常在菌によって代謝された食品着色料は、インターロイキン23の発現が調節されないマウスの大腸炎を促進する

常在菌によって代謝された食品着色料は、インターロイキン23の発現が調節されないマウスの大腸炎を促進する
Zhengxiang He, Lili Chen, [...], and Sergio. A. リラ

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要約
炎症性腸疾患（IBD）の発症には、遺伝的素因と環境因子の両方が関与していると考えられている。ヒトにおける遺伝子研究では、インターロイキン（IL）-23シグナル伝達経路がIBDと関連しているが、疾患に寄与する環境要因は不明なままである。我々は、世界で最も多く存在する食品着色料であるアゾ染料Red 40とYellow 6が、IL-23を条件付きで発現するマウス、あるいはIL-23の発現を増強させた2つの動物モデルでIBD様の大腸炎を誘発することを明らかにした。IL-23発現の増強は、インターフェロン-γを発現する活性化CD4+T細胞の生成をもたらし、Red 40に暴露されたマウスに病気を移した。大腸炎の誘発は、常在細菌が Red 40 のアゾ還元と代謝物である 1-amino-2-naphthol-6-sulphonate sodium salt の生成を促進することに依存していた。これらの知見は、特定の着色料が、IL-23シグナルが増加したマウスにおいて大腸炎を発症させる新たなリスクファクターであることを示唆している。

キーワード 着色料、食品添加物、CD4+ T細胞、IFN-γ、IL-23、大腸炎、微生物叢、アゾ結合、代謝産物

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Heらは、食品着色料のRed 40とYellow 6が、IL-23の発現が調節されないマウスに大腸炎を誘発することを見出した。大腸炎の発症には、着色料の細菌処理が必要であり、IL-23によって誘導された病原性CD4+T細胞がIFN-γを産生することに依存している。

イントロダクション
前世紀における大気・水質汚染物質の濃度の劇的な変化と、人間の食事における加工食品や食品添加物の使用量の増加は、炎症性疾患や自己免疫疾患の発生率の増加と相関している。これらの環境の変化は、これらの疾患の発症に寄与していると考えられているが、そのメカニズムについては比較的知られていない。

本研究では、世界中で数百万人が罹患する疾患である炎症性腸疾患（IBD）の発症に対する特定のクラスの食事製品（食品着色料）の寄与に焦点を当てます（Ng et al.、2018）。人工食品着色料は、19世紀末に初めて食物連鎖に導入されましたが(Sharma et al., 2011)、世界中の食事に非常に普及しているにもかかわらず、IBDの文脈で研究されていません。Allura Red ACとしても知られるRed 40は、世界で最も豊富な食品着色料であり、年間生産量は230万キログラムを超えます(Sharma et al., 2011)。Red 40は、多くの国で食品着色料として認可されている赤色アゾ色素であり、宿主に対する細胞毒性、発がん性、変異原性の有害作用はないと報告されている(Bastaki et al., 2017b; Honma, 2015; World Health Organization, 2017)。IBD発症に関する食品着色料の情報の少なさは、この症状の病因における遺伝的および免疫的要因について知られていることとは対照的です。200以上の遺伝子座と遺伝子がヒトのIBDと関連しており(Liu et al., 2015)、いくつかの免疫因子はマウスとヒトで十分に研究されています。IBDの発症に寄与する免疫因子のうち、最もよく研究されているのはインターロイキン（IL）-23（IL-23）です。ヒトにおけるゲノムワイド関連研究は、IL-23シグナル伝達経路をIBDと関連付け(Duerr et al., 2006)、最近の臨床研究は、クローン病（CD）（Feagan et al., 2017; Sandborn et al., 2012; Sands et al., 2017）および潰瘍性大腸炎（UC）（Sands et al., 2019）などの異なる形態のIBDの患者においてIL-23を標的とする治療が有効であることを示している。

IL-23は、IL-23特異的なp19サブユニットと、IL-12にも存在するp40サブユニットによって形成されるヘテロ二量体サイトカインである。CDとUCの両患者において、骨髄系細胞によるIL-23の産生の上昇が指摘されています(Kobayashi et al., 2008; Kvedaraite et al., 2016)。IL-23は、抗体遮断または遺伝子欠損マウスを用いたいくつかの研究において、大腸炎発症に寄与することが示されている(Bernshtein et al., 2019; Geremia and Jewell, 2012; Powrie et al., 1994)。しかし、我々の知る限り、IL-23発現のアップレギュレーションがマウスにおける大腸炎の誘発に十分であることを実証する研究は現在までにない。最近の報告では、IL-23のアップレギュレーションが大腸炎発症に寄与する可能性が示唆されているが（Bernshteinら、2019）、マクロファージ由来のIL-23はそのような細胞もIL-10シグナル伝達を欠いているので、その設定における病態の唯一のドライバーであるとは考えにくい（Bernshteinら、2019）。

私たちの以前の研究では、骨髄系細胞によるIL-23の過剰発現は、成体マウスにおける大腸炎の誘発には十分ではないようであることがわかりました（Chen et al.、2018）。今回開発したマウスは、CX3CR1陽性の骨髄系細胞にIL-23を条件付きで発現させたマウス（R23FRマウス）です。R23FRマウスは、Rosa26-lox-STOP-lox-IL23マウスとCX3CR1CreERマウス（FRマウス）を交配して作製した（Chen et al.，2018）。タモキシフェン（TAM）処理により、R23FRマウスはCX3CR1陽性細胞でIL-23を発現するが、当施設で使用する標準食（Labdiet 5053）を与えた場合、大腸炎を発症することはない。大腸炎は、R23FRマウスをカスタムダイエット2019（TD.160647、Envigo）のサイクルに繰り返し暴露した場合にのみ観察される（Chenら、2018）。組織学的に、TAM＋食餌2019によって誘導されるR23FRマウスの大腸炎は、ヒト潰瘍性大腸炎に似ており、TAMの2サイクル目（d21）後に明らかになる（Chen et al.、2018）。この大腸炎は一過性であり、食餌2019を中止した後、マウスは寛解に入る(Chen et al., 2018)。その後、寛解状態にあるR23FRマウスをTAMを含まない食事2019で処理すると、大腸炎が再燃する（d56）（Chen et al.、2018）。重要なのは、最初のTAM処理後、CX3CR1陽性細胞におけるIL-23発現は時間経過とともに安定しており、再発の発生はIL-23発現の増加によって引き起こされないことを示している(Chen et al., 2018)。

R23FRマウスに与えた食餌の異なる成分をスクリーニングすることにより、我々は現在、我々の実験で使用したTAM含有食餌の1つの識別を容易にするために添加した食品着色料Red 40が、食餌2019に存在する結腸原性物質であることを発見した（Chen et al.、2018年）。我々はここで、Red 40単独では対照マウスで大腸炎を誘発しないが、IL-23過剰発現マウスでは重度のIBD様大腸炎を誘発することを示す。大腸炎の発症は、常在菌によるRed 40の処理と、インターフェロン（IFN）-γを産生するCD4+ T細胞に依存する。IL-23が誘導される前にRed 40を与えた動物は、制御性T細胞（Treg）の誘導を介してIL-23とRed 40のチャレンジに反応しなくなり、通常の条件下でこの化合物に対する耐性が発達することが示唆された。さらに、Bacteroides ovatusとEnterococcus faecalisがR23FRマウスのRed 40誘発大腸炎に寄与していることを、無菌マウスのモノクロナイズにより明らかにした。重要なことは、R23FR マウスにおいて、Red 40 と Yellow 6 のアゾ還元物である 1-amino-2-naphthol-6-sulphonate sodium salt (ANSA-Na) が寛解期に大腸炎を誘発する可能性があることを示すことである。また、IL-23 の発現が増強された非トランスジェニック野生型マウスでは、Red 40 が大腸炎誘発剤として機能することを示した。これらの知見は、IL-23の発現が異常な条件下では、特定の食品着色料が大腸炎発症の環境リスク因子であることを示唆する実験的証拠となる。

結果
Red 40はIL-23を過剰発現したR23FRマウスに大腸炎を誘発する。
大腸炎の誘発を占める主要な食事成分の特定を開始するために、我々は食事2019（TD 160647）を水とエタノールで可溶化し、寛解期（d48、食事2019 TAM処理後）のR23FRマウスに与えてこれらの画分の大腸炎活性を試験した（Fig. S1A）。その結果、95%エタノール可溶性画分ではなく、水溶性画分がR23FRマウスの大腸炎を誘発することを、糞便リポカリン-2（Lcn-2）（図S1B）および腸管組織学（図S1CおよびS1D）により測定した。これらの結果は、食餌2019の大腸菌誘発性成分が水溶性であることを示唆した。さらに水溶性画分とエタノール可溶性画分を比較したところ、両者は色が異なっており、これは水溶性の食用色素であるRed 40の存在に起因していた（Fig.1A）。Red 40は、タモキシフェンの存在を示すために、カスタムダイエット2019に添加された。Red 40が大腸炎のフレアーの誘発に寄与したかどうかを試験するために、我々は、食事2019の2つのバージョン（2019グレー、TD 130833 vs 2019レッド、TD 160647）を直接試験した（図S1E）。我々は、2019グレー（TD 130833）ではなく、レッド40（TD 160647）を含む食餌2019が、R23FRマウスにおいて大腸炎のフレアを引き起こすことを見出した（図S1F〜S1H）。さらに、飲料水中のRed 40とともに食餌2019グレー（TD 130833）を投与すると（Red水）、食餌2019レッド（TD 160647）によって誘発されるものと同様の重度の疾患が誘発された（図S1E-S1H）。

Fig 1.
Fig 1.
Red 40は、IL-23過剰発現マウスにおいて大腸炎を誘発する。
試験への食餌切り替えに伴う影響を排除するため、我々の動物施設標準食（LabDiet 5053）にTAMを添加し、飲料水にRed 40を投与することで大腸炎が引き起こされるかどうかを試験した。着色料を含まないTAM飼料（5053 TAM、TD.190129）をマウスに与え、飼料2019で見られたのと同じ濃度のRed 40を飲料水中に添加（0.25g/L）しました（図1B）。我々の以前の結果(Chen et al., 2018)と一致して、TAMがCX3CR1+細胞で誘導したIL-23発現は、マウスが水を飲んだときに大腸炎を誘導しなかった(図1C--1E).1E)。Red 40を単独でマウスに投与しても大腸炎は生じなかったが、Red 40をTAMとともに投与（Red 40 water + TAM）すると、R23FRマウスに重度の再発寛解性大腸炎が生じた（図1C--1E).1E).1E)。Red 40水＋TAMで処理したマウスは、7日目には大腸に炎症が見られなかったが、21日目には盲腸の粘膜に著しい白血球の浸潤が見られた。48日目には、これらの浸潤は消失した（Fig. 1C--1E）.1E）。注目すべきは、TAMを用いないRed 40水の3サイクル目の処理（d49からd56まで）で再発が誘発されたことである（図1C--1E）.1E)。この時点（56日目）で、R23FRマウス（Red 40水＋TAM）の盲腸および結腸はともに、顕著な白血球浸潤、陰窩消失、上皮損傷、潰瘍形成を伴う重度の炎症を示した（Fig. 1D）。これらの所見は、TAMおよび食餌2019（Red 40の0.25g/kg）で処理したR23FRマウスで観察されたものと同様であり（図S1H）、Red 40が食餌2019に存在する大腸炎誘発物質であることが示された。

Red 40は、食品、医薬品、飲料に広く存在する。飲料水や食事に含まれるRed 40がR23FRマウスの大腸炎を促進することを示したので、次に、Red 40を含む飲料やRed 40を含む医薬品をヒトに与えるとR23FRマウスの再発の発症を促進するかどうかをテストした。寛解期（d49、TAMおよびRed 40投与後）のR23FRマウスに、Red 40含有飲料Kool-Aid（Red 40を200mg/L含有）（Stevens et al, 2014）またはRed 40含有水和液Pedialyteチェリーパンチ味（Red 40を16mg/L含有）ではなく、Red 40を含まない水和液Pedialyteで大腸炎の発症を促進し（図1F--1H），1H）、骨髄系細胞でIL-23を過剰発現するマウスにおいてRed 40が大腸炎の発症を誘導することをより確認した。

以前、我々は、寛解状態のR23FRマウスから得られた未分画の腸間膜リンパ節（mLN）CD4+ T細胞が、食事スイッチにさらされたRag1-/-マウスに大腸炎を移すことを示した（R23FR→Rag転移モデル）（Chen et al.、2018）。上記に示した結果に基づいて、我々は、Red 40がR23FR→Ragトランスファーモデルにおける疾患発症に寄与する可能性があると仮定した。予想通り、寛解期（d48、TAMおよびRed 40処理後）のR23FRマウスのmLNから得られた未分画CD4+ T細胞は、飲料水にRed 40を入れて与えたRag1-/-マウスに病気を移し、通常の水では移さなかった（図1I--1K）.1K）.1K。これらの結果は、Red 40とIL-23に応答した疾患発症がCD4+ T細胞に依存していることを示す。

IL-23発現前のRed 40曝露は、Red 40に対するTregを介した耐性の発生をもたらす
R23FRマウスにおけるRed 40の大腸炎誘発特性は、その報告された安全性プロファイルとは対照的である。広範な安全性試験により、Red 40には有害な細胞毒性、発がん性、変異原性がないことが証明されています(World Health Organization, 2017)。Red 40の摂取が集団全体における大腸炎の発症につながらないという事実は、この化合物（またはこれに結合するタンパク質、またはその代謝物）に対する免疫学的な耐性の発達を示唆しています。そこで、IL-23を誘導する前にRed 40を与えた動物は、IL-23とRed 40に反応しなくなることがわかり（図2A--2C）、通常の条件下でこの化合物に対する耐性が発達していることが示唆された。そこで次に、Red 40に暴露したコントロールマウス由来の制御性T細胞（Treg）が、大腸炎の発症を抑制または減弱させることができるかどうかを試験した（Fig.2D）。寛解期にあるR23FRマウスのmLNからの大腸炎誘導エフェクターCD4+ T細胞（CD45.2+）を、Red 40（Red 40 Treg）または水（水Treg）で処理した野生型マウスから分離したTreg細胞とともにRag1-/-マウスに移植した（Fig. 2D） 。重要なことは、エフェクターCD4+ T細胞および水処理マウス由来のTregを移植したマウスは、顕著な大腸炎を発症した（図2E--2F）.2F）.2F）。対照的に、Red 40処理マウスから分離したCD4+エフェクター細胞およびTregを移植した動物は、有意に少ない大腸炎を有した（Fig. 2E--2F）.2F)。これらの結果は、IL-23発現の上昇前のRed 40曝露がTregを介した耐性の発達をもたらし、IL-23の発現上昇がこの化合物に対する耐性の発達を妨げることを示唆している。

Fig.2
図2
Red 40で誘導されたTregはR23FRマウスの大腸炎発症から保護される。
Red 40による大腸炎はIFN-γに依存するが、IL-17A、IL-17F、TNF-α、IL-22には依存しない
R23FRマウスにおいて、Red 40がCD4+T細胞を介して疾患を促進することを示した後、我々は次に大腸炎発症の原因となる免疫原性メカニズムを明らかにしようとした。IL-23は、CD4+T細胞によるIL-17、IL-22およびIFN-γのようなサイトカインの産生を制御することが知られている。次に、これらのサイトカインが病気の発症に影響を与えるかどうかを、抗体や遺伝子欠損マウスを使って検証した。その結果、TNF-α、IL-17A、IL-17Fを遮断しても、R23FR→Ragトランスファーモデルでは大腸炎発症を抑制できないことがわかった（図3A--3C）.3C）。R23FRマウスと交配したIl22-/-マウス（Chenら、2019）を用いることにより、IL-22欠損は、2019 TAM（TD130968）でプライミングしたR23FRマウスおよび食事2019（赤、TD 160647）でチャレンジしたR23FRマウスにおける大腸炎の発生に影響しないことが分かった（Fig.3D）。

Fig 3.
図3.
IFN-γ産生CD4+ T細胞は、セカール炎症の発生に重要である。
上記の結果とは対照的に、R23FR→Ragトランスファーモデルでは、IFN-γの遮断により大腸炎の重症度が低下することが分かった（Fig.3A--3C）.3C）.3C）。これらの結果は、IFN-γがこのモデルにおけるCD4+ T細胞のエフェクター機能に寄与する主要なサイトカインであることを示唆した。疾患に寄与するIFN-γの細胞源をさらに区別するために、寛解（d48）のドナーR23FRマウスからCD4+ T細胞を選別し、それらをレシピエントRag1-/-マウスおよび食事2019（赤、TD 160647）で処置したIfng-/-Rag1-/-ダブルノックアウトマウスに移した（図3E）。R23FR CD4+T細胞を受け取り、Red 40含有食餌2019を2サイクル与えたIfng-/- Rag1-/ダブルノックアウトマウスは、同じ処理を受けた対照Rag-/-マウスと同等の大腸炎を発症した(図3F)。Ifng-/- Rag1-/-ダブルノックアウトマウスにおけるIFN-γの唯一の供給源がドナーCD4+ T細胞であることを考えると（図3E）、CD4+ T細胞によって生産されるIFN-γが大腸炎発症に重要であると結論付けられる。要約すると、Red 40に暴露したIL-23過剰発現マウスにおけるCD4+ T細胞のエフェクター機能には、IL-22, IL-17A, IL-17F, TNF-αではなく、IFN-γが重要であることが示唆された。

Red 40誘発大腸炎は、腸内細菌叢に依存している。
Red 40に関連した大腸炎発症メカニズムを探るために、我々は次に、微生物がRed 40誘発性大腸炎に必要かどうかをテストした。我々は、d48 R23FRマウスのmLN CD4+T細胞を無菌 (GF) Rag1-/-マウスに養子移入し、飲料水中のRed 40を与えた (Fig. 4A). GF条件では大腸炎は観察されなかった（Fig.4B--4C）.4C）。このGF Rag1-/-マウスに特定病原体非含有（SPF）常在菌をコロニー形成し、Red 40を投与したところ、顕著な大腸炎が生じた（図4H--4J）4J）ことから、Red 40が大腸炎を引き起こす能力は腸内細菌叢に依存していることが明らかとなった。

Fig 4.
Fig 4.
Red 40が引き起こす大腸炎は腸内細菌叢に依存している。
Red 40が細菌群集の構成を変化させることによって病気を引き起こすかどうかを調べるために、16S rRNAアンプリコンシークエンシングを実施した。Red 40を飲料水として投与しても、糞便中の細菌組成に有意な変化は見られなかった（図4D--4G）,4G）。これは、α多様性に有意差がなく（図4E）、重み付けUnifrac分析においてd0とd7の糞便サンプルのクラスタリングがなく（図4F）、d0とd7の間で操作分類単位（OUT）の存在量に有意差がない（図4G）ことから示された。これらの結果から、Red 40誘発大腸炎は微生物叢に依存するが、その組成の顕著なシフトには依存しないことが示唆された。

B.ovatus と E.faecalis は Red 40 誘発性大腸炎に寄与する。
特定の細菌株がRed 40誘発大腸炎に寄与しているかどうかを明らかにするために、SPF Rag1-/-マウスにバンコマイシン（グラム陽性菌を優先的に標的）またはポリミキシンB（グラム陰性菌を優先的に標的）（Atarashi et al, 2011）を2週間前処理し、上記のようにCD4+ T細胞を注入し、水中のRed 40に曝露した（図S2A）。予想通り、バンコマイシンまたはポリミキシンBの投与は、非抗生物質処理SPFマウスと比較して、糞便微生物叢密度の減少を導いた（図S2B）。重要なのは、バンコマイシンを投与すると、大腸炎の重症度が大幅に低下したことである（図S2CおよびS2D）。一方、ポリミキシンBで処理したマウスは、Red 40に曝露した非抗生物質処理SPF Rag1-/-マウスと同等の大腸炎を発症した（図S2Cおよび図S2D）。このことから、ポリミキシンB投与群では疾患関連菌が濃縮されているのではないかと推測された。抗生物質投与後のマウスの16S rRNAアンプリコンシークエンスによる腸内細菌叢の組成を解析したところ、グラム陰性菌の一種であるBacteroidesがポリミキシンB投与群で濃縮されていた（図S2E）ことから、BacteroidesがRed 40によるマウスの大腸炎に寄与していると考えられる。

Bacteroidesが疾患に関連し得るかどうかを調べるために、いくつかのBacteroides（ライブラリ番号#1001136）（表S1）（Brittonら、2019）を含む特定細菌株のコンソーシアムをGF Rag1-/-マウス（元GFマウス）にガベージし、寛解状態のd48 R23FRマウスからのCD4+ T細胞を注入し、飲料水にRed 40で処理した（図4H--4J）.4J）.4。Red 40で処理した細菌ライブラリーでコロニー形成したRag1-/- ex-GFマウスは、水で処理しなかったが、SPF C57BL/6マウスの全便でコロニー形成したRag1-/- GFマウスのものと区別がつかない顕著な大腸炎を発症した（図4H--4J）・4J). 16S rRNAアンプリコンシークエンスによるライブラリー#1001136再形成マウスの糞便微生物叢の分析により、細菌ライブラリーに存在する培養可能な種のほとんどが含まれていることが示された（表S1）。Rag1-/- ex-GFマウスで検出された最も高濃度の菌株としてBacteroides ovatus (B.ovatus) とEscherichia coli (E.coli) が挙げられた（Table S1）。

腸内細菌がRed 40の代謝に重要な役割を果たすことはよく知られている（Fengら, 2012; Zouら, 2020）。同定された細菌株のコンソーシアム（ライブラリー番号1001136）がRed 40誘導大腸炎を促進し得ることを定義したので、次に、ライブラリー番号1001136（Brittonら、2019）中に存在する特定の細菌がRed 40の代謝に寄与するか否かを試験した。これを検証するために、ライブラリ#1001136で再構成したRag1-/-ex-GFマウスの便に存在する2つの非常に豊富な株であるB.ovatusとE.coliをRed 40で培養した（表S1）（図S3）。以前の観察(Feng et al., 2012; Walker et al., 1971)と一致して、大腸菌ではなくB.ovatusをRed 40とともにin vitroで培養すると、Red 40が代謝処理されて無色になった（図S3Aおよび図S3C）。Red 40は細菌の増殖（OD600nmの検出による）には影響しなかったが（Fig. S3AおよびS3B）、培養後に培地から完全に消失した（OD504nmの測定による）（Fig. S3C）。

次に、これらの単一細菌種が生体内で大腸炎発症を引き起こすのに十分であるかどうかを検証した。GF Rag1-/-マウスにB.ovatusまたは大腸菌を単コロニーで投与した。次に、モノコロニー化したマウスに寛解期にあるR23FRマウスのCD4+ T細胞を注射し、水中でRed 40処理を行った（Fig.） その結果、大腸菌が混入したRag1-/-マウスでは、Red 40処理によって大腸炎の発症が誘発されないことがわかった（図5Bおよびand5C）.5C）.5C）。一方、B. ovatusが定着したRag1-/-マウスでは、水ではなくRed 40処理が大腸炎の発症を誘発した（図5Bおよびand5C).5C)。さらに重要なことに、この反応は、マウスを死んだB. ovatusの抽出物とRed 40処理に繰り返し暴露した場合には観察されず（図5D--5F）,5F）、Red 40が大腸炎発症を促進するためには生きたB. ovatusが必要であることが示唆された。

Fig 5.
Fig.
B.ovatusとE.faecalisはRed 40誘発大腸炎に寄与している。
腸内細菌Enteroccocus faecalis（E.faecalis）は、他の哺乳類腸内細菌と比較して、Red 40の代謝能力が高く、基質スペクトルが広い（Feng et al.2012; Walker et al.1971 ）。我々は、E. faecalisが我々のモデルにおいてB. ovatusと同様の役割を担っている可能性があると仮定した。この仮説を検証するために、E. faecalisをRed 40で5時間培養して無色にし（Fig. S3A and S3C）、この培養上清を寛解期（d49）のR23FRマウスに投与した（Fig. S3D）。その結果、Red 40を添加したE. faecalisの培養上清は、TAMとRed 40で前処理したR23FRマウスの大腸炎を誘発することができたが、Red 40を添加しないE. faecalisの培養上清は誘発しなかった（図S3Eおよび図S3F）。これらの結果は、常在菌（E.faecalis）によるRed 40の処理により、大腸炎を誘発する代謝物が生成されることを示唆している。さらに、無菌R23FRマウスをE.faecalisでモノクロナイズし、TAMとRed 40で処理した（Fig. 5G）。これらの動物の56日目の盲腸の組織学的解析では、著しい白血球浸潤、陰窩の消失、上皮の損傷、潰瘍化を伴う重度の大腸炎が認められた（図5Hおよびand5I）.5I）.5。一方、E. faecalis単コロニー化した無菌R23FRマウスにTAMを単独投与したところ、大腸炎の発症は見られなかった（図5G--5I）.5I)。これらの結果は、R23FRマウスをIL-23存在下でRed 40に反応させるためには、常在菌であるE. faecalisのモノコロニーゼーションで十分であることを示すものである。

これらの知見を総合すると、特定の常在菌によるRed 40のプロセシングが、その大腸炎誘発性に必要であることが示唆された。

アゾ結合の不活性化は、Red 40の大腸菌誘発性を著しく低下させる。
Red 40は赤色のアゾ染料である。アゾ染料は、官能基であるアゾ基（-N=N-）を持つ有機化合物である。B.ovatusまたはE.faecalisはともにRed 40による大腸炎に寄与していることから（Fig. 5）、これらの生物によるRed 40のアゾ結合の還元が大腸菌生成に重要である可能性があると考えた。この仮説を検証するため、アゾ結合を持たない化合物、ジヒドロRed 40 (-HN-NH-) を化学合成し (Fig. S4A and Fig. S5) 、生体内でその大腸菌活性を調べた (Fig. S4B-S4G)．その結果、ジヒドロレッド40処理は、R23FRマウス（図S4B〜S4D）、またはd48 R23FRマウスから得たCD4+ T細胞を投与したRag1-/-マウス（図S4E〜S4G）に大腸炎を誘導できないことがわかった。これらの結果は、アゾ染料に存在するアゾ結合の常在菌による処理が疾患誘導に必要であることを示唆しており、T細胞を移植したGF Rag1-/-マウスではRed 40が疾患を誘導しないという我々の観察とも一致している。

プライムマウスでは、Red 40の代謝物が大腸炎誘発物質である。
Red 40は、消化管内でアゾ還元により2つの主要代謝物：クレシジン-4-スルホン酸ナトリウム塩（CSA-Na）および1-アミノ-2-ナフトール-6-スルホン酸ナトリウム塩（ANSA-Na）（Zouら、2020）（図S3G）に代謝されることができる。Red 40を用いたE. faecalis培養物の上清のLC-MSによる分析で、その処理を確認し、2つの代謝物CSA-NaおよびANSA-Naの存在を明らかにした（図S3H）。私たちの以前のデータ (Fig. S3C) と同様に、大腸菌の培養上清には、その代謝物ではなく Red 40 が存在しました (Fig. S3H)。

Red 40 と共に培養した E. faecalis の上清が大腸炎の再燃を誘発することを示したことから (Fig. S3D-S3F) 、Red 40 の代謝物の一方または両方が Red 40 による大腸炎に寄与している可能性があると推測された。この仮説を検証するため、R23FR マウスを Red 40 と TAM で 2 サイクル処理し、最後のサイクルで CSA-Na または ANSA-Na を水に加えた (Fig. 6A)。その結果、ANSA-Naで処理した動物は大腸炎を発症したが、CSA-Naは発症しなかった（Fig. 6B and6C）,6C）ことから、この部位はRed 40の大腸炎誘発代謝物であることが示唆された。

Fig 6.
Fig 6.
1-amino-2-naphthol-6-sulphonate sodium salt (ANSA-Na) はIL-23発現マウスの大腸炎誘発物質である。
ANSA-Naが大腸炎誘導に重要な部位であることをさらに確認するために、もう一つの多用されているアゾ色素であるYellow 6 (Sunset Yellow FCF) (Fig. S6A) をテストした (Chung et al., 1992)。Yellow 6の代謝は、アゾ還元を介してANSA-Naを生成することもできる（Zouら、2020）（Fig. S6A）。予想通り、Yellow 6は、TAMおよびYellow 6で前処理したR23FRマウスにおいて大腸炎の発生を促進した（図S6B〜S6D）。興味深いことに、ANSA-Na部位を含まない非アゾ染料Red 3およびBlue 1は、R23FRマウスに大腸炎を誘発しなかった（図S6B-S6D）。さらに、色素のRed 40とYellow 6の間で同様の免疫反応を誘発する可能性があると仮定した。実際、TAMとYellow 6で前処理したR23FRマウスは、Red 40に暴露すると大腸炎を発症し（図S6E〜S6G）、その逆もまた然りであった（図S6E〜S6G）。

次に、微生物がANSA-Na誘導性大腸炎に必要であるかどうかを試験しようとした。d48 R23FRマウスからのmLN CD4+T細胞をGF Rag1-/-マウスに養子移入し、飲料水中のANSA-Naを与えた(Fig. 6D)。この物質でGFマウスを処理しても大腸炎は誘発されなかった（Fig. 6E and6F）,6F）ことから、刺激物としては働かず、発病には細菌の存在が必要であることが示唆された。したがって、ANSA-NaはTAMとRed 40で前処理したE.faecalis単細胞化R23FR GFマウスの大腸炎発症を促進した（図6G--6I）.6I）.6I）。さらに、これらのモノコロニー化R23FR GFマウス（図6G）のmLN CD4+T細胞をE.faecalisモノコロニー化GF Rag1-/-マウス（図6J）へ養子移入を行った。その結果、ANSA-Na処理では、水ではなく、E.faecalisを接種したRag1-/-マウスの大腸炎発症を誘発することがわかった（図6Kおよびand6L）.6L）.6L）。これらの結果は、Red 40とYellow 6のアゾ還元により生成されるANSA-Naが、プライムマウスにおいて大腸炎のフレアを誘発することを示唆している。

Red 40はIL-23の発現を増大させ、コントロールマウスの大腸炎発症を促進する
上記の結果を検証するために、我々はレッド40が非トランスジェニックマウスにおいて大腸炎を誘発する物質として機能するかどうかを調べた。IL-23 の安定した長期発現を誘導するために、IL-23 ミニサークル DNA の流体力学的送達を使用した（Fig. 7A）。血清IL-23濃度は注入後4日目までに上昇し、試験期間中持続した（Fig.7B）。以前の知見（Sherlock et al., 2012）と同様に、IL-23ミニサークルDNAを投与したすべてのマウスは、Red 40で処理したか否かにかかわらず、耳の炎症を発症した（図7C）。IL-23の全身レベルを発現する動物では、大腸炎はRed 40処理を受けたマウスでのみ観察された(Fig. 7C--7E7E)。

Fig 7.
Fig 7.
IL-23の発現が異常な野生型マウスにRed 40を投与すると、大腸炎が発症または増悪する。
最後に、Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) 感染と IL-10R 阻害を伴う確立された大腸炎モデルにおいて、疾患進行における Red 40 の役割を評価した。このモデルにおける大腸炎の発症は、腸のミエロイド細胞によって産生されるIL-23に依存している（Arnoldら、2016；Kullbergら、2006）。IL-23の発現が増加することが知られている期間（Arnoldら、2016）と一致するように、感染後4日から飲料水中の0.25g/L Red 40でマウスを処理した（図7F）。我々は、結腸と盲腸の両方で組織学的に測定したところ、マウスのRed 40処理群における大腸炎の重症度は、水処理群よりも有意に高いことを見出した（Fig. 7G--7H7H）。

これらのデータは、IL-23の発現が異常な野生型およびトランスジェニックマウスにRed 40を投与すると、大腸炎が発症または増悪することを全面的に示している。

考察
本研究により、IL-23シグナルの亢進を特徴とする条件下では、食品着色料が大腸炎の発症に寄与することが明らかになった。このような環境での疾患発症には、E. faecalis や B. ovatus などの常在菌が Red 40 や Yellow 6 を代謝することが必要である。私たちの発見は、特定の食品着色料が、免疫調節障害のある条件下での実験的IBDの危険因子であることを示唆しています。

IBDは遺伝的素因と環境因子によって引き起こされるようですが、これらの環境因子を同定することは困難であることが分かっています。マウスモデルでは、乳化剤(Chassaing et al., 2015; Chassaing et al., 2017; Viennois et al., 2017)、アルミニウム(Pineton de Chambrun et al., 2014) および二酸化チタン(Ruiz et al., 2017) などいくつかの食品添加物は、環境リスクファクターの代表として示唆されています (Marion-Letellier et al., 2019; Valadez et al., 2018)。ここでは、大腸炎発症の新たなリスク因子としてRed 40を特定します。Red 40は、多くの飲料、食品、医薬品の着色料として、人間の食物連鎖に広く存在する。Red 40は、市販されている多くのげっ歯類の飼料の成分ではないため、マウスはRed 40にさらされることはありません。ヒトで観察されるのと同様に、コントロールマウスやIL-23発現前のR23FRマウスにRed 40（最大40mg/kg/day）を投与しても、大腸炎は誘発されない。しかし、IL-23シグナルが増加したマウスに投与すると、ヒトで安全と考えられる用量（1日の許容摂取量は7mg/kg体重）よりも低い用量で使用しても、大腸炎につながるT細胞媒介反応の発生を促進する（Bastakiら、2017a）ことが、Pedialyte AdvancedCareチェリーパンチ味など、レッド40を含む一般飲料や医薬品を用いた我々の研究により実証されました。

Red 40の摂取が集団全体における大腸炎の発症につながらないという事実は、この化合物（またはそれが結合するタンパク質）に対する免疫学的耐性の発達を示唆している。実際、IL-23の発現が上昇する前にRed 40に曝露することで、耐性状態が誘導されることが示唆された。これらの結果は、（感染症や遺伝的疾患により）IL-23シグナルが増加した個体がRed 40（食品/飲料や薬剤に含まれる）に暴露されると、後年大腸炎を発症しやすくなることを示唆しているため、重要な意味を持つ。このことは、これらのアゾ染料を含む飲食物に初めて触れた子供の場合に特に関係すると思われる。我々は、IL-23シグナルの増加が、文献に十分に記載されているように、抗原提示および／またはTエフェクターもしくはT制御細胞集団の生成を含むいくつかの免疫学的経路に影響を与えるかもしれないと仮定する（Harbourら、2015年；Kullbergら、2006年）。Red 40の再チャレンジ時に、以前にプライミングしたR23FRマウスからリンパ球減少マウスへの未分画CD4 T細胞（Tregの正常な補体を含む）の移入を介して疾患を誘発することができるという事実は、IL-23が、Red 40（またはその代謝物）結合抗原を特異的に認識するTregの生成を一部阻害することによって疾患を引き起こす可能性を示唆するものである。

Red 40が大腸炎を引き起こす能力は、IL-23の発現が前提である。IL-23は自然免疫と適応免疫の両方で重要な役割を担っている。IL-23は、第3群自然リンパ系細胞を介して自然腸管病理を駆動するようである（Buonocoreら、2010；Chenら、2015）。適応免疫性大腸炎におけるIL-23の役割は、IL-17＋及び／又はIL-17＋IFN-γ＋CD4＋T細胞に依存するようである（Harbourら、2015）。ここで我々は、エフェクターCD4+T細胞の中にIL-17およびIL-22細胞が存在することを示すが、IL-17AおよびIL-17FをブロックしてもR23FRマウスの大腸炎発症を防ぐことができないため、Red 40およびIL-23によって引き起こされる免疫病理学は古典的Th17反応に依存しないようであることを示す。むしろ、IFN-γ産生CD4+T細胞が、疾患発症を駆動する主要な集団であることが分かった。実験的大腸炎におけるIFN-γ産生CD4+T細胞の役割は、1994年に発表された彼らの古典的研究においてPowrieと同僚によって最初に示された(Powrie et al., 1994)。我々は、Red 40投与に対する既定の免疫応答が寛容の生成であることから、IFN-γ産生細胞の発達がIL-23によって惹起される重要な免疫原性メカニズムである可能性が最も高いと示唆する。このような環境下でIL-23が抗原特異的TregをIFN-γ産生CD4 T細胞に積極的に変換するかどうかは、現在のところ未解決の課題である。

IL-23を発現するマウスにおける大腸炎の発症は、低分子化合物であるRed 40（分子量＝496.43）の投与に依存するエピソード的なものである。疾患が低分子によって誘発され、CD4+ T細胞に依存し、B細胞に依存しないという事実は(Chen et al., 2018)、IL-23およびRed 40が、確立された免疫原性メカニズム、すなわちIV型粘膜過敏反応または遅延型過敏反応（DTH）により大腸炎を誘発することが示唆される。この仮説は、IL-23が皮膚のDTH反応に重要であるという観察とも一致する(Ghilardi et al., 2004)。

トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）やオキサゾロンなどのハプテンがマウスに大腸炎を誘発することが知られている。これらのハプテンを感受性系統のマウスに投与すると、TBNSまたはオキサゾロンの大腸炎モデルにおいて、それぞれCD4+ T細胞（Wirtzら、2017）またはNKT細胞（Iyerら、2018）媒介の免疫が得られる。我々は、これらのハプテンとは異なり、Red 40は常在菌によるプロセッシングに生物活性が依存するプロハプテンとして働く可能性を示唆した。我々は、Red 40を代謝する能力を持つ代表的な微生物として、B.ovatusとE.faecalisを同定した。この2つの細菌は腸内ミシオバイオーム全体をカバーするものではなく、他の細菌分類群もこの能力を有している可能性があることを認識している。Red 40をアゾ還元して生成した1-アミノ-2-ナフトール-6-スルホン酸ナトリウム塩（ANSA-Na）は、生物学的に大腸炎を誘発する能力があり、生物学的に関連するハプテンである可能性があります。この部位は黄6の加工時にも生成されることから、赤40でプライミングされた動物が黄6に暴露されると大腸炎を発症し、その逆もまた然りであることが説明される。これらの知見は、異なる食用色素が、より高いレベルのIL-23を発現する素因を持つ宿主にハプテン誘発免疫腸管反応を引き起こす可能性を示唆するものである。ANSA-Naに結合し、免疫学的特性を持つ付加体を形成するタンパク質またはペプチドの同定が必要である。

以上、IL-23 の発現異常（トランスジェニックおよび非トランスジェニック）と最近の Red 40 への暴露が、マウスの大腸炎発症を促進することが示された。IL-23 は明らかに IBD の発症に関与しており、また赤色 40 や黄色 6 号などの食品着色料の消費は広く行われているので、これらの結果は人間の健康にも影響を与える可能性がある。

研究の限界
我々の研究はマウスで行われたものであり、同様の効果がヒトで観察されるかどうかはまだ評価されていない。我々のデータは、IFN-γ産生CD4+ T細胞が大腸炎発症を促す主要な集団であることを示しているが、IL-23がどのようにIFN-γ+ T細胞を誘導するか、またIL-23がどのようにRed 40に対する免疫反応全体を耐性から疾患へと移行させるかは、不明である。Red 40 と Yellow 6 の細菌処理により ANSA-Na が生成されることを示したが、この化合物のさらなる化学修飾が必要かどうか、またこの代謝物が細菌または宿主タンパク質と結合して免疫応答を誘導するかどうかはまだ不明である。最後に、本研究は、IL-23の発現が異常な宿主における大腸炎発症に対する食品着色料の役割の評価に焦点を当てたものであるため、食品着色料の幅広い影響を理解するためには、他のIL-23に依存しない前臨床大腸炎モデルに関する今後の調査が重要であろう。

STARメソッド
リソース入手
リードコンタクト リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトである Sergio A. Lira (ude.mssm@aril.oigreS) までお願いします。
材料利用可能性 この研究では、新しい独自の試薬は生成していない。
Data and Code Availability この研究で得られた16S rDNAシーケンスデータは、NCBI Sequence Read Archive (Accession number: PRJNA702431 and PRJNA702461)に寄託された。
実験モデルおよび被験者の詳細
マウス系統 C57BL/6 (stock # 000664), Rag1-/-(stock # 002216), Ifng-/-(stock # 002287) and CD45.1 (stock # 002014) miceはThe Jackson laboratory (Bar Harbor, ME) から購入した。R23FRマウス(Chen et al., 2018)、FRマウス(Chen et al., 2018)およびIl22-/-マウス(Chen et al., 2019)は、以前に記載したとおりである。すべてのマウスは、C57BL/6バックグラウンドで、少なくとも10世代にわたって戻し交配されていた。マウスは、マウントサイナイのアイカーン医科大学で特定病原体不検出（SPF）条件下で維持された。無菌（GF）C57BL/6、Rag1-/-およびR23FRマウス（Chenら、2018）は、マウントサイナイのIcahn School of MedicineのMicrobiome Translational Centerで社内で繁殖させた。本研究におけるすべての動物実験は、Icahn School of Medicine at Mount SinaiのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を受け、Icahn School of Medicine at Mount Sinaiの動物実験に関する承認ガイドラインに準拠して実施された。
細菌の増殖 B. ovatusは、L-システイン（1mg/ml）、ヘミン（0.5mg/L）、NaHCO3（2%）を添加したBrain Heart Infusion (BHI) Broth (Sigma-Aldrich) 中、37℃、70% N2、20% CO2 および 10% H2ガス混合物を用いたVinyl Anaerobic Chambersで無振動の嫌気性条件下に増殖した（Bacic and Smith、2008）。大腸菌とE.フェーカリスは共にLuria Broth (LB) Base (Invitrogen) を用いて37℃の好気的条件下で培養された。好気性培養はフラスコ瓶を用い、250rpmのシェーカーで行った。
方法の詳細
TAM処理。すべてのマウスは、LabDiet（ミズーリ州セントルイス）から購入した基礎飼料5053で飼育した。タモキシフェン（TAM）（500mg／kg）（Sigma、St Louis、MO）をEnvigo diet 2019（TD.160647）に添加して、2019 TAM diet（TD.130968）（Madison, WI）を作製した。タモキシフェン（TAM）（500mg/kg）（Sigma, St Louis, MO）を基礎飼料5053に添加して5053 TAM飼料（TD.190129）を製造し、これはEnvigo社（Madison, WI）から購入した。
食品着色料処理。赤40（Allura Red AC）、赤3（Erythrosine）、黄6（Sunset Yellow FCF）、青1（Brilliant Blue FCF）はSigma-Aldrich社から購入した。マウスは飲料水中の食品着色料に暴露した（0.025% w/v, 0.25g/L）。水処理（コントロール）群には同じ水を使用した。これらの溶液は1週間ごとに交換した。無菌状態で行う実験では、Red 40溶液を0.2μmフィルターで濾過した。一部の研究では、マウスを食餌中の食用色素に暴露した（0.25g/kgのRed 40を含む、食餌2019、TD.160647）。
食餌2019の成分の分離とin vivoでの大腸菌誘発性の試験 食餌2019（1kg）を細かく刻み、それを95％エタノールで室温で2時間抽出した。この溶液を2,000gで5分間遠心分離し、エタノール可溶性画分を含む上清を回収した。このペレットを室温で2時間水に溶かし、4000gで遠心分離し、水溶性画分を得た（Fig S1A）。エタノール抽出画分を気流下、減圧下で乾燥させた。得られた粉末（100g）を刻んだ5053飼料と混合し、R23FRマウスに7日間給与した（Fig S1A）。水溶性画分（Fig S1A）を凍結乾燥し、元の飼料重量の10％の水（100ml）に再懸濁し、その後、寛解時のR23FRマウスに経口投与した（1回0.5ml、1日2回、7日）。処理後、盲腸を組織学的分析のために採取し、糞便をLcn2 ELISAのために採取した。
Red 40濃度の測定。クールエイド飲料またはペディアライトチェリーパンチフレーバー中のRed 40濃度は、吸光度504 nm(Stevens et al., 2014)でRed 40(Allura Red AC, Sigma)の連続希釈により生成した標準曲線に対する吸光度を比較することにより決定された。
T細胞養子縁組移植。CD4+T細胞単離のために、mLNは、以前に記載されたようにコラゲナーゼで消化された(Chen et al., 2018)。CD4+T細胞は、CD4-（L3T4）マイクロビーズ（Miltenyi Biotec、Bergish Gladbach、ドイツ）を用いた陽性免疫選択によって濃縮された。磁気活性化細胞選別（MACS）で精製したCD4+ T細胞を養子移入実験におけるドナー細胞として用いた。MACS-ビーズを用いて濃縮したR23FRマウスの寛解期（TAMおよびRed 40投与後d48）のmLNからの100万個のCD4+ T細胞をSPF Rag1-/-マウスまたはGF Rag1-/-マウスに静脈内注射（i.v.）により移植した。
組織学 組織を解剖し、10％リン酸緩衝フォルマリンで固定し、パラフィン切片に加工した。5マイクロメートルの切片をヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色し、組織学的解析を行った。すべての切片について、上皮の完全性、杯細胞数（ムチン産生）、間質性炎症、陰窩膿瘍、びらん、粘膜下浮腫など、さまざまな組織学的特徴が評価された。その後、疾患の重症度を前に記載したように分類した(Chen et al., 2018)。
酵素結合免疫吸着アッセイによる糞便Lcn-2の定量新鮮に採取したまたは凍結した糞便試料を0.1％Tween 20（100mg／mL）を含むリン酸緩衝生理食塩水に再構成し、20分間ボルテックスして均質な糞便懸濁液を得た（Chassaing et al.、2012）。次に、これらのサンプルを12,000回転/分、4℃で10分間遠心分離した。透明な上清を回収し、分析まで-20℃で保存した。Lcn-2レベルは、Duoset murine Lcn-2 enzyme-linked immunosorbent assay kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて上清中に推定された。
In vivo抗体処理。IL-17A、IL-17F、TNF-aおよびIFN-γの遮断は、養子細胞移植モデルで行った。簡単に言うと、寛解（d48）のR23FRマウスからのCD4+ T細胞を、その後2サイクルにわたって食餌2019を与えたRag1-/-マウスに養子的に移した。抗IL-17A（17F3、BioXcell）、抗IL-17F（MM17F8F5・1A9、BioXcell）、抗TNFa（TN3-19・12、BioXcell）、抗IFN-γ（XMG1・2、BioXcell）、またはそれらのアイソタイプ抗体1mgを図に示す日数に腹腔内注射により投与した。21日目にRag1-/-マウスを屠殺し、大腸を採取して組織学的に解析した。
in vivoでの制御性T細胞抑制アッセイ。R23FRマウスの寛解期（TAMおよびRed 40投与後d48）のmLNからCD4-（L3T4）マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いたポジティブ免疫選択によりCD4+ T細胞を濃縮し、レスポンダー細胞として使用した。Red 40処理または水処理したCD45.1マウスからCD45.1+CD4+CD25+の制御性T細胞（Treg）を、Treg分離キット（Miltenyi Biotec）を用いてCD4+細胞のネガティブ選択とCD25+細胞のポジティブ選択により分離した。106個のレスポンダーT細胞＋4×105個のTreg細胞の静脈内注射と飲料水中のRed 40（0.025％w/v、0.25g/L）による処理により、レシピエントRag1-/-マウスに大腸炎を誘発させた。
IL-23 minicircle DNAのハイドロダイミックジーンデリバリー。マウスIL-23 Pre-made Minicircle DNA (RSV->FLAG-mP40-mP19-pA) (MN651MC-1) をSystem Biosciences社から購入した。Minicircle DNAは、流体力学的尾静脈注射を使用してマウスに導入された。簡単に言うと、20μgのMouse IL-23 Pre-made Minicircle DNAを滅菌生理食塩水（0.9%）の溶液にマウスの体重の10%の総量で希釈し、26ゲージ針付きの3ml注射器を用いて尾静脈から注射した。注射後のマウスの血清IL-23は、Biolegend社のELISA MAX™ Deluxe Set Mouse IL-23 kit (433704)を用いて測定した。
H. hepaticus感染と抗IL10R注射による大腸炎誘発。H. hepaticusを通気性ジャー内で80％N2、10％H2、10％CO2からなる微好気性ガス混合下で羊血寒天培地（Remel）上に増殖させた。菌体プレートを入れた微好気ジャーは37℃で2〜3日間放置した。培養後，菌体を回収し，20%グリセロールを含むブルセラブロスで懸濁し，OD600 nmの測定値が1.5 OD/mlとなるように菌体密度を調整し，-80 ℃で凍結した．経口感染では、H. hepaticusの0.2 ml凍結ストックアリコートを各マウスに隔日で3回経口投与した。抗IL-10R（クローン1B1.2）抗体は、マウス1匹につき毎週1mgを3週間腹腔内注射した。
微生物叢の移植 3〜5匹のドナーSPFマウスからプールした盲腸抽出物をPBSに懸濁し（盲腸あたり2.5ml）、Rag1-/-無菌マウスに直ちにガベージ（マウスあたり0.1ml）した（Chen et al., 2018）。追加の移入実験のために、我々は以前に記載された常在菌コンソーシアムを使用した(Britton et al., 2019)。この培養株のプールされたカクテルをRag1-/-無菌マウスにガベージした（200〜300μL）。移植されたマウスは、密閉陽圧ケージ（Allentown）で2週間維持され、その後、さらなる実験に使用された。
抗生物質処理。SPFマウスは、指定された時間中、飲料水中のバンコマイシン（500mg／L、シグマアルドリッチ）またはポリマイシンB（100mg／L、シグマアルドリッチ）で処理された。これらの抗生物質溶液は1週間ごとに更新された。
16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンス。DNAは、ビーズビーティング、QiaQuickカラム（Qiagen）により抽出し、Qubitアッセイ（Life Technologies）により定量した。簡単に説明すると、マウスの糞ペレット（〜50 mg）を、700μLの抽出バッファ（0.5% SDS, 0.5 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl）および200μL 0.1 mm径ジルコニア/シリカビーズを含む溶液に再懸濁させた。その後、ビーズビーター（BioSpec Products, Bartlesville, OK；最大設定、室温で5分間）を用いて細胞を機械的に破砕し、QIAquick 96 PCR Purification Kit（Qiagen）を用いて抽出した。細菌16S rRNA遺伝子は、以前に記載されたプライマーを用いて増幅した(Faith et al., 2013)。16S rDNA配列のサンプル調製および解析は、以前に記載された(Chen et al., 2018)とおりに行った。16S rDNAのデータは、MacQIIME 1.9.1で解析した。操作上の分類単位（OTU）は、最小配列長150 bp(Caporaso et al., 2010; McDonald et al., 2012)のGreengenes reference database setを用いて配列類似度97%のclosed reference OTU pickingを用いて摘出された。
B. ovatus死菌液の調製。培養したB. ovatusを4℃で遠心分離して培養上清を除去し、滅菌PBSで2回洗浄した。この菌体ペレットを最終濃度10g/LのPBSに再懸濁し、氷上でSonic Dismembrator（Fisherbrand Model 705, Fisher scientific）を用いて60%の出力で20×20秒プラス5分のインターバルで超音波処理（プローブ径＝12mm）した。この溶液を寒天プレートに接種し、37℃、嫌気条件下で3日間培養した結果、生菌が残存していなかった。再懸濁した菌液は、無菌マウスの飼料用飲料水として使用した。
LC-MS/MSのサンプル調製と方法。Red 40を用いた細菌の培養上清をドライアイスでコーネル大学のProteomic and Metabolomics Facilityに輸送した。90μLの培地を400μLのメタノール：アセトニトリル（1：1）と共に氷上で10分間インキュベートした後、16000gで遠心分離し、タンパク質を沈殿させた。上清に10μMのトリパンブルー（内部標準、IS）を30μL添加した。このサンプルの10μLを分析に使用した。標準物質（Red 40、クレシジン-4-スルホン酸、1-アミノ-2-ナフトール-6-スルホン酸）はすべて、1mM濃度になるようにオプティマ水で希釈して調製した。Sciex X500B装置およびLC-MSの最適化のため、10倍に希釈した1mM標準試料を200μL/minの流速で注入して使用した。同定および定量分析には、Sciex OS1.7ソフトウェアを使用しました。Red 40、クレシジン-4-スルホン酸、1-アミノ-2-ナフトール-6-スルホン酸レベルの定量には、分析物/IS面積比を使用しました。
Red 40の化学還元 ナトリウム6-ヒドロキシ-5-（2-（2-メトキシ-5-メチル-4-スルホナトフェニル）ヒドラジニル）ナフタレン-2-スルホネート（ジヒドロレッド40）は、修正手順（ZhangおよびWang、2003）を用いて調製した。N2H4-H2O (4.5 mL, 92 mmol) を、水 (23 mL) 中の Red 40 (450 mg, 0.91 mmol) の溶液に添加した。反応の進行は、赤から黄色に変化する色でモニターした。反応混合物を室温まで冷却させ、溶媒を減圧下で除去した。ジクロロメタン：メタノール（10：1）の混合溶媒でトリチュレーションして精製し、乾燥させて生成物を茶色固体として得た（390 mg、収率86％）。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz) 7.87-7.86 (2 H, m), 7.47 (1 H, d, J = 8.5 Hz), 7.16 (1 H, s), 7.09-7.06 (2 H, m), 6.35 (1 H, s), 4.90 (1 H, br), 4. 67 (2 H, br), 3.68 (3 H, s), 2.30 (3 H, s); HRMS (ESI-TOF) m/z: [M + 2Na]2+ calculated for C18H18N2O8S2Na2 250.0144; found 250.0842.XXX.
in vivoでの化合物の試験結腸原性 Red 40の代謝物：クレシジン-4-スルホン酸（Aablocks）および1-アミノ-2-ナフトール-6-スルホン酸（Carbosynth）をH2O（0.5g/L）に溶解し、pHは7に調整された。寛解期（d49、TAMおよびRed 40投与後）のR23FRマウスに、7日間、飲料水中の代謝物を曝露した。処理後、大腸を採取し、組織学的解析を行った。
定量および統計解析 ディープシーケンスデータを除き、統計解析はGraphPad Prism 7ソフトウェア（GraphPad, La Jolla, CA）を用いて行った。群間の差はノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定で解析した。統計学的検定は、図の説明の中で示されている。有意差はp<0.05のときに有意とみなされ、有意水準は図の説明文中に明記されている。データは、全体を通して平均値±SEMで示した。サンプルサイズを決定するための統計的手法は用いていない。

表サムネイル
主要リソース表
ハイライト
食品着色料Red 40およびYellow 6は、IL-23を過剰発現させたマウスに大腸炎を誘発する

IL-23の上昇は、IFN-γを産生する病原性CD4+ T細胞の発生を誘導する。

B.ovatusやE.faecalisなどの常在菌は、Red 40を代謝する。

Red 40とYellow 6の代謝産物であるANSA-Naは大腸炎の再発を誘導する。

補足資料
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謝辞
Alan J. Soto (Biorepository and Pathology CoRE, Sinai) の組織学的技術支援とHuaibin M. Ko博士 (Department of Pathology, Sinai) の病理学的評価への協力に感謝する。また、嫌気性菌培養の技術支援をしていただいたJoseph Eggers (Bongers Lab), Ilaria Mogno and Zhihua Li (Faith Lab)に感謝する。また、Howard C. Hang博士（Scripps Research）とGabriel D. Victora博士（The Rockefeller University）には、批判的なコメントをいただいたことに感謝する。この研究は、National Institutes of Health R01 DK 110352 and DK 121009 (to S.A.L.), P30 ES 002109 and P01CA028842 (to J.G.F.) and the Career Development Award (634253) from Crohn's & Colitis Foundation of America (CCFA) (to L.C.) から助成金を得て行われたものです。

脚注
出版社からの免責事項：この原稿は、出版が承認された未編集の原稿のPDFファイルです。お客様に対するサービスとして、この原稿の初期バージョンを提供しています。この原稿は、コピー編集、組版、校正を経て、最終的な形で出版される予定です。また、本ジャーナルに適用されるすべての法的免責事項が適用されます。

利害関係者の宣言

すべての著者は利害関係を明らかにしていません。

論文情報
Cell Metab. 著者原稿；PMC 2022 Jul 6で入手可能。
最終編集版として出版
Cell Metab. 2021 Jul 6; 33(7): 1358-1371.e5.
オンライン公開 2021年5月13日. doi: 10.1016/j.cmet.2021.04.015
pmcid: pmc8266754
NIHMSID: NIHMS1705898
PMID: 33989521
Zhengxiang He,1,8 Lili Chen,1,8,* Jovani Catalan-Dibene,1 Gerold Bongers,2 Jeremiah J. Faith,1,3 Chalada Suebsuwong,4,5 Robert J. DeVita,4,5 Zeli Shen,6 James G. Fox,6 Juan J. Lafaille,7 Glaucia C. Furtado,1およびSergio. A. Lira1,9,*
1プレシジョンイムノロジー研究所、アイカーン医科大学マウントサイナイ校、ニューヨーク、ニューヨーク州10029、米国。
2腫瘍科学部門、アイカーン医科大学マウントサイナイ校、ニューヨーク、ニューヨーク州10029、米国
3ゲノム・マルチスケール生物学研究所（Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY 10029, USA
4創薬研究所、アイカーン医科大学マウントサイナイ校、ニューヨーク、ニューヨーク州10029、米国
5アイカーン医科大学薬理学教室、ニューヨーク、ニューヨーク州10029、米国
6マサチューセッツ工科大学比較医学部、Cambridge, MA 02139, USA.
7ニューヨーク大学医学部生体分子医学研究所病理学教室、ニューヨーク、ニューヨーク州10016、米国
8これらの著者はこの仕事に等しく貢献した。
9主な連絡先
著者の貢献

Z.H.、L.C.、S.A.L.はプロジェクトの構想を練った。Z.H.、L.C.、J.CD.、G.C.F.は実験を行い、データを分析した。G.B.、J.J.F.、C.S.、R.J.D.、Z.S.、J.G.F.は必要な研究資源を提供した。J.J.F.とJ.J.L.は、データの解析と解釈を支援した。Z.H.、L.C.、S.A.L.は全著者の意見を取り入れながら原稿を執筆した。S.A.L.は本研究を監督した。
*Corresponding author: ude.mssm@nehc.ilil (L.C.), ude.mssm@aril.oigres (S.A.L.)。
著作権表示
出版社の免責事項
本論文の出版社による最終編集版はCell Metabに掲載されています
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