超低出生体重早産児の腸内マイクロバイオームとレジストロームに対する生後早期の抗生物質およびプロバイオティクス投与の影響

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超低出生体重早産児の腸内マイクロバイオームとレジストームに対する早期からの抗生物質およびプロバイオティクス投与の影響

Impact of early life antibiotic and probiotic treatment on gut microbiome and resistome of very-low-birth-weight preterm infants

Raymond Kiu, Elizabeth M Darby, Cristina Alcon-Giner, Antia Acuna-Gonzalez, Anny Camargo, Lisa E Lamberte, Kathleen Sim, Alexander G Shaw, Paul Clarke, Willem van Schaik, J Simon Kroll, View ORCID ProfileLindsay J Hall
doi: https://doi. org/10.1101/2024.12.18.629205
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要旨
早産児（妊娠37週未満）は、壊死性腸炎や敗血症などの重篤な罹患率に陥りやすいため、病院ではしばしば広域抗生物質が投与される。しかし、抗生物質は早期の微生物叢の発達を阻害し、腸管免疫やコロニー形成抵抗性を損なう可能性がある。プロバイオティクス（特定のビフィドバクテリウム株など）が健康な腸内細菌叢の回復に役立つ可能性があることを示す証拠がある。本研究では、34名の超低出生体重早産児（中等度早産児～超早産児）からなる2つのコホートにおいて、プロバイオティクスと抗生物質が早産児の腸内細菌叢とレジストームに及ぼす影響を検討した。それぞれのグループにおいて、一部の乳児は抗生物質（ベンジルペニシリンおよび/またはゲンタマイシン）による治療を受け、他の乳児は抗生物質による治療を受けない対照とした。乳児34名の糞便サンプル93検体についてショットガンメタゲノムシークエンシングを行い、300以上のメタゲノム集合ゲノムを作成した。さらに、新生児腸管モデルを用いて、早産児由来の多剤耐性（MDR）病原体エンテロコッカスの試験管内水平遺伝子移入（HGT）能力を調べた。全体として、プロバイオティクスの補充は抗生物質耐性遺伝子の有病率、MDR病原体量を有意に減少させ、典型的な早産児の微生物叢を回復させるのに役立った。しかしながら、HGTの可能性の高い腸球菌のようなMDR病原体が残存していることは、新生児医療における継続的なサーベイランスの必要性を浮き彫りにしている。今回の知見は、新生児マイクロバイオームの形成における抗生物質、プロバイオティクス、HGTの複雑な相互作用を強調するものであり、早産児集団における抗菌薬スチュワードシップのためのプロバイオティクスのさらなる研究を支持するものである。

はじめに
世界保健機関（WHO）の推定によると、世界では毎年10％以上の乳児が早産で生まれており、妊娠37週未満と定義されている1。新生児のうち、1500g未満で生まれた超低出生体重児（VLBW）は約1.1～1.4％である2,3。VLBW早産児は免疫系が未発達であるため、壊死性腸炎（NEC）4,5や敗血症6,7などの罹患率が特に高く、抗生物質耐性菌が関与していることが多い。このような危険性から、早産児は新生児集中治療室（NICU）に収容されることが多く、生後数日から数週間の間、通常ベンジルペニシリン、ゲンタマイシンまたはその誘導体などの広域抗生物質が日常的に投与される8,9。しかし、このような生後早期の抗生物質への曝露は、腸内細菌叢の正常な発達を阻害する可能性がある8,10,11。

早産児への抗生物質の使用は、腸内レジストームとして総称される抗生物質耐性遺伝子（ARG）の濃縮にもつながる12。腸内細菌群集内のARGは、主に水平遺伝子転移（HGT）によって急速に拡散する可能性がある。水平遺伝子転移は、常在菌から病原体へ、あるいはその逆も含め、種内および種間の両方で起こり、この転移はプラスミドなどの移動性遺伝要素を介して起こることが多い13。

ブドウ球菌、クレブシエラ菌、腸球菌、大腸菌などの多剤耐性菌は早産児の腸内に多く存在し5,8,14、その存在は入院期間の延長15、遅発性血流感染症16、病院環境における院内感染17-19にしばしば関連している。

こうした課題に対応するため、WHOは超早産児（妊娠32週未満）の母乳栄養児にプロバイオティクスの補給を推奨している20。プロバイオティクス、特にビフィドバクテリウム属菌とラクトバチルス属菌は、現在NICUでますます使用されるようになっており21、英国では約40％のNICUがこの方法を採用している8,9。プロバイオティクスの補充は、NEC発症率の低下、死亡率の低下、腸内病原体の減少、免疫成熟の亢進と関連している8,14,21-28。重要なことに、プロバイオティクスは早産児の腸内細菌叢におけるARGの量を減少させ、満期産児に見られるレベルに近づけることも観察されている29-32。

早産児の腸内細菌叢とレジストームに対するプロバイオティクスの影響を調査するために、我々はVLBW早産児の2つのコホートを調査した。ショットガンメタゲノミクスとゲノム分解アプローチを用いて、生後3週間のマイクロバイオームの種と株の動態、プロバイオティクスと抗生物質の影響を評価した。さらに、乳児腸内モデルで腸球菌を用いたプラスミド導入実験により、生体外でのARG導入を検討した。

結果
我々は34名のVLBW早産児（中等度早産児～超早産児）の腸内細菌叢を分析し、主に2つのコホート（プロバイオティクス添加（PS）コホートと非添加（NPS）コホート）に分けた。PS群の乳児にはビフィダム菌とアシドフィルス菌を含むプロバイオティクスが投与され、NPS群の乳児にはプロバイオティクスは投与されなかった。これらの乳児は、より大規模な研究からサブセットとして選択された8。各コホート内では、ベンジルペニシリンとゲンタマイシンによる経験的な抗生物質治療を受けた乳児もいれば、抗生物質無投与の対照となった乳児もいた（図1a）。糞便サンプルは、可能な限り生後3週間の早産児から毎週採取した（表1）。これらのサンプルは、腸内細菌叢の特徴を明らかにするために、処理、配列決定、計算機解析を行った。

図1.
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図1.
新生児期早産児の腸内マイクロバイオーム解析と機能プロファイリング。c,乳児34人の腸内マイクロバイオーム・プロファイルで、属レベルのデータに基づく相対存在量（％）。d、種レベルの分類学的割り当てに基づく乳児34人の腸内マイクロバイオーム・プロファイル（cと同様）。e、週数で層別化した2コホートの乳児34人の腸内マイクロバイオーム多様性指標（両側ウィルコクソン検定）。 f、週数で層別化した2コホート（NPS vs PS）における主要なビフィズス菌3種の分類学的存在量（％）の比較。示されたパーセンテージは、各種における平均相対存在量である。統計的有意性は両側Wilcoxon検定（NPS vs PS、週数に関して）を用いて行った。* g,バブルプロットに示された両コホートにおける最も豊富な細菌属上位10種の平均分類群比率。有意性（両側Wilcoxon検定）は、時点（週）に関してNPSとPSを比較した。* P<0.05、***P<0.01、***P<0.001、***P<0.0001。 h, 早産児34名の腸内細菌叢の機能プロファイルを週数で層別化したNPSとPSのNMDSプロット。 i, プロファイリングされた41の有意なパスウェイ（α=0.05、LDAスコア>2.0）を示す機能プロファイリングヒートマップ。ボックスウィズインフィギュアは、計算によって同定された合計407のパスウェイに基づく、NPS対PSの重複／特異的機能パスウェイのベン図を示している。

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表1.
コホートの特徴のまとめ： NPSコホートとPSコホートの比較。コホート特性は、必要に応じてウィルコクソン検定、スチューデントのt検定、フィッシャーの正確検定のいずれかを用いて比較した。
プロバイオティクスは生後早期の腸内細菌叢の回復をサポートする
腸内細菌叢の多様性はNPSコホートとPSコホートで有意に異なり、NPSコホートでは2週目と3週目に細菌叢の多様性が増加したが、PSコホートでは終始同程度の多様性が維持された（図1b）。全体的な腸内細菌叢のプロフィールは、NPS群とPS群の間で著しく異なっていた（図1c）。NPS群の乳児の腸内細菌叢は、早生期の病原細菌によって属レベルで特徴づけられていた（図1d）。1d）、クレブシエラ（Klebsiella pneumoniae）、エンテロバクター（Enterobacter）、エシェリヒア（Escherichia）、エンテロコッカス（Enterococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus haemolyticus）であった（図1e）。対照的に、PS乳児の腸内細菌叢はビフィドバクテリウム属、特に乳児に提供されたInfloranプロバイオティクスの主成分であるビフィドバクテリウム・ビフィダムに支配され、次いで2週目と3週目にはビフィドバクテリウム・ブレーベとビフィドバクテリウム・ロンガムに支配され、プロバイオティクスの補給の影響を反映していた（図1e）。注目すべきことに、母乳育児に関連し、ヒトミルクオリゴ糖（HMOs）を含む複合糖質を分解することによって乳児の腸内環境を健康にすることが認められているB. breveとB. longumは、NPS乳児と比較してPS乳児でより豊富であった（図1f）。

比較解析の結果、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）はPS群の微生物叢で有意に多く、一方エンテロバクター（Enterobacter）、エシェリヒア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）はNPS群の乳児でより多かった（図1g）。ブドウ球菌は生後1週目のみ顕著に優勢で、2週目と3週目には両コホートとも減少した。重要なことは、多剤耐性菌であるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）もまた、両コホートにおいて腸内細菌叢の顕著なメンバーであったことである。

次に、腸内細菌叢内の機能的経路を調べた。これらのパスウェイのクラスタリングは、2週目からPSとNPSのコホート間で次第に異なるパターンを示した（図1h）。全サンプルを通して、合計407の機能的パスウェイが同定され、84のパスウェイが2つのコホート間で有意に異なる存在量を示した（図1i）。このうち、ショ糖分解経路を含む14の経路（3.4%）がPSコホートに特有であり、370の経路（90.9%）が両コホート間で共有されていた。さらに、23のパスウェイ（5.7％）がNPS乳児にのみ関連していた。

プロバイオティクスの介入は、腸内レジストームにおけるARGの抑制と関連している
我々は、ベンジルペニシリンおよび／またはゲンタマイシンによる経験的治療を受けた乳児からなるNPSとPSの両コホートの腸内レジストームを調査し、生後3週間にわたる初期の腸内細菌叢とレジストームに対するこれらの抗生物質の影響を評価した（図2a）。注目すべきことに、ARGの存在量は、生後3週間を通じて、PS乳児と比較してNPS乳児で有意に高かった（図2b）。ARGの多様性（抗生物質／薬剤クラスの数で定義）を解析した結果、NPS乳児の腸内には、特に生後2週目と3週目において、PS乳児の腸内よりも有意に多くのARGタイプが含まれていた（図2c）。両コホートにおける主要なARGタイプには、アミノグリコシド、マクロライド-リンコサミド-ストレプトグラミン（MLS）、β-ラクタマーゼ、トリメトプリム、テトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子が含まれていたが、フルオロキノロンとコリスチンに対する耐性を付与するARGはNPS乳児にのみ認められた（図2d）。レジストームプロファイルのクラスタリング解析により、両コホートで共有されるARG（48 ARG）が明らかになり、NPS乳児では46 ARG、PS乳児では11 ARGがユニークであったが、グループ間の分離は明確ではなかった（図1e、f）。

図2.
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図2.
新生児早産児の腸内レジストームの詳細なプロファイリング。
a, 早産児の抗生物質投与スケジュールの概略図。両側Wilcoxon検定を用いて有意性を比較した。* c,ARGの種類数（ARGをコードする抗生物質／薬剤が耐性を示すクラス）のNPS群とPS群との比較。統計解析は両側Wilcoxon検定を用いて行った。* P<0.05、**P<0.01。 d、週ごとに層別化したNPSとPSの両コホートにおけるARGタイプの割合。図中のミニ棒グラフは、NPSとPSの両コホートにおけるARGの平均数をARGタイプ別に色分けしたものである。統計解析は両側Wilcoxon検定を用いて行った。**e, NPSとPSコホートの個体のARGプロファイルのNMDSプロット。 f, NPSとPSコホート間のユニークARGと共有ARGの数と割合を示すベン図。 g, NPSとPSコホートにおける抗生物質とコントロール（未処置）のシャノン指数（多様性指数）の比較。h, 生後3週間における早産児腸内細菌叢の動態（上位10属を示す）を、抗生物質投与群と対照群（抗生物質未投与）で層別化したもの i, NPSとPSの両コホートにおける抗生物質投与群（対照群）の分類学的存在量（上位10属）の増減。網掛け部分は抗生物質投与期間を表し、抗生物質投与群の乳児は生後1週間（中央値3日）のみ抗生物質投与を受けた。統計解析は、両側Wilcoxon検定を用いて行った。. * j, 抗生物質投与群と対照群（未治療群）のARG数をNPS群とPS群で比較。統計解析は両側Wilcoxon検定を用いて行った。 l,（シャノン）多様性指数とARGの相関プロット。散布図はコホートごとに色分けした。m,大腸菌由来のmcr-9.1 ARG（NCBIヌクレオチドデータベース）と100％一致するヌクレオチド同一性を持つmcr-9.1 ARG遺伝子を持つ計算で抽出した配列コンティグのゲノムマッピング。

経験的抗生物質治療が腸内細菌叢に及ぼす影響を調べるため、各コホート内で抗生物質治療群と対照群（非抗生物質治療群）を比較した。全体として、マイクロバイオームの多様性に抗生物質投与群と対照群との間に有意差は認められなかった（図2g）。NPSコホートでは、抗生物質投与群は1週目から高い腸内細菌叢多様性を示し、それは2週目と3週目まで続いたが、対照群の細菌叢多様性はそれ以降の週で増加した。PS群では、抗生物質投与群ではブドウ球菌が、対照群では腸球菌が初期に増加した以外は、2週目と3週目はビフィズス菌が優勢であった。分類学的存在量分析により、NPSコホートでは、ビフィドバクテリウムとラクトバチルスを除き、抗生物質投与群と対照群の存在量に全体的な有意差は認められなかった（図2i、上）。PSコホートでは、抗生物質を投与された乳児は、3週間にわたって腸球菌と連鎖球菌が減少し、クチバクテリウム、エシェリヒア、乳酸桿菌の量が有意に多かった（図2i、下）。

レジストームに対する抗生物質の影響をさらに理解するために、各コホート内の抗生物質群と対照群のARGプロファイルを比較した。いずれのコホートにおいても、ARG数に有意差は認められなかった（図2j）。しかし、NPSコホートでは、抗生物質投与群と対照群の乳児の両方が、PSコホートよりもARG数が多かったことから、早産児の腸内におけるビフィズス菌のARG抑制効果の可能性が示唆された（図2k）。

また、早産児におけるマイクロバイオームの多様性がARGの存在量と相関しているかどうかも評価した。統計学的検定により、マイクロバイオームの多様性の増加とARG量との間には、弱いながらも統計学的に有意な正の相関があることが示された（相関係数R=0.25；P=0.00074；図2l）。注目すべきは、コリスチン耐性遺伝子であるmcr-9.1が、早産児の腸内マイクロバイオームにおいて2011～2012年頃に100％の塩基配列同一性で検出されたことである（図2m）。

菌株レベルの腸内細菌由来レジストーム解析
菌株レベルの腸内細菌レジストームを調べるために、ゲノム分解メタゲノミクスを適用し、ショットガンメタゲノム配列から322の高品質なメタゲノム集合ゲノム（MAG）を回収し、早産児の糞便サンプルから培養した89の新規分離ゲノムを組み込んだ。これらのゲノムは合わせて27属47種に相当する。

これらの細菌ゲノムについて耐性遺伝子検索と統計解析を行い、早産児腸管レジストームの特徴を明らかにした。

MAGを含むすべてのゲノムを99.9％ANIの菌株レベルカットオフで重複除去した結果、さらなるレジストーム解析のために195の代表的ゲノムを得た（図3a）。細菌株全体で合計10種類のARGが同定され（図3a）、Enterococcus属、Escherichia属、Klebsiella属、Staphylococcus属が耐性菌の上位4属として同定され、それぞれ株当たりのARG数が他の属に比べて有意に多かった（図3b）。これらの属をさらに検討した結果、NPSと比較してPSコホートでは、腸球菌属、大腸菌属、クレブシエラ属のARG数が低い傾向が認められたが、その差は統計学的に有意ではなかった（図3c）。

図3.
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図3.
a、臨床メタデータ、ARGプロファイル、および遺伝子数で整列された細菌株（n=195）の株レベルの近傍結合木（分離株ゲノムと、合計411個の細菌ゲノムから得られたメタゲノム集合ゲノム（MAG）の両方を含む）。統計解析はKruskal Wallis検定とpost-hoc Dunn検定（FDR調整）を用いて行った。有意性はBifidobacteriumと比較した。**c、エンテロコッカス属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、スタフィロコッカス属を含む薬剤耐性病原細菌の上位4属間の株当たりARG数の比較。コホート間の統計解析は、両側Wilcoxon検定を用いて行った。 d, 薬剤耐性病原細菌の上位4属、Enterococcus属、Escherichia属、Klebsiella属、Staphylococcus属のゲノム（n=205）の多剤耐性排出ポンププロファイル（n=20）。 e, （上）NPSとPSの両コホートにおけるゲノムあたりのARGタイプの割合（n=205）。(下）NPSとPSの両コホートにおけるMDR/非MDRゲノムの割合。MDRは、予測されるARGタイプが3つ以上（3クラス以上の抗生物質に対して耐性）であると定義される。統計学的検定はFisher Exact検定を用いて行った。F****P<0.0001。 f, 主要な病原体ゲノム（n=193）のMLST（Multi-locus Sequence Typing）解析（上位4つの病原体属Enterococcus属、Staphylococcus属、Escherichia属、Klebsiella属を含む）。Klebsiella属の表面抗原タイピング（Kaptive）を追加。

これらの耐性属の多剤耐性（MDR）排出ポンプをより詳細に解析した結果、複数の排出ポンプをコードしていることが明らかになり、エシェリヒア属とクレブシエラ属の株が最も多く（n=13）、次いでスタフィロコッカス属（n=7）、エンテロコッカス属（n=6）であった（図3d）。さらにARG型解析により、β-ラクタマーゼ耐性遺伝子がエシェリヒア、クレブシエラ、ブドウ球菌の各菌株に広く存在することが示され、アミノグリコシド耐性遺伝子はNPS腸球菌株に多く存在した（図3e、上）。MDR能力を解析した結果、腸球菌属はこれらの耐性属の中で最も高い順位を示し、その半数以上の菌株が3種類以上の抗生物質に耐性を示すARGを保有していた。注目すべきことに、PSに関連したKlebsiella属（n=5）およびEscherichia属（n=12）の菌株はいずれもMDRではなかったが、NPSに関連したEscherichia属（n=31）の菌株の47.6％がMDRの特徴を示した（図3e、下）。

臨床的関連性を評価するため、多座配列タイピング（MLST）33スキームを用いて、大腸菌、クレブシエラ属菌、腸球菌、ブドウ球菌の合計193の主要耐性病原体ゲノムを配列タイピングした（図3f）。優勢な配列型（ST）は、大腸菌ではST1193、ST127、ST394、ST681であり、肺炎桿菌ではST432が顕著であった。腸球菌では12のSTが同定され、うち6つは新規のSTの可能性があった。S. epidermidisでは14のSTが同定され、そのうち10ゲノムでST32が同定され、12の潜在的新規STが同定された。特に注目すべきは、S. haemolyticusの主要なSTで、以前NICUに関連していたメチシリン耐性ST134と、小児に関連し、しばしばメチシリンに耐性を示すST49が含まれていたことである35,36。Klebsiellaの表面抗原タイピングも行い、KL10（n=10）が最も一般的なカプセル（K）型であり、O1/O2v1（n=15）がKlebsiellaゲノムで最も一般的なLPS（O）型であることを同定した（図3f、右）。

菌株レベルのモビローム解析とNICU内での菌株の循環
プラスミドのキャリッジがレジストームに関連しているかどうかを調べるために、195の菌株レベルの細菌ゲノムでプラスミドレプリコン検索を行った（図4a）。PSコホートとNPSコホートの比較から、NPSコホートではプラスミド数が有意に多いことが明らかになった（図4b）。モビロームにおける抗生物質の役割をさらに評価するため、両コホートにおける抗生物質投与群と対照群のプラスミド数を比較した。抗生物質処理株の方がプラスミド数が多かったが、その差はどちらのコホートでも（図4c）、また全体的な比較でも（図4d）、統計的に有意ではなかった。

図4.
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図4.
a、早産児腸内関連細菌株（n=195）のプラスミドレプリコンプロファイルを株レベルの近隣結合木で整列させたもの。プラスミド数とARG数の比較も行った。統計検定はウィルコクソン検定を用いて行った。*c,腸内細菌叢プラスミド数の比較 抗生物質vsコントロール、コホートNPSvsPSで層別化。ns: 無意義。 d: すべての早産児メタゲノムサンプルにおける、抗生物質とコントロールの腸内マイクロバイオームプラスミド数の比較。散布図は抗生物質の使用量によって色分けされ、紫色は抗生物質が投与された乳児、白色は未投与の乳児を示す。RはKendall順位相関係数を表す。 fは、抗生物質投与群と対照群間のゲノムあたりのHGTイベント（n=411）。統計解析はウィルコクソン検定を用いて行った。**g, 1株あたりのプラスミドレプリコン数の上位10属間の比較。統計解析はKruskal Wallis検定とpost-hoc Dunn検定（FDR調整）を用いて行った。有意性はBifidobacteriumと比較した。P<0.05、 P<0.0001. h, NICUの特定の早産児における腸球菌の伝播の可能性。菌株レベルのカットオフANI>99.9％。

次に、プラスミド・レプリコン数とARG数の相関を調べたところ、弱い正の相関が認められた（R=0.33；P=0.00001；図4e）。特に、抗生物質投与群では、対照群と比較して、潜在的な水平遺伝子転移の頻度が有意に高かった（図4f）。主要な病原細菌の属の中で、腸球菌、大腸菌、ブドウ球菌がプラスミドキャリアの上位に同定され、腸球菌はARGとプラスミドキャリアの両方で最高位であった（図4g）。MDR病原体としての腸球菌の重要性と、早産児におけるその相対的な控えめさを考慮し、両コホートにおける乳児の腸球菌伝播の追跡に焦点を当てた。

株レベルのカットオフ99.9％における平均塩基同一性（ANI）解析の結果、乳児の間で6株の腸球菌が循環しており、A病院では4組（うち1組は双子）の乳児（無関係）が、B病院では1組が同一株を保有していた（図4h）。さらにB病院では、血縁関係のない乳児3人が同じ腸球菌株でコロニー形成されており、このMDR病原体の院内伝播の可能性が明らかになった。

多剤耐性（MDR）病原体としてのエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の臨床的重要性と、乳児のマイクロバイオームにおける研究が比較的限られていることから、乳児の腸内でエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）株間にARGをコードするプラスミドが
移行する可能性があると仮定した。これを検証するために、早産児由来の2つのドナー株と、プラスミドを持たないゲンタマイシン感受性のレシピエント株（64/3）を用いてプラスミド転移実験を行った（図5a）。新生児の腸内環境をシミュレートするために、培養液として腸球菌を含まない乳児糞便スラリーを用いた腸内モデルを利用した（図4b）。24時間培養後、選択培地で腸球菌のコロニーを分離し、WGSを実施した。ゲノム解析の結果、アミノグリコシド耐性遺伝子aac6-aph2をコードする約137kbのメガプラスミドが、プラスミドを含まないレシピエント株64/3（形質転換体D1およびD3）に導入され、これらの株にゲンタマイシン耐性が付与されたことが明らかになった（図5b、5cおよび5d）。

図5.
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Fig.
図5. 腸球菌におけるゲンタマイシン耐性プラスミド導入試験
a. 24ウェルプレートをテンプレートとした試験デザインによるin vitro試験のワークフローと関連解析の概略図。単離株ゲノム間の関連性を反映するために、ゲノム中に予測されるプラスミドレプリコンと、計算されたゲノムサイズとを整列させた近傍結合樹を構築した。ボックス内ボックス（左上）は、腸内モデル実験に使用した乳児糞便スラリーのショットガンメタゲノムコンテンツ（微生物分類群）である。*c,代表的なドナー株B1、レシピエント（形質転換）株D1-1、D3-1から計算で抽出した抗生物質耐性遺伝子aac-aph2の比較。 d,ゲンタマイシン耐性遺伝子aac6- aph2をコードする完全なコンティグ配列の比較で、全体またはプラスミドを含む潜在的な移動性遺伝要素の一部であると予測される。

考察
本研究では、ゲノム分解メタゲノミクスを用いて、新生児室における生後3週間の早産児のレジストームとマイクロバイオームを解析し、抗生物質、プロバイオティクス、HGTが腸内マイクロバイオームに及ぼす複雑な影響を明らかにした。我々の知見は、B. bifidumとL. acidophilusによるプロバイオティクスの補充が、有益な微生物群をサポートするだけでなく、MDR菌と全体的なARGキャリッジを減少させる役割を果たすことを示唆している。

この研究の長所のひとつは、抗生物質を投与されなかったPS期とNPS期の乳児が含まれていることである。これは、これらのリスクの高い患者における抗生物質の処方率（英国では超早産児から極早産児で55～87％）37を考慮すると珍しいことであり、早産児の腸内細菌叢とレジストームに対するプロバイオティクスと抗生物質の特異的な影響の解明に着手することができる。より大規模な観察研究（n=234）から慎重に選択されたこのサブコホート（n=34）は、食事と出生様式をマッチさせた早産児（妊娠33週未満）のみで構成されており、比較的均一なベースラインを提供している8。さらに、経験的抗生物質療法が実施されたケースでは、抗生物質の期間と種類（ベンジルペニシリンおよび/またはゲンタマイシン、英国のNICUで最も頻繁に処方される抗生物質37）は厳密に制限され、1週間未満に標準化された。このような曝露にもかかわらず、PSとNPSの両コホートにおいて、マイクロバイオームの多様性全体への影響は最小であることが観察され、短期間の抗生物質曝露が早産児のマイクロバイオームの多様性に直ちに影響を与えない可能性が示唆された。しかし、3週間という限られたサンプリング期間であったため、抗生物質曝露によって誘発される長期的な変化を捉えることができなかった可能性がある。この観察結果は、抗生物質が早期のマイクロバイオーム構成に与える直接的な影響を最小限に抑えたと報告した先行研究と一致するが、一方で、より顕著な変化が長期にわたって現れる可能性を示している38。

しかし、抗生物質の投与期間は平均3日間（中央値）に限定されたとはいえ、最初の1週間でKlebsiella属やEnterococcus属など、病原性を持つ可能性のある特定の属の増殖を促進し、これらの菌株の一部は2週目まで持続することで、マイクロバイオーム構成に特異的な影響を与えた。エンテロバクター（Enterobacter）属は、本研究では複数のARGとの関連性が低かったが、NPSコホートでは抗生物質曝露後に減少が観察され、抗生物質レジメンに対する潜在的感受性を示していた。対照的に、ビフィドバクテリウムは（特にPSコホートにおいて）、Enterococcus菌量の顕著な減少によって証明されるように、防御効果を発揮したようであった。この減少は、ビフィズス菌がヒトの母乳で育った腸内環境において、特殊なHMOの利用によって促進される炭素源の枯渇、およびニッチpHの低下に起因する可能性があり、病原菌のコロニー形成と増殖を阻害する可能性がある39,40。

全体として、我々は早産児の腸内細菌叢に多様なARGを同定し、アミノグリコシド、マクロライド-リンコサミド-ストレプトグラミン（MLS）、β-ラクタマーゼ、トリメトプリム、テトラサイクリンに対する耐性をコードする遺伝子を主要なARGクラスとした。これらのARGクラスは、NICUにおいて臨床的に重要である。NICUでは、アミノグリコシド系薬剤やβ-ラクタム系薬剤、例えばゲンタマイシンやベンジルペニシリンなどが、感染の可能性を考慮して出生時から経験的に投与されることが多い8,37。これらのARGの存在は、この脆弱な集団における抗生物質の有効性を低下させる可能性を強調し、NICU環境における抗生物質スチュワードシップを注意深く改善する必要性を強調している。幅広い抗生物質を排出することで多剤耐性を促進するエフラックスポンプ41も、特にエシェリヒア属とクレブシエラ属の複数の菌株に広くみられ、早産児のこれらの病原体による感染症の治療選択肢をさらに複雑にしていた。注目すべきは、NPS乳児の腸内細菌叢から、最後の砦である抗生物質コリスチンに対する耐性を付与するmcr-9.1遺伝子が検出されたことである。この遺伝子は大腸菌68A株で発見されたホモログと同一であったが、ショートリード配列決定データには限界があり、単一のコンティグとしてしか現れなかったため、我々のコホート内の特定の細菌種に明確に結びつけることはできなかった（図2m）。mcr-9.1遺伝子は201942年にSalmonella entericaで最初に同定され、コリスチンに対する表現型耐性を付与した。我々のコホートにおけるmcr-9.1の存在は、早産児の腸内細菌叢におけるコリスチン耐性遺伝子の無言の循環について懸念を抱かせる。

また、NPSコホートでは経時的にARG量が増加していることから、ARGの獲得は（少なくとも短期間のサンプリング期間を通じて）乳児の腸内という閉鎖生態系におけるARGの進化というよりも、病院由来と思われる新規細菌の導入によってもたらされている可能性が示唆された。このことはさらに、菌株レベルの解析で、腸球菌のような特定の病原体が複数の時点にわたって持続していることが確認されたことからも裏付けられる。この持続性は、同一病院内の乳児間で共有株が検出されたことと合わせて、MDR菌の院内伝播の可能性が高いことを示唆している。これらの知見は、腸球菌、大腸菌、およびクレブシエラが一般的な院内感染病原体であり、しばしば早産児の晩期発症感染症に関与している他のNICUでの研究報告と一致している32,44,45。実際、新生児感染症に関連する特定のSTとして、大腸菌ST119346株、ST73株、ST9546株47株、肺炎桿菌ST43248株などが同定されたが、これらは典型的な薬剤耐性株であり、臨床的に重要である。本コホートで顕著なARG保菌者として頻繁に同定された腸球菌は、これまでに報告されていない新規のものを含む複数のSTを示し、ある菌株は同一病院内の異なる乳児間で共有されていた。このような無関係な乳児間での共有は、NICUにおける遅発性感染症の一般的な原因である腸球菌の院内伝播の概念をさらに裏付けるものである。このように、プロバイオティクスがないにもかかわらず、院内感染したARG保有菌が頻繁にコロニー形成されることは、NICUにおける継続的なサーベイランスと感染制御の重要性を強調している。

プラスミド、特にMDRプラスミドを保有する菌株が高い頻度で認められたことは、これらの菌株が耐性遺伝子のリザーバーとして機能し、HGTを介して同種および他属の非MR菌株に伝播する可能性があることを示しており、特に懸念すべきことである。注目すべきは、抗生物質投与によって新生児腸内におけるLGTの有病率が高くなることである。この圧力は、ARGを持つ移動性遺伝要素の保持と拡散を促進し、抗生物質投与児におけるHGT動態を増加させるようである。実際、E. faecium内でのプラスミド転移実験により、新生児腸内におけるプラスミドを介したARG転移の重要性がさらに強調された。アミノグリコシド耐性遺伝子（aac6-aph2）を持つ約137kbのメガプラスミドが、プラスミドを持たないゲンタマイシン感受性のレシピエント株への転移に成功し、表現型ゲンタマイシン耐性を付与したことが実証されたからである。ゲノム解析の結果、ARGの存在量全体とプラスミドレプリコン数との間には弱い相関しか認められなかったことから、プラスミドだけがARGの拡散に寄与しているわけではなく、別のHGT経路がARGの拡散を促進している可能性が高いことが示唆された49。

本研究の高解像度シーケンスデータは、早産児のマイクロバイオームの発達にプロバイオティクスの補充が有益な影響を与えることを強調した。PS乳幼児はNPS乳幼児と比較して、乳児関連ビフィドバクテリウム種、特にB. breveとB. longum subsp. プロバイオティクスのB. bifidumは、おそらくHMO53,54の交差摂食を通じてこれらの有益な種の定着を促進し、より経口乳児に近いマイクロバイオーム組成を促進した。実際、複数のビフィズス菌種が早期から豊富に存在することで、病原菌のコロニー形成抵抗性が著しく高まったようであり、これはPSコホート内のクレブシエラや大腸菌などの病原菌の存在が限られていることからも明らかである。

先行研究と一致して、PS群の乳児のARG保有数はNPS群の乳児よりも有意に少なかった29。ビフィズス菌の補充は、乳児の腸内細菌叢におけるARG保有量の低下と関連しているが、これはおそらくARGに富む病原細菌の競合的排除によるものであろう55,56。我々の研究では、PSコホートにおいてビフィズス菌の存在量が多いことは、特にエンテロコッカス（Enterococcus）、エシェリヒア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）などのMDR病原体とよく関連する属において、ARG負荷の減少と相関していた。注目すべきは、PS群の乳児のエシェリヒア属とクレブシエラ属のゲノムはMDRの特徴を示さなかったことで、早産児の腸内におけるMDR病原体の蔓延を緩和するプロバイオティクスの補充の可能性が強調された。しかしながら、プラスミド解析の結果、NPSコホートではPS乳児に比べて多くのプラスミドが検出されたことから、プロバイオティクスはARGを運ぶプラスミドプールを減少させ、ひいてはARGリザーバーを制限するのに役立つ可能性が示唆された。ビフィズス菌のようなプロバイオティクスは有益なマイクロバイオーム構成をサポートし、ARGリッチな病原性細菌を抑制する可能性はあるが、HGTやプラスミド転移を必ずしも防止できるわけではなく、特に抗生物質に暴露された腸内ではHGTがより一般的になる可能性がある。このことは、微生物のコロニー形成におけるプロバイオティクスの役割だけでなく、特に抗生物質が多用される環境におけるHGT動態への潜在的影響についても評価するためのさらなる研究の必要性を強調している。

最後に、本研究の限界として、サンプリング期間が比較的短かったため、マイクロバイオームの発達に対する抗生物質やプロバイオティクスの長期的な影響を捉えることができなかったことが挙げられる。

さらに、本研究では2つの別々の病院からサンプルを採取したため、ベースラインとプロバイオティクスを補充した状態を調べることができたが、診療の地域差による交絡因子の可能性は避けられない。今後、サンプルサイズを大きくし、サンプリング期間を延長し、多施設を対象とした研究を行うことで、抗生物質、プロバイオティクス、新生児マイクロバイオーム間の動的相互作用について、より包括的な知見を得ることができるであろう。

結論として、我々の調査は早産児腸内レジストームとマイクロバイオームの包括的な概観を提供し、ARG有病率と病原体負荷の低減におけるプロバイオティクス補充剤の役割を実証した。しかしながら、ビフィドバクテリウムが優占する生態系においてさえも、プラスミド保有率が高くARG移行能が実証された腸球菌のようなMDR病原体が残存していることから、MDR菌によるコロニー形成とその後の感染リスクを最小化するために、NICUにおける継続的なサーベイランスと的を絞った介入戦略の必要性が強調された。本研究で得られた知見は、新生児マイクロバイオームの形成における抗生物質、プロバイオティクス、HGTの複雑な相互作用を浮き彫りにし、脆弱な早産児集団における抗菌薬スチュワードシップと感染制御におけるプロバイオティクスの役割に関するさらなる研究のための基盤を提供するものである。

方法
コホートとサンプルの選択
既報の観察コホート研究8から、合計93サンプルのサブセットを選択した。本研究のすべてのNICUは、哺乳、抗生物質の処方、予防的抗真菌薬の使用について同様のプロトコルを適用していた。PSコホートでは、すべてのVLBW児に経口プロバイオティクス（Infloran®、Desma Healthcare、スイス）を1日2回（出生から月経後34週まで）定期的に処方したが、NPSコホートではプロバイオティクスは処方しなかった。プロバイオティクスのサプリメントには、ビフィズス菌（1 x 109 cfu）と乳酸菌（1 x 109 cfu）が含まれていた。両コホート（NPSとPS）からのサンプルは、以下の基準に基づいて本研究のために選択された： 妊娠週数34週未満のVLBW早産児、抗生物質ベンジルペニシリンおよび/またはゲンタマイシンのみを投与された乳児、および抗生物質を投与されていない年齢をマッチさせた乳児、両方のコホートにおいて乳児はすべて母乳および/またはドナー母乳で育てられた。合計34人のVLBW早産児がこの研究のために選ばれた。1週目、2週目、3週目（NICU滞在の最初の3週間）に縦断的に採取された糞便サンプルが本研究に採用された（補足表1）。

コホートの特徴
この研究は、以前に発表されたオリジナルの観察縦断研究8を「対照」サブ研究として行ったものである。コホートの特徴の要約を表1に示す。プラスミド導入実験用の糞便スラリーは、もともとPEARL研究57で募集した5人の乳児から採取したものである。

倫理的承認
Norfolk and Norwich University Hospital（BAMBI研究）からの糞便サンプル採取は、University of East Anglia（UEA）のFaculty of Medical and Health Sciences Ethics Committeeの承認を得て、UEA Biorepository（ライセンス番号：11208）が定めたプロトコールに従った。糞便サンプル採取 Imperial Healthcare NICU（NeoM研究）は、West London Research Ethics Committee（REC）により、REC承認参照番号10/H0711/39で承認された。すべての場合において、医師と看護師が両親の書面による同意の後、乳児を募集した。PEARL研究は、Quadram Institute BioscienceのHuman Research Governance CommitteeおよびLondon-Dulwich Research Ethics Committee（参照番号18/LO/1703）の審査と合意を得ており、Human Research Authorityから書面による倫理的承認を得ている。IRASプロジェクトID番号24188057。

ゲノム DNA 抽出とショットガン・メタゲノミック・シーケンシング
FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals社製）を使用し、FastPrep tissue homogeniser（MP Biomedicals社製）で3分間のビーズビートを行い、メーカーの指示に従って乳児の糞便からゲノム DNA を抽出した。ゲノムDNA濃度は、Qubit 2.0蛍光光度計（Invitrogen）を用いて定量した。DNAサンプルはその後、Wellcome Trust Sanger Instituteで実施された、125bpペアエンドリード（FASTQ）を生成するためのIllumina HiSeq 2500でのShotgun Metagenomic Sequencingの前に、確立されたIlluminaペアエンドライブラリー調製に供された（補足表2）。

細菌分離作業、DNA抽出
早産児の糞便サンプルに存在する最も豊富な分類群（ビフィドバクテリウム属、腸球菌属、ブドウ球菌属、クレブシエラ属、エシェリヒア属）を分離するために、標的細菌分離作業を実施した。簡単に説明すると、25-50mgの糞便サンプルを5mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でボルテックスしながらホモジナイズした。その後、ホモジネートをPBSで10-4に連続希釈し、各100mlのアリコートをそれぞれ選択寒天培地にプレーティングした： MacConkey（Oxoid；EscherichiaおよびKlebsiellaを含むグラム陰性菌をターゲット）、50mg/Lムピロシン（Oxoid；Bifidobacteriumをターゲット）を含むDe Man-Rogosa-Sharpe（MRS；Difco）、Baird-Parker（Oxoid；Staphylococcusをターゲット）およびSlanetz and Bartley（Oxoid；Enterococcusをターゲット）。その後、寒天プレートを好気的（MacConkey、Baird-Parker、Slanetz and Bartley）および嫌気的（MRS寒天のみ）に37℃で3日間培養した。次に、各寒天平板から5個のコロニーを摘出し、新たに調製した寒天平板に3回連続して再静置し、純粋な分離株を得た。

ゲノムDNA抽出の前に、分離した細菌を適切な培地で一晩培養した。DNA抽出は、以前に記載されたようにフェノール-クロロホルム抽出法を用いて行った58。簡単に説明すると、PBSで洗浄した細菌細胞ペレットを、pH8.0の10 mM Trisと1 mM EDTA中の25%スクロース2 mlに再懸濁し、次いで100 mg ml-1 (Roche)のリゾチーム50 μlを用いて酵素溶解ステップを行った。次に、20 mg ml-1 (Roche)のProteinase K 100μl、10 mg ml-1 (Roche)のRNase A 30μl、pH 8.0の0.5 M EDTA 400μl、および10% Sarkosyl NL30 (Thermo Fisher Scientific)250μlを、溶解した懸濁液に順次添加した。懸濁液を氷上で1時間インキュベートした後、50℃の水浴で一晩静置した。翌日、15mlのゲルロックチューブ（QIAGEN）を用いて、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（Merck）抽出を3回行い、続いてクロロホルム-イソアミルアルコール（Merck）抽出を行った後、エタノール沈殿工程と70％エタノールによる細胞洗浄を10分間（2回）行った。DNAペレットは一晩風乾した後、300μlの滅菌純水に懸濁し、-80℃のフリーザーに保存した。

細菌純分離株全ゲノムシーケンス（WGS）およびゲノムアセンブリ
各細菌純分離株のWGSは、Quadram Institute（英国ノリッチ）のIllumina NextSeq 500で実施し、151bpペアエンドリードを作成した。生配列リード（FASTQ）をまずfastp v0.20.059で品質フィルター（-q 20）した後、de novoゲノムアセンブルの前に、de novoゲノムアセンブラSPAdes v3.11.161、Bowtie2 v2.3.4.162、SAMtools v1.763、および配列研磨ソフトウェアPilon v1.2264を含むデフォルトパラメータでゲノムアセンブラ最適化ツールUnicycler v0.4.9b60を使用した。長さが500 bp未満のコンティグは、その後の解析の前に各ドラフトゲノムアセンブリから破棄された。すべてのドラフトゲノムアセンブリは、CheckM v1.1.365による配列汚染チェックを受け、汚染（配列汚染>5%）および不完全（ゲノム完全性<90%）なゲノムアセンブリは以降の解析から除外された（n=1）。gtdb-tk v1.5.166を使用して分類学的割り当て（種レベルの同定）を行った。ゲノムアセンブリー統計はsequence-stats v1.067で作成し、ゲノムはProkka v1.14.668で解析した（補足表3）。

メタゲノムアセンブルゲノムの回収
ショットガンメタゲノム生リード（FASTQ）は、まずfastp v0.20.059 (-q 20)を用いてトリミング、アダプター除去、クオリティフィルターを行った。その後、https://benlangmead.github.io/aws-indexes/bowtie から取得したヒトゲノム（GRCh38.p13 - ALTなし）bowtie2インデックスファイルを用いて、KneadData v0.10.0により宿主関連配列を除去し（オプション --bypass- trim および -reorder）、純粋な細菌配列からなるクリーンなFASTQリードを作成した。これらのメタゲノムリードは、Metagenome-Assembled Genomes (MAGs)の再構成の前に、MEGAHIT v1.2.969でco-assemblingされた。次に、MetaWRAP v1.3.270を使用して、メタゲノムCo-assembliesとメタゲノムクリーンリードに基づいてMAGを抽出し、MetaBAT v2.12.171、MaxBin v2.2.672、CONCOCT v1.1.073のサブモジュールmetawrap binningを用いてビニングした。

その後、サブモジュールmetawrap bin_refinementを使用してMAGを精製し、checkm v1.1.365を経由して、各サンプルから完全度が90%以上、コンタミネーションが5%未満の高品質ビン（MAG）を選択した。すべてのMAGは、モジュールgtdbtk classify_wfを介してgtdb-tk v1.5.166を使用して分類学的にランク付けされた。合計411の高品質（完全度>90%、コンタミネーション<5%）のMAG（n=322）および分離株ゲノム（n=89）が、その後の解析のために回収された。次に、dRep v3.2.274を用い、ANI 99.9%を株レベルの推論カットオフとして、すべてのMAGと分離ゲノムをデリプリケートした（n=195）。

糞便メタゲノムの分類学的プロファイリング
上記のようにクオリティフィルタリングステップを行った後、fastp v0.20.059 (-q 20)を用いてショットガンメタゲノム生リード(FASTQ)のクオリティフィルタリングを行い、KneadDataを用いて宿主関連配列を除去した。精製メタゲノムリードの分類学的割り当てにはKraken v2.1.275を利用し（Kraken2 standard Refseq indexes retrieved from https://benlangmead.github.io/aws-indexes/k2, May 2021）、信頼度は0.1に設定した。その後、Bracken v2.6.276を導入し、Kraken2の出力から属レベルおよび種レベルの分類群の相対存在量を再推定した（-tは偽陽性を減らすために推奨される10に設定）。データを視覚化する目的で単純化するために、全サンプルにわたって1000リード未満の最小属は、さらなる解析の前に除去された（全サンプルにわたって平均520,000属リードの結果）。全サンプルにわたって2%未満のマイナー属は、ライブラリggplot278を使用してR77でデータを可視化する前に、表現を単純化するために「その他」に分類された。

系統的関連性の推定
Mashtree v1.2.079を用い、100ブートストラップレプリカ、オプション-mindepth 0で、411ゲノム（MAGを含む）からなるMash-距離配列樹を作成した。その後、距離木を中点ルートし、iTOL v680で可視化した。

メタゲノム機能プロファイリング
前項の方法でフィルターしたショットガンメタゲノム生リード（fastp v0.20.0を使用）を、Humann v3.0.0およびMetaphlan v3.0.13を実行する前に、サンプルごとに1つのFASTQファイルに連結し、CHOCOPhlAn_201901のmetaphlanデータベース（bowtie2を使用して構築）に基づき、https://zenodo.org/record/3957592#.YSZDVS1Q3_o。パスアバンダンス出力ファイルは正規化され、マイクロバイオームの機能性の可視化に使用された。

抗生物質耐性遺伝子、Multi-Locus Sequencing Typing (MLST)、プラスミドレプリコン すべての配列データに対する抗生物質耐性遺伝子(ARGs)配列検索は、ABRicate v1.0.1を用い、-minid=95、-mincov=90のオプションをつけて、塩基配列データベースARG-ANNOT81 NT v6(https://www.mediterranee-infection.com/acces-ressources/base-de-donnees/arg-annot-2/)に基づき、ResFinder v4.082(取得したARGsのみ)データベースに対して個別に検証を行った。乳児腸内メタゲノムのレジストーム解析は、各サンプルのメタゲノムコアアセンブリーに対する配列検索により実施し、菌株レベルのレジストーム解析は個々のゲノムアセンブリーに対して実施した。抗生物質クラスはABRicate v1.0.1の出力を用いて、ARG-ANNOTで指定された抗生物質クラスに基づいてソートした。多剤耐性排出ポンプはMETABOLIC v4.083を用いて予測した。

MLSTはmlst v2.19.084を用い、デフォルトパラメータで、オックスフォード大学にあるPubMLST85 typing schemes (https://pubmlst.org/)に対してコンティグファイルをスキャンすることにより予測した。

プラスミドレプリコンは、ABRicate v1.0.186を用い、PlasmidFinder配列データベースv287を経由し、-minid=90および-mincov=90オプションで、個々の株レベルのゲノムアセンブリー上で予測した。プラスミドレプリコンは、iTOL v680を使用して可視化する前に、それぞれincファミリーとrepグループという2つの主要なグループに再分類された。

Klebsiella surface antigen typing
Kleborate v2.3.288を-allフラグ付きで起動し、デフォルトパラメーターを用いて、カプセル抗原（K）およびLPS抗原（O）遺伝子座をタイピングした。

水平遺伝子導入解析
Waafle v1.089をデフォルトのパラメータで使用し、脱複製MAGおよび全ゲノム配列における水平遺伝子導入の有無を調べた。抗生物質陽性(n=237)と抗生物質陰性(n=174)のコホート間の統計的有意性を決定するために、サンプルサイズを正規化するためにランダム並べ替え検定を行った。ここで、いずれかの集団からWaafleによって予測されたLGT事象の数をランダムに100回サブサンプリングし、これらの値をMann Whitney統計学的検定にかけ、Graphpad Prism v10を用いて平均化した。

ex vivo結腸モデルを用いた腸球菌関連プラスミド転移研究
Enterococcus faecium ARMA59およびARMA73を、Baby-Associated Microbiota of the Intestine（BAMBI）研究の一部である早産児の便サンプルから分離した。分離株は、腸球菌が暗赤色のコロニーを形成するSlanetz and Bartley培地（Oxoid）を用いて便サンプルから選択的に培養した。コロニーをBrain Heart Infusion寒天培地（Merck）でストリークした後、全ゲノム配列決定に供した。リファンピシンとフシジン酸の両方に高度の耐性を示すプラスミドを持たない派生株であるE. faecium 64/3を、コンジュゲーションアッセイのレシピエント株として利用した。この株はもともと病院患者の便サンプルから分離されたものである90。

Enterococcus faecium ARMA59株とARMA73株が生体外腸管モデル実験のドナー株として使用され、Enterococcus 64/3株がレシピエント株として使用された。ARMA59とARMA73の両菌株は、肝実験の前にゲンタマイシン耐性（>130μg/ml）を確認し、レシピエント株64/3はリファンピシン（>25μg/ml）とフシジン酸（>25μg/ml）に対して表現型的に耐性であった。

次に、選択寒天培地プレートで判定した腸球菌陰性の乳児の便検体（PEARL研究の乳児5名）を用いて糞便スラリーを調製した。便サンプル（1,965 mg）を7 mlの還元PBSと混合し、大腸モデル実験用の糞便スラリーとした。大腸培地は、ビタミン溶液を添加したわれわれの以前の研究に基づいて調製した91。M1（500ml）、M2（100ml）、M3（100ml）、M4（100ml）、M5（200ml）、M6（200ml）の6種類の培地を無菌容器中で無菌的に混合した。さらに、牛乳200mlとビタミンミックス（50ml；パントテン酸10mg/L、ニコチン酸アミド5mg/L、チアミン4mg/L、ビオチン2mg/L、ビタミンB12 0.5mg/L、メナジオン1mg/L、p-アミノ安息香酸5mg/L）を加えて総量を2000mlとし、最終総量が最大700ml（各培地または添加物）になるように調整した。これらのコロン培地をpH6.8に調整した。

細菌株調製のため、凍結した細菌ストックをBrain Heart Infusion（BHI）寒天培地に37℃で24時間嫌気的にプレーティングし、続いて5mlのBHIブロスにシングルコロニーを37℃で一晩（16時間）嫌気的に接種した。次に、培養物をホモジナイズし、10mlの大腸培地（1：50希釈に相当）と混合（200μl）し、嫌気的に37℃で一晩培養した。次に培養液を2回洗浄し（PBS＋3％システイン）、ペレット化した。

実験に先立ち、糞便スラリーは、培養（Slanetz and Bartley寒天培地）と全ゲノムシークエンシングの両方のアプローチにより、腸球菌を含まないことが決定された。糞便スラリーのDNA抽出は、FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）を用いて行った。その後、ゲノムDNAをIllumina NovaSeq Xによる全ゲノムシーケンスに供し、151bpのペアエンドリードを作成した。生のシーケンスリード（FASTQ）は、メタゲノム配列解析の前のセクションで述べたように処理した。Kraken v2.1.275 (Kraken2 standardDB; --confidence 0.1)を用いてシーケンスリードを分類し、Bracken v2.876 (-t 10)でさらに分類する前に、まずfastp v0.20.0で生シーケンスを品質フィルターした。

ex vivo 結腸モデルをセットアップするために、ヒト遠位結腸92 をモデル化する micro-Matrix 発酵システム（Applikon Biotechnology）を用いた。このシステムでは、バッチ発酵に24ウェルプレートを利用した。24ウェルプレートには4つの条件が設定された： 1) ドナーなし、レシピエントなし（コントロール）、2) ドナーあり、レシピエントなし、3) ドナーなし、レシピエントのみ、4) ドナー株とレシピエント株。各ウェルには総量5mlを使用した（スラリー26.6μl、ドナー株接種液100μl、レシピエント株接種液200μl、大腸培地ネガティブコントロール100/200μlに依存、大腸培地4.67ml）。大腸モデルの基本パラメータは pH6.8、温度 37℃、実験時間 24 時間とした。

実験後、4つの条件から得られたサンプルを、適切な抗生物質を添加したSlanetz-Bartley寒天プレートに再度静置した： 1）抗生物質無添加、2）130μg/mlゲンタマイシン、3）25μg/mlリファンピシン＋25μg/mlフシジン酸、4）130μg/mlゲンタマイシン＋25μg/mlリファンピシン＋25μg/mlフシジン酸。37℃で48時間嫌気培養した後、純粋なコロニーを選択し、培地ブロスで培養してDNA抽出に十分な細菌ペレットを得た。各単離株のゲノムDNA抽出は、FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）を用い、メーカーの指示に従って行った。また、腸球菌の非存在を確認するため、0時間後のウェル内容物をサンプリングし、FastDNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）を用いてDNAを抽出し、ショットガンメタゲノムシークエンシングを行った。

ゲノムDNAをNanopore MinIONプラットフォーム（R10.4.1 flowcell）で全ゲノム配列決定し、Dorado93を介したベースコールでロングリード生配列を作成した。filtlong v0.2.194を用いて生配列をフィルターし、<1000 bpのリードを除去した。フィルターしたリードをFlye v2.995 (--nano-hq -scaffold -g 3.6m)でアセンブルした。その後、Medaka v1.11.396 (medaka_consensus -m r1041_e82_400bps_sup_v4.3.0)を用いてゲノムアセンブリーをポリッシュし、その後の解析に用いる高品質なゲノムアセンブリーを作成した。

また、単離DNAをIllumina NextSeq 2000で全ゲノム配列決定し、151bpペアエンドショートリード（FASTQ）を、前段落に記載したロングリード配列決定と並行して作成した。生リードをまずfastp v0.20.059 (-q 20)でトリミングした後、ゲノムアセンブラーオプティマイザーUnicycler v0.5.060でde novoゲノムアセンブリーをデフォルトパラメータで行い、さらなる解析のためのドラフトゲノムアセンブリーを作成した。

平均ヌクレオチド同一性（ANI）推定と菌株レベルの同定
ゲノムを比較するために、デフォルトパラメータでfastANI v1.3497を用いてANIを計算した。菌株レベルのANIカットオフは99.9％、種レベルのカットオフは95％（種の境界）に設定した。細菌ゲノムを株レベルで分類するために、dRep v3.2.274 (dRep dereplicate -- ignoreGenomeQuality)を99.9% ANI (-sa 0.999)で使用し、類似性の高いゲノムを分離した。

データの可視化
Rライブラリtidyverse v1.3.198、ggplot2 v3.3.578、ggpubr v0.6.099を用い、R v4.1.277で棒グラフ、箱ひげ図、ドットプロット、円グラフ、散布図を作成した。Rライブラリvegan v2.6.2100は、腸内細菌叢（分類学的/機能的プロファイリング）データの非計量多次元尺度法（NMDS）プロットの構築に使用した。コンティグ/遺伝子のゲノム領域の比較は、Rライブラリ genoplotr v0.8.1101またはGenoFig v1.1.1102を用いて行った。

統計
統計検定はRの基本パッケージstats v4.1.277を用い、Wilcoxon検定、Shapiro-Wilk正規性検定などを行い、必要に応じてデータの正規性を検定した。スピアマンの相関検定は、Rライブラリggpubr v0.6.099関数ggscatterhistを用いて実施した。LEfSe103は、Humann3104の機能プロファイリング出力データに対して線形判別分析（LDA）を実行するために使用した。Rライブラリvegan v2.6.2100を用いてメタゲノムデータのシャノン多様性指数を推定した。ゲノム統計量はsequence-stats v1.067で作成した。R library dplyr v1.0.2105はデータハンドリングに頻繁に使用した。コホートの特徴は、Rパッケージrstatix v0.6.0106を用いて、Wilcoxon検定、Studentのt検定、Fisherの正確検定のいずれかを適宜用いて比較した。

データおよびコードの利用可能性
乳幼児糞便サンプルメタゲノムシーケンスのraw readは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)のaccession no. PRJNA1191223。本研究で作成した89株のシーケンス生リードとドラフトゲノムアセンブリーは、それぞれNCBI SRAとGenBankで公開されている（アクセッション番号：PRJNA119225）。PRJNA119225。

腸球菌プラスミド移植研究のロングリードWGSから得られたシーケンス生リードおよびドラフトゲノムアセンブリは、それぞれSRA（シーケンス生リード）およびGenBank（ゲノムアセンブリ）で公開されている（アクセッション番号：PRJNA119226）。PRJNA119226。本研究で腸内メタゲノムサンプルから回収された322のメタゲノム集合ゲノムと関連するRスクリプト（データの可視化と統計解析）はすべてGitHubリポジトリで公開・共有されている。https://github.com/raymondkiu/Infant-Resistome-Study

著者貢献
R.K.、C.A.、L.J.H.が本研究を発案。R.K.、A.A.G.、L.E.L.、C.A.は方法論を提供した。R.K.とE.M.D.はソフトウェアを提供した。L.J.H.とE.M.D.は本研究の妥当性を検証した。R.K.、E.M.D.、A.A.G.、L.E.L.、A.C.、C.A.が正式な分析を行った。R.K.、E.M.D.、A.A.G.、C.A.、A.C.が調査を実施。K.S.、L.E.L.、A.G.S.、P.C.、J.S.K.が資料を提供。R.K.、C.A.およびK.S.はデータのキュレーションを行った。R.K.とL.J.H.は原稿を執筆した。W.vS.、J.S.K.、L.J.H.が研究を監督した。R.K.、A.A.G.、W.vS.、J.S.K.、P.C.およびL.J.H.が原稿を校閲・編集した。R.K.とC.A.はプロジェクトを管理した。J.S.K.とL.J.H.は資金を獲得した。

利益相反
著者らは利益相反がないことを宣言する。