する宿主の健康状態のエフェクトサイズを推定するためにAdonisを使用した。ヒストグラムは、各軸に沿った健常（オレンジ）サンプルと非健常（青）サンプルの分布を示す。(C)健常群と非健常群間の6塩基バリアントタイプの割合をハーフバイオリン図で示し、比較した。Nは非健常群、Hは健常群を意味する。(D)75の変異ゲノムの6塩基バリアントタイプの相対的存在量を比較し、白は塩基バリアントの偏りに差がないこと、オレンジは健常群で高いこと、青は非健常群で高いことを意味する。(E）遺伝子コード領域に位置するSNVの割合を、データセット全体と75株それぞれについて評価した。P値はfdr補正を用いたWilcoxon順位和検定から求め、有意差はP<0.05の公称水準とした。
次に、全75株について、遺伝子コード領域に生じた点変異の全体的な割合を比較したところ、病態間の差は認められなかった（89.84％対89.75％、P = 0.1、図4E）。しかし、株レベルでは、32株の遺伝子コード領域における変異の割合が、非健常株群では健常株群よりも有意に高かった（32/75、42.67％）のに対し、健常株群では3株（Bacteroides sp.）のみが高かった（3/75、4％）。このことから、疾患状態は腸内微生物株の遺伝子コード領域におけるSNVパターンを変化させる可能性が示唆された。
SCFA産生関与遺伝子における菌株レベルのコドン変異の偏り
次に、特定の腸内菌株の主要な機能遺伝子に注目し、疾患条件下での微生物の適応進化によって誘発される腸内細菌叢の潜在的な機能変化を評価した。SCFAはヒトの健康と密接な関係があると考えられており、SCFA産生量の不足は様々な疾患で観察されているが、SCFA関連遺伝子の遺伝的進化過程はこれまで報告されていなかった。そこでまず、これらの菌株がコードするSCFA産生に関連する酵素を数え、酢酸キナーゼ（ack、E.C.2.7.2.1）、プロピオニル-CoA:コハク酸CoA転移酵素（scpC、E.C.2.8.3. -）、酪酸キナーゼ（buk、E.C. 2.7.7.7）、酢酸CoA転移酵素YdiF（ydiF、E.C. 2.8.3.8）、酢酸CoA転移酵素サブユニットα/β（atoD/A、E.C. 2.8.3.8）、酪酸-酢酸CoA転移酵素サブユニットA/B（ctfA/B、E.C. 2.8.3.9 .8.3.9）、およびブタン酸補酵素A転移酵素（BcAt、E.C.2.8.3.-）である（図5A）。
図5

図5 SCFA生産関連遺伝子における菌株レベルのコドン変異の偏り。(A）3種類の短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）の生産に関連する酵素を示す。ackは酢酸キナーゼ、scpCはプロピオニル-CoA:コハク酸CoA転移酵素、bukは酪酸キナーゼ、ydiFは酢酸CoA転移酵素YdiF、atoD/Aは酢酸CoA転移酵素サブユニットα/β、ctfA/Bは酪酸--アセト酢酸CoA転移酵素サブユニットA/B、BcAtはブタン酸補酵素A転移酵素。(B）ヒートマップは、75株がコードする6つのSCFA関連遺伝子ファミリー（合計185遺伝子を含む）それぞれについて、健常群と非健常群間のpN/pS（すなわち自然選択力）の濃縮方向性を示している。pN/pSは、非同義（pN）と同義（pS）のSNVの割合という2つの割合の比である。白いセルはその株で遺伝子が存在しないことを示し、灰色のセルはpN/pSに差がないことを、オレンジ色のセルは健常者グループでpN/pSが大きいことを、青いセルは非健常者グループでpN/pSが大きいことを意味する。(C）3株のSCFA遺伝子にはコドンバリアントの偏りがあり、SNVによってコドンが終止コドンになるか、開始コドンが不活性化されることが示唆された。密度プロットは、健常群および非健常群における3株の配列相対量を示している。群間比較はWilcoxon順位和検定を用いた。Nはこれらの遺伝子にSNVを持つ個体数を表す。有病率を計算する場合、分母はN、分子はコドン変異の偏りを持つ個体数とした。フィッシャーの正確検定によるP値と有意差は、P < 0.05の公称水準で考慮した。(D）コドンが終止コドンになったり、開始コドンが不活性化したりするSNVが少なくとも3個体で検出された。横軸はSNVの位置、縦軸は個体数を表し、さらにスキャフォールド、コドン、参照ゲノム、バリアントゲノム、隣接遺伝子も示した。
次に、上記のSCFA関連酵素をコードする75株のSNVプロファイルを示した（図5B）。その結果、ほとんどの菌株が酢酸生産に関与するack遺伝子をコードしていた（74/75株、98.67%）。また、74.67％の菌株が酪酸産生に関連する代謝経路を少なくとも1つ有し、6菌株が少なくとも2つの経路を有していた。また、バクテロイデス属はプロピオン酸の主な生産者である（16/21、76.19%）。次に、これらの遺伝子のpN/pS値が健康なコホートとそうでないコホートで異なるかどうかを比較し、腸内選択圧の大きさを評価した。その結果、4系統のpN/pS比は健常者群で高く、7系統は非健常者群で高かった。疾患に関連した腸内選択圧の違いにより、10株で関連遺伝子による酪酸産生が促進された。Bacteroides stercorisのscpC遺伝子のみpN/pSに差があり、非健常群が健常群より高かった。以上より、宿主の健康状態により、各菌株におけるSCFA関連遺伝子の適応進化パターンは多様であることが明らかとなった。
次に、これらのSNVがSCFAの産生を特異的に調節するかどうか、またどのように調節するかを調べた。ここでは、SCFA関連遺伝子上のSNVのうち、コドンが終止コドンになるSNVと開始コドンが不活性化されるSNVの頻度を比較した（図5C）。興味深いことに、これらのSNVは主に3株（Faecalibacterium prausnitzii C、Faecalibacterium prausnitzii D、Bacteroides stercoris）で見つかった。非健常株群におけるSNV由来のコドン変化の頻度は、疾患に関連した選択圧のため、健常株群よりも有意に高かった（補足ファイル2および表S7）。それぞれ、Faecalibacterium prausnitzii Cの2つの遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンに影響するコドン変異の偏りを有していた。また、Faecalibacterium prausnitzii Dのack遺伝子（1.08％対0％、P = 0.028）およびBacteroides stercorisのscpC遺伝子（5.03％対1.86％、P = 0.008）でもコドンバリアントの偏りが見られた。従って、非健常群の上記菌株に生じた適応的変異は、SCFA産生遺伝子の機能喪失と考えられる。いくつかの6株のSCFA遺伝子は、健常群ではより大きな腸内選択圧を受けたが、上記のコドン変異型の増加は引き起こさなかった（補足ファイル1および図S4）。また、前述の4株の相対的存在量を宿主状態間で比較したところ、Faecalibacterium prausnitzii C株（0.56％ vs 0.61％、P < 0.001）、Faecalibacterium prausnitzii D株（0.51％ vs 0.43％、P < 0.001）、Bacteroides stercoris株（2.43％ vs 2.56％、P = 0.007）の3株は健常者群でより多く存在することがわかった。最後に、SCFA産生に影響を及ぼす可能性のある腸内微生物株（宿主3個体以上で蔓延、図5D；補足ファイル2および表S7）の共通コドン変異を報告した。これには、Faecalibacterium prausnitzii C ack遺伝子の3つのアミノ酸、Faecalibacterium prausnitzii C BcAt遺伝子の1つのアミノ酸、Bacteroides stercoris scpC遺伝子の2つのアミノ酸が含まれる。
SNVプロファイルに基づくGMHIは宿主の健康状態を示す
腸内マイクロバイオーム健康指標（GMHI）は、メタゲノムシーケンスデータから得られた種レベルの分類学的存在量プロファイルを用いて、疾患の有無（または有無）を予測するために開発することが提案された。全体として、微生物の存在量は本質的に疾患状態に関連する生態学的変化を反映している。上記の知見から、SNVプロファイルは宿主の状態も予測でき、複数の疾患条件下で腸内微生物が適応する度合いや程度を反映することができると考えた。
まず，GMHIが宿主の状態をどの程度予測できるかを検証するために，変異ゲノムの配列存在量プロファイルを用いてGMHIを構築した（abundance-based GMHI，"Materials and Methods "参照）．発見コホートの1,711のメタゲノミクスサンプルと検証コホートの446のサンプルについて、合計2,740株の非冗長配列の相対存在量を計算した。注目すべきは，GMHIを算出するためのバイオマーカーとして，疾患状態間でDNA配列に差のある微生物株を選択したことであり，これは以前の研究（33）とは若干異なっていた（「材料と方法」および「コードの利用可能性」）。選択された471の株レベルマーカーのうち、222は非健常群に富み、249は健常群に富んでいた。その結果，アバンダンスに基づくGMHIの全体的な予測精度は73.97％（P = 9.98e-66）であったが，このGMHIは9つのコホートで健常群と非健常群の間に有意差を示した（図6A）．この結果は、種レベルでの腸内微生物の分類学的存在量に基づくオリジナルのGMHI法の報告精度（〜70％）と同様であった（33）。
図6

図6 SNVsプロファイルに基づくGMHIは宿主の健康状態を示す。GMHIは、変異ゲノムの配列存在量プロファイル（すなわち、存在量ベースのGMHI）、変異ゲノムのSNV率プロファイル（すなわち、SNV率GMHI）、およびSCFA遺伝子のSNVプロファイル（すなわち、SCFA-SNV GMHI）に基づいてそれぞれ計算された。(A）存在量ベースのGMHIの予測性能（AUROC：73.97%）．(B）SNV率プロファイルに基づくGMHIの予測性能（AUROC：74.23％）P = 4.12e-67、10コホートが該当する。(C）SCFA遺伝子のSNVプロファイルに基づくGMHIの予測性能（AUROC：65.20％）。GMHI値はWilcoxon順位和検定を用いて健常群と非健常群で比較した。有意差はP＜0.05の名目水準で考慮した。すべての箱ひげ図において、左が非健常群、右が健常群であった。
次に、各微生物株の遺伝的変異の規模を表すSNV率（式1）が、宿主の病状を予測する独立した指標として使用できるかどうかを調べた。そこで、各サンプルに含まれる冗長でない2,740株のSNV率を算出し、従来用いられてきた存在量ベースの特徴量表と比較して、新たなSNV率特徴量表を形成した。次に、宿主状態間でSNV率に有意差がある微生物株を同定し、そのSNV率を用いて疾患状態を分類するための新しいGMHIを構築した（材料と方法を参照）。選択された470のマーカーのうち、214は非健常群で濃縮され、256は健常群で濃縮された。さらに，受信者動作特性曲線（ROC）を用いて，このSNV-rate GMHIの高い予測精度を示した（AUROC＝74.23％，Wilcoxon順位和検定，P＝4.12e-67）。その性能は，菌株レベルの存在量に基づくGMHIよりもわずかに優れていた．さらに、このGMHIは10個の独立したコホートにおいて宿主の状態を区別できることがわかった（図6B）。
我々は、腸内微生物におけるSCFA遺伝子の変異頻度／偏りが、健康状態を区別できる可能性があることを示した。そこで次に、75の腸内細菌株のSCFA遺伝子のSNVプロファイルに基づいてGMHIを構築する可能性を検討した。我々は、適応的SNVを持つ75菌株から、9つの遺伝子ファミリー（ack、buk、ydiF、atoD、atoA、ctfA、ctfB、BcAt、scpC）から185遺伝子を収集した。まず、185の遺伝子で同定されたSNV（有無）のカウント表を作成した。次に、SNV数をゲノムレベルに集約し、各サンプルの各ゲノムにおけるSCFA遺伝子のSNVの相対頻度を算出した（「材料と方法」、補足ファイル2および表S8参照）。選択された48マーカー中、11マーカーが非健康群で濃縮され、37マーカーが健康群で濃縮された。選択された微生物SNVバイオマーカーにより、このSCFA GMHIはかなり良好な予測精度を示した（AUROC＝65.20％、Wilcoxon順位和検定、P＝1.07e-26）。このメタアナリシスにおける12のコホートのうち、SCFAに基づくGMHIは6つのコホートで有効であった（図6C）。この精度は完全ではないが、SCFA遺伝子の遺伝的変動性だけで、宿主の健康状態によるマイクロバイオームの違いを少なくとも部分的には説明できることが強く示唆された。
SNVによって誘導されるSCFA産生の機能的変化とGMHIの予測力の外部検証
上記の結果を検証するために、さらに動脈硬化性心血管疾患（ACVD）と結核（TB）に関連する、非健康な244人と健康な202人を含む合計446サンプルを含む3つの独立したコホートを対象とした（補足ファイル2および表S9）。4株の相対存在量の差は、コホートが異なるため、図5と比較して変化した（図7A）。その結果、Faecalibacterium prausnitzii C（P = 0.37）の相対存在量は健常群では非健常群に比べて有意に高くなくなったが、Faecalibacterium prausnitzii D（P < 0.001）とBacteroides stercoris（P = 0.042）の存在量は健常群で高くなった。興味深いことに、Faecalibacterium prausnitzii Cのack遺伝子（P = 0.034）とBacteroides stercorisのscpC遺伝子（P = 0.031）では、依然としてコドンバリアントの偏りのパターンに差が認められたが、他のコドンの偏りは証明されていない（補足ファイル1および図S5）。他の3遺伝子は、コドンバリアントバイアス（イニシエーターとターミネーター）の確率が低いため検証されなかったと推測されるが、これも図5から確認できる。全体として、特定の腸内微生物に存在するSCFA代謝遺伝子は、健康状態の異なる宿主においてコドン変異の偏り（イニシエーターとターミネーター）を示すことが示された。
図7

図7 SNVによって誘導されるSCFA産生の機能変化とGMHIの予測力に関する外部検証。(A）2つの腸内微生物（すなわち、Faecalibacterium prausnitzii CのackとBacteroides stercorisのscpC）から得られた2つの重要なSCFA産生遺伝子のコドン変異の偏りを、446の追加メタゲノムサンプルを用いて検証した。密度プロットは、Wilcoxon rank-sum検定を用いて、健常群と非健常群における2株の配列相対量の比較を示している。ack遺伝子とscpC遺伝子の変異体比率を宿主グループ間で比較した。Nはそれぞれの遺伝子にSNVを持つ個体数を示す。有病率を計算する場合、分母はN、分子はこのコドン変異の偏りを持つ個体数であった。フィッシャーの正確検定によるP値と有意差は、P < 0.05の公称レベルで考慮した。(B）検証コホートにおける3つのGMHIの予測性能。ROC解析の結果，3つのGMHIのAUROCはそれぞれ71.50％，69.28％，63.57％であった。これらのGMHIはそれぞれ、ACVDまたは結核と健常者を区別することができる。GMHI値はWilcoxon順位和検定により健常群と不健康群間で比較された。有意差はP＜0.05とした。すべての箱ひげ図において、非健康群を左、健康群を右とした。
次に、ACVDと結核のコホートについて、SNVプロファイルに基づくGMHIをさらに検証した（補足ファイル2、表S10-S12）。全体として、3つの異なるGMHIはそれぞれ許容できる予測精度を示した。存在量に基づくGMHIの検証精度（すなわちAUROC）は71.50％（Wilcoxon rank-sum検定，P = 5.2e-15），SNV率に基づくGMHIの検証精度（すなわちAUROC）は69.28％（Wilcoxon rank-sum検定，P = 2.3e-12），SCFA-SNV GMHIの検証精度（すなわちAUROC）は63.57％（Wilcoxon rank-sum検定，P = 8e-7）であった．さらに、これらのGMHIはACVDや結核と健康状態を区別することができる。以上より、腸内細菌叢の遺伝的変化により健康状態の変化を識別できることが示され、炎症性腸疾患やこれまで検討されていなかった多くの疾患の病因の根底にある、SCFA産生に関連するSNV誘発性の機能的変化の重要性が強調された。
考察
腸内微生物の遺伝子組成は、宿主の異なる腸内環境下で微生物が適応するために常に変化していると考えられており、SNVはその代表的な形態の一つである(33 - 35)。今回、我々は初めて、複数のヒト集団における健康状態の違いによる腸内微生物の普遍的な進化パターンを明らかにした(3)。以前の研究では、浅い配列決定データであってもSNVの構成は存在量の変化と相関しない(36)という洞察が得られた。したがって、集団レベルの遺伝的過程は、疾患の予測モデリングのためのマイクロバイオームデータの新たな情報層となりうる。次に、微生物株全体で非常に多様な進化パターンが見つかっており（5, 6, 11, 36）、腸内微生物の進化の規模とスピードと宿主の疾患発症との関係を深く理解することの重要性が浮き彫りになった。
腸内微生物はSCFA産生を通じて宿主の腸内健康を調節することができ、これは腸の恒常性とエネルギー代謝の調節に寄与している(37)。腸内のある種の主要なSCFA産生細菌は、健康なグループとそうでないグループとの間で遺伝的または微生物進化的多様性が著しく異なるため、懸念されている。Lachnospiraceaeは酢酸および酪酸産生菌の代表的なグループであり、宿主に有益な効果をもたらす(38)。我々の研究では、SNV率が異なる腸内微生物の半数以上がLachnospiraceaeに属していた。ヌクレオチド多様性が異なる株の約30％は、酢酸とプロピオン酸の一般的な生産者であるバクテロイデス（Bacteroides）に属する。これらの結果は、健康状態に関連した腸内淘汰圧による進化が、SCFA関連遺伝子の活性に関与している可能性を示唆している。次に、適応進化が複数の医学的条件下でSCFA遺伝子の代謝活性に影響を与えることを示した。SCFAの産生抑制は、関連遺伝子のコード領域に生じた好ましくない変異と関連している可能性がある。pN/pSが大きいとコドン変異が起こりやすく、イニシエータやターミネータに変異があると、腸内細菌叢の潜在的な機能不全が複数の慢性疾患につながると考えられた。興味深いことに、4つの菌株において、健常群と比較して非健常群では多くのコドンがターミネーターに変異する傾向が観察された。さらに、これらの微生物の遺伝子がより大きな腸内選択圧にさらされているとしても、この傾向は健常群では起こらない。したがって、宿主の健康状態の違いによる腸内選択圧が、SCFA遺伝子の明らかなコドン変異の偏りを促進していると推察される。以上のことから、健康でない人の腸内細菌叢にはSCFA産生因子が少ないだけでなく、これらの産生因子の遺伝子発現は適応的変異体によって機能を失っていると結論された。
バイオマーカーの同定は、腸内細菌に基づく慢性疾患予測モデルの確立に向けた重要な目標の一つである。一方では、非侵襲的な診断に応用でき、他方では、宿主の健康と腸内微生物との因果関係を構築するビジョンも提供する。腸内微生物の組成は、機能性遺伝子、代謝産物、臨床的特徴に次いで、最も基本的なバイオマーカーとなっている(39, 40)。最近、我々はSNVや複合プロファイルに基づく診断モデルの構築を試み、良好な結果を得た(9, 11)。GMHIは種の相対存在量に基づいて健常群と非健常群を区別する強力な指標であった(33)。我々はSNV率に基づくGMHIを用いて健常個体と非健常個体の比較を行い、SNV率が宿主の健康状態を評価する独立した指標であることを示した。SCFA遺伝子のSNVレベルでは、微生物と宿主の健康関係の深いメカニズムの理解に役立つ可能性がある。現在のところ、腸内微生物に基づいて宿主の健康状態を評価する統一的なモデルを実現することは難しいかもしれないが、腸内微生物の遺伝的進化はさらなる洞察を与えてくれるだろう。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、我々のメタアナリシスのサンプルサイズは、公開データベースから可能な限り多くの症例サンプルを含めたとはいえ、決して大きくない。発見コホートでは、16の研究から12の表現型について1,711サンプルを収集し、検証コホートでは446サンプルを収集した。また、複数の慢性疾患に対する普遍的な腸内細菌マーカーを探索しようとしたいくつかの研究では、通常メタ解析に3,000以上のメタゲノムサンプルが含まれている。このビッグデータ時代においては、宿主の健康に影響する腸内微生物の遺伝的変異に関する我々の知見を検証するために、より多くのメタゲノムデータをメタ解析に含めるべきである。第二に、SNVと血圧、高比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白など、より多くの宿主表現型との関連を構築する予定であった。しかし、サンプルのメタデータが不足していたため、この試みは失敗に終わった。したがって、科学者がより多くの宿主表現型と関連するコンセンサスSNVシグネチャーを探索するために、より一般にアクセス可能なデータを利用できるようにするオープンデータサイエンスの必要性が急務である(7)。
謝辞
メタゲノムデータを公開してくれたすべてのチームに感謝する。
本研究は、中国国家自然科学基金（32160545）および青島口腔疾患臨床研究センター（22-3-7-lczx-7-nsh）の支援を受けた。
C.M.、Y.Z.、S.J.、F.T.、S.H.、J.Z.はデータの収集と解析を行った。C.M.、S.H.、J.Z.が原稿を執筆した。著者全員が最終原稿を読み、承認した。
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要旨
宿主の絶え間ない淘汰圧のもとでは、腸内微生物群集の生態学的変化に先立って適応的な進化的変化が起こりうるが、宿主の疾患状態との関連については十分に検討されていない。多様なヒト疾患にまたがる腸内微生物の疾患関連一塩基変異（SNV）を探索する。12のヒト疾患にまたがる16の症例対照研究から得られた1,711の腸内メタゲノムサンプルのメタ解析を行い、検証のために446人のコホートを追加した。全体として、健康な人はより多くの変異した腸内常在菌を保有しており、主に短鎖脂肪酸（SCFAs）産生菌が関与するSNVが多かった。さらに、腸内細菌の塩基変異の偏りには、健康な人とそうでない人の間で広範な違いが観察され、宿主の病状によって腸内細菌の進化の方向性が異なることが示唆された。さらに、非健常者集団において、非同義変異が4つのSCFA産生遺伝子の機能喪失につながる可能性があることを見出し、そのうち、Faecalibacterium prausnitzii CおよびBacteroides stercoris由来の2つの遺伝子（すなわち、ackおよびscpC）については、それぞれ外部検証を行った。その後、全変異株のSNV率に基づく新しい腸内細菌叢健康指標を開発し、74.23％の精度で宿主の健康状態を分類し、高い精度（AUROC = 69.28％）で検証した。我々の研究は、ヒトの慢性疾患を予測することもできる腸内微生物の適応を特徴付けるために、腸内細菌叢の遺伝的変異を利用することの重要性を強調している。重要性大部分の研究は存在量の変化に焦点を当て、疾患状態に関連するマイクロバイオームの変動を説明できないことが多かった。興味深いことに、SCFA産生に関するいくつかの遺伝的バイオマーカーが、メタアナリシスに含まれるほとんどの慢性疾患をカバーできることが事前に判明した。今後、宿主の健康状態に関連する腸内細菌叢の適応進化と生態系とのダイナミックな相互作用をさらに探索することは、科学的にも臨床的にも重要である。

キーワード SNV率、腸内細菌叢、腸内細菌叢健康指数、短鎖脂肪酸、一塩基変異、バリアントバイアス。

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腸内細菌叢の一塩基変異体プロファイリングが新たな腸内健康評価法を示唆する

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