7種類の抗結核治療レジメンが喀痰マイクロバイオームに及ぼす影響：HIGHRIF study 2およびPanACEA MAMS-TB臨床試験のレトロスペクティブ解析

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7種類の抗結核治療レジメンが喀痰マイクロバイオームに及ぼす影響：HIGHRIF study 2およびPanACEA MAMS-TB臨床試験のレトロスペクティブ解析

https://www.thelancet.com/journals/lanmic/article/PIIS2666-5247(23)00191-X/fulltext


エマニュエル・ムジシ博士
アダム・ウィネス博士
Sahar Eldirdiri医学博士
エブリン・ドンベイ博士
バリキ・ムタフィヤ博士
ニャンダ・E・ンティニャ博士
他
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オープンアクセス掲載:2023年10月10日DOI:https://doi.org/10.1016/S2666-5247(23)00191-X

要旨
背景
呼吸管微生物叢は、呼吸器の健康の門番であると言われている。我々は、標準治療および実験的抗結核治療レジメンが呼吸器マイクロバイオームに及ぼす影響と治療成績への影響を評価することを目的とした。
方法
本レトロスペクティブ研究では、HIGHRIF試験2（NCT00760149）およびPanACEA MAMS-TB（NCT01785186）臨床試験に参加した、6種類の実験的レジメンと標準治療の対照治療を受けた結核患者の喀痰マイクロバイオームを、3ヵ月の治療フォローアップ期間にわたって解析した。サンプルはタンザニアのムベヤ、キリマンジャロ、バガモヨ、ダルエスサラームの参加者から得られた。実験レジメンは、リファンピシン（R）、イソニアジド（H）、ピラジナミド（Z）、エタンブトール（E）、モキシフロキサシン（M）、および新薬SQ109（Q）の異なる組み合わせで構成された。各参加者の総喀痰RNAの相補的DNAを作成するために逆転写を行い、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の塩基配列をイルミナのメタゲノム技術を用いて決定した。Qiimeを用いてアンプリコン配列の変異を解析し、アルファ多様性を推定した。記述統計量を適用して、治療開始前と治療開始後のα多様性の差、および各治療レジメンの効果を評価した。
調査結果
2008年9月26日から2015年6月30日の間に採取された治療前および治療後の397検体から、7つの治療レジメンにわたって配列データが得られた。治療前のマイクロバイオーム（206属）は、門レベルではファーミキューテス属（amplicon sequence variants [ASVs]6500のうち2860 [44％]）、属レベルではストレプトコッカス属（2340 [36％]のASVs）が優勢であった。HR20mg/kgZM（シャノン多様性指数p=0-0041）とHR35mg/kgZE（p=0-027）の2つのレジメンが、投与2週間後のマイクロバイオームに有意な抑制効果を示した。グラム陰性菌は治療の殺菌活性に対して最も感受性が高く、抑制された菌種数はモキシフロキサシンのレジメンで最も多かった。治療開始後12週目までに、マイクロバイオームはHR35mg/kgZEレジメンと、すべてのレジメンで回復を示さなかったマイコバクテリウム属を除き、治療前のレベルまで回復した。治療開始8週目までに結核菌の培養が陰性化したことは、ナイセリア属のクリアランスと関連しており、治療前レベルの98％の減少を示した。
解釈
HR20mg/kgZMは、マイクロバイオームの回復を制限することなく結核に対して有効であった。このことは、常在細菌叢に害を与えることなく、治療成績の改善を伴うより短い有効な抗結核レジメンが達成される可能性を示唆している。
資金提供
European and Developing Countries Clinical Trials Partnershipおよびドイツ教育研究省。

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はじめに
呼吸器微生物叢は、宿主免疫と病原体によるコロニー形成に対する抵抗性を調節する呼吸器の健康のゲートキーパーであると言われている1。イソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド、エタンブトール（HRZE）を2ヵ月間投与した後、イソニアジドとリファンピシンを4ヵ月間投与するという標準的な第一選択抗結核レジメンによる治療では、マイクロバイオーム全体の多様性は変化しないが、免疫学的に重要な常在菌の一部が減少することが示されており、この結果は個人の健康に長期的な影響を及ぼす可能性がある3。短期間の結核治療レジメンは、マイクロバイオームが抗生物質にさらされる期間を短縮し、マイクロバイオームへの長期的なダメージのリスクを低減する可能性がある。そのため、2022年にWHOが推奨したリファペンチン・モキシフロキサシンを含む4ヵ月の短期結核レジメンなど、新規の短期結核レジメンが研究されている4。
ヒトの肺は、健康な人でも無菌ではない。ヒトの肺の微生物叢は、一般的に多様なコア組成を有しているが、その相対的な存在量と有病率は人によって異なる5。微生物叢は、年齢（新生児、乳児、若年者、成人）、食事、疾患によって変化する6。肺は結核菌感染の好発部位であり、その微生物叢は結核の様々な状態と関連している。このことは、抗生物質治療のような介入は、マイクロバイオームに対して新たなレベルの圧力を加えることになり、肺微生物叢の組成と機能をさらに変化させる可能性があることを意味する7。肺微生物叢に対する結核レジメンの効果は、広範囲のグラム陽性菌とグラム陰性菌に対して活性を有する抗生物質との関連性が高いと思われる8。
われわれは喀痰を用いて、標準治療および治験中の結核レジメコースが肺微生物叢に及ぼす影響、および治療成績に及ぼす影響を調査した。
研究方法
研究デザイン
2つの臨床試験中に採取されたサンプルを用いて、喀痰マイクロバイオームに対する抗結核薬の影響をレトロスペクティブに解析した： PanACEA MAMS-TB（NCT01785186、2013年5月7日～2014年3月25日に実施）12とHIGHRIF試験2（NCT00760149、2008年9月26日～2013年9月8日に実施）13である。
マイクロバイオーム解析用の喀痰サンプルは、タンザニアで実施されたPanACEA MAMS-TB試験およびHIGHRIF試験2の参加者から入手した。MAMS試験の承認は、タンザニア国立医学研究所（NIMR）-ムベヤ医学研究センター倫理審査委員会、NIMR-国立保健研究倫理委員会（NatHREC）、およびミュンヘン大学（試験スポンサー）倫理委員会から得た。HIGHRIF試験2は、キリマンジャロ・クリスチャン医科大学研究倫理審査委員会、イファカラ健康研究所施設審査委員会、およびNatHRECの承認を得た。両試験ともGood Clinical Practiceガイドラインに従って実施された。参加者は、この追跡分析に参加することについて、口頭によるインフォームド・コンセントを行った。
試験の設定と参加者
PanACEA MAMS-TB試験
PanACEA MAMS-TB試験は、イソニアジドおよびリファンピシン10mg/kg＋ピラジナミドおよびエタンブトール（HR10mg/kgZE、標準治療）、イソニアジドおよびリファンピシン10mg/kg＋ピラジナミドおよびSQ109（HR10mg/kgZQ）を含む4つの実験的治療レジメンを評価する5群間試験であった； イソニアジドおよび20mg/kgのリファンピシン＋SQ109（HR20mg/kgZQ）；イソニアジドおよび20mg/kgのリファンピシン＋ピラジナミドおよびモキシフロキサシン（HR20mg/kgZM）；イソニアジドおよび35mg/kgのリファンピシン＋ピラジナミドおよびエタンブトール（HR35mg/kgZE；表1）。
表1PanACEA MAMS-TB試験およびHIGHRIF試験2における薬剤投与量と投与期間
投与量と投与期間
PanACEA MAMS-TB臨床試験12
第1群（HR35mg/kgZE） リファンピシン35mg/kg/日、エタンブトール15～20mg/kg/日、イソニアジド5mg/kg/日、ピラジナミド25mg/kg/日を12週間投与後、イソニアジド5mg/kg/日、リファンピシン10mg/kg/日を14週間投与。
第2群（HR20mg/kgZM）リファンピシン1日20mg/kg、モキシフロキサシン1日400mg/kg、イソニアジド1日5mg/kg、ピラジナミド1日25mg/kgを12週間投与後、イソニアジド1日5mg/kg、リファンピシン1日10mg/kgを14週間投与
第3群（HR20mg/kgZQ）リファンピシン20mg/kg/日、SQ109 300mg/kg/日、イソニアジド5mg/kg/日、ピラジナミド25mg/kg/日を12週間投与後、イソニアジド5mg/kg/日、リファンピシン10mg/kg/日を14週間投与
第4群（HR10mg/kgZQ） リファンピシン1日10mg/kg、SQ109 300mg、イソニアジド1日5mg/kg、ピラジナミド1日25mg/kgを12週間投与後、イソニアジド1日5mg/kg、リファンピシン1日10mg/kgを14週間投与
対照（HR10mg/kgZE） リファンピシン1日10mg/kg、イソニアジド1日5mg/kg、ピラジナミド1日25mg/kg、エタンブトール1日15～20mg/kg。
HIGHRIF試験2 臨床試験13
600 mg（HR600mgZE） 合剤4カプセル（各カプセルにリファンピシン 150mg、イソニアジド75mg、ピラジナミド400mg、エタンブトール275mgを含有）＋プラセボ2 カプセル
900mg（HR900mgZE）合剤4カプセル（各カプセルにリファンピシン150mg、イソニアジド75mg、ピラジナミド400mg、エタンブトール275mgを含有）＋リファンピシン300mg入り1カプセル＋プラセボ1カプセル
1200 mg（HR1200mgZE） 4カプセルの合剤（各カプセルにリファンピシン 150 mg、イソニアジド 75 mg、ピラジナミド 400 mg、およびエタンブトール 275 mgを含有）と2カプセルのリファンピシン 300 mg。
参加者全員 各参加者は、イソニアジド300mgとリファンピシン600mgを1日1回、4ヵ月間の集中期後治療を受けた。
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PanACEA MAMS-TBでは、タンザニアのムベヤの参加者の検体のみが解析に含まれた。治療に対して臨床的に良好な反応を示した患者、または治療フォローアップ終了時に培養が少なくとも1回陰性であった患者はすべて、この研究に組み入れられた。患者は、治療終了後6ヵ月まで、電話連絡または参加者の体調が悪い場合は現地訪問によってフォローアップされた。この研究では、12週目まで毎週採取された喀痰サンプルが収集された。追跡調査終了時に治癒、情報なし、再発の転帰が割り付けられた。細菌量は、Mycobacteria growth indicator tubeによる陽性化までの時間と結核分子細菌量測定法（TB-MBLA）によって測定された12。
HIGHRIF試験2
HIGHRIF2試験では、リファンピシンをさまざまな用量で投与し、薬物動態、忍容性、細菌学的反応を調査した。試験デザイン、実施施設、および試験参加者の選択の詳細は、Aarnoutseらによって発表されている13。簡単に説明すると、試験は2008年9月26日から2013年9月8日の間に、タンザニアのキリマンジャロとダルエスサラームで実施された。参加者は、リファンピシンを含む標準的な結核治療薬を1日600mg（HR600mgZE；標準治療薬）、900mg（HR900mgZE）、または1200mg（HR1200mgZE）の固定用量で投与された（表1）。試験薬は週7日間、1日1回午前中に一緒に服用された。集中治療期間の後、全患者はタンザニアのガイドラインに従って4ヵ月間治療を受けた。
喀痰は12週目までは週1回、治療期間中は14週目、17週目、22週目、26週目に採取した。排痰後のRNA損失を防ぐため、PanACEA MAMS-TB試験の喀痰はβ-メルカプトエタノールを含むチオシアン酸グアニジンで保存し、HIGHRIF試験2の喀痰はOrageneカップ（DNA Genotek, Stittsville, ON, Canada）で保存した。両試験の喀痰は、クロロホルム-フェノール法を用いてRNAを抽出するまで-80℃で凍結保存した。RNA抽出液（4μL）は、TB-MBLAによるM結核菌量の測定に使用した。
手順
QuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen, Manchester, UK）を用いて、全RNAを相補的DNA（cDNA）に逆転写した。逆転写反応混合物は、95℃で3分間インキュベートする前に、解凍したRNAサンプルに逆転写酵素（1μL）、転写バッファー（4μL）、転写プライマーミックス（1μL）を加えて調製した。得られたcDNAは、高感度一本鎖DNA Qubit assay（Fisher Scientific UK, Loughborough, UK）を用いて定量した。cDNAはヌクレアーゼを含まない水で希釈し、PCR開始時の鋳型濃度が高くなりすぎないようにした。
16S rRNA遺伝子のV3-V4領域をターゲットとするプライマーを用いて、Klindworthらの記載に従ってcDNAを増幅した15。簡単に言うと、2-5μLのcDNAを、Taqmix（Qiagen, Manchester, UK; 9-5μL）、フォワードプライマー（4μL）、リバースプライマー（4μL）を含むアンプリコンPCRマスターミックス17-7μLに加えた。アンプリコンPCR条件は以下のように設定した： 95℃で3分間、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間、72℃で5分間のサイクルを35回繰り返した。アンプリコンはAMPure XP reagent (Beckman Coulter, Wycombe, UK)とpH 8-5の10mM tris(hydroxy)methylaminomethaneバッファーとエタノールを用いてクリーンアップした(付録p 2)16。
ライブラリー調製には、Illuminaメタゲノムシーケンスプロトコールに従い、可変DNAアダプターを用いてアンプリコンを標識するインデックスPCRを用いた。簡単に説明すると、10μLのcDNAアンプリコンを、KAPA Hifi hot start ready mix（25μL; Sigma Aldrich, Glasgow, UK）とPCRグレードの水（10μL）を含むインデックスPCRマスターミックスに加えた。インデックスPCR産物を洗浄し（付録p2）、Qubitアッセイを用いて定量し、ユニークなインデックスを加えて標識した。
アンプリコン濃度は、1つのライブラリーにプールする前に、濃度が等しくなるように正規化した。アンプリコンの品質と特異性は、2-5％アガロースゲル、SYBRsafe色素（Qiagen, Manchester, UK）、50 bpラダーを用いたゲル電気泳動で評価した。600bpの単一バンドが得られ、プールされたライブラリーのアンプリコンの特異性が示された（付録p2）。プールライブラリーの濃度を測定したところ、2-47 ng/μlであった。陰性コントロールサンプル、ヌクレアーゼを含まない水、およびcDNA合成とアンプリコンPCRのマスターミックスを実行することにより、バックグラウンドまたはクロスコンタミネーションをチェックした。これらのコントロールはin vitro cDNA合成から配列決定まで行った。検出可能な配列がないことは、バックグラウンド汚染がないことの確認であった。
High-throughput amplicon sequencingはIntegrated Microbiome Resource (Edinburgh Genomics Centre, Edinburgh, UK)のHiSeq 2000プラットフォームで行った。シーケンス前に、バイオアナライザーの品質チェックで、シーケンスに十分な材料があり、アダプターダイマーがないことを確認した。QIIME2（バージョン2020.2）内のDADA2パイプライン（1.8）を用いて、生リードのフィルター、トリミング、重複除去、ペアリードのマージ、ノイズ除去、キメラ除去を行った。SILVA 132データベースを用いて、アンプリコン配列バリアント（ASV）に分類群を割り当てた。真核生物および古細菌に割り当てられた配列は削除された。SILVA 132データベースで全細菌の解析を行い、光合成シアノバクテリアに割り当てられた配列は別に抽出・解析した。アルファ多様性指標（アンプリコン配列のvariant richness [分類群相対量]、Faithの系統的多様性[系統樹ユニットの長さと数の総和]、Shannon多様性指数[群集中の分布でスケーリングした種の数]、Pielouの均等性指数[群集中の異なる種の分布]）は、すべてのサンプルが希薄化曲線のプラトーに達したことを確認した後、1500リードの希薄化でQIIME2内の処理中央値について計算した。
統計解析
参加者を出身地域に基づいてグループ分けし、マン・ホイットニー検定を用いてマイクロバイオーム多様性の差を検定した。同様に、異なるレジメン下での治療前と治療後のα多様性の差を算出するためにマン・ホイットニー検定を適用した。スピアマンの順位相関を用いて、マイコバクテリウム相対存在量とTB-MBLAで測定した結核菌量との相関を算出した。一元配置分散分析を適用して、結核菌培養が陰性、陽性、または不確定であった人の治療8週間における分類群の豊富さの変動を検定した。不確定とは、結核の状態が陽性とも陰性とも言えない培養と定義した。すべての計算はGraphPad Prism（バージョン9）で行い、統計的有意性はp<0-05で認められた。
資金提供者の役割
本研究の資金提供者は、研究デザイン、データ収集、データ解析、データ解釈、報告書の執筆には関与していない。
結果
394検体のうち、122検体（31％）がHR600mgZEまたはHR10mg/kgZE、40検体（10％）がHR10mg/kgZQ、48検体（12％）がHR900mg/kgZE、52検体（13％）がHR1200mg/kgZE、45検体（11％）がHR35mg/kgZE、42検体（11％）がHR20mg/kgZQ、45検体（11％）がHR20mg/kgZM治療レジメンのものであった。本研究の対象となった喀痰を提供した参加者の人口統計学的データは、付録（p2）に要約されている。
結核治療を受けた人のASV合計6500件を分析した。治療前の分類群は、ファーミキューテス（2860 [44%]）が圧倒的に多く、バクテロイデーテス（1170 [18%]）、プロテオバクテリア（845 [13%]）、アクチノバクテリア（52 [0-8%]）が続いた。参加者の出身地域別にマイクロバイオームを分けると、北南東タンザニアでは672（42％；1,600 ASV）、南西タンザニアでは2,597（53％；4,900 ASV）と、ファーミキューテス属が依然として優勢であった。処理前のActinobacteria（放線菌）の割合は、南西部（245 [5％]）と比較して北南東部（304 [19％]）のASVで高かった。バクテロイデーテス（Bacteroidetes）属（882 [18%]）とプロテオバクテリア（Proteobacteria）属（735 [15%]）のASVは、南西部の方が南東部よりも割合的に多かった（付録p 3）。
属レベルでは、Streptococcus属（2340 [36%]）、Neisseria属（650 [10%]）、Veillonella属（390 [6%]）およびMycobacterium属（325 [5%]）の4つのASVが最も多かった。サンプルの由来で分けると、Mycobacteriumは208（13％）のASVで、タンザニア北東部ではNeisseriaとVeillonellaを抜いて2番目に優勢な属であった（付録p 4）。
処理前のコホート全体のα多様性は、サンプルリッチ中央値81（IQR 17-205）、Faithの系統的多様性7-9（2-12）、Shannon多様性指数4-7（1-6-6-2）、Pielouの均等性0-7（0-3-0-9）であった。均等性はシャノン多様性指数やFaithの系統的多様性よりも比較的低く、一部の分類群が他の分類群を支配する偏在したマイクロバイオームであることが示唆された（図1）。
図サムネイルgr1
図1治療前のマイクロバイオームの豊富さ、分布、多様性
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治療前のαおよびβの多様性を確立した後、治療開始後に異なるレジメン下でこの多様性がどのように変化するかを調べた。すべてのレジメンにおいて、存在量と多様性の最も高い減少は、治療開始後2週間で起こった。治療開始後2週間を過ぎると、存在量と多様性は回復し始め、ほとんどのレジメンで治療開始後8週目には治療前のレベルに達した。αの多様性はレジメンによって異なるパターンを示し、下降と上昇を繰り返した。HR10mg/kgZQは、すべてのレジメンでα多様性の減少が最も小さかった（付録pp.5-7）。HR20mg/kgZMは均等性を最も低下させ、0-75から0-55まで低下させた。均等性はHR10mg/kgZEレジメンで上昇した。全体として、モキシフロキサシン-リファンピシン含有レジメン（HR20mg/kgZM）、次いで高用量リファンピシンレジメンHR35mg/kgZEが、α多様性の最大の低下を引き起こした（図2A-D）。
図サムネイルgr2
図2治療開始後の異なるレジメンにおけるα多様性の変化
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Mann-Whitney検定を用いて、α多様性の変化が治療前と治療後のマイクロバイオーム間で治療経過にわたって有意差があるかどうかを評価した。均一性は、標準レジメンHR600mgZEまたはHR10mg/kgZEにおいて、ベースラインの0～72から治療12週目の0～80まで有意に増加した（治療2週目のp＝0～035、8週目のp＝0～024、12週目のp＝0～034）。さらに、標準レジメンでは、治療期間中、リッチネス、フェイスの系統的多様性、シャノン多様性指数の有意な低下は認められなかった。リファンピシンの高用量レジメンであるHR35mg/kgZEは、2週目でのみリッチネスを減少させたが（p＝0-026）、Faithの系統的多様性（2週目でp＝0-0055、8週目でp＝0-015、12週目でp＝0-014）およびシャノン多様性指数（2週目でp＝0-027、8週目でp＝0-021、12週目でp＝0-011）は追跡期間を通じて減少した。
HR35mg/kgZEでは、治療期間を通じて均等性の有意な低下は認められなかった。リファンピシン-モキシフロキサシンのレジメンであるHR20mg/kgZMは、すべてのα多様性測定に早期から影響を及ぼし、リッチネス（2週目でp＝0-0007、8週目でp＝0-0023）、フェイスの系統的多様性（2週目でp＝0-0078、8週目でp＝0-0025）、シャノン多様性指数（2週目でp＝0-0040、8週目でp＝0-015）、均等性（2週目でp＝0-015）を減少させた。HR20mg/kgZMを投与した群では、初期に豊かさの減少がみられたが、12週目にはすべての多様性指標において、また均等性については投与8週目からマイクロバイオームの回復が観察された。HR900mg/kgZEでは投与1週目にリッチネスが低下し（p=0-031）、HR20mg/kgZQでは投与12週目に均等性が低下した（p=0-0093）。HR10mg/kgZQとHR1200mgZEでは、すべてのα多様性指標において、投与期間を通じて有意な減少も増加も観察されなかった（表2、表3）。
表2異なるレジメンにおける治療前と治療後のマイクロバイオームの差の2週目、8週目、12週目におけるMann-Whitney検定
観察されたASV フェイスの系統的多様性 シャノン多様性指数 偶奇性
2週目 8週目 12週目 2週目 8週目 12週目 2週目 8週目 12週目 2週目 8週目 12週目
HR600mgZE または HR10mg/kgZE
ベースライン（n=19） 88 88 88 88 8-02 8-02 8-02 4-68 4-68 4-68 0-72 0-72 0-72
フォローアップ（n=16-26） 66 88 71-5 7-04 7-94 7-16 4-38 4-97 4-83 0-76 0-76 0-77
p 値 0-090 0-92 0-61 0-09 >0-99 0-50 0-97 0-27 0-50 0-035* 0-024* 0-034* 0-50
HR35mg/kgZE
ベースライン（n=9） 102 102 9-23 9-23 9-23 5-49 5-49 5-49 0-81 0-81 0-81
フォローアップ（n=8-9） 63 74-5 72 6-58 7-66 7-6 4-76 4-83 4-78 0-8 0-75 0-76
p 値 0-026* 0-070 0-089 0-0055* 0-015* 0-014* 0-027* 0-021* 0-011* 0-54 0-17 0-063
HR10mg/kgZQ
ベースライン(n=7) 80 80 80 7-55 7-55 4-75 4-75 4-75 0-74 0-74 0-74
フォローアップ（n=8） 77-5 61 58-5 6-88 6-33 6-75 4-79 4-16 4-37 0-75 0-71 0-74
p 値 0-63 0-29 0-52 0-34 0-39 0-61 0-96 0-78 0-87 0-39 0-78 0-55
HR20mg/kgZQ
ベースライン（n=8） 98 98 8-96 8-96 8-96 4-96 4-96 0-75 0-75 0-75
フォローアップ（n=7-9） 65 80 76 6-92 7-39 7-5 3-85 4-22 4-61 0-64 0-69 0-71
p 値 0-16 0-15 0-34 0-094 0-075 0-19 0-014* 0-059 0-24 0-0093* 0-14 0-33
HR20mg/kgZM
ベースライン（n=9） 82 82 7-96 7-96 7-96 4-77 4-77 0-75 0-75 0-75
フォローアップ（n=7-9） 31 38 50 3-76 5-08 6-032 2-42 3-51 4-41 0-55 0-71 0-73
p 値 0-0007* 0-0023* 0-29 0-0078* 0-0025* 0-41 0-0040* 0-015* 0-41 0-015* 0-24 0-76
ベースラインおよび追跡調査は、特に断りのない限り中央値。HR600mgZEまたはHR10mg/kgZEレジメンでの均等性の上昇傾向を除き、ほとんどの場合、マイクロバイオームはHR35mgZEまたはHR20mg/kgZMレジメンで有意な下降傾向を示した。レジメンの詳細は表1を参照のこと。ASV=アンプリコン配列変異体。

  • p<0-05.
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    表3第1週、第4週、第5週における異なるレジメンでの治療前と治療後のマイクロバイオームの差のマン・ホイットニー検定
    観察されたASV フェイスの系統的多様性 シャノン多様性指数 偶奇性
    1週目 4週目 5週目 1週目 4週目 5週目 1週目 4週目 5週目 1週目 4週目 5週目
    HR900mgZE
    ベースライン（n=6） 64-5 64-5 64-5 6-52 6-52 6-52 3-84 3-84 3-84 0-67 0-67 0-67
    追跡調査（n=7-14） 26-5 32 41 3-66 3-88 4-58 3-02 3-39 3-79 0-65 0-67 0-71
    p 値 0-031* 0-25 0-33 0-091 0-18 0-35 0-091 0-23 0-85 0-90 >0-99 0-28
    HR1200mgZE
    ベースライン（n=7） 30 30 30 3-67 3-67 3-48 3-48 3-48 0-74 0-74 0-74
    追跡調査（n=6-11） 23 27 46-5 3-13 3-58 5-19 3-12 3-01 4-01 0-64 0-66 0-72
    p 値 0-20 0-29 0-63 0-29 0-37 0-95 0-15 0-21 0-95 0-33 0-25 0-73
    ベースラインと追跡調査は、特に断りのない限り中央値。HR600mgZEまたはHR10mg/kgZEレジメンでの均等性の上昇傾向を除き、ほとんどの場合、マイクロバイオームはHR35mgZEまたはHR20mg/kgZMレジメンで有意な下降傾向を示した。レジメンの詳細は表1を参照のこと。ASV=アンプリコン配列変異体。

  • p<0-05.
    新しいタブで表を開く
    α多様性指標に有意な変化をもたらした治療レジメンのもとで、どの分類群がどのように変化したかを明らかにしようとした。分類群は相対的な存在量（abundance）に基づいてソートされ、1％以上のabundanceには名前が付けられ、0-0-0-9％のabundanceのものはその他に分類された。処理の過程で、存在量が1％以上の種の一部は1％未満に減少し、相対存在量が1％以上に増加したその他グループの種に置き換えられた。一般的に、最も存在量の多い種は、すべてのレジメンにおいて、処理期間を通じて存在量が1％未満になることはなかった（アルファ多様性については付録p8を参照）。
    1%未満の微生物群では、レジメンによる特徴的な分類群の変化が観察された。存在量1％以上の分類群の変化はレジメン間であまり特徴的でないことを考慮し、存在量1％未満の分類群（相対存在量0-01-0-99）を分析した。第一選択レジメンであるHR600mgZEまたはHR10mg/kgZEでは、50の分類群の相対存在量が投与前に1％未満であったが、そのうち7（14％）は投与2週目までに検出不能レベルまで減少した。実験レジメンであるHR35mg/kgZEおよびHR20mg/kgZMでは、相対存在量1％未満の分類群は投与前にそれぞれ56および62個存在し、そのうち53個中24個（45％）および62個中32個（52％）が投与2週目までに検出不能となった。レジメンによって除去された分類群ではグラム陰性属が最も多く、HR600mgZEまたはHR10mg/kgZEでは7例中5例（71％）、HR35mg/kgZEでは24例中12例（50％）、HR20mg/kgZMでは32例中19例（59％）であった、 グラム陽性属では、HR600mgZEまたはHR10mg/kgZEでは7例中2例（27％）、HR35mg/kgZEでは24例中5例（21％）、HR20mg/kgZMでは32例中6例（19％）であった。
    マイコバクテリウム属菌の相対存在量は、すべての治療レジメンで継続的に減少し、治療前のレベルまで回復しなかった。マイコバクテリウム属菌の相対存在量の減少は、治療期間中、リボソームRNAベースの逆転写酵素定量PCR検査であるTB-MBLAによって測定されたM結核菌量と相関していた（r＝0-74、95％CI 0-49-0-87、p＜0-0001；図3）。
    図のサムネイルgr3
    図3治療期間中のマイコバクテリウムの相対量
    キャプション
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    参加者は、治療開始8週目の結核菌液体培養の結果によって、培養陰性（早期転化）、培養陽性（非転化）、不確定（培養で汚染物質が増殖するが、結核の有無を確定的に否定できない）にグループ分けされた。レジメンとマイクロバイオームの相互作用の効果は、培養検査の結果と関連していることが観察された（付録p10）。彼らのマイクロバイオームを門クラスおよび科属レベルで分割プロットしたところ、Gammaproteobacteria（ガンマプロテオバクテリア）クラスのProteobacteria（プロテオバクテリア）が治療結果グループ間で最も明瞭に変化していた。ガンマプロテオバクテリアには、最も病原性の高い細菌が含まれる： 治療開始8週目までに、ガンマプロテオバクテリアの存在量は大幅に減少し、そのうちナイセリア属は培養陰性群（早期転換群）の喀痰サンプルで98％減少した。非転化群（培養陽性）では、Neisseria属が2％増加するなど、Gammaproteobacteriaの存在量は比較的安定していた。判定不能群では、治療前のガンマプロテオバクテリアの存在量は少ないままであったが、ナイセリア属が優勢で、ベースラインから治療8週目までに25％増加した（図4A、B）。
    図サムネイルgr4
    図4治療8週目における分類群の変化と治療成績の関連性
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    考察
    本研究では、異なる抗結核抗生物質の組み合わせが呼吸器系マイクロバイオームに及ぼす影響と、この影響が治療成績に及ぼす影響を系統的に評価した。DNAを用いた多くの研究とは異なり、マイクロバイオームはRNAから抽出されたため、治療期間中のマイクロバイオームの生存率に対する抗生物質の影響を正確に評価することができた。抗結核抗生物質に曝露されると、マイクロバイオームの多様性と存在量は、捕食者と被食者の関係に似た下降と上昇のパターンをとり、抗生物質の圧力下におけるマイクロバイオームの感受性と回復力を反映することを示した。12週間の縦断的追跡調査では、治療開始後2週間でマイクロバイオームの多様性の有意な減少が観察され、抗結核抗生物質の初期の殺菌活性が再現された。モキシフロキサシンとリファンピシン35mg/kgを含むレジメンでは、マイクロバイオーム多様性の減少が最も大きく、治療前のレベルとは有意に異なっていた。ほとんどの分類群は回復したが、マイコバクテリウム属は回復を示さず、抗結核抗生物質に対する特異的感受性が示唆された。マイコバクテリウム属の除去傾向は、M結核複合体からの生菌を特異的に定量する逆転写酵素定量qPCRベースのアッセイであるTB-MBLAによって測定された。今後の研究では、特に無症状または健康な人における常在菌としての結核菌の存在や、結核菌が病原性を持つようになる閾値やきっかけを探ることができるだろう。
    治療前のマイクロバイオームは、タンザニアの南西部では北東部よりも多様であり、宿主のマイクロバイオームに地理的な影響があることが示唆された。地理的な位置は、環境と食事の種類を包含しており、獲得したマイクロバイオームを形成することが示されている1。しかし、両地域の参加者のマイクロバイオームは不均一であり、ファーミキューテス属（レンサ球菌属）、バクテロイデーテス属（ベヨネラ属）、プロテオバクテリア属（ナイセリア属）、およびアクチノバクテリア属（マイコバクテリウム属）が優勢であった。呼吸器微生物叢におけるレンサ球菌属、ヴィエロネラ属、ナイセリア属の優位性は他の研究でも報告されている1。
    すべてのレジメンでリッチネス、多様性、均等性の減少がみられたが、HR20mg/kgZMおよびHR35mg/kgZEレジメンで有意な減少がみられ、アルファ多様性指標全体に影響を及ぼした。モキシフロキサシンの効果は投与8週目まで強かったが、HR35mg/kgZEの分類群多様性抑制効果は投与12週目まで持続し、リファンピシンの長期的な影響を示唆した。これらの観察結果は、報告されているモキシフロキサシンとリファンピシンの速効性と殺菌効果と一致している12, 17。2つのレジメンのうち、モキシフロキサシンレジメンのみが投与開始2週間で均等性を低下させた。HR10mg/kgZQレジメンも、同じ2週間の間に系統多様性と均等性に影響を及ぼした。対照的に、標準的なHR600mgZEまたはHR10mg/kgZE投与群では、投与2週目から12週目まで、分類群による均等性の増加がみられた。HR35mg/kgZEによる均等性の有意な低下とHR600mgZEまたはHR10mg/kgZEによる増加は、リファンピシンの殺菌効果が分類群に均等に行き渡り、その結果、除去よりもむしろ分類群の分布が均等になることを示している。リファンピシンの投与量が35mg/kgを超えると、効果は異なる可能性がある。PanACEA MAMS-TB臨床試験では、HR35mg/kgZEレジメンの方が安定した培養転換を引き起こすのに有効であることが認められ、第3相試験に推奨された。HIGHRIF試験2では、リファンピシン1200mgの固定用量は標準的なリファンピシン600mgよりも培養転換を引き起こす点で優れていなかったことから、HR20mg/kgZEレジメンで観察された効果はモキシフロキサシンが寄与している可能性が高いと推測するのはもっともである。
    少数の分類群（n=12）は相対存在量が1%以上であったが、大部分は存在量が1%未満（0-10-0-99%）であった。1％以上の存在度を示す分類群は比較的安定しており、抗生物質の作用による減少はほとんど見られなかった。モキシフロキサシン投与下では、相対的な存在量の減少が顕著であり、Streptococcus属は15％減少し、Prevotella属が2番目に多く、Neisseria属は14％減少し、2位から7位となり、存在量が回復するのに12週目までかかった。対照的に、リファンピシン35mg/kg投与群では、投与開始後2週間でレンサ球菌属が7％、ナイセリア属が4％増加したが、HR600mgZEまたはHR10mg/kgZE投与群では、同属の減少はわずか3％と1％であった。この効果は、モキシフロキサシンを含むレジメンの強力な早期殺菌活性を示すものである。この強力な早期殺菌活性は、リファンピシンをモキシフロキサシンで補充することで、リファンピシンのみを増量するよりも強力かつ迅速な抗菌作用が得られることを示唆している。
    1％以上存在する比較的安定した分類群では、投与開始後2週間で観察された豊かさと多様性の減少を説明することはできなかった。相対存在量が1％未満であった分類群をさらに詳しく分析したところ、その群集の構成員は、投与2週目には検出されない程度まで存在量が減少していた。検出レベル以下まで減少した分類群の半数以上がグラム陰性菌であった（63種中36種［57％］、うち19種［53％］はモキシフロキサシンを含むレジメンで減少）。モキシフロキサシンのようなフルオロキノロン系抗菌薬がグラム陰性菌（髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）を含む）、グラム陽性連鎖球菌（Streptococcus pnuemoniae）、および一般的な嫌気性菌に対して強い作用を示すことは、以前から実証されている18, 19, 20。
    その他の分類群は治療中に回復したが、マイコバクテリウム属の細菌はすべてのレジメンで回復しなかったことから、何らかの選択的排除が行われていることが示唆された。Kateteら21は、標準的なHR10mg/kgZEレジメンを投与された結核患者において、他の分類群の回復に関してマイコバクテリウム属菌の同様の減少を報告している。マイコバクテリウム属菌の持続的除去は、抗結核レジメンの成分（イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール）がマイコバクテリウム属菌に特異的に作用し、おそらく広域リファンピシンまたはモキシフロキサシンによって増強されることで説明できるかもしれない22, 23。
    抗生物質とマイクロバイオームの相互作用が結核の治療成績に影響を及ぼすかどうかを検討した。治療開始8週目までに結核菌培養陰性に転じた患者では、ナイセリア属のプロテオバクテリアは検出可能レベル以下まで減少した。対照的に、培養陽性のままであった患者ではナイセリア属菌が2％増加し、治療開始8週目までに判定不能のままであった患者ではナイセリア属菌が25％増加した。
    分析したレジメン数で割るとサンプルサイズは小さい。しかし、本研究で対象とした治療前のコアマイクロバイオームは、アフリカ東部およびアフリカ以外で実施された他の研究で発表された呼吸器系マイクロバイオーム組成と一致しており、代表的なものである24, 25。このことは、コアマイクロバイオームは参加者間で類似しており、参加者数にかかわらずあまり変化しない可能性があることを示唆している。第二に、本研究では、回復した分類群がどの由来によるものかを調べていない。回復が抑制されていた分類群の再成長によるものなのか、それとも食事からの補充によるものなのかを追加研究で調査し、長期的な臨床結果や健康結果への影響を調べる必要がある。
    まとめると、抗結核レジメンと投与量の違いによって、喀痰マイクロバイオームへの影響が異なることが示された。標準的な第一選択レジメンであるHR600mgZEまたはHR10mg/kgZEは、マイクロバイオームにわずかな影響しか及ぼさないように思われ、分類群の均等性の増加を引き起こし、多様性の有意な減少は認められなかった。標準レジメンのバックボーンの中で、リファンピシンの投与量を35mg/kgに増量すると、マイクロバイオームが有意に減少し、治療3カ月目の追跡調査までに治療前のレベルに回復しなかった。リファンピシンの投与量を20 mg/kgに減らして400 mgのモキシフロキサシンを補充すると、マイクロバイオームの多様性が有意に減少し、治療開始3ヵ月目には治療前レベルまで回復した。SQ109という薬剤は、抗結核レジメンのパフォーマンスやマイクロバイオームへの影響に大きな付加価値を与えなかったようである。最も重要なことは、結核菌はレジメンによらず回復を示さなかったことである。このことは、新規の最適抗結核レジメンが、有益な呼吸器マイクロバイオームに不可逆的なダメージを与えることなく、治療期間を短縮できる可能性を示唆している。さらに、除去されるのはM結核菌だけなのか、またこのことが回復しつつあるマイクロバイオームや治療成績にどのような影響を及ぼすのかを確認するためには、大規模な縦断的研究が必要であろう。
    貢献者
    EM、WS、SHGが本試験とプロトコルをデザインした。EM、SE、WS、AW、ED、BM、RA、NEN、GSKがデータ収集とキュレーションに参加。EM、WS、AWがデータの解析を行った。WSとAWは図を作成した。WS、SHG、NH、MH、RA、MBは本研究を支援する資金を得た。EM、WS、SHGが第1稿と最終稿を執筆。WS、EM、AWは本研究の全データにアクセスし、検証した。著者全員が原稿執筆に参加した。EM、AW、WSは原データにアクセスし検証した。
    データの共有
    配列データはBioProject (PRJNA729425)の下、米国国立生物工学情報センター(NCBI)のSequence Read Archive (SRA)に寄託され、一般公開されている。アルファ多様性データ、解析、データディクショナリーのExcelスプレッドシートはセントアンドリュース大学でホストされており、倫理承認に従って10年間保存される。データへのアクセスは、対応する著者に連絡し、データが収集された倫理的要件を満たすことで可能である。
    利益申告
    WSとSHGは、臨床用の結核分子細菌量測定法を開発している企業に無償で助言を提供している。他のすべての著者は、利害関係がないことを表明している。
    謝辞
    我々は、European and Developing Countries Clinical Trials Partnership（EDCTP1；助成金IP.2007-32011-013およびIP.2007-32011-012；プロジェクトコードIP.2007-32011-011）およびGerman Ministry of Education and Research（01KA0901）の助成によるPanACEA MAMS-TBおよびHIGHRIF study 2試験からのサンプルの提供に感謝する。サンプル処理と配列決定はEDCTP1 PanAfrican Biomarker Expansion Programme（助成金IP.2007-3201-011）およびEDCTP2 PanACEA-2助成金（バイオマーカー開発コアストリーム）の支援を受けた。
    補足資料
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    補足付録
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    論文情報
    出版履歴
    発行 2023年10月10日
    識別
    DOI: https://doi.org/10.1016/S2666-5247(23)00191-X

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図
図サムネイルgr1
図1治療前のマイクロバイオームの豊富さ、分布、多様性
図サムネイルgr2
図2治療開始後の異なるレジメンにおけるα多様性の変化
図サムネイルgr3
図3治療経過におけるマイコバクテリウムの相対的存在量
図1gr4
図4治療開始8週目における分類群の変化と治療成績の関連性
表
表1PanACEA MAMS-TBおよびHIGHRIF study 2臨床試験における薬剤投与量と投与期間
表2異なるレジメンにおける治療前と治療後のマイクロバイオームの差の2週目、8週目、12週目におけるMann-Whitney検定
表3第1、4、5週における異なるレジメンでの治療前と治療後のマイクロバイオームの差のマン・ホイットニー検定
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