基質の硬さが緑膿菌の痙攣運動を調節することで初期のバイオフィルム形成に影響を与える

哉百名


微生物学・感染症学
生命システムの物理学
基質の硬さが緑膿菌の痙攣運動を調節することで初期のバイオフィルム形成に影響を与える

https://elifesciences.org/articles/81112?utm_source=twitter&utm_medium=social&utm_campaign=organic

ソフィア・ゴメス
リオネル・ビューロー
Sigolene Lecuyer

et al.著者リストを展開する
グルノーブルアルプ大学、CNRS、フランス
リヨン大学物理学研究所、リヨンENS、クロード・ベルナール大学、CNRS、フランス
他、著者リストを展開
2023年5月9日
https://doi.org/10.7554/eLife.81112
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ソフィア・ゴメス
リオネル・ビューロー
カリン・ジョン
エリーズ・ノエル・シェーヌ
デルフィーヌ・デバール
シゴレーヌ・ルクイエ

(2023)
基質の硬さが緑膿菌の痙攣運動を調節することで初期のバイオフィルム形成に影響する

eLife 12:e81112.
https://doi.org/10.7554/eLife.81112
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2023年6月9日（本バージョン）
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概要
細菌の世界では、表面に付着した生活様式が支配的である。バイオフィルムと呼ばれる大規模な多細胞集合体は、過酷な環境における細菌の生存に不可欠であり、病原菌株の抗生物質耐性と密接な関係がある。バイオフィルムは、生体組織から不活性物質まで、細菌が遭遇する多種多様な基質の表面コロニー形成に由来する。ここでは、乱雑な日和見病原体である緑膿菌が、基質の剛性によって異なる基質を探索し、バイオフィルムの構造、エキソ多糖（EPS）の分布、共殖時の菌株混合、表現型の発現に顕著な変化をもたらすことを実験的に示す。単純な速度論モデルを用いて、これらの表現型は、基質の弾性とIV型ピラス（T4P）機構との間の力学的相互作用によって生じることを示した。これらの知見を総合すると、複雑な微小環境における細菌の空間的組織化において、基質の柔らかさが果たす新たな役割が明らかになり、効率的なバイオフィルム形成に多大な影響を及ぼすことが示唆される。
編集部の評価
この基礎研究は、バイオフィルム形成の初期段階における基質の物理的特性の影響についての理解を大きく深めるものである。マイクロ流体工学、単一細胞の運動性、そしてモデリングを統合することで、本研究は、基質とタイプIV繊毛の間の機械的相互作用がこれらの現象を促進するという説得力のある証拠を示している。この研究は、マイクロコミュニティやその構造、生態学に興味を持つ幅広い読者を惹きつけるであろう。
https://doi.org/10.7554/eLife.81112.sa0
決定書
サイエティでのレビュー
イーライフの査読プロセス
はじめに
バイオフィルム形成において、細菌がプランクトン状態から表面に付着した状態に移行することは極めて重要である。そのため、細菌が表面の近接性を感知し、それに反応する方法は、熱心に研究されてきた（Dufrêne and Persat, 2020; Laventie and Jenal, 2020）。この相互作用には、表面に向かって泳ぐだけでなく、付着した細菌が集団的または個々に表面を探索するために使用する群泳、滑走、痙攣など、細菌の運動性のさまざまな側面が関与している（Wadhwa and Berg, 2022; Conrad et al.） 最終的には、本質的な成分（マトリックスの産生、運動性の喪失）は知られているが、依然として不明な手がかりに反応するメカニズムによって、恒久的な細菌の接着とマイクロコロニーの構造が生じる可能性がある。
細菌はユビキタスであり、様々な生体組織や生物学的表面へのコロニー形成を成功させることができる（Stoodley et al.、2002；Mann and Wozniak、2012）。環境が異なると、ある微生物が異なる表現型を示すことが多い（Dötsch et al.） しかし、化学シグナル伝達が細菌の遺伝子制御に影響を与えることは長い間知られているが、遭遇した表面の機械的特性が細菌の挙動にどのような影響を与えるかは依然として不明である（Persat et al.、2015b）。本稿では、基質の剛性が細菌の運動性をどのように変化させ、そうすることでマイクロコロニーの形態形成と初期のバイオフィルム形成にどのような影響を与えるかを調べる。
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa、PA）は、非常に柔らかい組織から硬いインプラントまで、幅広い基質を汚染する日和見性の桿状病原体である（Moradali et al.） 特に優秀で多彩なバイオフィルム形成能を持ち、抗生物質耐性を獲得する傾向が極めて強い（Pang et al.） PAは、表面上を移動するためのテクニックの宝庫を開発した。そのうちの一つが、IV型繊毛（T4P）を用いて単一細菌が表面を移動することを可能にする痙攣運動性である（Maier and Wong, 2015）。T4Pは細菌表面にある細いタンパク質フィラメントで、タンパク質サブユニットPilAの集合と分解によって伸縮する。T4Pの先端は、ほとんどの表面をつかむことができる遊走フックとして機能する。付着、収縮、剥離、伸長のサイクルが細菌を推進する（Merz et al., 2000; Maier and Wong, 2015; Skerker and Berg, 2001; Talà et al.） この表面運動性は、細菌が効率的に表面に定着するために重要であるが、その正確なメカニズムは不明である（O'Toole and Kolter, 1998; Leighton et al., 2015; Craig et al.） T4Pの機能と環境に力を及ぼすという事実から、T4Pは表面感知機構の明らかな候補となる（Merz et al., 2000; Dufrêne, 2015; Sahoo et al., 2016）。最近の結果から、PAにおけるピリの極性局在は、表面感知に反応して起こる可能性があることが示された（Cowles and Gitai, 2010）。極性局在化した繊毛は、ランダムな変位ではなく持続的な変位をもたらし、強い流れにさらされたバクテリアの上流への移動といった特異的な効果ももたらす（Shen et al.） 障害物に遭遇すると、バクテリアの痙攣が急速に逆転することから、T4Pによる力学的フィードバックが示唆される（Kühn et al.） さらに、PAは急性感染から慢性感染まで、さまざまなタイプの病原性を発揮することができ（Furukawa et al., 2006; Valentini and Filloux, 2016）、従来、特定の宿主-病原体相互作用が、これらの病原性経路の制御における重要な役割を果たすと考えられてきた（Gellatly and Hancock, 2013）。しかし最近、表面感知自体が、病原性関連遺伝子のアップレギュレーションを引き起こす可能性のあるシグナルとして登場している（Islam and Krachler, 2016; Persat et al.） 細菌の接着とバイオフィルム形成に対する表面剛性のグローバルな影響については時々取り上げられているが（Saha et al., 2013; Song and Ren, 2014; Song et al., 2018）、これまでのところ、個々の細菌が経験するマイクロメカニカル環境が細菌の挙動にどのように影響するかはまだ不明である。
本研究では、自作のマイクロ流体セットアップを用いて、制御された流動条件下で、開放表面に付着するPA細菌に対する基質の剛性の影響を単一細胞レベルで調べた。まず、基質の弾力性が初期のマイクロコロニーの形成に強く影響することを示した。次に、単一細胞の挙動に焦点を当て、剛性が細菌の運動性をどのように調節するかを定量的に研究し、我々の観察結果を説明する純粋に力学的なモデルを提案する。最後に、この運動性の機械的調整によって、剛性に起因する初期の表面コロニー形成の変化が説明できることを示し、マイクロコロニーの形態、マトリックスの沈着、ひずみの混合、および長期的な遺伝子発現の観点から、その結果を探る。
研究結果
付着細菌の挙動に対する基質の剛性の影響をin situで調べるために、我々は、制御された流動条件を提供し、共焦点イメージングを可能にするマイクロ流体チャンネルに、機械的に明確に定義されたハイドロゲルパッドを含める実験的アプローチを開発した（図1A）。われわれは、生体適合性のあるハイドロゲルであるポリアクリルアミド（PAA）を用いている。このハイドロゲルは、哺乳類細胞における細胞-基質相互作用とメカノトランスダクションの研究に広く用いられている。PAAは、調製時にビスアクリルアミド架橋剤の量を変えることで、粘性散逸を低く保ちながら、生物学的に適切な剛性範囲（約1-100kPa）をカバーすることができる。各実験では、弾性率が約3～100kPaの範囲にある複数のパッド（図1の補足1および材料と方法を参照）を使用し、PAAおよびガラス表面に付着した細菌を、高解像度の位相差および蛍光タイムラプスイメージングで、表面被覆率が非常に低い状態からマイクロコロニーの形成まで（約10時間にわたって1フレーム／分）撮影した。
図1と4つの補足
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細菌のマイクロコロニー形成は基質の剛性に依存する。
(A）実験セットアップ：細菌（緑膿菌PAO1株）をフローセル内で最小培地を一定に流しながら撮影。(B）10時間後、軟質PAA（2.7 kPa）上に密集した分離コロニーが形成された。
図1-図4
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T4P欠損変異体PAO1 pilA::Tn5 では、基質の硬さはコロニーの形態に大きな影響を与えない。
スケールバー20μm。
図1-図3
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基板剛性は、せん断流がない場合の初期マイクロコロニーの形態に影響を与える。
6ウェルプレートの底にあるPAAハイドロゲル上のWT PAO1細菌の位相差画像（攪拌せずに37℃で150分間培養後）。赤：t0における初期付着細菌。
図1-図2
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マイクロコロニーの形態はPEGハイドロゲルの表面剛性に強く影響される。
表面コロニー形成開始5時間後のPEGハイドロゲル上のWT PAO1細菌の位相差画像。スケールバー、20μm。
図1-図1
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AFMによるハイドロゲルの機械的特性評価（a）圧子による弾性率とマイクロレオロジーによる弾性率の比較。
両手法ともヤング率E<20 kPaのゲルでは定量的に類似した結果が得られる。(b)押込み測定によるゲルの空間的均一性。各位置について、分離された... もっと見る
基質弾性はT4P依存的にPAAの細菌コロニー形成を変化させる
我々はまず、初期のマイクロコロニー形成に対する基質の剛性の効果に注目した。位相差イメージングによる素直な観察から、数時間後のマイクロコロニーの形状に顕著な影響があることが示された（図1Bおよびビデオ1）：最も柔らかいハイドロゲル（＜10 kPa）では、細菌は明瞭で緻密な半球状のコロニーを形成する。対照的に、硬いハイドロゲルでは、細菌は表面の大部分を覆う薄い層に分布し、ガラス上で観察される形態に近い。細菌の増殖速度の変化による影響を排除するため、異なる基質上での細菌の分裂時間（図1C）と、数時間後の細菌コロニーが占める体積（図1DとE）を定量化した。両者とも影響を受けていないことから、細菌は基質の剛性に関係なく同じ速度で発育しコロニー化するが、コロニーへの自己組織化を促進するプロセスは変化していることが示唆された。対照的に、コロニーの形態の変化は、剛性が高くなるにつれて減少するバクテリア層の特徴的な粗さ（図1E）と、柔らかいハイドロゲルではさらに広がる表面からの距離によるバクテリアの分布（図1F）を定量化することで確認できた。この現象が、特異的な化学的相互作用ではなく、基質の弾性に駆動されるロバストな現象であることを確認するため、PAAとは化学的に異なるが、同様の剛性範囲に及ぶことができるポリエチレングリコール（PEG）ハイドロゲルを用いて、このアッセイを再現した。その結果、コロニーの表現型に関して非常によく似た結果が得られ、細菌の自己組織化において基質の機械的特性が果たす役割がさらに確認された（図1-図2）。最後に、せん断流は極性付着細菌を配向させ、運動性を誘導し、クオラムセンシング分子を分散させ、一般にコロニーへの空間的組織化に影響を与える可能性があるため、上記培地を攪拌することなく、ウェルの底に固定化したハイドロゲルで実験を行った。この場合、泳動する細菌によって長時間の観察は困難になるが、より軟らかいPAA上でより高密度のコロニーが形成されることがはっきりと観察され（図1-図3）、基質の硬さが様々な環境における付着後の細菌の挙動を変化させることがさらに示された。
ビデオ1
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2.7kPa（左）と65kPa（右）のPAAハイドロゲル上での表面コロニー形成。位相差顕微鏡で6時間にわたって1分間に1枚の画像を撮影。
2つのゲルを同じマイクロ流体チャンネルに入れ、準同時撮影した。スケールバーは20m。
PAの初期自己組織化には表面運動性が重要であることが知られているので、観察されるマイクロコロニーの形状の違いにも、この運動性が関与している可能性がある。この関連性を、IV型絨毛（T4P）を欠失し、表面で運動できない変異体（変異PAO1 pilA::Tn5, Figure 1-figure supplement 4）を用いた実験から探った。これらのアッセイでは、マイクロコロニーの形態が基質の剛性に依存することはなく、細菌はすべてのPAA基質上で密な半球状のコロニーを形成した。従って、T4Pを介した表面運動（"twitching"）が、柔らかい弾性基質上でのWT PAO1によるマイクロコロニー形成の剛性調節に重要な役割を果たしていると結論した。
基質の弾力性が痙攣運動性を調節する
実験結果-グローバルな運動性
基質の弾性とバクテリアのピクピク運動性との間の結合を定量化するために、フローセル内の付着バクテリアのタイムラプス位相差画像を解析した。これらの画像は、撮影開始時（視野あたり数個の分離したバクテリア）から、面外成長に移行するまでの間、個々のバクテリアのセグメンテーションを可能にする（SIサブセクションI.A）。初期の撮像段階（＜100分）で分割された2値画像から、占有ピクセルの割合として表面被覆率A(t)を、時間tで探索されたピクセルの割合として累積探索領域S(t)を求める（図2A）。A(t)の進化は、最初に表面に付着したバクテリアの指数関数的な成長と、撮影中の潜在的な付着・離脱イベントを反映している。しかし、我々の実験では、初期の表面被覆率は極めて低く、初期の時点では、清浄な流動媒体中のバクテリアの数はごくわずかであるため、付着イベントはほとんど観察されない。したがって、次のように考えることができる。
(1)dAdt=(kdi-kde)A(t).
細菌の分裂速度kは基質に依存せず（図1C）、各実験で測定された（k=27.8±1.4分）。図2Bは、ゲルの剛性に依存するA(t)の実験的時間変化を示しており、これは実に単純な指数関数（傾きkdi-kdeを持つ半対数表示の直線）でよく記述できる。A(t)の傾きはゲル剛性とともにわずかに増加し、このことは、より軟らかいハイドロゲルでは剥離速度kが速いことを示唆している。
図2と1つの補足
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柔らかいハイドロゲル上では細菌表面の運動性が損なわれる。
(A）柔らかいPAA表面と硬いPAA表面で100分後に探索された表面（紺色）と現在の表面被覆率（シアン）。スケールバー：20μm。(B）表面被覆率A(t)（破線）と累積表面被覆率...続きを見る
図2-ソースデータ1
表面被覆率と探傷面積の時間変化。
https://cdn.elifesciences.org/articles/81112/elife-81112-fig2-data1-v2.xlsx
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図2-図1
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変異体PAO1sadC::Tn5およびPAO1wspR::Tn5の軟質（2.7 kPa）および硬質（84 kPa）PAAハイドロゲル上での挙動。
左：最初に付着したバクテリア（赤）と100分後の総探索面積（白）を示す典型的な画像。右： 本文の式2を用いて計算した細菌の平均速度Vg。
A(t)と比較して、累積表面被覆率S(t)の基質剛性に対する依存性は定量的に非常に大きい（図2B）。この結果は、表面上の細菌の大域的な運動性Vの変化を直接反映していると考えられる。実際、バクテリアの表面付着を無視すると、Sの進化は次のように書くことができる。
(2)dSdt=kdiA+VgwbN=(kdi+Vglb)A.
ここで、Nは表面上のバクテリアの数を表し、棒状のバクテリアの典型的な大きさはwblb（幅×長さ）なので、占有面積はA=Nwblbとなる。ここでは、T4Pの極性局在に関するこれまでの知見（Cowles and Gitai, 2010; Jin et al. (バクテリアがどの方向にも移動できることを考慮すると、速度の値はlbwb--√≒3-√倍下がるが、これからの議論に大きな変化はない)。各実験で平均細菌サイズを測定した(lb =2.8 ± 0.13 μm, wb =0.8 ± 0.13 μm)。各モニター位置について、dS/dtとA(t)を実験的に決定した。次に、最初の100実験時点の平均をとることにより、式2を用いて大域的細菌速度Vを推定した。
フロー下での最初の100分間、Vは基質の弾性に明確な依存性を示した（図2C）。運動性の値は、非常に柔らかい基質（3-6 kPa）ではゼロに近く、本研究でテストした中で最も硬いハイドロゲル（84 kPa）では約0.5±0.25 μm/分に達するまで徐々に増加した。我々は、このような表面運動性の基質弾性依存性が、細菌の表面感知に反応した細胞内修飾に起因するのではないかと考えた。緑膿菌では、これまでに2つの主要な表面感知システムが明らかにされている。T4Pの収縮を介した力感知を伴うPil-Chpシステム Webster et al., 2021と、細胞外皮ストレスによって活性化されると考えられるWspシステム O'Neal et al. セッシビリティとマトリックスの産生は、細胞内のc-di-GMPレベルを上昇させることで促進され、その産生はジグアニル酸シクラーゼ（DGC）によって触媒される。我々は、表面感知応答に関与することが知られている2つのDGCであるwspR変異体とsadC変異体を用いて実験を行った。c-di-GMPの制御が損なわれているが、両変異体は依然として硬さに依存した痙攣運動性を示した（図2-図1）。他のDGCが関与している可能性があるにせよ、これらの初期結果は、初期のタイムスケールにおける我々の観察結果が、主にバクテリアと基質との機械的相互作用に支配され、遺伝子制御は二次的な役割を果たしている可能性を示唆している。この理論的根拠が、次に示す単純な動力学モデリングの動機となった。
最小限の運動モデリング
細菌が表面に付着すると、ほとんど直ちに痙攣速度の違いが観察されることから、単純な仮説としては、メカノトランスダクション機構を必要とせずに、T4Pの伸長／引き込み機構と基質の線形弾性との相互作用という機械的要因によって、痙攣効率の調節が生じるということが考えられる。この最小限の仮説を検証するために、我々は図2Dに模式的に示した運動モデルを開発した。
簡単に説明すると（詳細は付録1を参照）、弾性基質に付着した細菌が、1本の効果的なピラスを持つと考える。この単純な選択は、ピラスが収縮する際に全長にわたってまっすぐになるという顕微鏡観察と、牽引力顕微鏡の測定からピラス付着スポットのサイズを≈1 nmと推定したKoch et al. なお、基質への毛細血管の複数の付着も示唆されている。しかし、我々の単純なアプローチでは、この可能性は考慮しない。ここで、Fは毛柄にかかる引っ張り荷重、Fは引き込み停止力、vは荷重ゼロのときの引き込み速度を表す。線形弾性を仮定すると、引張荷重Fはピラス付着パッチにおける基質の変位uとF=Yuで表される。菌体lbの典型的な大きさはλよりはるかに大きいので、菌体によって誘発される基質の変形を無視する。その代わりに，ピルスの張力は，直線的な力-速度の関係vB(F)=v0FFB（SIサブセクションII.BおよびSens, 2013を参照）で細菌体の前方への滑走をもたらし，基質の変形とピルスの荷重を減少させると仮定する．ここで、比η=FBv0は基質上の細胞の移動度定数を表す。このモデルを用いると、ピラス張力Fの変化は次式で与えられる。
(3)dFdt=Ydudt=vR(F)-vB(F)
で与えられる。
(4)F(t)=F0(1-e-Yv0F0t)
を、自然に生じる力スケール
(5)f0=fbfrfr+fb。
dxBdt=vB(F)から、毛管引き込み中の細菌の滑走距離が得られる。
(6)xB(t)=F0FB[v0t+F0Y(e−Yv0F0t−1)].
引き込む間、毛柄は基質から速度定数koffで剥離する。力に依存しない剥離速度定数koff=k0off（したがって、平均毛瘡付着時間(k0off)-1）と毛瘡引き込み頻度kを仮定すると、細菌の実効速度が得られる：
(7)veff=kp⟨xB⟩ e-k0offtdt=VmaxEE+E0.
ここで、⟨xB↪Pe_27E9 は、1回のピラス引き込みイベントあたりの細菌の平均滑走距離を表し、Vは、無限の剛性において、与えられた基質上で細菌が到達できる最大有効速度を表す。これは次式で与えられる。
(8)Vmax=v0kpk0offFRFB+FR.
E0は半分の最大速度での剛性を表し、次式で与えられる。
(9)E0=FBFRk0off(FB+FR)v0λ.
実験的に測定された細菌の実効速度Vに対して(A11)を当てはめると、Vmax=0.77±0.35μm.min-1、E0=84±68kPaのデータを定量的に説明することができる。VとE0の誤差推定値は、フィット関数の共分散行列と残差の分散（カイ二乗和を自由度で割ったもの）から直接計算したもので、異なる実験間で測定された速度のばらつきが大きいことを反映している。逆に、モデルで使用されるパラメーターの値から、VとE0を推定することができる：典型的なピラス引き込み速度v0=1 m.s-1 (Marathe et al., 2014)、FR=100 pNのオーダーの失速力(Marathe et al., 2014; Koch et al、 2022）、ピラスオフ速度定数k0off=1 s-1（Talà et al.、2019）、接触サイズλ=1 nm（Koch et al.、2021）、FB=1 nNの高摩擦表面、および典型的なピラス引き込み頻度（ここでは、引き込みイベント中に1つの有効なピラスが活動すると仮定する。典型的なピルスの長さ5μm、引き込み速度v0=1μm.s-1を用いると、1回の引き込み時間は5秒、引き込み頻度は0.2s-1となる）、kp=0.2s-1を用いると、Vmax∼1μm.min-1、最大速度の半分における基質剛性E0=100kPaが得られ、これらは適合値の30%以内であった。
加えて、我々のモデル[式8]は、2つの別々の効果によって、（速い）無荷重の微視的な毛管引き込み速度vが（遅い）巨視的な細菌速度Vに変換されることを示している。第二に、毛胞の収縮速度は負荷に依存してFR/(FB+FR)のように遅くなる。両効果を合わせると、局所速度はμm.s-1からμm.min-1へと一桁低下する。
このことから、弾性基質上での細菌の有効運動性に関するわれわれの実験結果は、ピラス引き込み機構、弾性基質の変形、基質上での細菌体の摩擦の間の単純な相互作用の結果として解釈できることがわかる。
個々の軌道の解析
図2に示した単純なアプローチでは、細菌の速度Vの集団平均値が得られた。しかし、細菌の集団は不均一である可能性があり、さらに、式2を用いてVを決定したモデルは、剥離や再付着の事象を無視するなど、多くの強い仮定に依存している。PAA基質上でのバクテリアの運動性をさらに解明するために、われわれはセグメンテーションとトラッキングのプロトコルを開発し、取得の過程で可視化されたすべてのバクテリア細胞の個々の軌跡を得た（詳細は図3A、ビデオ2、および材料と方法）。この徹底したアプローチにより、各1分間の変位ステップに関連する速度を測定することができる。
図3と5つの補足
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ピクピク運動は基質の剛性に依存し、細菌集団に高度に分布している。
フルトラック（上段）と1分間の変位ステップ（下段）の解析。(A) 最初の3分間の軟質（2.7 kPa）、中間（18.5 kPa）、および硬質（84 kPa）PAA上の個々の細菌トラック。
図3-ソースデータ1
細菌追跡による瞬間速度値。
https://cdn.elifesciences.org/articles/81112/elife-81112-fig3-data1-v2.xlsx
Download elife-81112-fig3-data1-v2.xlsx
図3-図5
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PEGハイドロゲルで測定された特徴的な伸縮速度は、同一の実験条件下でPAAハイドロゲルで測定されたものと類似している。
PAAハイドロゲルまたはPEGハイドロゲル上の変位ステップの分布を、同じような基質剛性範囲でフィッティングして得られたV。エラーバーはSEM。各ポイントは1...続きを見るから2つの位置の平均である。
図3-図4
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様々なゲル剛性におけるV（A）とV（B）の統計解析。
n.s.は、0.05の閾値で有意差がないデータセットを示す。
図3-図3
アセットをダウンロードする オープンアセット
単一指数による変位ステップ分布のフィッティングの検証。
左図は、特徴的な速度VとVを持つ減少指数分布に従う2つの無相関ランダムベクトルの和の分布（点）を計算したもので、角度...続きを見る
図3-図2
資産をダウンロードする 資産を開く
平均トラック速度の解析。
(A) 基質剛性の異なる値に対する平均飛跡速度分布。フルトラックのみを考慮した（図3-図1中の右のピークに対応）。もっと見る
図3-図1
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追跡の結果、ハイドロゲル基質上の細菌のサブ集団が明らかになった。
(A）異なるPAA基質（WT PAO1）上で測定した細菌トラックの経路持続時間の分布。1つの飛跡は分裂イベント後に始まり、次の分裂時、または... もっと見る
動画2
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個々のバクテリアを追跡するための画像処理の原理。
制御されたせん断流下でのガラス表面のコロニー形成を、位相差顕微鏡で90分間追跡（1フレーム/分）。左は、登録された位相差画像と中央の... もっと見る
すべての細菌について、特徴的な痙攣速度を定義することができるのか、あるいは、表現型的に異なる遅い細菌と速い細菌の集団が表面に同居しているのか？これらの疑問に答えるため、連続する2つの分裂イベント間の細菌の移動量として定義される各トラックにラベルを付けた（図3A）。図1Cに示された特徴的な分裂時間に類似していることが予想された。1つは分裂時間（約27分）を中心とするピークで、もう1つはバクテリアが剥離する前に表面上で5-10分過ごすことに対応するピークである（図3-図1A）。それぞれの集団に対応する速度分布は類似している（図3-図1B）。この観察は、Laventie et al., 2019の結果と一致し、娘細胞間の表現型の違いと一致する。実際、剥離前の軌道の持続時間は、柔らかい基質では短い傾向があるが、基質から剥離する細菌の割合（35±2 %）は、基質の硬さに依存しない。従って、実験初期には、1番目の娘細胞と同調して移動した後、2番目の娘細胞が基質から剥離することがあると考えられる（約70％の割合）。この特徴は、その後のタイムポイントで変化する可能性がある。細菌の追跡は、3D空間編成の開始時に中断された（最も柔らかいハイドロゲル上では約100分。）
完全な追跡が記録された付着子孫のみを考慮し、追跡を初期位置に関して正規化したところ、図3Aが得られた。これらの均一な半径方向分布は、せん断が我々の実験において細菌の配向に影響を与えないことを確認した。予想通り、基質の剛性が高くなるにつれて、飛跡の伸長は大きくなる。飛跡の平均速度の分布から、異なる細菌亜集団を区別することはできない。それは、より硬いハイドロゲル上ではより高い値に達するが、指数関数的減衰（細胞集団で予想される挙動の多様性を反映している；図3B）を伴う連続的な幅広い値である。加えて、各トラックにおいて、この平均速度の標準偏差は同程度であり、その平均値に比例している（図3-図2）ことから、与えられた軌道内での痙攣ステップの確率的分布が示唆される。
次に1分間の変位ステップに注目し、実験の最初の100分間のすべてのモニターイベントをプールすると（同じ時間ウィンドウ内の全トラックを分析するよりも多くのデータが得られる）、図3Cに示す典型的な速度分布が得られた。これらの分布は、細菌の変位が非常に不均一であることをさらに確認し、指数関数的に減少する尾を示し、この尾をフィッティングすることで、与えられた基質上の細菌集団の特徴的な速度Vが得られる：
(10)N(V>V0)=N0exp(-V-V0VC)、
(V0=0.08μm/minは低速度の視覚的カットオフを示す)。
Vの意味を合理化するために、我々は、変位ステップは、細菌の伸長、局所的な再編成、実験ノイズによる受動的な速度と、T4Pによる能動的な速度の和であると推論した。pilA変異体を用いて得られた速度分布は純粋に指数関数的であり、特徴的な受動運動性を決定するのに用いられたが、これは基質の剛性に有意に依存しない（VC(pilA)=VC,p=0.044 μm/min、図3D参照）。運動性ひずみの場合、能動的変位と受動的変位がインコヒーレントであると仮定すると、我々の数値計算（図3-図3）は、極限V>Vにおいて、上記のようにして得られた適合特性速度Vは、集団の能動的な痙攣運動を反映しており、受動的運動によって有意な影響を受けないことを示している。変位ステップの確率分布の解析の詳細な正当性は、「方法」のセクションに記載されている。
強力な仮定に依存しないこの解析により、WT株（図3D）の活動速度値は、前述のグローバル速度解析（V、図2C、および図3-図4）と非常によく定性的に一致した。ここでも、我々の動力学モデルは、前のサブセクションでフィッティングして計算した値（Vmax=0.48±0.12μm.min-1、E0=32±30kPa）に非常に近い値で、データを定量的に説明している。フィッティング・パラメーターの大きなエラー・バーは、同一の実験を再現する努力にもかかわらず、実験測定のばらつきを反映している。しかし、ある実験で測定された速度値は、常に基質剛性に対する同様の依存性、すなわち剛性が増加するにつれて運動性が明らかに増加することを示している。さらに、各タイプの基質上で、最速5％の菌体移動ステップの速度を特徴付けた（図3E）。この解析により、基質剛性に対する痙攣速度の依存性が確認されたが、より高い速度値も得られ、他の実験的アプローチ（Talà et al. 最後に、このアプローチは、PEGハイドロゲル上の実験（図1-図1-pp.を示す）で細菌の運動性を定量化するために使用され、我々が使用した2種類の基質上での細菌の挙動が非常に類似していることを確認した（図3-図5）。
剛性に調節された細菌の運動性は、初期の表面コロニー形成の空間的特徴を支配する
出現コロニーの面内から3次元への移行
剛性調節された細菌の運動性がマイクロコロニーの形成過程に与える影響を理解するために、コロニーが面外成長に移行する過程を詳細に研究した。このプロセスを解明するために、過去にいくつかの実験的・理論的アプローチが開発されている。限定されたコロニーでは、隣接する細胞を外側に押し出すのにエネルギー的にコストがかかりすぎるようになると、平面から3次元成長への転換が起こる。その場合、細菌とその下にある基質との間の接着力が重要な役割を果たす。強く接着する細菌は、発生の早い段階で3Dコロニーに移行する（Duvernoy et al.） 私たちの実験では、強い縦方向や横方向の拘束はない：バクテリアは基質上を移動することも、基質から離れることもできるため、ある前駆細胞から発生した細胞は必ずしも互いに接触しているとは限らない。しかし、2つの連続する分裂の間に、細胞が平均してどれくらい互いに離れるかは、細胞の引き攣れ速度によって決まり、それによって表面に新しい子孫を受け入れるスペースができる。
増殖しているミクロコロニーの2Dから3Dへの移行と痙攣運動性との関連性を調べるために、我々は、2Dから3Dへの移行が起こるときの子孫（すなわち、ある細菌の連続する分裂から生じたもの）の接着細胞数Nを、痙攣速度の関数として決定しようとした。柔らかい基質では、すべてのバクテリアを画像化することができ、Nを直接測定することができる。より硬い基質では、母細胞から発生したすべてのバクテリアを追跡することは不可能である。そのため、tc（3Dへの移行が最初に観察される時間）における画像上のバクテリアの数を測定し、先に柔らかい基質で決定した平均マイクロコロニー密度で割ると、Nの良い近似値が得られる。図4Aは、異なる基質と9つの異なる実験について、上記（図3D）で決定した質量中心特性速度Vの関数としてNを示している。Nは一貫して曳糸速度とともに増加し、曳糸効率と初期コロニーの形状の間に強い相関があることを示すとともに、基質の剛性の関数としてのマイクロコロニーの形態の変化に関するわれわれの最初の観察（図1BおよびD-F）に光を当てた。
図4と1つの補足
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表面コロニーの空間的構造化は、痙攣速度を通じて基質の剛性に影響される。
(A）図3Aで定義した質量中心特性速度Vの関数としての、2Dから3Dへの移行におけるマイクロコロニーのサイズ（細菌数N）。マーカーは... 詳細
図4-図1
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コンカナバリンAによるEPS染色は、8時間の表面コロニー形成後、異なる硬さの基質表面上のマトリックス沈着を強調する。
マトリックス沈着物は柔らかい基質上ではよりコンパクトで、EPSのない領域が広い（60％以上）のに対し、硬い基質上ではほぼ全面がEPSで覆われている（被覆面積＞％）。軟らかい基質の2つの色... さらに表示
NとVの間の関連を読み解くために、未知のパラメータを1つ持つ単純な運動モデルを構築した（詳細は付録2を参照）。簡単に説明すると、2Dから3Dへの移行は、バクテリアが占有する面積が、子孫のバクテリアが探索する特徴的な面積として定義される、同等の「マイクロコロニーサイズ」の何分の一かに達したときに起こると仮定する。バクテリアが持続性を持つランダムウォークによって表面を探索すると仮定すると（Marathe et al.、2014）、マイクロコロニー内のバクテリアが経時的にアクセスできる特徴的な面積は、a(t)=a0(1+αVCt)と書くことができる。我々の実験データは、速度だけでなく、バクテリアの軌道の輪郭の長さも、これらの軌道の持続時間がほぼ一定であることから、剛性とともに増加することを示している（図4Bおよび図3-図1）。面積a(t)は、マイクロコロニーが広がる面積に関係するが、等しくはない。実際、バクテリアはマイクロコロニーの領域内に均一に分布しているわけではなく、局所的に強い密度変動が観察される。ここで、細胞の分裂と剥離のバランスにより、表面上のバクテリアの数が指数関数的に増加すると考えると、細胞数の増加、したがって表面上のこれらの細胞を収容するのに必要な面積は、アクセス可能な面積よりも速く成長し、3次元成長への移行を促すことになる。この遷移が確率的に起こる時点でのマイクロコロニー内の細胞数Nを表すと、Vの関数として次のような依存性が導かれる：
(11)Nc=1+γVClog(Nc)
γは、ランダムウォークの特性と、各実験で測定可能な表面上のバクテリアの増殖速度に関連する未知のパラメーターである。図4Aに、γの実験値の平均値（実線）±その標準偏差（点線）を用いて対応する曲線をプロットした。T4P欠損変異株とWT株のガラスへの接着を含め、広い速度範囲にわたって、この単純な動力学モデルと実験データとの間に優れた一致が観察された。このことは、弾力性が弾性基質上での初期コロニーの構成を形成する重要な因子であり、化学的に同一で剛性の異なる基質上での実験で観察されたコロニー形状の主な決定因子であることを示唆している（むしろ、細菌がその剛性に応じて他の細胞や基質への接着を好むエネルギー最小化よりも）。
細胞外マトリックスによる表面装飾
基質の弾力性によって伸長効率が調節される結果の一つは、表面上のマトリックス分布の変化である可能性がある。実際、緑膿菌は主にエキソ多糖類（EPS）からなる細胞外マトリックスを分泌することができ、その結果、ガラス基板上に "軌跡 "が形成されることが示された。このような沈着物は、下層の基質への細胞体の付着を媒介することで、細菌によるさらなるコロニー形成を促進し、マイクロコロニーの形成に影響を与えると推測される（Liu et al.） ハイドロゲル基質上へのマトリックス沈着を調べるため、われわれはデバイスに注入した栄養培地中に蛍光色素（レクチンコンカナバリンA、材料と方法を参照）を導入した。PAO1マトリックスの主成分であるpsl（Jacksonら、2004）はマンノースに富んでおり、conAが特異的に結合する（Maら、2007）。
細菌が効率的に表面を探索する高剛性基質では、この染色によりマトリックスの痕跡が表面のかなりの部分を飾っていることが確認された。逆に、軟質基質上ではほとんど動かない細菌が局所的にマトリックスを蓄積し、表面の大部分は修飾されないままである（図4CおよびD）。このマトリックス分布の違いは、表面コロニー形成の後期段階でも維持される（図4-図1）。硬いハイドロゲル上では、表面のほとんどがバクテリアから分泌されたマトリックスで覆われているのに対し、軟らかいハイドロゲル上のレクチン染色は、EPSが全くない領域で区切られたコンパクトなコロニー上にのみ存在する。それぞれのケースで産生されたマトリックスの総量を適切に定量することは困難であるが（染色効率は、密集したコロニー内部でのレクチン拡散の影響を受けるかもしれない）、この結果は、基質の剛性が、マトリックスの沈着によってハイドロゲル基質を改変する細菌の傾向に影響を与えることを確認した。
基質剛性は細菌の混合に影響する
現実のバイオフィルムは一般的に複数の種から構成されている：病原体は互いに競合したり助け合ったりすることがあり（DeLeon et al., 2014; Orazi and O'Toole, 2017）、常在菌株は有害なものから生物を守る（Aoudia et al.） 剛性による表面コロニー形成の調節が、形成されるバイオフィルムの構造にどのような影響を与えるかをさらに調べるために、2つの異なる蛍光タンパク質を構成的に発現する2つのPAO1株によるハイドロゲルのモデル共コロニー形成について研究した。蛍光の他に、2つの菌株はWT PAO1と同様の性質（運動性、分裂速度など）を示した。蛍光共焦点イメージングにより、2つの菌株をスペクトル的に分離し、表面コロニー形成の異なる段階における空間分布を調べた。予想されたように、剛性に調節された運動性は、初期段階からハイドロゲルの共コロニーゼーションに影響を与える（図5-図1）。剛性の高い基質上では、高い運動性が異なる細胞の子孫の混合を促進し、その結果、2つの株の空間分布はランダムに近くなる（分裂したばかりの細胞が存在するため、隣接する細胞の色の間には常に残留相関が見られる）。逆に、軟質基質上のほとんど動かない細胞は、隣接する細胞間に強い相関を示し、そのほとんどは単一の前駆細胞から生じる。バイオフィルム形成の後期段階でも、表面共コロニー形成時の菌株混合におけるこの顕著な差は維持される。軟質基質上では、完全に空間的に分離した準単クローン性コロニーが観察されるのに対し、硬質表面上に形成されるバイオフィルムでは、10μmスケールで2つの菌株がランダムに近い分布を示す（図5A）。この効果を定量化するために、種の空間的なクラスター化を定量化するために設計された統計ツールであるモランのI指数を用いた。これは局所的な空間相関の尺度を提供し、1（完全に相関した値）から-1（完全に反相関した値）までの値をとり、0は変数の空間的にランダムな分布に対応する（詳細は材料と方法を参照）。その結果、定量分析（図5B）により、混合バイオフィルムの構造に剛性が決定的な影響を与えることが確認され、複数種のバイオフィルムにおける異なる菌株の相互作用に、潜在的に広範な影響を及ぼす可能性があることがわかった。
図5 補足資料1
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細菌の空間分布は基質の剛性に影響される。
(A）GFPまたはYFPを発現する構成的蛍光細菌の1：1混合物を播種した表面の画像から、軟質ハイドロゲル上ではほとんどが単クローン性コロニーであり、硬質ハイドロゲル上では混合細菌であることがわかる。
図5-図1
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基質の剛性の関数としての細菌の空間分布。
上図は、GFPまたはYFPを発現する構成的蛍光細菌の1:1混合物を播種した表面の画像で、表面コロニー形成開始後の2つの異なる時間における（下図：3Dレンダリング... もっと見る
表面の剛性が遺伝子発現に影響
バイオフィルムが形成される過程では、排出された分子または直接接触による細胞間コミュニケーションが重要である (Shrout et al., 2011)。したがって、上記のような細菌の分布の変化は、表面に付着した細菌の遺伝子制御に影響を与える可能性が高い。この複雑な疑問への対応を開始するため、我々は緑膿菌の運動性から無柄性への移行を制御するセカンドメッセンジャーである環状-ジ-GMP（c-ジ-GMP）の発現レベルに注目した（Rodesney et al.） 我々は、PAO1によるバイオフィルム形成時に発現が上昇する、マトリックスの凝集に関与する輸出タンパク質をコードする遺伝子cdrAのプロモーター上に構築した転写後蛍光レポーターを用いた（Reichhardt et al.） PcdrA-gfp細胞内レポーターは、遺伝子の発現と蛍光検出の間に約40分の遅延があるため、CdrAの統合的産生を測定することができる（Rybtke et al.） 図6は、同じマイクロ流体デバイスに含まれる4つの基質上で、crdAの発現が剛性によってどのように調節されるかを示している。このレポーターの場合、gfpの分解速度は数時間かけて起こり、細菌の成長と分裂による希釈はどの表面でも同じ速度で起こる（図1C参照）。したがって、蛍光シグナルの増加速度は、遺伝子cdrAの発現速度、ひいてはc-di-GMPレベルの変化の直接的な代用となる。
図6と1つの補足
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プラスミドPcdrA-gfpレポーターを持つ改良型PAO1株から増殖したコロニーを、フロー下で500分後に位相差（上）と蛍光（下）で撮像した。
スケールバー、20μm。(B) 異なるPAA表面およびガラス上における、時間の関数としての細胞内gfp蛍光の平均値。破線はある表面上の重複位置。(C）平均cdrA ... もっと見る。
図6-図1
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PcdrA-gfpプラスミドを発現させたPAO1株の蛍光強度の経時変化で、≈500分後に蛍光発現のプラトーを示す。
我々の実験では、このような挙動の変化は、マイクロ流路内でバイオフィルムが成長する際に流れ中の酸素が不足し、発生するためと考えられる。2つの剛性を示し、... もっと見る
表面コロニー形成の最初の段階では、蛍光はどの表面でも低いままである。その後、シグナルは直線的に増加し始め、すべての表面でほぼ同時に増加する（蛍光定量の不確かさの範囲内、つまり約10分）。この第二段階は、プラトーの開始とともに終了し、やはり全表面でほぼ同時刻に、表面に付着した細菌の指数関数的増殖が終了した時点で、おそらく、全表面で同時に感知される流動培地中の酸素枯渇の結果であろう（図6-図1）。この蛍光の直線的な増加は、CdrAの一定の産生速度に直結し、4つの表面について比較することができる（図6C）。
考察
本研究では、弾性率の異なるハイドロゲル上での緑膿菌の初期マイクロコロニー形成を、一定の流速下で調べる実験的アプローチを考案した。表面に付着したバクテリアをその場で連続的にイメージングすることで、基質の剛性が個々のバクテリアの運動性に影響を及ぼし、マイクロコロニー形成過程に強い影響を与えることを示した。細菌集団の表面運動性について、探索された領域の全体的な変化または個々の細胞の追跡による2つの異なる分析を通して、我々は、特徴的な痙攣速度が基質の剛性とともに増加することを見出した（剛性が約3から80kPaになると、0.02から0.4μm/分になる）。
バクテリアと基質との出会いは機械的ストレスを発生させる。つまり、この相互作用から生じる機械的フィードバックが、細菌の行動を調整する化学的シグナルにどのように変換されるかを理解することが、最近の多くの研究の焦点となっている。例えば、T4Pの収縮は、単細胞レベルで細菌にシグナルを伝達する力センサーとして働き（Websterら、2021年）、c-di-GMPレベルの増加を伴う応答を引き起こすことが明らかになっている（Armbrusterら、2019年）。さらに最近の結果では、繊毛は基質の剛性を区別することができ、剛性値が300kPa以上で最大応答を示すことが示唆されている。
しかしながら、我々の実験では、柔らかいPAAまたは硬いPAAに表面接着すると、ほぼ直ちに細菌の運動性の違いが観察され、この挙動はc-di-GMP制御に障害を持つ変異体（wspRまたはsadC）では変化しない。そこで我々は、痙攣運動の調節を説明する物理モデルを提案する。この1次元モデルは、(i)決められた頻度で伸長、付着、収縮するピラス、(ii)収縮に伴うピラス先端の基質の変形、(iii)ピラスのもう一方の端で表面を引きずられる際の菌体の付着による摩擦力、の間の力のバランスに基づいている。このバランスにおいて、基質からのピラス先端の剥離速度は、結果として生じる細菌の速度の重要なパラメータとなる。われわれはピラスについて力に依存しない剥離速度定数を仮定した。より複雑なシナリオでは、ピルスと基質との接触はスリップボンドまたはキャッチボンドとして働くかもしれない。完全性を期すため、SI（I.D節）にスリップボンドとキャッチボンドの挙動に関する数値結果を示したが、これは実験と理論速度データのフィットの質を高めるものではない。加えて、ハイドロゲルネットワークのメッシュサイズに直接相関する基質の剛性が、T4Pの付着頻度に影響する可能性を検討したが、これは観察された運動性の変動を効率的に説明するために必要なことではなかった。
驚くべきことに、この最小限の力学的モデルは、観察された様々な現象（コロニーの3次元構造；表面へのEPS沈着；共コロニー形成中のひずみ混合）がすべて、柔らかい基質の変形能によるピリ活性効率の調節に由来することを示唆している。この純粋に機械的なモデルは、表面コロニー形成において特に重要であると思われる。というのも、環境に対する細菌の行動の適応は、このように瞬時に行うことができるからである。
このモデルは、われわれの観察結果（痙攣速度、マイクロコロニー形成）を説明するには十分であるが、おそらく並行して起こるであろうバクテリアの制御反応を否定するものではない。このような反応は2つのレベルで起こりうる。単細胞レベルでは、例えばT4Pの接着と引き込みによって媒介されるメカノトランスダクションプロセスが、短い時間スケール（約1時間）で遺伝子発現に影響を与える可能性がある（Armbruster et al. より長い時間スケールでは、発達中のマイクロコロニーにおいて、細胞間相互作用が、マイクロコロニーの特性（形状、細胞密度、マトリックス含量など）に依存する細菌のトランスクリプトームを調節する可能性がある。蛍光細胞内レポーターを用いてc-di-GMP発現を定量化する我々の試みは、基質の硬さによる細菌の制御反応の違いを証明している。遺伝子の発現レベルは明らかに基質の剛性に影響されるが、発現レベルの違いが検出されるのは表面コロニー形成の開始から6～7時間後であり、最初の段階はどの表面でもc-di-GMPレベルが低いことが特徴である。この時間枠から、観察された遺伝子発現の差は、おそらく個々の細菌が基質の剛性を直接感知したためではなく、むしろ細菌がコロニーをより高密度またはより低密度に組織化した結果であることが示唆される。注目すべきは、c-di-GMPの増加が起こった時、細菌は痙攣を止め、コロニーに固定化されていることである。文献に記載されているような初期のc-di-GMPの増加は観察されないが、これはおそらく、最初は表面上のごく少数のバクテリアしか追跡できず、発現シグナルが確率的であるためであろう。WT株と変異株で、機械的に異なる基質への接着に伴うc-di-GMP発現をさらに調べれば、どの経路が軟質基質上で異なる活性化を示すかが明らかになるだろう。
興味深いことに、マイクロコロニーの表現型は、特定のc-di-GMP制御を示すものではない可能性が示された。これは、c-di-GMP産生がバイオフィルム誘導遺伝子、特にマトリックス産生をアップレギュレートする一方で、運動性をダウンレギュレートするというパラダイムを考えると、直感に反する結果である。ここでは、機能的な繊毛がないためというよりも、むしろ環境のミクロ力学的特性によって運動性が不可能になり、その結果、柔らかい基質上にコンパクトなコロニーが急速に形成される場合について述べる。このようなコロニーにおける細胞外マトリックスの密度と正確な組成をさらに調べることは、このパラメータが表面上の細菌のその後の運命に影響を与える可能性があるため、興味深い。EPSの分布、組成、濃度は、表面上の新しい細胞の増殖にも重要かもしれない。実際、以前に沈着したマトリックスは緑膿菌の接着を強化すると考えられており（Zhao et al.
より広い文脈では、我々が観察したプロセスは、例えば細胞組織の上など、環境の柔らかい領域にある高密度のコロニーへの細菌の集積を確実にすることで、機械的に不均質な環境における細菌のコロニー形成を最適化する戦略としても想定される。最近、Contら（2020）は、密集したコロニーが軟らかい基質を変形させ、上皮層を破壊する力を発揮できることを示している。このように、剛性調節された痙攣は、緑膿菌に軟組織を標的として協同破壊とその後の侵入を行う便利な手段を提供する可能性がある。
私たちが報告したコロニーの表現型の違いは、その後の細菌と環境との相互作用、すなわち栄養や酸素の利用可能性の変化に対する反応や、密集したコロニー内部には効率的に浸透しない化学的シグナル一般に影響を与えると考えられる。これは特に抗生物質に対する感受性に影響する可能性があり、Cont et al. PAは様々な環境に侵入する可能性があり、嚢胞性線維症患者の肺や硬いインプラントの表面に定着した場合、異なる方法で治療しなければならない可能性がある。
最後に、われわれのデータは、表面コロニー形成時の異なる菌株の混合に、剛性調節された痙攣が顕著な影響を与えることを示している。混合種群集の形成を支配するメカニズムを解明することは、現在のバイオフィルム研究の重要な課題のひとつである。ここで説明する運動調節機構は極めて一般的であり、付属器の伸長／収縮を通じて移動する異なる菌株／種の特殊性にはほとんど影響されないはずであるため、異なる機械的微小環境における共コロニー形成を研究するための適切な枠組みを提供するものと期待される。
材料と方法
菌株
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この研究で用いた菌株は、緑膿菌野生型（WT）PAO1、蛍光株PAO1 miniCTX-PX2-gfpおよびPAO1 miniCTX-PX2-eyfp（PBRCグループ、IBS、グルノーブル、未発表）、およびワシントン大学のトランスポゾンライブラリーから得たPAO1変異体pilA::Tn5、sadC::Tn5およびwspR::Tn5である（Jacobs et al.） PAO1株pCdrA-gfpは、Rybtkeら, 2012のプラスミドpCdrA::gfpcを我々のWT株で形質転換して得た。
菌はグリセロールストックからLuria-Bertani（LB）培地に植菌し、37℃、250rpmで一晩培養した。翌朝、定常期の培養液10μLをLB培地3mLで希釈し、振盪培養器（37℃、250rpm）で3.5時間静置し、指数期中期（OD600=0.6-0.8）に到達させた。その後、細菌を作業培地であるTB:PBSでOD600=0.005に希釈し、チャンネルに接種した。TB:PBSは、TB(Tryptone broth, Euromedex, 10 g.L-1)とPBS(w/o calcium and magnesium)を1:2の体積比で混合することにより得られる。この最小限の培地は、接着後数時間は細菌の痙攣に有利であることがわかった。
マイクロ流体デバイス
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マイクロ流体チャンネルは、100μm厚の両面粘着テープ（7641 W #25 、寺岡、日本）にダイカッターで切断した。通常、長さ5 cm、幅1 mmの流路を使って、ハイドロゲルパッチを貼った長方形のガラスカバースリップと、厚さ5 mmの平らなポリジメチルシロキサン（PDMS、Sylgard社製、架橋剤とモノマー溶液を1：10で混合し、65℃で1時間焼成して調製）のスラブを貼り合わせた。流路を通る流れが厚さ25μmのPAAハイドロゲルによって大きく変化しないように、高さ200μmになるように2つの流路を貼り合わせた。これらの粘着テープ付き流路をまずPDMS片に接着し、次に脱水ハイドロゲル上に配置した。適切な結合を確実にするため、装置全体を30分間真空下に置いた。次に、ハイドロゲルを再水和するために、チャンネルをTB:PBS（1:2）で最低1時間洗浄した。メデュームをプラスチック容器に入れ、シリンジポンプ（Harvard Apparatus, USA, 30 μL/min）を用いて気泡の発生を避けながら流路に注入した。
ゲルと基質の調製
詳細プロトコールを請求する
ポリアクリルアミド（PAA）とポリエチレングリコール（PEG）のハイドロゲルは、以前に確立されたプロトコールに従って調製した（Tse and Engler, 2010; Beamish et al.） 試薬はすべてSigma Aldrichから入手し、そのまま使用した： アクリルアミド溶液（AA、水中40％）、N,N'-メチレンビスアクリルアミド（Bis、水中2％）、過硫酸アンモニウム（APS、98％以上）、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED、99％以上）、ポリエチレングリコールジアクリレート（PEGDA、Mn〜6000g. mol-1）、2-ヒドロキシ-4'-（2-ヒドロキシエトキシ）-2-メチルプロピオフェノン（Irgacure 2959、98％）、バインドシラン、シグマコート。
長方形のガラスカバースリップ（24×60 mm）をゲルキャスティング用の基板として用いた。プラズマ洗浄後、Bind-silane溶液（Bind-silane 60 μL、10%酢酸 500 μL、エタノール 14.5 mL）に1時間浸した後、エタノール、水で洗浄し、使用前に窒素でブロー乾燥した。丸いガラスカバースリップ（直径12 mm）をゲルキャスティングの対向面として使用した。プラズマ洗浄後、Sigmacoteに1時間浸漬し、アセトン、エタノール、水でリンスし、使用前に送風乾燥した。
AA/BisとPEGDAのバルク溶液をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製し、使用まで4℃で保存した。ゲルの最終的な硬さは、表1に従ってAA/BisまたはPEGDA含量を調整することにより調整した。PAAゲルは、168μLのAA/Bis溶液に、1μLのTEMEDと1μLの作りたてのAPS溶液（水中10w%）を加えて得た。この混合液の3μLの液滴を直ちにバインドシラン処理したガラスカバースリップの表面に置き、シグマコート処理したラウンドカバースリップで挟み、水蒸気飽和雰囲気中で1時間放置して硬化させた。硬化後、メスの刃先で丸いカバースリップを剥がすと、厚さ約25-30μmの円形のゲルパッドが下の長方形のカバースリップに共有結合し、その自由な上面が露出した。その後、円形ゲルパッドをカミソリの刃で削り、最終的に取り付けるマイクロ流路の幅に横方向のサイズを合わせた。その後、ゲルパッドを超純水で大量にすすぎ、層流キャビネット内で乾燥させた。弾性特性の異なるこのようなパッドを、マイクロ流路の長さに合わせて並べ、同じカバースリップ上に同時に3つまで準備した。PEGゲルは、0.5mLのPEGDA溶液に、エタノール中のIrgacureの10wt%溶液5μLを加えて得た。この混合物の3μL液滴を上記のようにカバースリップの間に置き、UV光（365nm、180mW.cm-2）を15分間照射して硬化させた。その後の手順は、PAAゲルについて上述したとおりである。
表1
ハイドロゲルの組成とヤング率。
アクリルアミド(wt%)ビスアクリルアミド(wt%) (wt%)PEGDA(wt%)弾性率(kPa)40.2250.02.7 ± 0.350.2250.06.1 ± 0.280.2640.018.5 ± 0.7200.470.065 ± 5.6150.650.084 ± 1.1200.70.0103 ± 3.80055.7 ± 0.30020102 ± 8.4
機械的特性評価
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様々なゲルの粘弾性特性は、最近報告され、ハイドロゲルで検証された「接触力変調」技術（Abidine et al.） これにより、1-300 Hzの範囲で周波数の関数として弾性率および損失せん断弾性率、GおよびGを決定することができる。表1で報告されているヤング率は、すべてのゲルについてポアソン比ν=0.5を仮定し、マイクロレオロジーによって得られた低周波プラトー弾性率をGとして、E=3G′0として計算されている。すべてのゲル試料は、G′≫G′′の弾性挙動を示した。
測定は、JPK Nanowizard II AFMを用い、バネ定数15 mN/mのピラミッド型先端MLCTプローブ（Bruker）を用いて行った。データは、自作のマイクロレオロジー用ソフトウェアを用いて解析した。厚さ30μmのゲルは、上述のように35mmシャーレの底に取り付けた丸いカバースリップ上に調製した。その後、フローチャンバーへの封入に使用したプロトコルを模倣するため、すぐに特性評価を行うか、乾燥させた。実験はPBS+1%vol.のTween20（Sigma）中で行い、TweenはゲルへのAFMチップの付着を防ぐために使用した。細菌を用いた実験条件を模倣するため、測定はすべて37℃で行った。結果は、低剛性（<20 kPa）では一貫した結果を示したが、それ以上の値では剛性を過大評価した力-距離圧痕曲線と比較した（図1-図1a）。
ゲルの均質性は、多重位置測定によってμmとmmのスケールで評価した。すべてのスケールで、測定の再現性とゲルの均質性が非常に高いことがわかった（図1-図1b）。そこで、ゲル内の3～6カ所で測定し、その平均値と標準誤差を示した（表1）。構造への損傷の可能性をチェックするため、ゲルの乾燥と再水和の前後で剛性も測定した。さらに、蛍光標識したゲル表面の共焦点画像を用いて、乾燥前後のゲル表面のデフォルトを追跡した。この研究では用いなかった剛性1 kPa以下の非常に軟らかいゲルを除いて、乾燥時にハイドロゲルが損傷した証拠は見つからなかった（図1-図1c）。
顕微鏡実験
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希釈した細菌溶液を流路に注入し、細菌が付着するように30分間流さないようにした。その間、清潔なチューブをシリンジに接続し、3mMグルコースを添加したTB-PBS培地で満たし、装置の注入口に接続した。細菌を装置に注入してから30分後、清浄培地の流量を開始した。流速は、付着していない細菌を洗い流すため、まず25μl/minで3分間設定し、その後1μL/minに下げ、取得中はシリンジポンプ（Pico Plus、Harvard Apparatus）で一定に維持した（壁せん断応力2.5mPa）。セットアップを直ちにLeica SP8共焦点顕微鏡のインキュベーションチャンバー（37℃）に入れ、1フレーム/分で撮影を開始した。
マトリックス染色実験のために、コンカナバリンA（Alexa Fluor 647コンジュゲート、ThermoFisher Scientific社製）を培地に添加し（1mg/mlストック溶液の3μl/ml）、撮像の少なくとも30分前にフローセルに注入した。4価のconAはマトリックスの構造を阻害するため、初期段階における細菌の痙攣の短期イメージング（t＜1時間、図4D）に使用するか、あるいはコロニー上およびコロニー周辺のマトリックス分布を評価するために撮影の最後に添加した（t〜8時間、図4-図1）。
ウェルでの対照実験（図1-図3）については、プロトコルを以下のように変更した： PAAゲルは上記のように調製したが、35 mmの丸いガラスカバースリップの中心に置いた。このカバースリップを、あらかじめ32 mmの円形の穴を開けておいた6ウェルプレート（Costar、コーニング社製）のウェル底に接着した（5分間エポキシ樹脂、アラルダイト社製）。希釈した細菌懸濁液（OD600=0.005）1mLをゲル上に付着させ、30分間インキュベートした後、注意深くピペッティングし、ウェルを新鮮な培地（TB-PBS+3mMグルコース）3mLで満たし、37℃に保った。このセットアップにより、Orca-Flash 4.0 LTカメラ（浜松）を装備したZeiss Axio-observer 7倒立顕微鏡で、位相差モード（対物レンズ63 x）でバクテリアを連続的にイメージングすることができた。
表面被覆分析および個々の細菌の追跡
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特に断りのない限り、画像処理と解析はすべてFijiを使用し、利用可能なプラグインと自作のマクロを用いて行った。個々の細菌の動きを定量化するため、時系列の位相差画像をFijiプラグイン "MultiStackReg" Thévenaz et al., 1998を用いて登録し、プラグイン "weka trainable segmentation" Arganda-Carreras et al., 2017を用いてセグメンテーションした。得られたセグメンテーションを手動でチェックし、修正した。
グローバル速度Vの解析には、セグメンテーションされた2値画像を使用して、自作のMATLABスクリプトを使用して、表面被覆率A(t)と探索された表面積S(t)を推定した。1つはバクテリアによって占有されたピクセルを値1、それ以外はすべて0としたもの（A(t)を提供）、もう1つは、このタイムポイントまでのすべての2値画像を加算して得られた画像で、訪問したピクセルをすべて値1としたもの（S(t)を提供）である。
個々の変位ステップを解析するために、セグメント化されたバクテリアを楕円でフィッティングし、その後、imageJの'analyze particle'関数を用いて各バクテリアの重心を特定した。Fijiプラグイン「TrackMate」Tinevez et al., 2017を使用して、すべての個々の細菌を追跡し、再び手動で検証と修正を行った（動画2参照）。関数importTrackMateTracks (Tinevez et al., 2017, https://github.com/fiji/TrackMate/blob/master/scripts/importTrackMateTracks.m)を使用して追跡データをMATLABにインポートし、自家製スクリプトを使用してデータのソート、トラックのプロット、速度分布の取得を行った。
変位ステップのヒストグラムの解析は以下のように行った：測定されたステップは、2つの変位ベクトル、T4P活性による能動的変位V、および測定上のノイズ、細菌の増殖と局所的混雑に起因する変位の両方による受動的影響を含むベクトルVのインコヒーレント和であると仮定する。まず、pilA変異体で得られた実験分布を検討したところ、V=0⃗であった： これは、特徴的な受動速度 VC,p:p(∥V⃗ p∥∥)=exp(-∥V⃗ p∥∥VC,p) を持つ減少指数でうまくフィッティングでき、V = 0. 044 μm/分である。次に、痙攣するバクテリアの場合を考えた。ここでは、変位ステップ分布のテールも指数関数的な減少傾向に従うことが観察された。受動的な変位は短距離であり、大きな変位値では分布を大きく変更しないはずであるという推論に基づき、∥V⃗ a∥ の確率分布のテールは減少する指数関数、p(∥V⃗ a∥)=exp(-∥V⃗ a∥VC) であり、V はバクテリアの特徴的な能動的な痙攣速度であると推論しました。
確率分布関数を計算することで、この仮説の妥当性を確認した。測定された変位ステップの分布 ∥V⃗ tot∥=∥V⃗ a+V⃗ p∥ は、スケールが異なり、2 つのベクトル間の角度がランダムな 2 つの無相関指数分布の和であると仮定しました。この和の解析式はないため、一般的なケースで得られた分布の数値計算を行いました。極限 ∥V⃗ tot∥>>VC>VC,p では、Vの影響を受けない特徴的な速度Vを持つ指数分布が得られました（図3の左）。p(∥V௰ tot∥)<0.3 (これは指数関数的な傾向に従わない最初の数点を除外する)の範囲のフィッティングは、VC>VC,pの場合にVが正確に得られることを確認します(図3-図3、右)。この限界以下では、能動的な変位が受動的な「ノイズの多い」変位の範囲にあるため、Vのみが検出される。
実験的には、分布の指数部分に制限するため、フィッティング範囲に ∥V ȇ tot∥> 0.08 μm/min≃2VC,p の低いカットオフ値を使用しました。また、測定のノイズを考慮し、VC,p=0.044μm/min以下のフィッティング値は[0;0.044]m/minの範囲にあると考えた。
コロニーの形態の定量化
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定量化は共焦点蛍光3次元分解画像で行った。まず、深さによる信号の減衰を、深さによるコロニー内部の平均画素値の減少指数フィッティングによって補正し、対応する関数で正規化した。次に、zスタックの各画像に対して2D 3x3の平滑化処理を行い、その後、単純な閾値処理を用いてコロニーをセグメンテーションした。この手順では個々の細菌をセグメンテーションすることはできないが、コロニーの3Dエンベロープを適切に推定することができる。次に、広く使われている算術平均粗さRaを用いてこの包絡線の粗さを計算することにより、コロニーのトポロジーを定量化した。
(12)Ra=1N∑i=1N|zi-⟨z⟩|、
ここで、総和は3D画像内のすべての2D位置iにわたって、ziは位置iで最も高くセグメント化されたピクセルの高さ、⟨⟩はすべての位置にわたる平均化演算子である。占有体積Vは次式で計算される。
(13)V=px2∑i=1Nzi、
pxはピクセルサイズである。カバースリップまでの距離の関数としての占有面積は、ビンサイズ0.5μmのzi値のヒストグラムである（3D画像の垂直サンプリングに対応）。
同じ軟質基質に共生する2つの菌株の混合の定量化（軟質の関数として
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この定量化は、単離した細菌を用いた低密度の段階と、成熟したコロニーを用いた後の段階の両方で行われる。この目的のために、種の空間的クラスターを定量化するために設計され、生態学や地理学の分野で広く使用されている統計ツール、Moran's I indexを使用した Moran, 1950. モランのIは局所的な空間相関の指標で、空間的な近接性の概念を含み、異質性の計算のための空間的なカットオフ（言い換えれば、特徴的な距離）、または近隣の数という形で表される。これは，1（完全相関値）から-1（完全反相関値）までの値をとり，0は変数の空間的にランダムな分布に対応する．
2つの異なる値（我々の場合、緑（1）または黄色（-1））を取りうる変数yをn個の実写で考えると、Moran'Iは次式で表される：
(14)I=n∑i=1n∑j=1nwij∑i=1n∑j=1nwij(yi-⟨y⟩)(yj-⟨y⟩)∑i=1n(yi-⟨y⟩)2、
ここでwは空間情報を含む重みの行列である（wii=0）。我々の実験では、表面上のバクテリアの密度が変化するため、関連する空間スケール（したがって重みの行列）は時間とともに大きく変化する。高密度（成熟したコロニー）では、長さスケールを定義することが局所相関の存在をテストするのに適した方法であるが、近隣間の距離が大きな確率的変動を示す初期の時期、特に硬い基質では、これはより困難である。そこで、表面のコロニー形成の初期段階と後期段階とで異なる重み行列を選択した：
コロニー形成の初期段階では、バクテリアが表面にまばらに存在するため、各バクテリアの最近隣に焦点を当てることにした。この目的のために、個々のバクテリアを緑と黄色の画像でセグメント化し、その重心位置を視野内のすべてのバクテリアの2次元座標と色のリストに照合する。次に、このリストに基づいて、以下の重み行列を用いてモランのIを計算する：
p=5を有意な隣接数として任意に選んだが、pの値が4から10の範囲でも同様の結果が得られた。これより少ない数は、細胞分裂によって偏りが生じる：分裂時、最も近い近傍菌は必然的に対象となる細菌と同じ株であるため、両者の間には常に正の相関が存在する。実際には、p=5が、視野の半分（すなわち160μm）より離れた細菌間の相関を考慮しないという「局所的」アプローチを維持しながら、このバイアスを制限するための良い妥協点であることがわかった。
w
高密度の3Dコロニーを持つ後期段階では、バクテリアの個々のセグメンテーションは困難になり、相関測定は個々のピクセルに対して実行される：まず、単純な閾値処理が緑と黄色の画像に対して実行され、各ピクセルは値：1（緑ピクセル）、0（黒ピクセル）、または-1（黄色ピクセル）に帰属する。この新しい画像から、以下の重み行列を用いてモランのIが計算される：
ここでも、カットオフ距離dは任意に5μmを選んだが、3～10μmの値でも同様の結果が得られた。さらに、個々の細菌は取得された画像の複数の画素をカバーしているため、細菌とそれ自身との相関を避けるために、画素iと同じ色の画素の数が削除される。我々のデータでは、1つのバクテリアがカバーするピクセルの平均数は40と測定された。
w
ウェイトマトリックスの選択にはある程度の自由度があるが、3つの異なる剛性で得られたデータを比較するために同じウェイトを使用することが重要である。対照的に、2つの異なる時点で1つのサーフェスで得られた値は、同じウェイトマトリックスで得られていないため、直接比較すべきではありません。
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付録1
軟質基材上での痙攣速度のモデル化
図2D（本文）に示すように、1次元における剛性変調された痙攣のモデリングの原理は、3つの主要な要素、すなわち基質の変形のモデリング（サブセクションA）、表面上の細胞体の摩擦のモデリング（サブセクションB）、そして毛乳頭の引き込みダイナミクスのモデリング（サブセクションCとD）を組み込んでいる。
A. 基質変形のモデル化
この枠組みでは、基質の変形は接着の大きさλで与えられる典型的な長さスケールで起こり、それは加えられる力に比例する。最後に、比例係数Yは、基板の弾性率Eと接着サイズλの積、すなわちY=Eλとしてスケールする。この単純な関係は、剛性基板上の小さな変位に対してのみ有効である。変位が大きく、架橋剤密度が低く、非アフィン変形の非常に柔らかい基材では定量的に破綻する可能性が高いが、ここで提案する単純なモデルの第一近似としては妥当である。
このモデリングでは、細菌の部位に依存する特徴的な長さスケールを導入している。ピラスはその先端でλ≈1 nmの大きさで付着し、細胞体はlb≈1 μmの典型的な大きさである。加えて、第三の長さスケールはピルスの典型的な長さLであり、これは収縮中に変化するが、ほとんどの場合1μmを超える。これら3つの量を導入することで、基質の変形の記述を単純化することができる。毛柄の張力Fと基質の接着部位の変位uは、F=Yuによって線形関係にあり、Yは有効バネ定数である。基材は無限（厚さ≈25μm ≫λ、横方向の伸び≈1-10mm ≫λ）、等方性、弾性、非圧縮性の半空間としてモデル化する。さらに、L>>λであるため、細胞体の変形が細胞体においてゼロに減衰することから、細胞体によるピラス先端付近の変形への影響を無視する。
原点での点状のせん断力fに対する表面z=0での2次元ブシネスク・グリーンテンソルはLandau and Lifschitz, 2004によって与えられる。
(A1)G(r)=34πE[Ir+r⊗rr3]f.
長さλ、半値幅dの粘着性T4P先端を考え、細長い体の近似を用いると、「長さ方向」の変位uに対するピラスにかかる全力Fは次式で与えられる。
(A2)F=Eλπ3lnλduwithY=Eλπ3lnλd≈Eλ。
つまり、力と変位のベクトル的性質を無視し、1次元の設定に限定する。これは、λをlb>>λに置き換えても等価に成り立つ。その結果、同じピラス張力Fによって引き起こされる細胞体の基質変形は、振幅がλ/lb≪1≫倍小さくなり、単純化のために無視される。
対照的に、ピラス先端は剥離するまで基質にしっかりと付着しており、細胞体は表面上を滑ることができると考える。細菌体（基質上を巨視的に滑走する）と小さいと思われるピラス／基質接触（基質を変形させる点状の力）の間のこの非対称性は、細菌体とピラス先端部の接触が機械的に同等に扱われるSimsek et al.
B. 細胞体の摩擦のモデル化
上述したように、このモデルには、ピラスによって加えられる力Fの関数として、基質上での細胞体の滑走運動を記述することが必要である。私たちはSens, 2013の理論に基づいてモデリングを行った。この理論は、弾性基質と細胞の間にあるN個の弾性リンカー（常に全て結合しているとは限らない）のアンサンブルによる確率的摩擦を考察するもので、滑走速度vに従う。結合は、臨界力f、力ゼロのときのオフレート定数k、オンレート定数konを持つスリップ結合としてモデル化される。リンカーの剛性はkである。
無限に硬い基質の場合、細胞体にかかる平均総力 ⟩F⟩は速度vの関数として非単調で、次式で与えられる。
(A3)⟨F⟩=Nf∗rone1/v~∫∞0fe-(efv~)dfv~+rone(1v~)Γ[0,1v~] で与えられる。
v~=v/vβ, vβ=k0offf∗/kb, ron=kon/k0off である。Γ[0,x]はオイラー・ガンマ関数です。式(A3)は、⟩F⟩のvに対する複雑な依存性を示しており、実験におけるパラメータの典型的な値を推定する必要がある。典型的な速度vを求めるために数値を入れると、次のように推定できる。
k0off≒1-10s-1（特異的リガンド／レセプター結合の場合よりもわずかに高い Robert et al.）
f∗=kBT/xβ、xβ≈0.1-10 nmはEvans, 2001などが提唱した結合状態と非結合状態の遷移状態距離である Pereverzev et al.
kbを推定するのはより難しい。ここでは、細菌の接着は細菌が産生する細胞外マトリックスによって媒介されると仮定する。持続長さLp≈10 nmのポリマー（Kuik et al、 2006）、輪郭長L0≈100 nm（サイズ1 nmのモノマー約100個の鎖長を仮定）を用い、弱い力の領域での線形力-伸長関係を計算すると、力定数kb≈3kT2LpL0≈6×10-3 pN.nm-1となる。
極端な値をとると、典型的な速度はvβ=1-100μm.s-1となる。われわれの実験では、細菌は毛管引き込み速度（すなわち1μm.s-1 Skerker and Skerker and Berg, 2001、われわれの実験ではあまり観察されなかったスリングショットの場合を除けば）より速く動くことはないと予想される。羽毛の収縮速度は、羽毛の張力が大きくなるにつれてかなり遅くなることを考慮すると、1回の羽毛収縮中の細菌速度は、この最大値よりもむしろ小さい。したがって、常にv~=v/vβ<1となり、式(A3)は次のように線形化できる。
(A4)⟩=Nf∗konk0off+konv~、
さらに、基板の弾性を考慮する必要がある。Sens,2013は、この状況は直列のバネシステムを持つことと等価であり、1つは基板の弾性に由来し、もう1つは個々のボンドバネの集合体であると提案しています（並列）。この場合、再び線形弾性理論を用いると、vを係数Elbで再スケーリングし、E>3 kPaを基質のヤング率、lb≈1 μmを細菌細胞体の特徴的な大きさ、a=lb≈1 μmとすると、前述の解析が成り立つ。したがって、Elb≧3 pN.nm-1 ≫kbとなり、スケーリングファクターElbkb+Elb≒1となるので、基質の弾性は細胞体の摩擦に影響しない。まとめると、毛柄の引き込みによる引っ張り力に対する細菌の滑走速度は、ηを摩擦係数とするF=ηvの線形近似が合理的に使えることがわかった。最後に、ηを基質の剛性から独立したものと考える。これは、基質自体の結合部位の数（PAAメッシュサイズ≈3-10 nm）よりも、基質と相互作用できる細胞体の分子／付属物の数によって結合の数が制限され、さらに相互作用は細菌によって沈着した吸着外多糖によって媒介される可能性があると仮定すれば妥当である。しかしながら、他の非線形依存性も容易にモデリングに含めることができる。
C. ピラス収縮の基本モデリング
細菌の運動を誘発する痙攣の間に関連するステップは、基質に付着したときの能動的な毛管の引き込みである。ここでは、細菌の運動に対する制限効果は、基質からの毛管の剥離であり、細菌による毛管の完全な引き込みではないと仮定する。従って、細菌の運動速度に対する基質の剛性の役割を理解するために、動態学が完全には理解されていないピラスダイナミクスの全サイクルを記述することなく、この重要なステップに集中する。
ここでは、基質から剥離するまで細菌体を引っ張る単一の有効なピルスの後退を考える。ピルスの弾性は2pN.μm-1の力定数、基質の剛性はE=100kPa、付着サイズはλ=1nm、ピルスが及ぼす最大力はFR=100pNと仮定すると、基質の変位はu∼FR/Eλ=1μmとなる。一方、ピルスの伸長はΔL=50 nmであり、この条件では無視できる。しかし、ピルスの伸縮性を計算に含めることは難しいことではない。
基質に変位uを引き起こす付着したピルスの後退速度をvとする。同時に細菌は速度vで前進し、毛髄の張力と基質の変位を減少させる：
(A5)dudt=vR(F)-vB(F)withF=Yu.
両方の運動（基質の変位と細菌の滑走）は、毛柄の張力Fを介して結合している。その引き込み速度は、よく文書化されている単純な線形依存性で記述される。
(A6)vR=v0(1-FFR)、
Fは失速力である。前のサブセクションで確立されたように、細菌の滑走速度は摩擦定数η=FB/v0を持つ毛状突起の張力に線形に依存する：
(A7)vB=1ηF=v0FFB.
Fは細菌を基質上で最大引き込み速度vで引っ張るのに必要な力を表す。式A5から、引き込み中の毛管張力の経時的増加を求めることができる。
(A8)F(t)=F0(1-e-Yv0F0t)
を力のスケール
(a9)f0=fbfrfr+fb.
解(A8)を式(A7)に組み込み、vB=dxBdtとすると、毛管収縮中の細菌の滑走距離について次のようになる。
(A10)xB(t)=F0FB[v0t+F0Y(e−Yv0F0t−1)].
引き込む間、毛管は基質から速度定数koff(F)で剥離する。力に依存しない剥離速度定数koff=k0offを仮定すると、剥離時間は平均1/k0offで指数関数的に分布する。さらに、このモデルで考えられる単一の有効なピラスは、周波数kで後退し、したがって有効速度
(A11)veff=kp⟨xB∫∞0xB(t) e-k0offtdt=VmaxEE+E0.
ここで、⟨xB⟩は、1回のピラス引き込みイベントあたりの平均細菌滑走距離を示す。Vは与えられた基質上で細胞が無限の剛性で到達できる最大有効速度を表し、次式で与えられる。
(A12)Vmax=v0kpk0offFRFB+FR.
E0は半分の最大速度での剛性を表し、次式で与えられる。
(A13)E0=FBFRk0off(FB+FR)v0λ.
付録1-図1は、実験データとフィッティング曲線を示しており、中・高剛性のデータをよく捉えている。理論曲線は、最小二乗フィット（ソフトウェアgnuplot Williams and Kelley, 2019）を用いて、すべての実験値（測定された剛性の統計的重みと速度の等しい重みを適用）にフィットさせた。典型的なピラス引き込み速度v0=0.5-1μm.s-1 Marathe et al., 2014; Koch et al., 2022、FR=50-100 pNのオーダーのストール力Marathe et al., 2014; Koch et al., 2022、ピラスオフ速度定数k0off=1 s-1 Talà et al、 2019、接触サイズλ=1 nm Koch et al., 2022、FB=1 nNの高摩擦表面、典型的なピラス引き込み頻度（ここでは、1回の引き込みイベント中に1本の有効なピラスが活動すると仮定する。典型的なピルスの長さを5μm、引き込み速度をv0=0.5-1μm.s-1とすると、1回の引き込み時間は5-10秒、引き込み頻度は0.1-0.2s-1である）、kp=0.1-0.2s-1を用いると、Vmax∼0.1-1μm.min-1、最大速度の半分における基質剛性はE0=10-100kPaとなり、この範囲はフィッティング値を囲む（付録1-図1参照）。
付録1-図1
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実験的に測定された速度対剛性データと、凡例に示した実験値に対する式A11の最小二乗フィット。
(a) 局所速度。最小二乗フィットにより得られたパラメータ： E0=32±20kPa、Vmax=0.48±0.12μm.min-1。(b）グローバル速度測定値。最小二乗フィットによって得られたパラメータ： E0=84±68kPa、Vmax=0.77±0.35μm.min-1。エラーバー ... もっと見る
ここでは、ピルスの力に依存しないオフレート定数を仮定した。より複雑なシナリオでは、ピルスと基質との接触はスリップボンドやキャッチボンドとして働くかもしれない。完全性を期すために、スリップボンドとキャッチボンドの挙動に関する数値結果を以下に示す。
D. 力に依存する剥離速度定数
モデルの複雑さを増すため、我々はピルスの剥離速度が力に依存すると仮定する Kramers, 1940; Björnham and Axner, 2010; Pereverzev et al.
(A14)koff=k0off(εe-FFC+eFFS).
ε=0はスリップボンドを表し、ε>0はキャッチボンドの挙動を表す。FとFは正の力定数を示す Pereverzev et al., 2005. 式(A14)は、ピルスの剥離時間が指数関数的に分布しないことを意味している。
次に、基質に付着したピルスが引っ込み、それによって変位uを引き起こす確率密度p(u)の展開方程式を考える。
(A15)∂tp=-koff(F)p-∂uju
第一項は（張力に依存する）基質からの毛虫の剥離を表し、第二項は毛虫の引き込みと細菌の滑走による変位の移流を捉える。これは次のようなフラックスjの発散として定式化される。
(A16)ju=[vR(F)-vB(F)]pである。
ピルスの後退vR(F)とバクテリアの滑走速度vB(F)は式(A6)と(A7)で与えられる。方程式の解析を容易にするために、変換p(u)=p(u[F])=P(F)および∂u=Y∂Fを使用し、進化方程式を生じさせる。
(A17)∂tP(F)=koff(F)P-v0Y∂F[(1-FFR-FFB)P].
パラメータの数を減らすために、タイムスケールt0=1/k0off、長さスケールl0=v0t0、力スケールF0=(FRFB)/(FR+FB)を導入する。無次元量は、F~=F/F0、t~=t/t0、u~=u/l0と表記される。P~(F~)の無次元進化方程式は次の形をとります。
(A18)∂tP~=-κ(F~)P~-μ∂F~[P~(1-F~)], with F~∈[0,1].
ここで、μ=Yv0/(F0k0off)は次元的な基板剛性を表し、κは次元的な力に依存するオフ率、すなわちκ=koff/k0offを表す。定常状態で式(A18)を解くと、次のようになります。
(A19)P~=P~01-F~eI(F~)μ
となり
(A20)I(F~)=εe-1F~CEi(1-F~F~C)+e1F~SEi(-1-F~F~S).
式(A20)では、力定数FとFはF0によって再スケールされている。正規化係数P0は積分条件∫10P~(F~)dF~=1.Ei(x)によって定義されます。剥離時の力Fの分布は次式で与えられる。
(A21)P~d(F~d)=P~d0κ(F~d)1-F~deI(F~d)μ
で与えられ、正規化係数Pは積分条件∫10P~d(F~d)dF~d=1によって決定される。
基板からの剥離時の力とバクテリアの滑走距離を用いて
(A22)F~d=1-e-μt~d
(A23)x~B=1F~B[t~d+1μ(e−μtd~−1)]
という変換を行うと、P~d(F~d)dF~d=P~d[F~d(t~d)]μe-μt~ddt~d=P~t~d(t~d)dt~dとなり、毛管収縮1回あたりの平均細菌変位は、次のような高次元の形で復元されます。
(A24)⟩=∫∞0x~B(t~d)P~t~ddt~d.
式A11と同じ論法に従うと、有効細菌速度（次元）は次式で与えられる。
(A25)veff=kpl0⟨=kpk0offv0⟩x~B⟨x~B
(A26)=Vmax∫∞0[t~d+1μ(e-μt~d-1)]P~(t~d)dt~d、
であり、μ=E/E0である。
付録1-図2は、力非依存、スリップおよびキャッチボンド挙動（付録1-図2a）のオフレート定数、およびスリップボンドおよびキャッチボンドモデルの実効速度と力非依存剥離を、局所速度解析を用いた細菌速度の測定値（付録1-図2b）と比較して例示的に示している。これにより、例えばFR=FS=FB/10の高摩擦基質の場合に対応するスリップボンド定数FS=1.1F0を任意に選択した（すなわち、以前に使用したFR=FS=100pN、FB=1nN）。キャッチ・ボンド力定数は小さく、すなわちFS≪F0とした。これは、Talàら（2019）の、ピルス-基板間の付着はピルスの張力が小さい場合に安定するという考えに従ったものである。さらに、ε=2を選択した。つまり、ゼロ荷重におけるピルスの剥離は、スリップボンドモデルよりも3倍速い。E0=32kPa（力非依存モデルのフィッティングから得られた（付録1-図1a参照））を固定し、力依存の剥離速度定数を持つ理論曲線を、パラメータVの最小二乗フィットを用いてフィッティングした。キャッチボンドの挙動は、低剛性での速度を定性的によく捉えているが、スリップボンドもキャッチボンドも、中・高剛性では単純な解析的力非依存剥離モデルよりも優れていないようである。
付録1-図2
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凡例に示したピラス剥離速度定数koffの様々な力依存性の比較。
(b)様々な複雑性を持つモデルによって得られた細菌の速度と、実験的に測定された値（局所速度解析）との比較。
付録2
バイオフィルムの垂直化の開始に対する細菌の運動性の影響
A. 単純な速度論モデル
つまり、コロニーの垂直化は、細菌間あるいは細菌と基質間の接着力間の競争からではなく、細菌の分裂と運動性の間の競争から起こると仮定する。したがって、細胞の基質への結合エネルギーには、その剛性の関数として強い差はなく、このエネルギーは他の細胞への結合エネルギーよりもわずかに高いと仮定する。したがって、細菌はどのような場合でも基質に付着することを好むが、必要であれば他の細胞にも容易に付着することができる。この仮定に基づき、2Dから3Dへの移行を記述するために、表面コロニー形成の2つの重要な特徴を考察する：
成長：最初、時間t=0において、1つの細菌が表面に付着している。細菌の数Nは時間とともに次のように指数関数的に成長する：

(A27)N(t)=ett0.
特徴的な時間スケールであるtは、成長と、時折表面からバクテリアが剥離することの両方を説明する。表面へのバクテリアの脱着は無視される。さらに、tは時間とともに、また異なる表面間で一定であると仮定する。
移動：バクテリアは特徴的な速度Vで表面を探索し、ランダムウォークを行う（バクテリアの痙攣運動の持続長／時間よりも大きな時間スケールと長さスケールを考慮する）。これらの変位は、拡散過程に従って、特徴的な面積a(t)にコロニーの拡散をもたらす：

(A28)a(t)=a0+αVCMt
ここで、aは1つの細菌の面積であり、αはランダムウォークの特性に関連する現象学的パラメータである。
上の2つの式から、表面に付着したバクテリアの数は対応するコロニーのサイズよりも速く成長することが明らかである。したがって、基質上のバクテリアの数Nに対応する臨界時間tcにおいて、バクテリアが表面上に広がるために利用可能な領域は完全に占有される。
(A29)Nc=1+γVCMln(Nc)
ここで、式A27のr.h.s.のtcにln(Nc)を代入し、γ=αt0/a0とする。この方程式を解くと、Vと1つの未知のパラメーターγの関数としてNを求めることができる。VCM=0（バクテリアがまったく動かない状態）の場合、2Dから3Dへの移行は最初の分裂で、つまりNc>1になるとすぐに起こることに注意されたい。
ここで、Vがバクテリアの平均速度ではなく特性速度であるのと同様に（本文、図3A参照）、時間tにおいてコロニー内のバクテリアがアクセス可能な特性領域a(t)は、必ずしもコロニー全体の領域と等しくないことに注意すべきである：第一に、バクテリアの質量中心速度Vが有限であるため、第二に、局所的な密度がバクテリアの動きとアクセス可能な表面を制限する可能性があるためである。この効果を定量化するのは難しい。というのも、コロニー領域内の密度の変動は、Vにもよるが、粒子のブラウン拡散の場合よりもはるかに大きい可能性があるからである。実際、静止したままの細菌もいれば、広範囲に表面を探索する細菌もいる（本文、図3E）。もう一つの理由は、分裂時に2つの娘細胞が接触するため、分裂時の密度が系統的に変動することである。したがって、細菌がアクセスできる面積はむしろ効果的な尺度であり、微視的な拡散過程のみから直接導き出すことはできない。他の式を用いることもできるが、この式が提案できる最も単純なものであり、我々の実験データと十分に一致する。一つの正当化は、バクテリアの速度は局所密度の影響を受けない（a(t)とVの線形スケーリングを保持する）という基本的な仮定が、2Dから3Dへの移行が起こる前に、密閉パックされたバクテリアのグループが5-8セルを超えることがないという評価された状況において正当化されることである。しかし、比較のために、次節では準線形スケーリングと超線形スケーリングを実験データと比較する。
γの微視的な意味をさらに分析するために、γは速度の逆数であり、コロニーのコンパクトさに関連していることに注意する。値が大きいほど、細菌の分布がまばらで、成長／増殖中の細菌が他の細菌に遭遇し、局所的な混雑のために3Dに移行する確率が低いことを示す。しかし、コロニー面積とバクテリアがさらに拡散するためにアクセス可能な面積の間に前述の不一致があるため、持続性を持つランダムウォークから得られる値と比較するのは誤解を招く。γを実験的に測定された細胞の移動量と関連付けるには、表面上の細胞密度の揺らぎを詳細に解析する必要があるが、これは本稿の範囲外である。
B. 実験データとモデルの比較
特性速度が抽出された利用可能なデータ（本文、図3B）は、2D→3D転移の開始前に表面に気泡が存在したため、ガラス上の1つのデータポイントを除いて、すべて分析され、含まれた。各実験および各剛性における特徴的な速度は、図3Bから得た。コロニーあたりの特徴的なバクテリア数Nは以下のように推定した。
まず、低・中剛性表面（2.7 kPa、6.1 kPa、18.5 kPa）について、分離したバクテリアからのコロニー形成を、2Dから3Dへの移行が起こるまで経時的にモニターした。その後、最初に分離された菌に由来する表面上の菌数を数え、すべてのコロニーの数を平均してNを算出した。
剛性の高い表面では、細菌の移動が大きすぎるため、同じ始祖に由来するすべての細菌が混在したり視野から離れたりする一方で、他の細菌が入ってきたりするのを追跡することができない。その結果、Nは、2Dから3Dへの移行が始まった時点で視野内の細菌の総数を数え、この数を低剛性表面で測定された推定コロニー数で割って計算された。さらに、視野内のコロニー数の評価方法は誤差を生じやすい可能性があるため、視野内の細菌数をカウントする前に行う「ブラインド」評価手順を用い、起こりうるバイアスを回避した。細菌の総数を正規化するために使用したコロニー数の1変化（約4の平均値と比較）は、各個々のデータポイントのエラーバーの良い推定値を提供し、データポイントの広がりと同等である（付録2-図1参照）。1回の実験で同じ剛性の複数の表面を測定した場合、異なるN値は平均される。
付録2-図1
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3Dマイクロコロニーへの転移に関する実験結果と動力学モデル。
(a) 実験データ（マーカー）と動力学モデル（線）の比較。青い点はピリ欠損変異体pilA: Tn5で得られたデータ。挿入図は、全てのモデルのフィットの残差。
上記の引用した手順により、各実験の各剛性に対して1つのダブレット（V, N）が得られた。
我々の単純なモデルを実験データと一致させるために、式A27を用いて、与えられたγの値に対するVの関数としてNを計算することができる。しかし、式A27には解析解がないため、実験データに直接フィットすることは難しい。その代わりに、各実験点から以下の式を用いてγの実験値を算出した。
(A.30)γexp=Nc-1VCMln(Nc)
次に、平均実験値が標準偏差とともに計算され、 ງγexp'=56.8 min.μm-1、δγ=11.2 min.μm-1となる。
付録2-図1aは、Vの関数としての実験データ(Nc-1)/Log(Nc)（各マーカーは異なる実験に対応する）、および傾き⟨γ⟩（実線）、および⟨γ⟩±1標準偏差（点線）を持つ対応する理論直線を示す。高速度での曲線からのずれを評価するため、v0<2μm.min-1の全データ点から⟨γ↪Pe9↩も計算したが、値の変化はわずかであった（56.8min.μm-1の代わりに58.2min.μm-1、付録2-図1b参照）。
このモデリングにおける我々の最も強い仮定は，a(t)をVの関数として表現することである[式A26]．しかし，我々の主張を補強するために，Vの指数を0.5から1.5（0.1のステップ，付録2-図1a，挿入図）の範囲にして同様の曲線を計算した。実験データとの比較から，妥当な一致が得られるのは，せいぜい指数が0.8から1.1の間であることがわかる。
最後に、バクテリアの密度や2D→3D転移の時間をプロットした場合、データがうまく崩れないことを指摘したい（付録2-図1cとd）。考えられる説明は、表面上のバクテリアの初期数が異なるデータセット間で異なることであり、密度や転移の開始時間の代わりにバクテリアの数をプロットすると、このバイアスがキャンセルされる。密度については、付録2-図1aの曲線に観察面積あたりの平均コロニー数（3コロニー）を乗じ、画像面積（26,121μm2）で割ったものである。移行時間については、移行時のコロニーあたりの細菌数の対数に、表面上の細菌数の典型的な成長時間（約40分）を乗じたものである。この時間には、分裂時間（約30分）と細菌の一部が表面から離脱する時間の両方が含まれている。
データの利用可能性
図2-source dataおよび図3-source dataには、図の作成に使用した数値データが含まれている。
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決定書
タム・ミニョ
CNRSエクス・マルセイユ大学、フランス
アルトゥーロ・カサデバル
シニアエディター、ジョンズ・ホプキンス・ブルームバーグ公衆衛生大学院、米国
(i)読者の便宜のためにプレプリントと一緒に掲載されるようにデザインされた公開レビュー、(ii)以下に示す修正依頼を含む著者への原稿に対するフィードバック。また、編集者がその論文のどこを興味深く、あるいは重要だと感じたかを説明するアクセプトサマリーも含まれる。
査読後の決定通知
論文「Substrate stiffness impacts early biofilm formation by modulating Pseudomonas aeruginosa twitching motility」をeLifeに投稿していただき、ありがとうございます。あなたの論文は2名の査読者によって査読され、査読編集者であるTam Mignotと上級編集者であるArturo Casadevallによって評価が監督されました。査読者は匿名を選択しました。
査読者は互いの査読について議論し、査読編集者は修正投稿の準備のためにこれを起草した。
重要な改訂点
著者らは、運動性の変化は表面センシングに起因する生理学的変化によるものではなく、むしろ基質の力学的特性が運動性の違いを調節する役割を担っていると結論づけている。しかしながら、この結論はchpA変異体を用いたことに一部由来するものであり、著者らのデータは、chpA変異体がWTと比較して運動性の違いを示さないことを示している。いくつかの発表された研究が、PilChp変異体（chpAを含む）において、ピラス合成と痙攣運動性の両方に欠陥があることを示していることを考えると、これらのデータは非常に驚くべきものである。発表された研究と発表された文献との間にどのような違いがあり、これらの結果に食い違いが生じたのかは不明である。
chpA変異株には多くの表現型があるが、著者らは使用した株でそれらを観察しているのだろうか？彼らが操作した株のピリレベルは実際どの程度なのだろうか？加えて、この非常に意外な結果を確認するためには、pilG変異体でこれを繰り返すことが重要であろう（ChpAリン酸化転移によるPilGの制御は、PilChpシグナル伝達経路の大部分を駆動するので、これは図S6に示した意外な結果を検証する良い方法であろう）。キネティック・モデリングと、この現象が純粋に機械的なものであるという結論がこの結果に基づいていることを考えると、これは非常に重要なコントロールである。著者らがpilG変異体で同様の結果を得た場合、何が観察された差異をもたらしたかについての議論を取り入れることが重要であろう。
その他の修正

  • 著者らは、補足図4に示されたデータに基づき、柔らかい弾性基質上でのPAによるマイクロコロニー形成の剛性調節において、痙攣運動性が重要な役割を果たしていると結論づけた。コントロールとして、最も軟らかい基質（2.7 kPaパッド）上のT4P変異体ではコロニーの形態が変化しないことを確認できればよい。

  • タイムスケールのジャンプについては、もっとよく説明する必要がある。およそ1um/sの局所速度が、1分間に1回のフレームレートで見ると、um/minの実効速度になる。これは運動性のランダム性を反映しているだけかもしれないが、文章やモデルでもっと説明すべきである。一般的な注意点として、この論文を読み進める上で難しいのは、多くのパラメータがグローバルな方法で定義されており、その仮定が必ずしも十分に検証されていない派生式からのフィットとして定義されていることである。例えば、式(1)は、清浄媒体による流路のフラッシングのため、新たな添加がないことを仮定している。しかし、2.7 kPaゲルでの最初の滞留時間のピークは、図S7によると約5分であるのに対し、Vgの計算は100分以上行われており、記録視野の上流で細菌が剥離・再付着する時間は十分に残されているはずである。同様に、Vcmの定義も簡単には理解できない。一般的な速度の平均値がノイズが多すぎるのだろうか。

  • 式10でpilA変異体の平均速度を直接差し引くことは正当化されるかもしれないが、それにはもう少し説明が必要だろう。全体として、データ解析の選択肢の長所と短所についての説明をもっと充実させれば、誰もが理解できる論文になるだろう。異なるパラメーターを抽出する他のもっと簡単な方法（直接平均、カットオフの選択...）を提示することは、補足だけでも役に立つだろう。また、141行目の「細菌は長軸に沿って移動する」という仮定は、液体中では長軸に垂直に移動することが示されている（Gibiansky et al. Science 330(6001):197）。

  • 提示された単純な速度論モデルは、データの多くの側面を理解しやすい形で要約しているが、いくつかの仮定についてはさらに議論する必要がある。ピリは先端でしか結合しないという仮定は合理的であるが、非常に強い。この仮定はモデルの多くの簡略化を可能にするが、IV型ピリはその長さ全体で結合する可能性があり、長さがミクロンになることもあるので、結合領域もミクロンになる可能性がある。Kochらによる2021bの論文では、このような推論がなされているが、論文の早い段階でちょっとした考察があるとよいだろう。

  • 一定の流路におけるバイオフィルムの形成は、よく特徴づけられた一般的な技術であるが、栄養塩の更新や環境が制御されていないような一般的な環境におけるバクテリアの条件とはかなりかけ離れたものである可能性があることに言及することは重要であろう。このテーマでちょっとした議論があってもいいかもしれない。

  • 発見されたパラメーター（特にVmax、E0）の異なる推定値に関するかなり大きな誤差について議論するのも面白いかもしれない。

  • 図1およびいくつかの図において：使用された4つの剛性（2.7、18.5、65、84kPa）は、必ずしもすべて表示されておらず、図1のように、時には一致しないセットになっている。これが修正されれば素晴らしいことである。
    本文：

  • 著者らはこの研究で測定された単一細胞のクラスターをコロニーと呼んでいる。一般的にコロニーはプレート上の巨視的スケール（肉眼で見える）のコロニーを指すので、これは少し紛らわしい。全体を通してわかりやすくするため、「コロニー」を「マイクロコロニー」に変更することを提案する。

  • 補足図4と本文図4の凡例にタイプミスがある。

  • 補足図8の凡例に "data not shown "の記述がある。

  • 著者名5行目のDelphineの代わりにDephine。

  • 補足の6ページの凡例の84の代わりに85 kPa。
    査読者1（著者への提言）：

  • 著者らは、補足図4に示されたデータに基づいて、柔らかい弾性基質上でのPAによるマイクロコロニー形成の剛性調節において、痙攣運動性が重要な役割を果たすと結論している。コントロールとして、最も軟らかい基質（2.7 kPaパッド）上のT4P変異体ではコロニーの形態が変化しないことを確認できれば幸いである。

  • 著者らは補足図6で、chpA変異体はWTと比較して、硬い表面上でも同程度のVgを示すことを示した（図2C）。この結果は、PilChp変異体がピラス合成とぴくぴくする運動性に欠陥があることが知られている（Bertrand et al. この非常に意外な結果を確認するために、pilG変異体（ChpAリン酸化転移によるPilGの制御が、PilChpシグナル伝達経路の大部分を駆動している。） キネティック・モデリングと、この現象が純粋に機械的なものであるという結論がこの結果に基づいていることを考えると、これは非常に重要なコントロールである。著者らがpilG変異体で同様の結果を得た場合、何が観察された差異をもたらしたかについての考察を取り入れるとよいだろう。

  • 著者らは「典型的なピルスの引き込み速度」を1um/minとしているが、これはPAでは0.5um/minと測定されている（Skerker and Berg 2001）。この値が変われば、著者らのモデルに違いが生じるのだろうか？
    査読者2（著者への提言）：
    公開レビューでの指摘1に対するフォローアップとして： 式10でpilA変異体の平均速度を直接減算していることは、妥当かもしれないが、もう少し説明が必要だろう。全体として、データ解析の選択肢の長所と短所についての説明をもっと充実させれば、誰もが理解しやすい論文になるだろう。異なるパラメーターを抽出する他のもっと簡単な方法（直接平均、カットオフの選択...）を提示することさえ、補足だけでも役に立つだろう。141行目の「細菌は長軸に沿って移動する」という仮定は、液体中では長軸に垂直に移動することが示されている（Gibiansky et al. Science 330(6001):197）。

  • 一定の流路におけるバイオフィルムの形成は、よく特徴づけられた一般的な手法であるが、栄養素や環境の更新が制御されていないような一般的な環境におけるバクテリアの条件とはかなりかけ離れたものである可能性があることに触れておくことは重要であろう。このテーマでちょっとした議論があってもいいかもしれない。

  • 発見されたパラメーター（特にVmax、E0）の異なる推定値に関するかなり大きな誤差について議論するのも面白いかもしれない。

  • 図1およびいくつかの図において：使用された4つの剛性（2.7、18.5、65、84kPa）は、必ずしもすべて表示されておらず、図1のように、時には一致しないセットになっている。これが修正されれば素晴らしい。
    https://doi.org/10.7554/eLife.81112.sa1
    著者からの回答
    本質的な修正：
    著者らは、運動性の変化は表面センシングに起因する生理学的変化によるものではなく、むしろ基質の力学的特性が運動性の違いを調節する原因であると結論づけている。しかし、この結論はchpA変異体の使用から導き出されたものであり、この変異体はWTと比較して運動性の違いを示さないことを著者のデータは示している。いくつかの発表された研究が、PilChp変異体（chpAを含む）において、ピラス合成と痙攣運動性の両方に欠陥があることを示していることを考えると、これらのデータは非常に驚くべきものである。発表された研究と発表された文献との間にどのような違いがあり、これらの結果に食い違いが生じたのかは不明である。
    chpA変異株には多くの表現型があるが、著者らは使用した株でそれらを観察しているのだろうか？彼らが操作した株のピリレベルは実際どの程度なのだろうか？加えて、この非常に意外な結果を確認するためには、pilG変異体でこれを繰り返すことが重要であろう（ChpAリン酸化転移によるPilGの制御は、PilChpシグナル伝達経路の大部分を駆動するので、これは図S6に示した意外な結果を検証する良い方法であろう）。キネティック・モデリングと、この現象が純粋に機械的なものであるという結論がこの結果に基づいていることを考えると、これは非常に重要なコントロールである。もし著者らがpilG変異体について同様の結果を得た場合、観察された違いの原因について考察を加えることが重要であろう。
    実際、chpA変異体でこのような高い運動性が観察されたことは驚きであり、この点を指摘してくれたレフェリーに感謝する。文献上のほとんどの研究では、chpA変異体では、振幅は異なるものの、痙攣の減少が報告されている（例えば[1-3]を参照）。我々はさらに、巨視的プレートアッセイ（TurnbullとWhitchurch[4]が記載した方法を使用）により変異株の痙攣を確認したところ、この株は痙攣運動が可能であることが確認された（著者回答画像1）。我々が使用した変異体はPAO1トランスポゾン・ライブラリーから得られたもので、適切なプライマーを用いたPCRによって確認された。従って、トランスポゾンが確かにchpA遺伝子に存在することがわかった。しかし、ライブラリーのウェブサイトによると、挿入位置は遺伝子配列の末尾に非常に近く（PA0413、ORF中の位置は7419塩基中6598塩基）、その結果、機能的なタンパク質が残っている可能性がある。現段階では、これがこの驚くべき結果を説明する唯一の仮説である。混乱を避けるため、このデータの一部を原稿から削除することにした。
    著者回答画像1
    アセットをダウンロード アセットを開く
    Macroscopic twitching assay (A) 37℃で24時間後に測定した痙攣領域の大きさ (B) WTとchpAで得られた典型的なプレート（24時間後、常温で撮影）。
    黒い印は1cm。
    レフェリー1の提案に従い、ピリを介したメカノセンシングに障害を持つ細菌の挙動を調べるため、pilG変異体（PAO1、pilG::Tn5）を用いた実験を行った。しかし、この株は明らかに痙攣運動性が非常に低かった（プレートアッセイで確認）。さらに驚くべきことに、この株では、流路内での短時間に、PAAへの顕著な付着が観察されなかった。pilG変異体が接着不全であるか（これは新しい結果であろう）、あるいはこの特定の株がさらなる変異を持ち、異常な挙動を示したかのどちらかであろう。いずれにせよ、PilChp機構を改変した変異体のほとんどは、痙攣運動性にも障害があるため、我々の実験に使うには不適当な候補となる。
    そこで、PilChpシステムの下流でc-di-GMPレベルを調節するジグアニル酸シクラーゼsadCを変異させた株を使うことにした。その結果、この変異株はWT株よりわずかに運動性が劣るものの、硬さに依存した運動性を維持していることがわかった。このことは、ピリによって誘導されるc-di-GMP調節は、我々が軟質基質上で報告した痙攣調節には関与していないことを示唆している。この論文では、PAO1のメカノセンシングを制御することが知られている2つのジグアニル酸シクラーゼ（wspRとsadC）の変異体[5]を探索しているので、このアプローチはより「論理的」であると考えられる。
    私たちは、これらのコントロールが網羅的なものではなく、痙攣を修正しうる表面付着に対する制御反応の可能性を排除するために使用することはできないことを十分認識している。しかし、この原稿でこの可能性を厳密に否定する意図はなかった。我々は単に、付着細菌と基質との間の機械的相互作用が、観察されるコロニーの表現型につながる主要な要素であると推論しているだけである。このことは現在、原稿の中で十分に明らかにされている。
    [1] Bertrand JJ, West, JT, Engel, JN (2009). 緑膿菌のChp化学感覚系によるIV型ピラス機能制御の遺伝学的解析。このような研究により、緑膿菌のIV型ピラス機能の遺伝学的解析が可能となった。[2] Silversmith, R. E., Wang, B., Fulcher, N. B., Wolfgang, M. C., Bourret, R. B. (2016). Pseudomonas aeruginosa Pil-Chp Chemosensory System内のホスホリル基の流れ。Journal of Biological Chemistry, 291(34), 17677-17691. doi:10.1074/jbc.m116.737528. [3] Khn MJ et al. (2021) Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. PNAS, 118(30) e2101759118. [4] Turnbull, L. and Whitchurch, C. B. (2014). Motility Assay： Twitching Motility. doi:10.1007/978-1-4939-0473. [5] Randall TE et al. (2022) Sensory Perception in Bacterial Cyclic Diguanylate Signal Transduction. ジャーナル・オブ・バクテリオロジー, 204(2) doi:10.1128/jb.00433-21
    その他の修正

  • 著者らは、補足図4に示したデータに基づき、柔らかい弾性基質上でのPAによるマイクロコロニー形成の剛性調節において、痙攣運動性が重要な役割を果たしていると結論している。コントロールとして、最も軟らかい基質（2.7 kPaパッド）上のT4P変異体ではコロニーの形態が変化しないことを確認できれば幸いである。
    対応する画像を図1-図4へ追加した。

  • タイムスケールのジャンプについては、もう少し説明が必要である。およそ1um/sの局所速度が、1分間に1回のフレームレートで見ると、um/minの実効速度になる。これは運動性のランダムな性質を反映しているだけかもしれないが、本文とモデルでもっと説明すべきである。一般的な注意点として、この論文を読み進める上で難しいのは、多くのパラメータがグローバルな方法で定義されており、その仮定が必ずしも十分に検証されていない派生式からのフィットとして定義されていることである。例えば、式(1)は、清浄媒体による流路のフラッシングのため、新たな添加がないことを仮定している。しかし、2.7 kPaゲルでの最初の滞留時間のピークは、図S7によると約5分であるのに対し、Vgの計算は100分以上行われており、記録視野の上流で細菌が剥離・再付着する時間は十分に残されているはずである。同様に、Vcmの定義も簡単には理解できない。一般的な速度の平均値がノイズが多すぎるのでしょうか？
    A) 実際、数分の時間スケールで細菌の変位を測定した場合、1µm.s-1の局所的な（負荷のない）毛管引き込み速度が、1µm.min-1の実効的な細菌速度にしかつながらないのは驚くべきことである。この挙動の理由は2つある。第一に、ピルスの伸長と収縮の各サイクル（長さ5µmのピルスでは≈5s、Tala et al. 2019と一致）の間、ピルスは基質に付着している時間がτ=(k0off)-1≈1sと短いため、ピルスのライフサイクルより長い時間スケールでは、k0は当然k0offkp=5のファクターで局所的なピルス速度を低下させる。第二に、ピルスの引き込み速度は負荷に依存して遅くなり、局所速度、ひいては実効速度が、係数FRFR+1≈10だけさらに低下する（ここでFは、ピルスの張力に対する細菌の摩擦の効果を表し、摩擦が大きい場合はFR=100pN、FB=1nNとなる）。この2つの効果は、細菌が無限に硬い基質上で到達できる最大有効速度Vmaxでうまく捉えられる［本文の式（8）参照］。
    微視的な高速度から巨視的な低有効速度への減少には、より徹底的な説明が必要であるというレフェリーの意見に同意する。本文中の式(9)の後に上記の理由を記載した。(9)の後に、モデルおよびその結果得られたフィットパラメータVmaxとE0について議論しています。
    B)レフェリーの言う通り、原理的には、視野の上流で細菌が剥離し、その後視野内で再付着する（または視野内へ移動する）ことは可能であり、速度解析に欠陥が生じる可能性がある。しかし、これは実験では見られない。バクテリアの追跡はバクテリアの離脱を示すが、初期のバクテリアの付着は（起こるとしても）まれな出来事であり、累積探索面積S(t)［式(2)参照］の増加を説明することはできない。
    この観察には2つの理由が考えられる：

  • 初期の表面被覆率は極めて低く、通常1視野（約160x160マイクロメートル四方）あたり2～4個のバクテリアである。さらに、画像取得を開始する直前に上流のチューブを交換するため、細菌はフローセル内の表面にしか存在しない（流動媒体中に多くの細菌が存在することを避けるため、意図的に行った予防措置）。したがって、Vgの測定に使用する100分間のウィンドウの大部分では、剥離するバクテリアの実際の数は少なく、フロー中のバクテリアの濃度は非常に低くなる。

  • このような流れ中の細菌は、付着確率が低いのかもしれない。表面での非対称分裂現象を示唆する結果と一致して、剥離したバクテリアは、その特異的な表面特性により、基質への付着確率が低い可能性がある。
    C) レフェリーの指摘に同意する。読みやすさを向上させるため、いくつかの部分、特に個々の細菌の変位の分析に関するサブセクションと関連する図3を書き直した。具体的には、Vgの計算がいくつかの議論可能な仮定（すなわち、顕著な細菌の付着がないこと、および細菌の主軸に沿った方向性のある運動性）に依存しているという事実を認める。しかし、個々の細菌の追跡によるVC（以前はVCM）の決定は、「探索された表面積」アプローチよりも時間がかかるが、そのような仮定を必要とせず、Vgを計算する際に得られたものと非常に類似した運動性の値を提供する。このことは現在原稿で強調されており、検証されていない仮定に関するレフェリーの懸念の大部分に応えることができたと考えている。
    同様に、VCの意味も明確にした。基本的に、レフェリーの言う通り、速度の一般的な平均値はノイズが多い（図S9Bで強調したように、平均トラック速度の標準偏差は通常、決定値の約50％である）。私たちは当初、細菌集団の不均一性を探るために個々の細胞の追跡を行い、また集団の運動性を特徴付ける方法として時間的なc "自然 "追跡を行いました。現在では、能動的変位と受動的変位に対応する2つのインコヒーレントな変位場を追加することによって得られる理論的分布の数値計算を含む、変位ステップの分布の解析に関する広範な説明を追加した（「材料と方法」）（図3図3）。こうすることで、VCが細菌の活動的速度に直接対応し、受動的変位（pilA変異体<<VC値><<VC値><<VC値><<VC,p>で決定される速度）には大きく影響されないことが証明される。驚くべきことに、これらは全く異なる分析から得られたものであるが、VC値とVg値の間の整合性は極めて顕著である。

  • 式10でpilA変異体の平均速度を直接差し引くことは正当化されるかもしれないが、それにはもう少し説明が必要だろう。全体として、データ解析の選択肢の長所と短所についての説明をもっと充実させれば、この論文を誰にでもわかりやすいものにできるだろう。異なるパラメーターを抽出する他のもっと簡単な方法（直接平均、カットオフの選択...）を提示することは、補足だけでも役に立つだろう。また、141行目の「バクテリアは長軸に沿って移動する」という仮定は、液体中では長軸に対して垂直に移動することが示されている（Gibiansky et al. Science 330(6001):197）。
    A) 材料と方法のセクションに、速度データ解析の詳細な説明を追加した（ポイント2Cも参照）。我々の変位ステップのモデル分布は、WTで得られた値にpilAの値を差し引く必要がないことを示している。そのため、この総説ではVC値をわずかに修正したが、これは図3Dをわずかに変えるだけである。
    B)菌軸を基準とした様々な方向への運動を考慮すると、Vgの値は定量的にわずかに修正されるが、すべての剛性で得られた速度はほぼ同じファクターで変化する。例えば、（非方向性運動を考慮するために）1b--√wbの細菌寸法の特性値を用いると、1µm×3µmの細菌寸法を仮定した場合、測定された速度は1bwb---√≒3-√のファクターだけ減少する。先に述べたように、この単純な解析は、集団全体の運動性の変動を定性的に読み取ることを目的としているに過ぎない。これは多くの仮定に依存しているが、より詳細な追跡解析は、細菌の速度を調査する、より正確で徹底的な方法である。

  • 提示された単純な動力学モデルは、データの多くの側面を理解しやすい方法でカプセル化しているが、いくつかの仮定についてはさらに議論する必要がある。ピリは先端でしか結合しないという仮定は合理的だが、非常に強い。この仮定はモデルの多くの簡略化を可能にするが、IV型ピリはその長さ全体で結合する可能性があり、長さがミクロンになることもあるので、結合領域もミクロンになる可能性がある。Koch et al.の2021bにはその根拠が書かれているが、論文の早い段階でちょっとした考察があると良いだろう。
    私たちは、ピルスがその末端として付着するという単純な仮定に関する議論を、本文の最小動力学モデル（184ページ）と付録1に導入した。

  • 一定の流路におけるバイオフィルムの形成は、よく特徴づけられた一般的な手法であるが、栄養素や環境の更新が制御されていないような一般的な環境におけるバクテリアの条件とはかなりかけ離れたものである可能性があることに言及することは重要であろう。このテーマに関するちょっとした議論があってもいいかもしれない。
    我々の実験的アプローチでは、当初、一度に一つの環境特性（ここでは基質の硬さ）の影響を研究するという考えに従った。研究室の外では、緑膿菌はほとんどせん断にさらされない環境（肺胞や創傷表面などがその例である）に侵入することができるからである。この研究と並行して、我々は現在、フローや培地更新がない状態でのマイクロコロニー形成をウェルで観察する研究を進めている。この場合にも、フロー下で観察されるのと同様に、細菌がより軟らかいPAA上に密集したコロニーを形成しており、細菌組織には明らかな違いがあることを示す図（図1-図3）を追加した。この点については、本文（l.111から）で少し触れている。

  • 発見されたパラメーター（特にVmax、E0）の異なる推定値に関するかなり大きな誤差について議論するのは興味深いかもしれない。
    誤差の推定は、gnuplot (version 5.2.8 for Mac OSX)で、フィット関数の共分散行列と非線形フィットの残差の分散(カイ二乗和を自由度で割ったもの)から直接計算しました。この残差は、異なる実験間で測定された速度が大きくばらついていることを反映している（ただし、剛性が高くなるにつれて速度が増加する傾向は、すべての実験で同じである。） 本文中の式9の後に、大きな誤差の推定値の原因に関する注釈(l.211)を追加した。9 では、痙攣プロセスの微視的パラメーターの測定値に対するフィッティングパラメーターについて述べている。

  • 図1といくつかの図において：使用された4つの剛性（2.7、18.5、65、84kPa）が必ずしもすべて表示されておらず、図1のように一致しないセットになっていることがある。これが修正されれば素晴らしいことです。
    実験に使用した流路の形状とハイドロゲルのサイズから、ある実験では長さ5cmの流路で3つのハイドロゲルしか観察できなかった。そのため、また測定値にばらつきがあるため、選択した画像を示した図では、同じ日に取得した画像を使用しており、テストした4つの剛性すべてを表示することはできません。残念ながら、これを簡単に修正することはできない。主な実験上の限界は、基板上に堆積させる必要があるハイドロゲル・プレミックスの量が少ない（我々の場合、厚さ12mm、35ミクロンのハイドロゲル・パッチを得るために3μl）ことで、長さ5cmの1本のチャンネルでより多くの剛性値を得るためにハイドロゲルのサイズを縮小することができなかった（試みたが、液滴の量が少なすぎるとハイドロゲル・プレミックスが急速に蒸発してしまい、最終的なゲルの空間的均一性に影響を与えた）。
    本文：

  • 著者らはこの研究で測定された単一細胞のクラスターをコロニーと呼んでいる。一般的にコロニーはプレート上の巨視的スケール（肉眼で見える）のコロニーを指すので、これは少し紛らわしい。全体を通してわかりやすくするため、「コロニー」を「マイクロコロニー」に変更することを提案する。

  • 補足の図4と本文の図4の凡例に誤字がある。PAO1 pilA::Tn5 （コロンが1つではなく2つ）と読むべきである。

  • 補足図8の凡例に "data not shown "の記述がある。

  • 著者名5行目のDelphineの代わりにDephine。

  • 補足図6ページの凡例の84の代わりに85 kPa。
    これらの間違いはすべて訂正された。図S8（現在の図3-図1）は示唆されたように修正された。原稿を注意深く読んでくれたレフェリーに感謝する。
    https://doi.org/10.7554/eLife.81112.sa2
    論文および著者情報
    著者詳細
    ソフィア・ゴメス
    グルノーブル・アルプ大学、CNRS、グルノーブル、フランス
    貢献
    バリデーション、調査、方法論
    競合利益
    競合利益なし
    リオネル・ビューロー
    グルノーブルアルプ大学、CNRS、グルノーブル、フランス
    貢献
    概念化, データキュレーション, 形式分析, 監修, 検証, 調査, 執筆 - 査読と編集
    競合利益
    競合利益なし
    カリン・ジョン
    グルノーブルアルプ大学、CNRS、グルノーブル、フランス
    貢献
    形式分析、方法論、執筆 - 査読および編集
    競合利益
    このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです：0000-0003-1678-6880」。
    エリーズ・ノエル・シェーヌ
    リヨン大学物理学研究所、リヨンENS、クロード・ベルナール大学、CNRS、リヨン、フランス
    貢献
    調査、方法論
    競合利益
    競合利益なし
    デルフィーヌ・デバール
    グルノーブルアルプ大学、CNRS、グルノーブル、フランス
    貢献
    概念化、データキュレーション、形式分析、監修、検証、調査、方法論、原著執筆、査読・編集
    お問い合わせ先
    delphine.debarre@univ-grenoble-alpes.fr
    競合利益
    このORCID iDは、この論文の著者を特定するものである。
    シゴレーヌ・ルクイエ
    グルノーブル・アルプ大学、CNRS、グルノーブル、フランス
    リヨン物理学研究所、リヨン大学、リヨンENS、クロード・ベルナール大学、CNRS、リヨン、フランス
    貢献
    概念化、データキュレーション、形式分析、監修、検証、調査、方法論、執筆（原案）、執筆（校閲・編集
    お問い合わせ先
    sigolene.lecuyer@ens-lyon.fr
    競合利益
    このORCID iDは、この論文の著者を特定するものである。
    資金提供
    フランス国立研究庁 (ANR-19-CE42-0010)
    デルフィーヌ・デバール
    Labex Tec21 (ANR-11-LABX-0030)
    リオネル・ビューロー
    カリン・ジョン
    デルフィーヌ・デバール
    シゴレーヌ・ルクイエ
    資金提供者は、研究デザイン、データ収集、解釈、論文投稿の決定には関与していない。
    謝辞
    AFM弾性測定にご協力いただいたClaude Verdier氏、マイクロ流体工学にご協力いただいたDenis Bartolo氏、データモデリングについて有益な議論をいただいたBenoit Coasne氏とBenedikt Sabass氏に感謝する。また、Ina AttreeとSylvie Elsen（IBS、グルノーブル）には、ひずみ、助け、助言をいただいた。pcdrA-gfpレポータープラスミドの提供をしてくれたTim Tolker Nielsenに感謝する。DDはフランス国立研究庁（ANR-19-CE42-0010）の支援を受けた。LabeX Tec 21（ANR-11-LABX-0030）の支援に感謝する。
    シニアエディター
    アルトゥーロ・カサデバル（ジョンズ・ホプキンス大学ブルームバーグ公衆衛生大学院、米国
    査読編集者
    Tâm Mignot, CNRSエクス・マルセイユ大学, フランス
    バージョン履歴
    プレプリント掲載 2022年2月19日（プレプリントを見る）
    受理 受理：2022年6月15日
    受理 受理：2023年5月5日
    受理原稿公開 2023年5月9日（第1版）
    記録版発行 2023年6月9日（第2版）
    著作権
    © 2023, Gomez et al.
    この記事はクリエイティブ・コモンズ 表示ライセンスの条件の下で配布されています。このライセンスは、原著者および出典のクレジットを条件として、無制限の使用と再配布を許可するものです。
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