Toll様受容体9の欠損は腸内細菌が関連する全身性慢性炎症を介して破骨細胞性骨量減少を誘発する
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公開日：2022年5月27日
Toll様受容体9の欠損は腸内細菌が関連する全身性慢性炎症を介して破骨細胞性骨量減少を誘発する
Peng Ding, Qiyuan Tan, ...Chen Yao 著者紹介
Bone Research 10巻 記事番号：42 (2022) この記事を引用する
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概要
Toll様受容体（TLR）は炎症において極めて重要な役割を担っており、免疫系と骨格系をつなぐ重要な役割を担っている。TLRの活性化は破骨細胞の分化や骨代謝に影響を与える可能性があるが、TLRが正常な骨リモデリングに必要なのか、またどのように必要なのかは、まだ十分に検討されていない。本研究では、TLR9-/-マウスが低骨量と低グレードの全身性慢性炎症を示すことを初めて示し、これはCD4+T細胞の膨張とTNFα、RANKL、IL1βなどの炎症性サイトカインのレベル上昇によって特徴付けられる。これらのサイトカインのレベル上昇は、破骨細胞形成を著しく促進し、骨損失を誘発する。重要なことは、TLR9の欠失によって腸内細菌叢が変化し、この細菌異常がTLR9-/-マウスで観察される全身性炎症と骨量減少の基礎になっていることです。さらに、単一細胞RNA配列解析により、TLR9-/-マウスの骨髄において骨髄に偏った造血が確認され、造血幹細胞の全身性炎症への適応によって引き起こされると考えられる骨髄造血の増加が、炎症による破骨細胞形成とその後のTLR9-/-マウスの骨量低下に寄与することも決定された。このように、我々の研究は、TLR9シグナルが腸内細菌叢、免疫系、骨を結びつけ、正常な状態での炎症、造血、骨代謝の恒常性維持に重要であるという新しい証拠を提供している。
はじめに
炎症と骨代謝の密接な関係は、古くから知られている。RAや感染症などの炎症性疾患では、活性化したT細胞やマクロファージによって刺激される破骨細胞性骨吸収が骨量減少の主な原因である。活性化T細胞やマクロファージから分泌されるTNFαやIL17などの炎症性サイトカインは、炎症と破骨細胞形成を協調して促進する1。さらに、敗血症による炎症は、骨芽細胞による骨形成を抑制する2。破骨細胞と免疫細胞は、密接に関連しています。破骨細胞は、単球-マクロファージ前駆体の融合により形成される多核細胞であり、単球、マクロファージ、樹状細胞などの自然免疫細胞と、その起源や機能において多くの共通点を有している。骨髄は造血の主要な場であり、造血幹細胞や前駆細胞（HSPC）、成熟免疫細胞（B細胞、マクロファージ、T細胞など）を保有しているため、破骨細胞と免疫細胞は骨髄において同じ微小環境を共有し、互いに影響し合っています。破骨細胞は、抗原の処理、提示、交差提示を行い、T細胞の活性化をもたらすことが分かっている。また、免疫反応に影響を与えるサイトカインや免疫調節因子を産生する。3 相互に、活性化されたT細胞やB細胞は、破骨細胞の分化と活性化を促す重要なシグナルの一つであるRANKLを産生する。さらに、OPG（RANKLのデコイ受容体）はBリンパ球に高発現しており、T細胞はB細胞におけるOPG産生と基礎骨代謝の重要な調節因子です。4 T細胞とB細胞の機能異常によるRANKL/OPG比の不均衡は、HIV感染に伴い、抗レトロウイルス剤の併用療法により引き起こされる骨減少に寄与します5。さらに、免疫細胞から分泌されるTNFα、IL6、IL1βなどの炎症性サイトカインは、関節リウマチ（RA）、炎症性腸疾患（IBD）、HIV感染を含む多くの炎症性疾患において骨量減少につながる強力な促進因子です1,5,6。
RAなどの古典的な炎症性疾患に加えて、低レベルの炎症が加齢や代謝異常による骨量減少に重要な役割を果たすことが観察されています。8 研究では、老化細胞による炎症性セクレトームの産生を阻害することにより、マウスにおける加齢に伴う骨粗鬆症を予防できることが示されています。さらに、腸内細菌叢の変化が炎症を調節し、エストロゲン欠乏症による骨量減少に中心的な役割を果たすことを示唆する証拠が増えています10,11。腸内細菌は、さまざまなメカニズムで骨生理学に影響を与える可能性がありますが、それでも、宿主免疫系の調節は、腸内細菌叢と骨を結びつける重要な経路であると考えられています11。
TLR9は、細菌やウイルスが持つ非メチル化CpG DNAを感知し、免疫細胞によるI型インターフェロン（IFN）や炎症性サイトカインの産生を開始させます13,14。現在、炎症の調節におけるTLR9の役割については議論の余地があります。これまでの研究で、アゴニストによる TLR9 の活性化が、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節炎、血管炎、心筋炎、歯根膜炎などの炎症性疾患を誘発または増強することが分かっています。また、Stanberyら22は、遺伝子変異後のTLR9の活性化異常がIFN-γによる致死的な炎症性疾患を引き起こすことを示しました。しかし、近年、いくつかの疾患モデルにおいて、TLR9が炎症を抑制することを示す証拠が増えつつあり、また、異なるSLEのマウスモデルに基づいて、相反する結果が報告されています。したがって、TLR9が正常な条件下で炎症を抑制することができるかどうかについては、さらなる研究の余地が残されています。
免疫細胞の多くは骨髄に由来しており、骨と免疫の間には密接な相互作用があることが示唆されています。実際、免疫反応や炎症を媒介する役割に加え、TLRは骨代謝を調節することが示されています。TLR1-9 は破骨細胞前駆細胞（OCP）に発現しており、破骨細胞形成に二重 の影響を及ぼします。30 TLR の活性化は、破骨細胞の形成と骨吸収を促進する31 か、 破骨細胞形成を停止する32 かのいずれかを引き起こしますが、破骨細胞における TLR9 の役割も論議されています。TLR9は、RANKLと同様の下流NFκBシグナル経路を示すが、TLR9の活性化では、TRAP+単核細胞の形成のみが誘導され、成熟破骨細胞の形成は見られない。33 In vitro研究では、骨髄由来マクロファージにおいてCpG-ODNでTLR9を活性化するとRANKLによる破骨細胞形成を抑制し、RANKL刺激した破骨細胞前躯体にCpG-ODN処理すると破骨細胞形成を促進した34, 35。破骨細胞におけるTLR9の役割に関するこれまでの研究は、ほとんどが外来性のTLR9リガンドによる活性化を伴うin vitroの実験に基づいていた。しかし、 生理学的条件下で生体内の骨リモデリングを制御する TLR9 の役割については、 ほとんど知られていません。
ここで、TLR9欠損（TLR9-/-）C57BL/6マウスモデルを用いて、我々は初めてTLR9欠損マウスが破骨細胞形成の増加により低い骨量を有することを示した。さらにそのメカニズムを検討した結果、TLR9-/-マウスは低悪性度の全身性炎症を呈しており、この炎症が骨吸収促進サイトカインのアップレギュレーションだけでなく、骨髄に偏った造血を介して破骨細胞性骨量減少に寄与していることを明らかにした。さらに、TLR9-/-マウスの炎症と骨量減少は、腸内細菌叢の変化と関連していることを見いだした。このように、TLR9は生理的条件下で炎症と骨代謝の恒常性を維持する新しい機能を持つことが明らかになった。
研究成果
TLR9-/-マウスは骨量低下と破骨細胞形成の亢進を示す
破骨細胞形成と骨代謝における TLR9 の役割を調べるために、まず C57BL6/J 遺伝子を持つ TLR9-/- (KO) と野生型 (WT, TLR9+/+) マウスの骨量を micro-CT 分析で評価した36, 37。興味深いことに、TLR9-/-マウスは大腿骨遠位部と脊椎骨の両方で海綿骨量が著しく低いことがわかった（図1a-cおよびS1a, b）。皮質骨には両群間に差はなかった（図S1c-f）。また、TLR9-/-マウスは、循環中の骨吸収（CTX）および骨形成（P1NP）マーカーのレベルが上昇しており、TLR9-/-マウスの骨ターンオーバー状態が高いことが示された（図1d）。さらに、組織形態学的解析では、TLR9-/-マウスで破骨細胞数が有意に増加し、骨吸収指数が高いことが示された（図1c、e）。両群間で骨芽細胞数や表面積に有意差はなかったが、ミネラルアポジションレート（MAR）はTLR9-/-マウスで高かった（図S1g-j）。TLR9-/-マウスとWTマウスの頭頂骨芽細胞を用いたリアルタイムPCRでは、AlpとOsxの発現がTLR9-/-群で高かったが、他の骨芽細胞遺伝子には有意差はなかった（図S1k）。また、in vitro骨芽細胞分化後のアルカリホスファターゼ（ALP）アッセイでは、TLR9-/-骨芽細胞でALPがやや高値を示したが、統計学的有意水準には至らなかった（図S1l, m）。
Fig.
図1
TLR9-/-マウスは骨量が少なく、破骨細胞形成が亢進し、全身性炎症を起こしていた。 a TLR9-/-（KO）マウスと野生型（WT）マウスの大腿骨とL3椎骨の代表3D μCT画像。b 大腿骨および L3 椎骨の海綿骨微細構造。骨密度（BMD）、組織体積あたりの骨量（BV/TV）、海綿体数（Tb. N）、海綿体厚（Tb. Th）および海綿体分離（Tb. Sp）などを示している。c 各群の大腿骨遠位部の代表的な HE（上段）および TRAP（下段）染色像 d 血中 CTX および P1NP 濃度。f-h In vitro 破骨細胞形成アッセイ。f TRAP染色破骨細胞様細胞（OCLs）。g TRAP+多核OCLsの数と面積の定量化。h アッセイ終了時の破骨細胞シグネチャー遺伝子発現のqPCR分析。j-k野生型BMNCsのTLR9アンタゴニスト存在下でのin vitro破骨細胞形成 j TRAP染色OCL k OCL数の定量化 l 8週齢雄TLR9-/-および野生型マウスからの脾臓。m 血清および骨髄上清中のTNFα、IFNγ、IL1β、およびRANKLのレベル n = 3〜13/群 n 脾臓T細胞集団はフローサイトメトリーで解析 n = 6〜10/群 o 骨髄T細胞集団 n = 5〜10/群。nとoの数字は、脾臓または骨髄の全細胞における頻度を表す。d、eおよびm-oでは、8週齢の性別を一致させたマウスを用いた。kでは一元配置分散分析とトルコの多重比較検定を行い、他のパネルでは、統計的有意性は対応のない両側t検定を用いて決定した。エラーバーはs.d. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1およびns P > 0.05を表す。
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次に、破骨細胞分化におけるTLR9の役割を、in vitro破骨細胞形成アッセイを行うことで評価した。TLR9-/-マウスとWTマウスの初代非付着性骨髄単核細胞（BMNC）をRANKLとCSF1で5日間刺激し、破骨細胞数を測定した。その結果、破骨細胞様細胞（OCL）の数はTLR9-/-グループで大幅に増加し、OCLあたりの面積には大きな変化がなかった（図1f, g）。定量的PCRの結果、TLR9-/-OCL（5日目）はWT OCLよりもCTSK、RANK、NFATc1などの破骨細胞シグネチャー遺伝子の高い発現を示した（Fig.1h）。また、ウェスタンブロット解析により、in vitro培養2日目のTLR9-/- OCPsでは、RANK、Fos、NFATc1およびCSF1Rのタンパク質レベルが上昇していることが明らかになった（Fig. 1i）。さらに、TLR9-/- OCPは、CSF1に応答してWT細胞よりも高い増殖率を示した（図S1n）。これらの結果は、TLR9-/-骨髄細胞がWT細胞よりも破骨細胞への分化能を有していることを示す。
TLR9-/-マウスで破骨細胞形成が増加した主な理由が破骨細胞内在性TLR9の喪失であるかどうかを検証するために、TLR9特異的アンタゴニスト（ODN-2088、0-10μmol-L-1）存在下でWT BMNCを培養し、TLR9の分子ブロックがTLR9の遺伝子切除と同程度に破骨細胞形成を促進するかどうかを調査した。その結果、TLR9アンタゴニストは破骨細胞分化に大きな影響を与えなかったが、TLR9アンタゴニストを非常に高い濃度（10 μmol-L-1 ）で適用すると破骨細胞形成の抑制効果が認められた（図1j, k）。この結果は、TLR9-/-マウスにおける破骨細胞形成の増加は、破骨細胞内在性のTLR9シグナルの消失に起因するものではない可能性を示している。あるいは、TLR9-/-マウスにおける破骨細胞形成の増加は、他のメカニズムによって媒介されている可能性もある。
TLR9-/-マウスは慢性的な全身性炎症を示す
TLR9-/-マウスの破骨細胞性骨量減少の基礎となるメカニズムをさらに探るため、まず循環血中の破骨細胞促進サイトカインのレベルを測定した。驚くべきことに、TLR9-/-マウスの血清サンプルでは、TNFα、IL1β、RANKLなどの強力な破骨細胞形成活性を持つ炎症性サイトカインのレベルが、IL17とIL6ではなく、有意に上昇していた（図1mおよびS2a、b）。一方、循環血中OPGレベルは低下し、その結果、TLR9-/-マウスのRANKL/OPG比が有意に上昇した（図S2b）。自然免疫反応と適応免疫反応の両方の重要な活性化因子であるIFNγの循環レベルも、TLR9-/-マウスで増加した（図1m）。循環サイトカインで得られた結果と同様に、TLR9-/-マウスの骨髄上清では、TNFα、IL1β、RANKLレベルが高く、OPGレベルが低かった（図1mおよびS2b）。循環血中の炎症性サイトカインレベルが高いことに加え、TLR9-/-マウスはWTマウスと比較して脾臓の肥大を示した（図1l）。これらの結果は、TLR9-/-マウスの全身性炎症の存在を示唆している。
TLR9-/-マウスに見られる炎症性サイトカインの増加について、免疫細胞に変化があるか、どの免疫細胞が寄与しているかを調べるため、TLR9-/-マウスとWTマウスの骨髄と脾臓からフローサイトメトリーにより免疫細胞の表現型を決定した。その結果、TLR9-/-マウスは、脾臓のCD4+およびCD8+ T細胞の割合が増加していることがわかった（図1n、oおよびS2c、d）。我々はまた、骨髄CD4+ T細胞の有意な増加を観察し、TLR9-/-マウスの骨髄CD8+ T細胞の増加傾向も確認した。注目すべきは、TLR9-/-マウスの骨髄と脾臓の両方で、WTマウスより多くのCD69+活性化CD4+およびCD8+ T細胞が見られたことである（図1n、oおよびS2c、d）。細胞内サイトカイン分析により、TLR9-/-マウスの骨髄及び脾臓において、TNFα及びIFNγ産生CD4+ T細胞の数が著しく増加していることが明らかになった（図1n, o）。TLR9-/-マウスは、骨髄ではなく脾臓においてWTマウスよりも多くのTNFα-及びIFNγ産生CD8+ T細胞を提示した（図S2c、d）。また、TLR9-/-マウスでは、RANKL産生脾臓CD8+ T細胞およびTNFα産生マクロファージの数が増加していた（図S2c）。フローサイトメトリーの結果と一致し、TLR9-/-脾臓CD4+T細胞の培養上清において、TNFα、IFNγ及びRANKLレベル並びにRANKL/OPG比が上昇した（図S2e）。従って、我々の発見は、CD4+ T細胞がTLR9-/-マウスに見られる炎症性サイトカインのレベル上昇の重要な貢献者であることを示唆している。
Bリンパ球は、B細胞の発生と成熟が骨髄で行われることから、骨細胞と密接な関係を示している。そこで、TLR9の欠損が骨髄や末梢リンパ組織のB細胞に影響を与えるかどうかも検討しました。興味深いことに、TLR9非存在下では、骨髄および脾臓のB細胞数が減少することがわかった（図S2c, d）。4 B 細胞由来の RANKL と OPG のレベルを測定するために、TLR9-/- および WT マウスの精製脾臓および骨髄 CD19+ B 細胞を培養し、培養上清中の分泌 RANKL および OPG を測定しました。CD4+T細胞と同様に、TLR9-/-B細胞は、可溶性RANKLの産生が増加したが、上清中のOPGのレベルは減少した（Fig. S2f）。骨芽細胞と骨髄間葉系細胞（BMSCs）も RANKL と OPG の重要な供給源であるため、さらに TLR9-/- と WT マウスから骨芽細胞および BMSCs を培養した。TLR9-/-とWT細胞から採取した培養上清の間に、骨芽細胞およびBMSC由来のRANKLとOPGのレベルに差は見られなかった（図S2g）。これらの結果は、TLR9の欠失後のRANKL/OPG比のアンバランスには、B細胞も寄与していることを示唆している。
TLR9-/- マウスにおける破骨細胞形成の亢進と骨量減少の主要因は全身性の炎症である
TLR9-/-マウスにおける破骨細胞形成の亢進に、免疫細胞が産生する炎症性サイトカインが関与しているかどうかを調べるために、TLR9-/-マウスおよびWTマウスの脾臓細胞とRag1-/-マウスのBMNCをトランスウェルシステムを用いて一緒に培養してみました。Rag1-/-マウスはTおよびBリンパ球を持たないが、WTマウスと比較して骨量に変化はない38。したがって、TおよびB細胞汚染のない理想的なBMNC源を用い、トランスウェル培養系により可溶性因子のみを自由に流動させることが可能であった。我々は、TLR9-/-脾臓細胞が産生する可溶性因子が、WT脾臓細胞よりも有意に高い数の破骨細胞をBMNCから誘導することを見出した (Fig. 2a, b)。さらに、TLR9-/-脾臓CD4+ T細胞ではなく、TLR9-/-脾臓B細胞をRag1-/- BMNCと共培養すると、破骨細胞の分化が有意に促進された（図S3a-d）。この結果は、CD4+ T細胞がTLR9-/-マウスにおける破骨細胞形成の増加の主要な貢献者であることをさらに示唆している。これらのin vitroの結果をin vivoで確認するために、TLR9-/-またはWTマウスの脾臓細胞をRag1-/-レシピエントマウスに養子的に移植する実験を実施した。興味深いことに、TLR9-/-脾臓細胞を受け入れたRag1-/-マウス（KO_Rag1-/-マウス）は、WT脾臓細胞を受け入れたマウス（WT_Rag1-/-マウス）より骨量が少なかった（図2c、dおよびS3e）。それに伴い、CTX値もKO_Rag1-/-マウスで高くなったが、P1NP値には変化がなく（図2e）、KO_Rag1-/-マウスの骨量減少は破骨細胞による骨吸収の増加によることが示された。
図2
図2
TLR9-/-マウスの全身性炎症は破骨細胞による骨量減少に重要な役割を果たす。 a, b Rag1-/-BMNCsをTLR9-/-（KO）または野生型（WT）の脾細胞と共培養し、トランスウェルシステムでRANKLおよびCSF1で刺激した。c-j TLR9-/- 脾臓細胞の養子移入は Rag1-/- マウスの骨量減少を誘発した。 c 各群の大腿骨の代表的な 3D μCT 画像。レシピエントマウス（KO_Rag1-/-, n = 10; WT_Rag1-/-, n = 11）の大腿骨およびL3椎骨のN。 e 血清CTXおよびP1NP。f KO_Rag1-/-およびWT_Rag1-/-マウスの脾臓。 g-h 脾臓（g）および骨髄（h）のT細胞集団はフローサイトメトリーで解析した。数字は脾臓または骨髄の全細胞における頻度を表す。KO_Rag1-/-、n = 7; WT_Rag1-/-、n = 8。 j-p 骨髄移植実験。KOchim, n = 6; WTchim, n = 7）。 l-m KOchimおよびWTchimマウスのBMNCsを用いたin vitro破骨細胞形成アッセイ。l TRAP染色OCL。m OCL数の定量。n 血中CTXおよびP1NPレベル。血清TNFα、IL6およびRANKLレベル。KOchim, n = 7; WTchim, n = 8. p KOchimおよびWTchimマウスの脾臓。P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 and ns P > 0.05; 統計的有意性は対応のない両側t検定を用いて決定した。
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さらに、TLR9-/-脾臓細胞の養子移入は、TLR9-/-マウスの炎症状態を再現した。KO_Rag1-/-マウスは、WT_Rag1-/-マウスよりも大きな脾臓を示し（図2f）、骨髄および脾臓においてCD69+-活性化CD4+/CD8+ T細胞のみならず、総CD4+/CD8+ T細胞のカウントが増加していた（図2g、hおよびS3f,g）。TLR9-/-マウスと同様に、KO_Rag1-/-マウスは、循環中のTNFα、IFNγ、IL1β、RANKL及びIL6のレベルの上昇を示した（図2i、S3h）。TNFαおよびRANKL産生CD4+ T細胞数は、KO_Rag1-/-マウスの脾臓において顕著に増加した（図2gおよびS3g）。また、KO_Rag1-/-マウスの骨髄では、より多くのIFNγ産生CD4＋及びCD8＋T細胞が存在した（図2h及びS3f）。TLR9-/-マウスにおける所見と一致して、KO_Rag1-/-マウスの脾臓において、総マクロファージ及びTNFα産生マクロファージのカウントが増加していることが分かった（図S3g）。これらの観察から、TLR9-/-マウスの脾臓細胞はレシピエントマウスに炎症と骨量減少を引き起こすことができることがさらに示された。これらのデータを総合すると、免疫細胞によって引き起こされる炎症が、TLR9-/-マウスの破骨細胞性骨吸収の仲介に重要な役割を担っていることが示される。
骨髄上清中の炎症性サイトカインレベルの上昇と活性化骨髄T細胞の増加が観察されたことから、循環系と脾臓での炎症に加え、TLR9-/-マウスの骨髄でも炎症が起きていることが示唆された。TLR9-/-マウスの骨量減少に対する骨髄の炎症と造血区画の寄与を確認するために、6週齢の致死照射WTマウスにTLR9-/-とWT骨髄細胞を移植し、骨髄キメラを構築した。骨髄キメラは骨髄細胞の性染色体のPCR遺伝子型判定により確認した(Fig. S3i)。細胞移植から6週間後、TLR9-/-骨髄細胞を受け取ったマウス（KOchim）は、WT骨髄細胞を受け取ったマウス（WTchim）に比べて大腿骨と脊椎の骨量が著しく低いことが分かった（図2j、kおよびS3j）。KOchim骨髄細胞は、in vitroで破骨細胞形成能の上昇を示した（図2l, m）。したがって、KOchimマウスはCTXのレベルが有意に上昇したが、P1NPのレベルは両群間で同様であった（Fig. 2n）。これらの結果は、KOchimマウスの骨量減少の主な原因は破骨細胞による骨吸収であることを示している。さらに、TLR9-/-マウスと同様に、KOchimマウスも脾臓の肥大、循環血中TNFα、IL6およびRANKLレベルの上昇、循環血中OPGレベルの低下を示した（図2o、pおよびS1k）。TLR9-/-マウスでは、循環血中IL1βおよびIFNγレベルが高くなる傾向も観察された（図S3k）。これらの結果は、TLR9-/-骨髄細胞の移植がレシピエントマウスの骨量減少と低レベルの全身性炎症を促進したことを示し、骨髄の炎症と造血細胞がTLR9-/-マウスの破骨性骨量減少に重要な役割を果たすことをさらに示すものであった。
炎症性サイトカインの分泌は、炎症の基本的要素の一つであり39、TLR9-/-マウスで観察される全身性炎症の重要な特徴の一つは、複数の破骨細胞形成促進性炎症性サイトカインのレベルの上昇である。これらのサイトカインのうち、TNFαは炎症性骨量減少の中心的存在であり1、TLR9-/-マウスは循環および骨髄におけるTNFαレベルの有意な上昇を示した。TLR9-/-マウスの骨量減少におけるTNFαの役割を明らかにするため、WTおよびTLR9-/-マウスに抗TNFα抗体またはコントロールIgGを投与しました。TNFαの遮断が骨吸収を減少させるという以前の報告40と同様に、TLR9-/-マウスの海綿骨量は抗TNFα処理後に著しく増加し、IgG処理したWTマウスの骨量と同様になった（TNFα_KO vs IgG_WT）（図3a、bおよびS4a）。抗TNFα療法はまた、TLR9-/-マウスのP1NPレベルに有意な変化を与えず、CTXレベルの有意な減少をもたらした（図3c）。興味深いことに、TLR9-/-マウスの循環IL6およびTNFαレベルは、抗TNFα療法後に低下した（図S4b）。また、TLR9-/-マウスの循環RANKLおよびIFNγレベルは、抗TNFα療法後に低下する傾向が観察された（図S4b）。さらに、抗TNFα療法は、TLR9-/-マウスの脾臓CD4＋及びCD8＋T細胞の頻度を減少させた（図S4c）。抗TNFα療法による骨量の回復は、TLR9-/-マウスの骨量減少におけるTNFαの重要な役割を示唆する。以上の結果を総合すると、TLR9-/-マウスで観察される慢性的な全身性炎症が、破骨細胞形成の亢進とその後の骨量減少の主な原因であることが示された。
図3
図3
抗TNFα療法実験とTLR9-/-マウスの腸内細菌叢組成の変化と腸内炎症。 a-c, l, m 抗TNFα療法実験。すべてのパネルで、IgG_KOおよび抗TNFα_WT群ではn = 3、抗TNFα_KOおよびIgG_WT群ではn = 4。 a 各群の大腿骨の代表的な3D μCT再構成。b 海綿体BMD、BV/TVおよびTb。d 8週齢の雌雄同体TLR9-/-（KO）および野生型（WT）マウスの糞便微生物叢の16S rRNA配列の3次元PCoA。各ドットは1匹のマウスの糞便微生物叢を表す。e-f KO（e）およびWT（f）群における有意に発現量の増加したファミリーの相対的存在量（P < 0.05）。h 血中LPSおよびIgAレベル。i 8週齢の雄のKOおよびWTマウスの大腸。KO, n = 5; WT, n = 6. k MLNおよびPPにおけるT細胞集団のフローサイトメトリー分析。l, m 抗TNFα療法後に改善された腸の炎症。eおよびfではMann-Whitney t testを、b、cおよびmでは多重比較の二元配置分散分析（Turkey's test）を、他のパネルでは対応のない両側t-testを適用した。エラーバーはs.d.を表す。 *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.000 1 and ns P > 0.05
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TLR9の欠損は腸内細菌叢の組成を変化させ、腸の炎症を誘発する
我々のデータは、TLR9-/-マウスにおいて骨量減少をもたらす慢性炎症を示したが、この炎症の原因は明らかでなかった。TLRシグナルは腸内細菌の生態に影響を与えることが示されており、腸内細菌組成の変化は炎症と疾患における重要な原動力であることが分かっています。
この仮説を検証するために、まずWTマウスとTLR9-/-マウスの糞便を用いて、マイクロバイオームの16S rRNA配列決定を行った。これらのマウスのマイクロバイオームの主座標分析（PCoA）では、2つのグループ間で分離が見られた（図3d）。腸内細菌叢の豊かさとシャノンの多様性は、WTマウスとTLR9-/-マウスで同程度であった（図S4e）。ファミリーレベルでの相対的な存在量では、両群間で微生物叢の構成に違いが見られた（図S4f）。TLR9-/-マウスでは、Deferribacteraceae, Odoribacteraceae, Rikenellaceae, Staphylococcaceaeの増加が見られ、ErysipelotrichaceaeとTuricibacteraceaeの減少が見られた（図3e、図f）。特に、グラム陰性菌であるDeferribacteraceae, Odoribacteraceae, Rikenellaceaeは、WTマウスよりもTLR9-/-マウスで高い存在比を示すことが明らかとなった。この観察は、線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）の結果からもさらに支持された（図3gおよびS4g）。興味深いことに、Deferribacteres門は、TLR9-/-グループで特に濃縮されていた(Figs. 3g)。最も豊富な10種を分析したところ、2つのグラム陰性菌、Mucispirillum schaedleri (M. schaedleri, Deferribacteres門) と Parabacteroides distasonis (P. distasonis, Bacteroidetes門) がTLR9-/-マウスで有意に増加した (Fig. S4h)。興味深いことに、M. schaedleri と P. distasonis は共に IBD と関連することが報告されている44,45。これらを総合すると、TLR9 非存在下では、病理学的特性が増加するように腸内細菌叢が変化することが明らかになった。
次に、TLR9-/-マウスの腸内細菌叢の変化が全身性免疫に影響を及ぼすかどうかを検討した。そこで、IgAと、主にグラム陰性菌が産生する内毒素であるリポ多糖（LPS）の血中濃度を調べました。興味深いことに、TLR9-/-マウスでは、循環血中LPSとIgAのレベルがともに高かった（図3h）。LPSレベルの上昇は、TLR9-/-マウスでグラム陰性菌がより多く存在することと一致した。また、マウスの回腸肛門接合部から肛門までの大腸の長さを評価したところ、回腸肛門接合部から肛門までの大腸の長さは、回腸肛門接合部から肛門までの大腸の長さよりも短いことがわかった。興味深いことに、TLR9-/-マウスの大腸はWTマウスに比べ有意に短く（図3i）、これはTLR9-/-マウスにおける腸の炎症46を示すものであった。次に、大腸炎のマーカーである糞便中のLipocalin 2 (Lcn-2) を測定したところ、TLR9-/-マウスはWTマウスよりも高いレベルの糞便中のLcn-2を示した（Fig. 3j）。次に、粘膜関連リンパ組織の免疫細胞を解析したところ、TLR9-/-マウスの腸間膜リンパ節（MLN）とパイエル板（PP）では、CD4+ T細胞の割合が高いことが観察された（図3k）。また、TLR9-/-マウスのPPでは、CD8+ T細胞数の増加が見られた（図3k）。さらに、抗TNFαで処理した後、TLR9-/-マウスの大腸の長さは、WTマウスで観察されたのと同じ長さまで増加した（図3l）。抗TNFα処置はまた、TLR9-/-マウスの糞便Lcn-2および循環LPSのレベルを有意に減少させた（図3m）。CD4＋及びCD8＋T細胞数は、抗TNFαで処理した後、TLR9-/-マウスのPPで有意に減少した（図S4d）。これらの結果は、TLR9-/-マウスの不顕性慢性腸内炎症の存在を示唆している。
腸内細菌叢の変化が、TLR9-/-マウスの全身性炎症とその後の骨量減少に重要な役割を果たす
TLR9非存在下で観察される炎症と骨量の変化に、腸内細菌叢の変化が寄与しているかどうかを検証するため、無菌（GF）TLR9-/-およびWTマウスを子宮切除により再導出し、gnotobiotic施設内で8週間維持した。我々の仮説と一致して、GF TLR9-/-マウスの海綿骨量は8週齢でWTマウスと同じレベルまで回復した（図4a、bおよびS5a）。P1NPレベルはGF TLR9-/-マウスで依然として高かったが、GF TLR9-/-マウスのCTXレベルはGF WTマウスのそれと同様であり（図4c）、従来のTLR9-/-マウスのそれよりも顕著に低かった（図1d）。GF TLR9-/-マウスとWTマウスのBMNCを用いたin vitro破骨細胞形成アッセイでも、両群間で同程度のOCLの数を示した（図4d、e）。
図4
図4
腸内細菌叢の変化が TLR9-/- マウスの全身性炎症と骨量減少に重要な役割を果たした。 a-i 8 週齢の雄 GF TLR9-/- および野生型マウスの表現型研究 a 大腿骨の代表 3D μCT 画像 b 海綿体 BMD、BV/TV および Tb. 各群の大腿骨およびL3椎骨のN。GF_KO, n = 4; GF_WT, n = 6. c 血中CTXおよびP1NPレベル。GF_KO、n = 4; GF_WT、n = 6. d-e GFマウス由来のBMNCsを用いたin vitro破骨細胞形成。GF_KO, n = 4; GF_WT, n = 6. g 各群の脾臓. h-i 脾臓CD4+ T細胞およびマクロファージ（h）および骨髄CD4+ T細胞（i）のフローサイトメトリー解析. n = 5/group. j-r 同室実験。 j 大腿骨の代表3D μCT イメージ。 k 骨盤BMD、BV/TV、Tb.のN。雄 Co-H_KO および Co-H_WT マウスの大腿骨および L3 椎骨の N. n = 7/群. l 血清 CTX および P1NP レベル。血清、各群 n = 14; BM 上清、各群 n = 3。 n 雄 Co-H_KO および Co-H_WT マウスの大腸 o 血清 LPS および糞便 Lcn-2 レベル。LPS, n = 3/group; Lcn-2, n = 8/group. p, q フローサイトメトリーによる脾臓（p）および骨髄（q）CD4+ T細胞集団. n = 6/group. 12週齢の性別を一致させたマウスをl, m, o-q で使用した。h、i、pおよびqの数字は、脾臓または骨髄の全細胞における頻度を表す。有意性は、対応のない両側t検定を用いて決定した。エラーバーはs.d. *P < 0.05, **P < 0.01 and ns P > 0.05
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次に、GF TLR9-/-とWTマウスの炎症状態を比較した。GF TLR9-/-マウスの循環RANKLレベルが高いことを除いて、他のサイトカインのレベルには両群間で有意差は認められなかった（図4f）。注目すべきは、TNFα、IL1β及びIFNγの循環レベルが、従来の条件で飼育したTLR9-/-マウスと比較してGF TLR9-/-マウスで著しく減少したことである（図4f及び図1m）。さらに、脾臓の大きさはGF TLR9-/-マウスで減少し、GFまたは従来のWTマウスで観察されたものと同様であった（図1lおよび4g）。脾臓のCD4＋およびCD8＋T細胞、マクロファージまたはCD69＋活性化T細胞の割合に、2つのGFグループ間で有意差は認められなかった（図4hおよびS5b）。GF TLR9-/-マウスの骨髄CD8+ T細胞のわずかな増加が見られたが、他の骨髄T細胞集団の頻度は、2つのグループ間で同様であった（図4i及びS5b）。GF TLR9-/-マウスは脾臓および骨髄B細胞が少なかったが（図S5b）、GF TLR9-/-とWTマウスの骨髄B細胞の割合の差は、従来のTLR9-/-とWTマウスの差に比べて著しく減少している（図S2d）。これらの結果を合わせると、GF TLR9-/-マウスでは炎症レベルの低下とともに骨吸収が減少しており、腸内細菌叢がTLR9-/-マウスの重要な炎症源であることがさらに示唆された。
GFマウスで得られた知見をさらに裏付けるために、新たに離乳したWTマウスとTLR9-/-マウスを9週間同室飼育しました。同居マウスの糞便サンプルから腸内細菌叢の配列を決定したところ、2つの遺伝子型間の腸内細菌叢の差は、同居後に正常化することがわかった（図S5c-h）。TLR9-/-の特徴的なファミリーの存在量は、2つの同居グループ間で同様であり、WTマウスではDeferribacteraceaeが増加し、TLR9-/-マウスでは同居後にOdoribacteraceaeとRikenellaceaeが減少した（Fig. S5f）。種レベルでは、M. schaedleriとP. distasonisは両群で同程度であった（Fig. S5h）。このように、TLR9-/-マウスとWTマウスの同居は、微生物の移動を促進し、両群間の腸内細菌叢の差異を正常化することが確認された。
次に、骨表現型に対する同居の影響を調べたところ、TLR9-/-マウスとWTマウスの海綿骨密度は、同居後に同程度になることが分かった（図4j、kおよびS5i-k）。TLR9-/-マウスの血中CTX濃度はWTマウスと同程度に低下し、P1NP濃度も両群間に差は見られなかった（図4l）。WTマウスとの同居は、TLR9-/-マウスの循環および骨髄におけるTNFαおよびIFNγレベルも低下させ、循環および骨髄のTNFα、IL6、IFNγおよびOPGのレベルに、同居したTLR9-/-マウスとWTマウスとの間に差異は認められなかった（図4mおよび図S5l）。RANKL及びIL1βレベルは、同居させたTLR9-/-マウスにおいてWTマウスよりも依然として高かったが（図S5l）、同居させたTLR9-/-マウスの骨髄におけるそれらのレベルは、単独で同居させたTLR9-/-マウスの骨髄におけるレベルよりも著しく低かった（図1m）。興味深いことに、同室飼育は脾臓の大きさと大腸の長さもTLR9-/-マウスとWTマウスの間で正常化した（図4nとS5m）。糞便中のLcn-2および血清中のLPSレベルは、同居させた2つのグループ間で同程度であった（図4o）。MLN、PP、脾臓及び骨髄のT細胞集団には、同居後のTLR9-/-マウスとWTマウスの間で有意差は認められなかった（図4p-q及びS5n-p）。以上の結果を総合すると、GFマウスでの知見と一致し、TLR9-/-マウスの炎症の発生とその後の骨量減少には、腸内細菌叢の変化が重要であることがさらに示唆された。
TLR9-/-マウスの炎症性骨量減少には、骨髄に偏った造血が重要な役割を担っている
我々のデータは、免疫細胞が産生する炎症性サイトカインがin vivoでTLR9-/-マウスの破骨細胞形成を促進することを示していたが、TLR9-/-BMNCsがin vitroで同濃度の破骨細胞形成性サイトカインで誘導した後にWT細胞よりも破骨細胞を生成する理由を十分に説明できていない。最近、慢性炎症が造血の正常なホメオスタシスを乱し、骨髄の偏りをもたらすという証拠が現れている。48,49 TLR9-/-マウスの骨髄では炎症性サイトカインの増加とBリンパ球の減少が見られたことから、TLR9-/-マウスに見られる慢性炎症は、骨髄の偏った造血をもたらし、骨髄中のOCPs頻度を高めることにより破骨細胞形成をさらに促進するのではないかと推測している。
骨髄は、多くの細胞種から構成される高度に不均一な組織である。異なる細胞系の発生に対する TLR9 の影響をさらに解明するために、10x Genomics Chromium プラットフォームを使用して、TLR9-/- および WT マウスの BMNCs で異なる発現遺伝子 (DEG) を調べるためにシングルセル RNA シークエンシング (scRNA-seq) を使用しました。厳密な品質管理の後、36 263個の細胞（TLR9-/-およびWTマウスの細胞はそれぞれ18 664個および17 599個）からクラスタリング解析用の遺伝子発現データをコンパイルしました。その結果、32の異なる集団が均一多様体近似投影法（UMAP）埋め込みとして可視化された。集団の命名法は特定の遺伝子発現に基づいており、B細胞の10クラスタ、マクロファージ/単球と前駆体の5クラスタ、好中球の5クラスタ、赤血球と前駆体の2クラスタ、および以下の細胞タイプの各1クラスタを同定した。T細胞、樹状細胞、NK細胞、単球-樹状細胞前駆体（MDP）、HSPC、間葉系細胞、好塩基球、形質細胞および巨核球（図5aおよびS6a）。以前の結果と同様に、TLR9-/-マウス (KO) はWTマウスよりもB細胞が少なかった。しかし、scRNA-seqの結果は、単球、好中球およびその前駆細胞を含む骨髄系細胞系列の増加を明らかにした。TLR9-/-マウスでは、より多くのT細胞とHSPCも観察された（図5bおよびS6b、c）。
図5
図5
a TLR9-/- (KO) マウスおよび野生型 (WT) マウスの BMNCs の scRNA-seq。36263の単一細胞トランスクリプトームをUMAPクラスタリングし、有意な細胞型クラスターで色付けしたもの。c, d WT（c）およびKO（d）細胞の単クローン軌跡をaと同様にクラスタで色分けしたもの。WT（e）およびKO（f）骨髄細胞内の疑似時間（左から右へ）に沿った単球マーカーLy6c2の発現量。g-l HSPCのマッピング。 g 全HSPC中のKOとWT細胞間の差次的発現遺伝子（DEGs）（Log2[fold change] > 0.5 およびP値 < 0.05 のDEGsは有意とみなす）。赤丸はTLR9-/-細胞で発現が増加した遺伝子、青丸はTLR9-/-細胞で発現が減少した遺伝子。 h SCENIC解析により、HSPC全体でKO細胞とWT細胞の間で特定の制御因子活性に差があることが明らかになった。k 造血幹細胞におけるFos, Vpreb1, Flt3の発現の違い（iのクラスタ10） l CMPにおけるCebpbとFosの発現（iのクラスタ7）。統計的有意差はWilcoxon検定で求めた；*P < 0.05 および **P < 0.01
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骨髄細胞の発生における両群の違いをさらに分析するために、細胞の異なるクラスターを軌跡に沿って並べ、TLR9-/- (KO) と野生型 (WT) 細胞で異なる分化軌跡を確認した（図5c, d）。WT細胞は、確定的な系統のコミットメント（分岐1）の前に、循環性骨髄系細胞および前駆細胞のクラスター（分岐2）に発達しました（図5cおよびS7a, b）。興味深いことに、WTクラスター11および21単球の大部分がブランチ2内にあることがわかった（図S8a、右図）。これは、WT単球の大部分（図5aのクラスター5、11および21からなる）が、細胞周期を経て、分化の状態にはないことを示唆している。WT細胞とは対照的に、KO細胞では3つのブランチが確認され（図5d、S7a、c、S8a）、系統関与までの道のりが著しく短かった（KOは図5dのブランチ3からブランチ1または2へ、WTは図5cのブランチ2 から1へ）。KOグループの単球のクラスタ11および21は、循環状態ではなく主に分化軌道上にあった（図S8a、左図）。擬似時間遺伝子解析でも、TLR9-/-骨髄細胞では単球シグネチャー遺伝子の発現が経時的により急速に増加していた（図5e、f、S8b-d）。これらの結果を総合すると、TLR9-/-骨髄細胞では、より速い系列コミットメントとより速い単球の分化が起こっていることが示唆される。
次に、幹細胞のマーカー（CD34、Ifitm1、Hlf）に富むHSPCのクラスター（Cluster 16）について洞察を求めた。 50 DEGsの解析により、TLR9-/-HSPCsでは骨髄系シグネチャー遺伝子 (Lyz2, Mpo, Fos, Elane, CD9) 51,52 の発現レベルが有意に上昇し、リンパ系分化遺伝子 (Sox4, Satb1, Vpreb3, Myl10) 53,54,55 はダウンレギュレートされていた (Fig. 5g)。次に、WTとTLR9-/-HSPCの間の転写因子（TF）の活性の違いを調べるために、単一細胞制御ネットワーク推論とクラスタリング（SCENIC）分析を行いました。その結果、TLR9-/-HSPCsでは、骨髄および幹細胞関連のTF（Cebpb、Fos、Jun、Egr1、Hlf）の活性が上昇し、B細胞発生関連のTF（Pax5、Ebf1、Klf2）の活性が減少することがわかりました（図5h）。これらの知見は、さらにTLR9-/-HSPCsにおける骨髄形成への偏りを示していた。興味深いことに、TLR9-/- HSPCsは急性期の炎症反応遺伝子であるCebpd (予測される下流遺伝子157個) の活性が有意に高く、56,57 炎症シグナルによるTLR9-/- HSPCsのプライミングが示唆されました。
HSPCは不均一であるため、これらの細胞はさらに、特定の遺伝子発現に基づいて15のサブクラスタに分けられた。このサブクラスターは、HSCs（Hlf、Ifitm1、CD34の低発現）、MPP細胞（CD34、HlfとIfitm1の中程度の発現）、CMPの2クラスタ（Kit、Flt3とLy6aの低発現）、GMP（MpoとLyz2）、MDP（MpoとIrf8）などのミエルイド前駆細胞のクラスタがあった。cMoP (Lyz2 and Ly6c2) および顆粒球前駆細胞 (Lyz2 and Chil3), B細胞前駆細胞 (Flt3, Ebf1, Dntt, CD79a and CD79bに富む), MEP細胞 (Gata2 and Car1), 赤血球前駆 (Car1 high expression) および巨核球前駆 (Pbx1, Pf4 and Vwf) のクラスター (Figs.5i and S8e.) 。5i and S8e)。TLR9-/-細胞（KO）はHSPCの各サブクラスターで優勢であり、特にHSCs、CMPs、MDPsおよびcMoPsで顕著であった（図5j）。造血幹細胞（Cluster 10）内では、TLR9-/-細胞はFosの発現が有意に高く、Flt3およびVpreb1の発現が低かったことから（図5k）、TLR9-/-造血幹細胞では骨髄系へのコミットメントの傾向があることが示された。同様に、TLR9-/-グループは、CMP（Cluster 7）においてCebpbとFosの高い発現を示した（図5l）。骨髄造血系遺伝子（Mpo、Cebpb、Elane、Ms4a3、Fos）の高い発現とリンパ球系遺伝子（Sox4、Myl10、Pax5、Ly6d）のダウンレギュレーションも他の関心対象のサブクラスターで見られた（図S8f, g）。これらの結果を総合すると、TLR9-/-の骨髄では、初期のHSPCに骨髄に偏った造血が起こっていることが示唆される。
次に、scRNA-seqで得られた結果を裏付けるために、フローサイトメトリー解析を行いました。その結果、TLR9-/-マウスの骨髄には、GMP、CMP、cMoP細胞などの骨髄系前駆細胞が多く存在することが分かった（図6a）。骨髄中の一般的なリンパ系前駆細胞の割合は、両群間で同様であった（Fig. 6a）。さらに、CD11b+骨髄系細胞の総数は、TLR9-/-マウスの骨髄で増加していた (図6a)。興味深いことに、TLR9-/-マウスの骨髄では、破骨細胞前駆細胞（B220-CD11b-CD115+およびB220-CD11b-Ly6chi細胞）の数の増加も確認した（Fig.6a）。
図6
図6
TLR9-/-マウスの炎症性骨量減少には、骨髄に偏った造血が重要な役割を果たしている。 a TLR9-/-マウスと野生型マウスの骨髄前駆細胞、骨髄細胞、破骨細胞前駆細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。B220-CD11b+細胞のデータは、2つの独立した実験からの結果のプールである。他のパネルでは、2つの独立した実験のうちの1つからの代表的なデータを示した。 b 造血幹細胞のin vitro分化。LSK+細胞はFACSで選別され、液体培地でリンパ系（上段）または骨髄系（下段）支持条件下でそれぞれ12日または7日間培養された。c 8週齢の雄のTLR9-/- (KO) と野生型 (WT) マウスに化学療法剤 5-FU を投与し、投与12日後に骨髄骨髄系細胞と B220+ 細胞の集団をフローサイトメトリーで分析した。左2パネル、5-FU投与後のB220+細胞およびCD11b+細胞の集団を示す代表的なヒストグラム。右4枚、5-FU処理後のKOおよびWTマウスの骨髄における骨髄系細胞およびB220+細胞の割合。骨髄キメラマウスモデルにおける骨髄（d）および脾臓（e）の骨髄系細胞のフローサイトメトリー解析 KOchimおよびWTchimグループでそれぞれn = 5および6。g 12週齢の雌雄同腹のマウスにおける骨髄骨髄細胞のフローサイトメトリー解析。すべてのフローサイトメトリー結果の数値は、全脾臓細胞、骨髄細胞、または培養細胞における頻度を表す。エラーバーはs.d.を表す。 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 and ns P > 0.05; 統計的有意性は対応のない両側t検定を用いて決定した。
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TLR9-/-マウスの造血に関する研究を発展させるため、WTおよびTLR9-/-骨髄からLSK+ (Lin-Sca1+Kit+) 細胞をフローサイトメトリーにより精製し、in vitroで培養を行った。リンパ系細胞や骨髄系細胞の分化に特異的なサイトカインのカクテルを培養物に加え、B細胞（B220+）と骨髄系細胞（CD11b+）の分化をフローサイトメトリーで評価した。その結果、TLR9-/-LSK+細胞は、in vitro分化の過程で、WT細胞よりもCD11b+骨髄系細胞を多く産生したが、B220+リンパ系細胞は少なかった（図6b）。これらの所見をさらに生体内で検証するため、TLR9-/-およびWTマウスに5-FUを単回投与し、投与12日後に骨髄細胞をフローサイトメトリーで分析した。先の結果と同様に、TLR9-/-マウスは5-FUをチャレンジした後、WTマウスよりもB220+細胞の数は少なかったが、CD11b+骨髄系細胞および単球/マクロファージの合計（CD11b+CD115+およびCD11b+Ly6chi細胞）は著しく増加した（図6c）。
TLR9-/-骨髄細胞の単独移植は、レシピエントマウスに著しい骨量減少と低いレベルの全身性炎症を引き起こすことを示したので（図2j-p）、次にTLR9-/-またはWT骨髄細胞を移植したキメラマウス（KOchim対WTchimマウス）の免疫細胞の表現型を調べて、骨髄異常に基づいた血液形成がTLR9-/-マウスの骨量低下に関与しているのかどうかを調査した。KOchimマウスとWTchimマウスの間で、脾臓T細胞集団の頻度に差はなかった（図S3l）。KOchimマウスは、その骨髄においてより少ないCD4+ T細胞を示し、脾臓または骨髄CD8+ T細胞の割合に2群間の有意差は認められなかった（Fig. S3l, m）。しかし、骨髄の骨髄前駆細胞およびOCPの数は、KOchimマウスで有意に増加した（図6d）。また、KOchimマウスの脾臓と骨髄では、骨髄系細胞が増加し、B細胞が減少していた（図6d、eおよびS3l、m）。これらの知見は、TLR9-/-マウスの骨髄で観察された骨髄造血の増加は移植可能であり、受け手マウスの骨量低下と低レベル炎症状態の主要な原因であることを示し、骨髄に偏った造血がTLR9-/-マウスの破骨性骨量低下に重要な役割を果たすことをさらに示唆するものであった。
TLR9-/- マウスにおける骨髄系細胞の拡大が炎症と関連しているかどうかを調べるため、抗 TNFα療法後の WT と TLR9-/- マウスの骨髄系細胞集団の変化も調査した。その結果、TLR9-/-マウスの骨髄におけるCD11b+骨髄系細胞とLy6chi OCPの頻度は、抗TNFα抗体で処理すると、WTマウスと同程度に回復した（図S4c）。WTマウスでは抗TNFα抗体投与後、有意な変化は見られなかった。この結果は、TLR9-/-マウスの骨髄造血の促進に炎症が重要な役割を担っていることを示している。さらに、TLR9-/-マウスの炎症の主な原因は腸内細菌叢の変化であり、その除去により炎症レベルが有意に低下することを明らかにしたため、GFマウスにおいても骨髄系細胞の変化を検討した。その結果、GF TLR9-/-マウスとWTマウスでは、骨髄CD11b+細胞、OCP（B220-CD11b-Ly6chi）、脾臓マクロファージ（CD11b+F4/80+）が同数であった（図6fおよび図4h）。さらに、9週間同居させた後、骨髄CD11b+細胞、OCP、CMP、GMP、脾臓マクロファージなどの骨髄系細胞と前駆細胞の割合も、同居させたTLR9-/-とWTマウスの間で同様になった（図6gおよびS5n）。他の報告59と同様に、これらの結果は、腸内細菌叢がTLR9-/-マウスの造血のバランスに影響を与えること、そしてこの腸内細菌叢の造血への影響は、TLR9-/-マウスの炎症の調節によって媒介されていると思われることを示唆するものである。以上のことから、炎症による骨髄の偏りがTLR9-/-マウスの破骨細胞性骨量減少に重要な役割を果たすことがさらに示された。
scRNA-seqにより、TLR9-/-単球と破骨細胞の前駆細胞でFosとSpi1の発現が上昇することが明らかになった。
破骨細胞は単球/マクロファージ前駆細胞から派生します。TLR9-/-マウスで破骨細胞分化が増加する分子メカニズムを探るため、単球とマクロファージ（Cluster 5, 11, 15, 21, 27）の scRNA-seq データを組み合わせて解析しました。その結果、全単球/マクロファージのうち、TLR9-/-群ではFosとSpi1（PU.1とも呼ばれる）の発現が全体的に有意に上昇し、RANK+細胞の数が増加していた（Fig. S9c）。RANK+細胞の増加は、TLR9-/-単球においてより多くのOCPが存在することを示し、これはフローサイトメトリー分析によっても示された（図6a）。他の報告と同様に、Klf4、Fos、Cebpb、Spi1を含む単球特異的なレギュロンがSCENICによって同定された（図S9a）。単球の活性化と分化の重要な制御因子であるCebpb、Fos、Spi1の活性は、TLR9-/-単球/マクロファージで有意に上昇した（図S9b）。さらに、炎症の重要な指標であるCebpdの活性は、TLR9-/-単球/マクロファージで劇的に上昇し（図S9b）、TLR9-/-単球の分化と機能における炎症の役割の可能性が示唆された。興味深いことに、SCENIC解析により、Fos、Cebpd、Spi1が互いの転写標的であることも明らかになった（図S9d）。Fos、Cebpd、Spi1間の転写ネットワークの増加は、単球関連遺伝子を標的としてTLR9-/-単球の分化と機能を促進する上で重要な役割を果たすと考えられる（Fig. S9d）。
次に、すべての単球／マクロファージをUMAPエンベッディングで示すように26のサブクラスタに分けた（図7a）。特異的な遺伝子発現に基づくと（Fig. S9h）。単球前駆細胞の3つのクラスター（Mpo、Ms4a3、Ifitm1およびElane）、循環単球の2つのクラスター（Mpo、Ms4a3およびLyz2の中程度の発現；細胞周期遺伝子に富む）、古典的単球の3つのクラスター（Lyz2、Lgals3およびCcr2）、循環単球の6つのクラスター（細胞周期遺伝子に富む）、マクロファージ（H2-AAおよびC1qb）の一つのクラスタが存在した。その他の小さな単球集団としては、Ly6c-intermediate単球（Ly6c2の中程度の発現）、Ly6c-negative単球（Nr4a1に富むがLy6c2の発現なし）、単球-IFNIC（IFN誘導単球、Ifit3とIrf7に富む）、単球-Klf2とFtl1に富む（単球＿Klf2／Ftl1）、単球-Fn1に富む（単球＿Fn1）などがあった。単球以外の細胞（Other_cell）は6クラスタあり、さらなる調査から除外された。クラスター18と26を除くすべてのサブクラスターで、WT細胞よりもTLR9-/-細胞の方が多かった（図7b）。
図7
図7
骨髄単球/マクロファージおよびT細胞のscRNA-seqマッピング a-e 単球/マクロファージのマッピング a リクラスター化した単球/マクロファージ（図5aのクラスター5、11、15、21、27のプール）。b 各サブクラスターにおけるKOとWTの相対的な割合。X軸はクラスタ数と細胞種を表す。 c 異なる細胞種におけるOCPマーカーの発現。d, e 示したサブクラスターにおけるKO細胞とWT細胞のFos (d), Spi1 (e) の発現の違い。X軸はサブクラスタ番号。f, g. 骨髄T細胞の解析。 f SCENIC解析により、全T細胞におけるTLR9-/- (KO)と野生型(WT)のレギュロン活性の違いが明らかになった。 g 示した細胞型間でのリガンド・レセプター予測値。赤矢印と青矢印は、それぞれKO細胞で増加したリガンドと減少したリガンドのペアを示す。 h TLR9-/-マウスの破骨細胞性骨量減少のメカニズムに対する提案モデル。TLR9-/-マウスは、腸内細菌叢の変化に由来する低悪性度の全身性炎症を示している。全身性炎症は、CD4+T細胞の膨張と炎症性サイトカインの増加を特徴とする。これらのサイトカインは、OCPsを刺激して破骨細胞へ分化させるだけでなく、骨髄に偏った造血を促進することによって、OCPsのプールを増加させる。このような炎症性サイトカインの二重作用により、TLR9-/-マウスでは破骨細胞形成と骨量減少が有意に促進される。さらに、骨髄系細胞の増加は、炎症の慢性化の維持にも寄与し、フィードフォワードループを形成している可能性がある。dとeでは、アスタリスクは平均的な遺伝子発現の有意差を意味する。dとeの有意差の判定にはWilcoxon検定を用いた。 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1
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単球／マクロファージのサブクラスターのうち、単球前駆細胞（クラスター3、8、14）、循環単芽球（クラスター10、11）、循環単球（クラスター4、5、6、9、13、17）などの細胞タイプが、OCP（CD11blo/Ly6chiCD115+）61と同様の表現型を示すことが分かった（図7c）。これらの細胞タイプは、UMAPで示されるように、ほとんどが未熟な単球を表していた（図7aの丸で囲んだクラスター）。興味深いことに、クラスター13、14、17を除くこれらの細胞型の中で、Fosの発現はTLR9-/-グループで有意に高かった（図7d）。古典的単球（Cluster 1、2、7）におけるFos発現の差は、未熟な単球における差ほど顕著ではなかった（図7d）。この結果は、TLR9-/-OCPsにおいてより高いFosタンパク質レベルが確認されたことと一致する（図1i）。さらに、TLR9-/-単球前駆細胞では、より高いSpi1発現が観察された（図7e）。これらの結果は、TLR9-/-単球がFosとSpi1の発現と転写活性を増加させていることを示している。Spi1とFosは破骨細胞形成に重要な役割を果たすため、TLR9-/-未熟単球におけるSpi1とFosの特異的な濃縮は、破骨細胞分化の増加の分子基盤を構成すると思われる。
TLR9-/- 単球の研究をさらに発展させるために、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) の濃縮解析が行われた。その結果、古典的単球と循環単球において、TLR9-/-細胞で発現が上昇した遺伝子は、主にリソソームと抗原提示に関与していた（図S9e, f）。同様に、monocyte_IFNIC（IFN誘導性単球、Cluster 20）においても、TLR9-/-細胞で同定された発現上昇遺伝子は、感染症、リソソーム、抗原提示、破骨細胞分化に関与していた（Fig. S9g）。これらの結果は、さらにTLR9-/-単球が炎症刺激によって活性化され、宿主防御のための免疫活性の上昇を示す可能性を示唆している。
scRNA-seqにより、TLR9-/-マウスの骨髄におけるT細胞の活性化が明らかになりました。
上記で、TLR9-/-マウスの骨髄でT細胞が増加する傾向を説明しました (図 1o および S2d)。この観察の基礎となる分子特性を調べるため、scRNA-seqによって骨髄T細胞の遺伝子発現パターンを評価した。全 T 細胞に基づく SCENIC 解析 (図 5a のクラスタ 14) では、TLR9-/- T 細胞は、重要な T 細胞発生因子であり、メモリー T 細胞の分化と持続に不可欠な Tcf7 と Lef1 の活性が増加していることが示されました62 。細胞間相互作用の解析では、TLR9-/-マウスの骨髄において、CD40-CD40Lを介したT-B細胞相互作用が増加していた (Fig. 7g) 。CD40-CD40L 相互作用は、B 細胞の RANKL 産生を刺激する。63 したがって、CD40-CD40L ライゲーションを介した T-B 細胞相互作用の増加は、TLR9-/- 骨髄 B 細胞による RANKL 産生の増加に寄与している可能性がある。
次に、T細胞をさらに11の異なるクラスターに細分化し、NK T細胞 (Nkg7 と Klrb1c) の2つのクラスター、CD4+セントラルメモリー (TCM) T細胞 (CD4, Ccr7, Lef1), CD4+ エフェクターメモリー (TEM) T細胞、Treg (S100a4, Tnfrsf4, Ifrf4, Tncf4) を表現しました。Tnfrsf4、IcosおよびFoxp3）、CD8+ TCM T細胞（CD8a、Ccr7およびLef1）、CD8+ TEM T細胞（CD8a、Ccl5）の2クラスタおよびγδT細胞（Id3およびTrgv2）およびICOSに富むT細胞などのT細胞の他の小さな集団（図解S10a、b）。S10a, b）。すべてのサブクラスターでTLR9-/-（KO）T細胞がより多く存在した（図S10c）。Gene ontology (GO) の濃縮解析により、CD4 TCM細胞 (Cluster 3)、CD8 TEM (Cluster 5) 細胞およびγδT細胞 (Cluster 11) では、KOでアップレギュレートされた遺伝子は、免疫反応のポジティブな制御およびT細胞の活性化に優先的に関連していた (Fig. S10d, f)。CD4 TEMおよびTregクラスターでは、KOアップレギュレートされた遺伝子は、IL4応答と優勢に関連していた（図S10f）。64 骨髄T細胞は主に移動性メモリーT細胞から構成されているので65 、Ccr7のアップレギュレーションがTLR9-/- CD4+T細胞の骨髄への移動を促進し、TLR9-/-マウスの骨髄におけるCD4+T細胞数の増加に貢献している可能性がある。まとめると、これらの結果は、TLR9-/-マウスの骨髄T細胞の拡大および活性化という概念をさらに支持し、骨髄の炎症性微小環境に寄与している可能性を示している。
考察
自然免疫細胞における TLR の活性化は、破骨細胞の分化を促進する炎症性サイトカインの放出を誘導するため、 TLR は骨と免疫系の間の重要なリンクとして認識されている66 。Sato らは、TLR シグナルに重要な分子である Myd88 を欠失させると、破骨細胞分化が抑制され、骨代謝が低い状態になり、マウスの骨量が低下することを報告している67。最近、マウスの TLR5 欠損は骨強度を損なうが、海綿骨量に変化をもたらさないことが報告された68 。したがって、生体内の正常な骨リモデリングにおける TLR9 の役割は不明なままである。
本研究では、TLR9の欠損が破骨細胞形成の亢進による海綿骨量の減少をもたらすことを初めて明らかにした。メカニズム的には、TLR9-/-マウスの腸内細菌叢の変化により引き起こされる慢性全身性炎症が、破骨細胞性骨量減少の主要原因であることを明らかにした（図7h）。慢性炎症は、破骨細胞への分化を促す破骨細胞形成性の炎症性サイトカインの産生と、骨髄での骨髄造血の促進から生じるOCPsレベルの上昇という2つの機序で破骨細胞形成を促進する。これら2つのメカニズムは、慢性炎症状態において破骨細胞新生を増加させるために協調して作用する。興味深いことに、破骨細胞形成における役割に加えて、TLR9-/-マウスの骨髄異型造血は、炎症の維持と慢性化に寄与しており、したがって、炎症と骨髄造血の間のフィードフォワードループである（図7h）。
閉経後の骨量減少は、現在では活性化T細胞によるTNFαの産生を特徴とする低グレードの炎症状態とみなされている10。TLR9-/-マウスの炎症は、脾臓および骨髄T細胞の活性化と拡大、TNFα、IL1β、IFNγ、RANKLなどの破骨細胞形成サイトカインの上昇を伴い、骨量の低下に寄与している。TNFαは破骨細胞形成の強力な促進因子である。TNFαとIL6の組み合わせは、RANKLとは無関係にOCLの形成を誘導する69。さらに、IL1βはRANKLの産生をアップレギュレートし、破骨細胞形成の刺激においてTNFαと相乗的に作用する70。TNFα が主要なメディエーターである可能性もあるが、増加した全ての炎症性サイトカインは、TLR9-/-マウスの骨量減少を促進する上で相乗的に作用していると思われる。
TLR9 がいくつかの疾患モデルで炎症を抑制していることを示す証拠が増えてきているが、これにはまだ議論の余地がある。我々の研究は、標準的なC57BL6/JバックグラウンドのTLR9-/-マウスにおいて、全身性の慢性炎症を示すことで、これらの知見を支持している。我々の結果と同様に、Tilstra ら71 は、B 細胞における TLR9 の特異的欠失により、MRL/lpr マウスの脾臓において CD19+ B 細胞の減少とともに、CD4+ T 細胞の数が増え、活性化が促進されることを観察しています。著者らはまた、B細胞内在性のTLR9は、彼らのマウスモデルで炎症を抑制するのに重要であると結論づけた。炎症の発生におけるTLR9-/-B細胞の因果関係についてはさらに研究が必要であるが、我々の研究は、正常な条件下で炎症を抑制し、骨量減少を防ぐ上でTLR9が重要であることを強調するものである。
今回の研究の大きな発見は、慢性炎症は、骨髄に偏った造血を介して破骨細胞形成と骨量減少も促進する可能性があるということである。骨髄造血の亢進は、多くの慢性炎症性疾患の特徴である。炎症時の骨髄造血の役割は、心筋梗塞、動脈硬化、老化、癌などの急性および慢性炎症状態の研究において評価されているが、破骨細胞形成と骨リモデリングに対する炎症に関連した骨髄造血の寄与は、まだ解明されていない。骨髄のHSPCは炎症刺激を感知し、増殖の亢進と骨髄系への偏向によって適応する。破骨細胞は骨髄系に由来するため、骨髄系への偏向はより多くのOCPプールを提供する可能性もある。実際、慢性炎症に伴い、TLR9-/-マウスとTLR9-/-骨髄細胞を投与したキメラマウスの骨髄では、OCPが増加し、骨髄系に偏った造血が確認された。この結果は、in vitro破骨細胞形成において、TLR9-/- BMNCsの骨形成能がより高いことの根本的な理由も明らかにしている。
TNFα、IL1β、IL6、IFNγなどの炎症性因子は、HSPCsの炎症への適応において協調し、中心的な役割を果たすことから、全身的に上昇した炎症性サイトカインレベルに慢性的にさらされることが、TLR9-/-マウスにおける骨髄造血の増加の主要な原因であると考えられる。抗TNFα療法後にTLR9-/-マウスで観察された骨髄系細胞とOCPの減少は、骨髄系に偏った造血に炎症が重要な役割を果たすことを示している（図S4c）。また、Cebpdは炎症指標として認識されており、主にTNFα、IL6、IFNγ、LPS、IL1βなどの炎症刺激によって活性化されることから、Cebpdの転写活性の増加は、TLR9-/- HSPCにおける炎症シグナルによるプライミングの発生を示唆している73。さらに、GFおよび同胞モデル動物による実験では、TLR9-/- WTマウス間の骨髄細胞および前駆細胞の違いが炎症サイトカイン濃度の正常化後消滅したことが確認された。これらの結果から、TLR9-/-マウスでは、炎症がHSPCを骨髄形成の方向へプライミングする役割を担っていることがさらに示唆された。
HSPCが炎症に適応した結果、骨髄系細胞の数が増加し、さらに炎症が促進され、慢性炎症状態を維持するフィードフォワードループが形成されることが提案されている48。骨髄キメラ（BMC）モデルの結果は、この考えを支持している。炎症シグナルによって誘導された偏った造血は、レシピエントにおいてさらなる外因性刺激を与えることなく移植可能であることから、BMCはTLR9-/-造血細胞の生態や炎症および骨代謝におけるその役割を研究するための良いモデルであると言えるでしょう。骨髄に偏った TLR9-/- 骨髄細胞の移植は、骨髄形成の増加と骨量減少をもたらしただけでなく、レシピエントマウスの脾臓肥大と炎症性サイトカインレベル上昇の表現型も再現した (Fig. 2j-p)．これらの知見は、TLR9-/-マウスにおける骨髄造血-炎症のフィードフォワードループのメカニズムの可能性を示唆し（図7h）、慢性炎症中の骨吸収を促進する骨髄の歪みの新しい役割を明らかにした。
近年、scRNA-seqは、疾患と関連した骨髄形成をマウスモデルで定義するための新規かつ強力なツールとみなされるようになりました49。急性または慢性の炎症では、造血幹細胞は骨髄前駆細胞への直接分化により、従来の造血階層を迂回することができます。76 scRNA-seq を利用して細胞の発生軌道を解析したところ、TLR9-/- 骨髄細胞の発生過程で、より速い系統コミットメントとより速い単球の分化が確認されました。さらに、 HSPC が炎症刺激にさらされると、 転写記憶を獲得することを示す証拠もあります。77 scRNA-seq によって、 TLR9-/- HSPC が骨髄系に偏っていることもわかりました。これは、骨髄系シグネチャー遺伝子の発現が増加し、骨髄系関連 TF が活性化し、リンパ系発生遺伝子がダウンレギュレーションしていることが理由です。特に、Fos mRNAは、TLR9-/-HSPCsとこれらの細胞のサブクラスタ（HSC、CMP、GMP、MDP）で一貫して発現が上昇した（図5j-lとS8g）。Fosのアップレギュレーションは骨髄系と単球の分化を促進し52,78、TLR9-/-骨髄細胞に観察される骨髄系に偏った造血の分子基盤を構成していると思われる。さらに、 TLR9-/- HSPC における Sox4, 54 Satb179 および Pax5 などの重要なリンパ系発生遺伝子のダウンレギュレーションは、 TLR9-/- マウスの骨髄における B 細胞の減少を説明すると思われます。
scRNA-seq法を用いて、単球と破骨細胞の分化を仲介する重要なTFであるSpi1とFosが、TLR9-/-単球前駆細胞で特異的に発現上昇することを発見した。また、SCENIC解析により、TLR9-/-の骨髄単球ではFosとSpi1の活性が上昇していることが確認された。これらの知見は、我々のモデルで観察された炎症を介した破骨細胞形成の分子基盤を示していると思われる。FosとSpi1は共に炎症性シグナルの下流標的である。Cebpdの活性の上昇とCebpd、Fos、Spi1間の転写ネットワークは、TLR9-/-骨髄単球における炎症性シグナルの活性化を示唆している。TNFαは、骨髄系前駆細胞と造血幹細胞においてSpi1の強力な誘導因子である80。Spi1は、自身のプロモーターと炎症シグナルを自己制御してSpi1タンパク質を活性化し、単球におけるSpi1の発現上昇も誘導すると報告されている81。破骨細胞形成の初期段階で、Spi1はCSF1受容体の発現を誘導し82、これはTLR9-/-破骨細胞前駆細胞においても同様に上昇した（図1i）。以前の in vitro 研究34 では、TLR9 リガンドは Fos の分解を促進することで破骨細胞新生を抑制することが示され ている。しかし、LPSやTNFαのような外来性のシグナルは単球／マクロファージのFosの発現を誘導することから、Fosの発現増加は炎症の結果である可能性がある83。Fosは破骨細胞の分化に重要な因子である。Fosの欠損は破骨細胞新生を阻害し、マウスの破骨ペトロシスを誘発する。一方、Fosの過剰発現はOPGによる破骨細胞新生の抑制を逆転させる。85 要するに、TLR9-/-マウスで炎症シグナルに長時間さらされると、骨髄形成と単球分化の際に前駆細胞にFosとSpi1の高い発現と転写活性が持続すると考えられている。FosとSpi1の発現と活性化の増加は、次にTLR9-/-マウスで観察される破骨細胞コミットメントの増加に寄与している。
腸内細菌叢の組成の変化は、IBD、代謝異常、癌、骨格系疾患など、多くの慢性疾患と関連している86。免疫系は腸内細菌叢の組成を形成し、腸内常在種と免疫系の間には相互作用がある。TLR5、Myd88、Nlrp6 などの自然免疫分子の遺伝子破壊により腸内細菌叢が変化し、免疫系や炎症の調節を通じて疾患を誘発または防御することが報告されている41,42,87。しかし、TLR9 関連疾患における腸内細菌叢の役割については広範な研究がされていない。今回の研究では、TLR9の欠損が腸内細菌叢に特異的な変化、特に特定のグラム陰性菌の増加を引き起こすこと、そして変化した細菌叢がTLR9-/-マウスの全身性慢性炎症とそれに伴う骨量減少の媒介に重要な役割を果たすことを明らかにした。(図7h）。炎症は、腸内細菌叢と骨の間の重要なリンクである。7,10,11 GFマウスでは、性ステロイド欠乏により破骨細胞形成性サイトカイン産生が増加せず、海綿骨損失が生じる。10 我々は、TLR9-/-マウスの微生物叢枯渇または同居により炎症レベルが減少し、骨吸収が減少して骨量が回復したことを示し、我々のモデルにおいて同様の経路を同定した。さらに、微生物叢は、炎症性サイトカインレベルのアップレギュレーションを通じて、HSPCプールとこれらの細胞の骨髄系への分化を制御することが示唆されている59。炎症が骨髄系に偏った造血とOCPの拡大に寄与することも分かったので、炎症負荷の減少は、GFおよび同室したTLR9-/-マウスの骨髄細胞およびOCPの頻度がWTマウスと同レベルまで回復した理由を説明しているかもしれません。
循環血中の炎症性サイトカインの増加に加えて、我々はTLR9-/-マウスの腸内環境に不顕性慢性炎症を確認したが、これは腸内細菌叢の変化によって引き起こされたと推定される。90 クローン病（CD）患者は、IL-6、TNFα、IL-1、RANKL などの炎症性サイトカインレベルの上昇を示し、腸の炎症と骨密度を標的とした抗 TNFα 治療が有効である。6 これらの観察は我々のデータと一致しており、さらに腸が TLR9-/- マウスの骨損失を誘発する全身性の慢性炎症の起源である可能性を示唆するものである。
結論として、私たちの研究は、生理的条件下での炎症、造血、骨代謝の恒常性の維持におけるTLR9の基本的な制御役割に関する新しい洞察を提供するものである。腸内細菌叢の変化がTLR9-/-マウスの炎症と骨量減少の重要な原因として同定されたため（図7h）、本研究は、将来、腸内常在菌を操作する取り組みが、炎症性骨量減少を防ぐ代替方法として探求される可能性も示唆している。
材料と方法
動物実験
マウス
TLR9-/- C57BL6/J および WT C57BL6/J マウスは、Li Wen 教授 (Yale University School of Medicine, New Haven, CT) の好意により提供され、以前の報告書に記載されている。36,37 マウスの尾部 DNA 抽出は REDExtract-N-AMP tissue PCR kit (Sigma-Aldrich) を用いてメーカー推奨プロトコルに従って PCR genotyping で実施された。使用したプライマーは以下の通りである：フォワード、5′-CCTGAAGTCTGTACCCCGTT-3′；リバース、5′-TCTGGCTCAATGTCATGT-3′. 317bpのアンプリコンがWT対立遺伝子から生成され、516bpの産物が破壊された対立遺伝子から増幅された。TLR9-/-マウスとWTマウスを別々のケージで飼育し、通常の飼料を与えた。養子移入実験に用いたRag1ノックアウトマウス（Rag1-/-）は、南京大学モデル動物研究センターから入手した。すべての手順は、当研究所（上海交通大学付属第六人民病院）で承認されたIACUC動物プロトコルに従って実施された。
マウス血清骨髄上清の調製
血清の採取は、マウスの眼窩静脈から血液を採取した。その後、卓上遠心分離機で最高速度で遠心分離し、上清を血清試料として採取した。骨髄上清は、マウス大腿骨の両端を切除し、骨端部をエッペンドルフチューブに直立させた。850×gで30秒間遠心分離した後、細胞ペレットとその上清を80μLのPBSで再懸濁し、再度2 300×gで1分間遠心分離を行った。その後、上清を回収し、新しいチューブに移した後、-80 ℃で保存した。
GFマウスの作製とコホージング
GF TLR9-/-およびWTマウスを子宮摘出により再導出し、axenic motherで飼育した。その後、マウスはgnotobiotic施設にて8週間維持した後、さらなる解析のために犠牲にした。同居させるために、同じ数の新しく離乳した（3週齢）性適合TLR9-/-およびWTマウスを新しいケージに入れ、さらに9週間給餌してから、さらなる分析のために犠牲となった。
Rag1-/-マウスへの脾臓細胞のアダプティブトランスファー
6週齢の雄性Rag1-/-マウス（C57BL6/Jバックグラウンド）を、TLR9-/-またはWT脾臓細胞のレシピエントとして使用する2群にランダムに分配した（KO_Rag1-/-群およびWT_ Rag1-/-群）。雄のTLR9-/-またはWTマウスから新鮮に採取した合計107個の脾臓細胞を、最終容量200μLでRag-/-マウスに静脈内（眼窩静脈）注射した。6週間後、マウスはさらなる解析のために犠牲にされた。
5-フルオロウラシル（5-Fu）処理
5-Fu (Sigma-Aldrich) を10 mg-mL-1の濃度で通常生理食塩液に調製した。そして、8週齢の雄のTLR9-/-およびWTマウスに5-Fuを単回投与（体重10gあたり1.5mg）して腹腔内投与（i.p.）し、投与12日後にマウスを生け捕りにした。
骨髄キメラの作製
6週齢の雄C57BL6/Jマウスに骨髄移植前に致死量のX線照射（10 Gy, rs2000 irradiator, Rad Source Technologies）を行った。照射後6時間以内に、ドナー骨髄細胞107個（雄のTLR9-/-またはWTマウス由来）を最終容量200μLで各照射マウスに静脈内（眼窩静脈）に注射した。骨髄移植から6週間後にレシピエントマウスを犠牲にし、さらなる解析を行った。
骨髄キメラマウスの遺伝子型を調べるために、WT雄ドナーの骨髄細胞を致死的に照射したWT雌マウスに移植して、別の実験を同時に実施した。細胞移植から3週間後、レシピエント雌マウスの骨髄細胞を回収し、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）を用いて全DNAを抽出した。PCRはEx-Taq酵素（Takara）を用いて、キットの説明書に従って実施した。以下のプライマーを使用した：フォワード：5′-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3′、およびリバース：5′-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3′、およびリバース。5′-cttatgttataggcatgcaccatgta-3′である。最初の変性は、98℃で1分間行った。増幅は35サイクル行い、変性、アニーリング、伸長をそれぞれ98 ℃（15秒）、55 ℃（30秒）、72 ℃（60秒）で実施した。最終伸長は72 °Cで10分間行った。PCR産物は100bpのDNAラダーとともに電気泳動にかけられ、紫外線照射下でエチジウムブロマイド染色により可視化された。Y染色体からの増幅では280bpの産物が得られ、X染色体からの増幅では約480bpと660bpの大きさの2つのバンドが得られた91。
生体内における抗TNFα療法
TNFα中和抗体（MP6-XT3、1 mg-mL-1、Invitrogen）またはIgG1 kappaアイソタイプコントロール（eBRG1、1 mg-mL-1、eBioscience）の送達のために、合計200 μLの原液TNFα抗体またはIgGが各Alzet Minipumpにロードされた。このポンプを6週齢の雄のTLR9-/-またはWTマウスに皮下移植し、合計6週間治療を継続した。
骨密度測定
大腿骨とL3腰椎は軟組織を取り除き、75％EtOHで4℃保存し、μCT装置（SkyScan1176）を用いてスキャンした。走査ボクセルサイズは9×9×9μm3であった．X線管電圧は50kV、電流は450μAであった。積分時間は520ms。回転ステップは0.4°で180°スキャンした。画像解析はCTAn micro-CT software version 1.13 (Bruker)を用いて行った．大腿骨と腰椎の海綿骨の解析には、すべて75（グレースケール指数）の閾値を適用した。皮質骨の解析にはすべて110（grayscale index）の閾値を用いた。大腿骨遠位骨幹の骨内境界から、成長板から1mm、近位に1.8mm（200セクション）の二次海綿体を含む海綿体解析用ボリューム領域を選択し、9μmの解像度でスキャンした。脊椎骨では、一次海綿体を除く海綿骨領域全体（頭側成長板から300μm下、尾側成長板より上）を解析した。大腿骨では，骨幹中央部の長さ600μmの皮質骨領域（近位成長板と遠位成長板の間の骨幹中央部から近位および遠位に300μm伸長）を定量化した．椎骨の皮質分析は行わなかった。収集したデータは、骨密度（BMD）、骨量／総体積率（BV/TV）、海綿体数（Tb.N）、海綿体厚（Tb.Th）、海綿体分離（Tb.Sp）であった。皮質厚（Ct.Th）、総断面積（Tt.Ar）、皮質面積（Ct.Ar）を含む皮質骨の指標も定量化された。
骨組織形態学的解析
解剖した大腿骨は，4％パラホルムアルデヒドで48時間固定し，10％EDTA（pH＝7.2）を用いて4℃で約1週間脱灰した．その後，標本をパラフィンに包埋し，厚さ4μmで切片化した．破骨細胞を解析するためにTRAP染色を行った。骨芽細胞の解析には、抗オステオカルシン抗体（Abcam、ab93876）を用いた免疫組織化学染色を用いた。測定は、骨端成長軟骨の0.5-2.5mm近位に位置する、二次海綿体のみを含む遠位大腿骨海綿骨の〜2.5mm2領域で行った。カルセイン標識は、動的組織形態学的解析に使用された。マウスは、1日目と7日目に30μg-1体重のカルセイン（Sigma-Aldrich）を腹腔内注射した後、犠牲にされた。その後、その骨を固定し、脱水し、メチルメタクリレートで埋め込み、未染色切片で分析した。MARと骨形成率は、標識間期間を適用してソフトウェアにより算出した。組織形態計測はBioquant Osteoソフトウェア（Bioquant社）を用いて行った。結果の報告には、認められた命名法を使用した92。
細胞培養および細胞ベースの実験
In vitro 破骨細胞形成アッセイ
骨髄細胞は、まずマウスの大腿骨と脛骨をフラッシングして得た。この細胞を10％FBS、100 U-mL-1 ペニシリン、100 μg-mL-1 ストレプトマイシン（Gibco）および20 ng-mL-1 M-CSF（Peprotech） を含むα-MEM（HyClone）で一晩培養して付着した細胞を除いた。その後、非付着細胞を回収し、Ficoll-Paque（GE Healthcare）に積層し、遠心分離した。界面のBMNCsを回収し、氷冷PBSで2回洗浄した。破骨細胞分化のために、BMNCs（96ウェルプレートの場合は1ウェルあたり2.5×104細胞、24ウェルプレートの場合は1ウェルあたり1.2×105細胞）を、10％FBS、100 U-mL-1 penicillin、100 μg-mL-1 streptomycin（Gibco）、100 ng-mL-1 M-CSF （Peprotech）及び100 ng-mL-1 RANKL（Peprotech）含むαMEMで5日培養してからTRAP染色又はRNA抽出用のライジングを実施した。細胞は、5% CO2下の加湿インキュベーター内で37℃に維持され、培地は1日おきに交換された。
TLR9アンタゴニストで処理するために、0〜10 μmol-L-1 CpG-ODN 2088 (Invivogen) をRANKLおよびCSF1とともにアッセイ開始時から細胞培養物に添加した（Day 0）。細胞は5日間培養した後、TRAP染色を行った。
破骨細胞数と面積を定量するために、アッセイ終了時（Day 5）に細胞を固定し、Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit (Sigma-Aldrich) を用いてTRAP（tartrate resistant acid phosphatase）染色を実施した。大きな多核細胞（核数3以上）を成熟OCLとした。解析は3連で行い、各生物学的複製についてウェルあたりのOCL数を記録した。
頭蓋骨芽細胞の採取と骨形成分化
新生 TLR9-/- マウスまたは WT マウス（生後 2～3 日）を用いて、頭蓋骨を採取した。犠牲後、頭蓋を解剖し、0.1%コラゲナーゼ（Roche）および0.2%ディスパーゼ（Roche）を含むα-MEMで5回消化した。最後の4回の消化から集めた細胞をプールし、10% FBS、100 U-mL-1 ペニシリン、100 μg-mL-1 ストレプトマイシンを含むα-MEMで培養した。60%〜80%のコンフルエンスを示す細胞を12ウェルプレートに1×105/ウェルの密度で複製し、培養液を骨芽細胞分化培地（Cyagen）に変更して骨芽細胞の分化を誘導した。7 日間の分化後、ALP 染色のために細胞を固定するか、RNA 抽出または ALP アッセイ（Jiancheng Bioengineering, Nanjing）のために細胞を溶解した。骨芽細胞培養上清の収集のために、細胞を通常の10% FBS α-MEMでさらに2日間培養してから、上清を収集した。すべての実験は二重に行い、生物学的複製の数は、各棒グラフの点の数で示した。
造血幹細胞分化
FACSで選別したLSK+細胞（96ウェル丸底プレートに5 000個／ウェル）を、3％BSA、100 U-mL-1 ペニシリン、100 μg-mL-1 ストレプトマイシン含有X-VIVO-15培地（Lonza）において培養した。骨髄系分化には、20 ng-mL-1 IL-3、20 ng-mL-1 IL-6、50 ng-mL-1 SCF、30 ng-mL-1 M-CSF (Peprotech) を含むサイトカインカクテルを使用した。リンパ系分化サイトカインカクテルは、100 ng-mL-1 IL-7、50 ng-mL-1 Fit3Lおよび50 ng-mL-1 SCF（Peprotech） を含んでいた。サイトカイン含有培養液の半分を1日おきにリフレッシュした。骨髄系細胞またはリンパ系細胞の分化のために、それぞれ合計7日間または12日間培養した。
BMNCsと脾臓細胞のトランスウェル共培養
BMNCsは、30 ng-mL-1 M-CSFおよびRANKLを添加したα-MEMを用いて、1×105個（24ウェル）または1.25×104個（96ウェル）/ウェルの密度で24ウェルまたは96ウェル皿（下部チャンバー）にプレーティングした。全脾臓細胞との共培養のために、0.4μm孔径のトランスウェルインサート（Corwell inserts with a 0. 4μmの孔径(Corning)を有するトランスウェルインサートを24ウェルディッシュに挿入し、TLR9-/-またはWT脾臓細胞を、10％FBS、1μg-mL-1抗CD3、5μg-mL-1抗CD28、3μg-mL-1抗IgMおよび10μg-mL-1抗CD40（バイオレンド）を補足したRPMI1640培地中で1×105細胞/ウェル密度で上部チャンバーにプレーティングした。脾臓 T 細胞または B 細胞との共培養には、孔径 0.4 μm の HTS Transwell-96 システム (コーニング) を使用した。Mojosort Mouse CD4 T Cell Isolation Kit (Biolegend) または CD19 B Cell Isolation Kit (Biolegend) を用いてWTおよびTLR9-/- TまたはB細胞を磁力で分離した。次に、1μg-mL-1抗CD3および5μg-mL-1抗CD28（T細胞用）または3μg-mL-1抗IgMおよび10μg-mL-1抗CD40（B細胞用）を補充した10％FBS-RPMI1640培地中に、ウェル当たり4×104細胞の密度で上部チャンバーにプレーティングさせた。BMNCsと脾臓細胞は、TRAP染色用に固定する前に5日間共培養した。
T細胞のin vitro培養
脾臓CD4+ T細胞は、製造者の指示に従ってMojosort Mouse CD4 T Cell Isolation Kit (Biolegend) を用いて磁気的に分離した。T細胞を96ウェル丸底プレートに1×106個／ウェルの密度で播種し、10％FBS、1μg-mL-1抗CD3および3μg-mL-1抗CD28を補充したRPMI1640培地で48時間培養し、プレートを遠心分離し、上清を回収した。
B細胞のin vitro培養
脾臓および骨髄のCD19+ B細胞を、Mojosort Mouse CD19 B Cell Isolation Kit (Biolegend) を用いて、製造者の説明書に従って磁気的に分離した。この細胞を、10％FBS、3μg-mL-1抗IgMおよび10μg-mL-1抗CD40を添加した96ウェルの丸底プレートに1×106個／ウェルの密度で48時間播種した後、プレートを遠心分離し、上清を採取した。
骨髄由来間葉系幹細胞（BMSCs）のin vitro培養
TLR9-/-マウスまたはWTマウスの大腿骨および脛骨を洗浄して骨髄細胞を採取し、10％FBS、100 U-mL-1 ペニシリンおよび100 μg-mL-1 ストレプトマイシンを含むDMEM（HyClone）中で培養を行った。48時間後、非付着細胞を除去し、新鮮な培地を加えた。付着した紡錘形細胞は、さらに2日間培養した後、上清を回収した。
フローサイトメトリー
脾臓細胞、骨髄細胞、MLN と PP の細胞は、通常の手順で入手した。表面マーカー染色は、分離した細胞を抗CD16/32抗体（Biolegend）で15分間ブロッキングした後、蛍光標識抗体で4℃、暗所にて30分間染色した。具体的には、抗CD16/32-FITCで染色した場合、ブロッキング工程はない。以下のように記載された抗体は、Biolegendから購入した（カタログ番号を括弧内に記載）。抗Ly-6C-Pacific Blue（128013）、抗Ly-6G-Pacific Blue（127611）、抗lineage cocktail-Pacific Blue™（133305）、抗CD4-FITC（100405）、抗CD16／32-FITC（101305）、抗CD4-PE（100407）。抗CD19-PE（115507）、抗CD115-PE（135505）、抗CD127-PE（121111）、抗Ly-6C-PE（128007）、抗CD117-PE（105808）、抗CD4-PE/Cy5（100409）、抗CD45R-PE/Cy5（103209）、抗CD19-PerCP/Cyannine5. 5（115533）、抗CD34-PerCP/Cyannine5. 5（128607）、抗CD8-PE/Cy7（100721）、抗CD115-PE/Cy7（135523）、抗Ly-6G-PE/Cy7（127617）、抗CD8-APC（100711）、抗CD135-APC（135309）、抗-CD127-APC（135011）、抗-CD45R-APC（103212）。anti-Ly-6A/E-APC (108111), anti-CD69-APC/Cy7 (104525), anti-CD117-APC/Cy7 (105825), anti-CD4-APC/Cy7 (100413), anti-Ly-6A/E-Alexa Fluor® 700 (108142) and anti-F4/80-Alexa Fluor® 700 (123129)．
細胞内染色は，脾臓細胞および骨髄細胞をCell Activation Cocktail (with Brefeldin A) (Biolegend) で4時間，37 ℃，CO2インキュベーター内で刺激した。その後、細胞を洗浄し、上記と同様に表面染色を行った。その後、固定化バッファー（Biolegend）および細胞内染色パーマ洗浄バッファー（脱イオン水で1×に希釈）（Biolegend）を用いて細胞を固定化および透過処理した。染色は、抗体とともに4 ℃、暗所で30分間インキュベートすることにより行った。細胞内染色に用いた抗体はBiolegendから購入し、抗IFNᵬ-FITC（505806）、抗TNFα-PE（506306）、抗CD254-PE（510005）などを使用した。
測定はCytoFlexフローサイトメーター（Beckman Coulter）で行い、各サンプルについて50 000イベントを収集した。フローサイトメトリー解析は、FlowJoソフトウェアバージョン10.4を用いて行った。まず、FSC-A/FSC-Hプロットでシングルのゲーティングを行った。次に、FSC-A/SSC-Aプロット上で細胞破片と死細胞を除外し、解析のためにゲーティングされた残りの細胞を全脾臓細胞または骨髄/MLN/PP細胞と見なした。各細胞タイプに対するゲーティング戦略を図S11-13に示す。
蛍光活性化セルソーティング(FACS)
LSK+細胞のソーティングのために、骨髄細胞をマウスの脛骨および大腿骨からフラッシュし、BMNCをFicoll-Paque勾配遠心分離により濃縮した。さらにMojoSort Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit (Biolegend) を用いて濃縮した後、抗CD117-PEおよび抗Ly-6A/E-APCで染色を行った。染色された細胞は、Moflo XDP（Beckman）プラットフォームでソートされた。CD117+Ly-6A+細胞は、精製モードで標的細胞としてゲーティングされた。ソートされたLSK+細胞を洗浄し、サイトカインカクテルで刺激する前に、50 ng-mL-1 SCFを補充した3% BSA、100 U-mL-1 ペニシリン、100 μg-mL-1 ストレプトマイシンを含むX-VIVO-15培地で一晩維持した。HSPCのゲーティング戦略は、図S13に示されている。
細胞増殖アッセイ
実験は、製造者の説明書に従って、細胞増殖ELISA BrdUキット（Roche）を用いて実施した。簡単に言えば、細胞を平底96ウェルプレートで定常的に培養した。測定前にBrdUを培養液に添加し、さらに4時間培養した後、培養液を除去し、FixDenat溶液、抗BrdU-POD作業溶液、基質溶液と順次インキュベートした。発色が十分であれば、プレートリーダー（BioRad社製）で吸光度を測定した。
リアルタイムPCR
RNeasy® Mini Kit (Qiagen) を用いて Total RNA を抽出し、PrimeScript™ RT Master Mix (Takara, RR036A) を用いて逆転写を行った。Real-time PCRはSYBR Premix Ex Taq™ II (Takara, RR820L) を用いて行い、サンプルはABI HT7900 platform (Applied Biosystems)で実行された。増幅は、変性を95℃で5秒、アニーリングと伸長を60℃で34秒行うサイクルを40回行い、プライマーの特異性を確認するために融解曲線ステージを追加した。標的遺伝子の相対発現量は、2-⊿CT計算法を用いて解析した。プライマーは Sangon Biotech 社（上海）で合成し、表 S1 に記載した。
ウェスタンブロット解析
Protease Inhibitor Cocktail (Cell Signaling Technology, 1:100) を添加した通常の溶解バッファー (Beyotime) を用いて、細胞タンパク質溶解物を採取した。タンパク質サンプルはSDS/PAGEで分離し、PVDF膜（Millipore）に移した。膜をブロッキングし、一次抗体とともに4℃で一晩、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。タンパク質のバンドはPierce® ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fisher Scientific）を用いて検出し、デジタルイメージングシステム（BioRad）で可視化した。抗RANK（Santa Cruz、カタログ番号 sc-390655）を除くすべての一次および二次抗体は、Cell Signaling Technologyから入手し、以下（カタログ番号は括弧内に含む）を含む：抗GAPDH（5174S）、抗c-Fos（2250S）、抗NFATc1（8032S）、抗M-CSF受容体（3152S）、HRP連動抗マウスIgG（7076S）およびHRP連動抗うさびIgG（7074P2）。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA法）
CTX、P1NP、RANKL、OPG、TNFα、IL1β、IL17、IL6、IFNγ、Lcn2、LPSおよびIgAの濃度は、市販のELISAキット（Jianglai Biological、上海）を用いて、製造者の説明書に従って測定された。簡単に言うと、ワーキングスタンダードと希釈したサンプルを調製し、各ウェルに添加した。プレートを密封し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、100μLの酵素標識試薬を添加し、プレートを37℃でさらに1時間インキュベートした。その後、TMB基質を添加し、プレートを37 ℃で15-30分間インキュベートし、停止液を添加した。プレートは5分以内に450 nmで読み取られた。
シングルセルRNA-seq解析
2匹のWTマウスおよび2匹のTLR9-/-マウスのBMNCを、2つの独立した実験でプロファイリングした（各実験には1匹のWTマウスおよび1匹のTLR9-/-マウスの試料が含まれる）。5′末端トランスクリプトームのシングルセルRNA-seqは、10X Chromium Single Cell Platform（10X Genomics）を用いて実施された。ゲルビーズインエマルジョン（GEM）の作製、バーコーディング、GEM-RTクリーンアップ、相補的DNA増幅、ライブラリ構築はすべてメーカーのプロトコールに従って行った。プーリング前のライブラリー定量にはQubitを使用した。最終的なライブラリープールは、Illumina NovaSeq 6000プラットフォームで150-base-pair paired-end readsを用いてシーケンスされた。配列決定データは、Cell Rangerソフトウェア（10X Genomics）を使用して処理した。
scRNA-seqデータの前処理、クラスタリング、パスウェイ解析
生シーケンスデータをCell Rangerパイプラインでデマルチプレックス、アライメント、カウントを行った。Cellranger aggrコマンドを使用して、複数のライブラリからのシーケンスデータをマッピングされたシーケンス深度で結合しました。
TLR9-/-およびWT細胞からのサンプルをマッピングされたシーケンス深度で集約した後、RパッケージSeuratを使用して遺伝子および細胞のろ過、正規化、主成分分析（PCA）、可変遺伝子同定、クラスタリング分析、t分布確率的近傍埋込み（tSNE）を実施しました。解析はデフォルトのパラメータで行った。<200または>10,000遺伝子を発現する細胞は、非細胞または細胞凝集体を除外するためにフィルターにかけられた。s > 0.10% のミトコンドリア遺伝子を持つ細胞もフィルターで除外した。UMI の正規化については、少なくとも 1 つの細胞で UMI カウントが検出された遺伝子のみを解析対象として保持した。ライブラリサイズの正規化は、各細胞に対して行った。補正された遺伝子-バーコード行列は、次元削減およびクラスタリング解析の入力として使用された。
次元削減のためにPCAを実施した。最初の30主成分がクラスタリング解析に用いられた。クラスタはtSNEとUMAPエンベッディングで可視化された。遺伝子発現の可視化は Seurat 関数を用いて行った。残りのすべての細胞に対する特定のクラスターのマーカーは、FindAllMarkers関数で同定した。DEGs (P < 0.05 between 2 identities) はFindMarkers機能で同定した。
FindAllMarkers機能で同定した各クラスタのマーカー遺伝子、またはFindMarkers機能で同定したfold change>1.5のエンリッチ遺伝子を用いてGOおよびKEGGパスウェイ解析をDAVID (database for annotation, visualization and integrated discovery) ウェブサイト上で行い、Rパッケージggplot2によりプロットした。
示された集団のサブクラスタリングのために、細胞の生データは、新しい別のSeuratオブジェクトの作成のために、集約された発現行列を含むSeuratオブジェクトから取得された。その後、同様の遺伝子ろ過、PCA、クラスタリング、tSNE、UMAPエンベッド、パスウェイエンリッチメント解析が行われた。
擬似時間軌跡解析
Rパッケージのmonocle（バージョン2.14.0）を用いて、デフォルト設定で擬似時間軌跡解析を実施した。DDRTree法を用いて、次元の縮小と擬似時間軌跡に沿った細胞の順序付けを行った。分岐解析は、分岐発現解析モデリングで行った。分岐点において有意差を示す遺伝子（P値により有意に変化した最初の100個の遺伝子から選択）を提示するために、2つの異なる細胞状態につながる遺伝子発現変化の異なるパターンに従って、4つの遺伝子ブロックを選択した。
リガンド・レセプターの細胞内情報伝達解析
2 種類の細胞間のリガンド・レセプターの相互作用の可能性を推測するために、CellPhoneDB (https://www.cellphonedb.org) で用いられている方法を採用した。Efremova ら 93 によって編集されたヒトのリガンド-受容体ペアのマウスオルソログを解析に使用した。2つの細胞型間の濃縮された受容体-リガンド相互作用は、我々の scRNA-seq データを用いて、ある細胞型による受容体の発現と別の細胞型によるリガンドの発現に基づいて予測された。
SCENIC解析
遺伝子制御ネットワーク解析にSCENICを使用した。GRNBoost2によりscRNA-seqデータの共発現ネットワークを作成した。次に、Python SCENICパッケージを使用して、sc-RNA seqデータから細胞制御ネットワークを作成し、シス制御解析のためにマウスmm10ゲノムを使用しました。遺伝子モチーフのランキングは2つ使用した。転写開始点（TSS）周辺10キロベース、またはTSSの上流500塩基対（bp）と下流100塩基対（bp）の2つの遺伝子モチーフランキングを使用し、https://resources.aertslab.org/cistarget/ から取得した。
16S rRNA seq
マウスの結腸と盲腸から新鮮な糞を滅菌チューブで採取した。糞から市販のキット（Magen）を用いて細菌ゲノムDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅し、有効なライブラリーを用いてIllumina MiSeqプラットフォームで配列決定した。生リードをフィルタリングし、ペアエンドリードにタグを付加した後、運用分類学的単位（OTU）にクラスタリングした。その後、代表的なOTUの配列を分類し、Greengenesデータベース（v201305）を用いてトレーニングした。OTUレベルでMOTHUR (v1.31.2) とQIIME (v1.8.0) を用いてα多様性とβ多様性を推定した。PCoAはQIIME (v1.8.0)を用いて実施した。異なる分類レベルの棒グラフを作成し、R (v3.4.1) を用いて Wilcoxon 検定に基づき有意な種を決定した。LEfSe クラスタ解析と LDA は LEfSe で実施した。
統計解析
2群間の比較は、特に指定がない限り、両側Studentのt検定を用いて行った。ノンパラメトリック解析にはMann-Whitney t test (Wilcoxon rank-sum testとしても知られている)を使用した。3つ以上の群間の比較は、多重比較検定（Tukeyの検定）を伴う一元配置分散分析（ANOVA）または二元配置分散分析（抗TNFα療法実験用）を用いて行った。統計的有意性はGraphPad Prism Software (v8.2.1) を用いて決定し、P値＜0.05は統計的に有意とした (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.000 1)．
リソースの利用
scRNA-seqデータは、GEOデータベース（アクセッション番号：GSE166366）からアクセスできます。16S rRNA-seq データは Sequence Read Archive (SRA) のアクセッション番号 PRJNA693037 および PRJNA693105 から利用可能。
データの入手方法
scRNA-seqデータはGEOデータベース（アクセッション番号：GSE166366）より入手可能。16 S rRNA-seq データは Sequence Read Archive (SRA) のアクセッション番号 PRJNA693037 および PRJNA693105 から入手可能。
変更履歴
2022年7月7日A 本論文の訂正を掲載しました。https://doi.org/10.1038/s41413-022-00221-0
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謝辞
原稿を注意深く読んでくださったFuan Wang博士に感謝します。また、動物実験に協力いただいた上海交通大学医学部実験動物科のYao Li博士と教員に感謝する。この研究は、中国国家自然科学基金（Nos. 81820100820 and 81372845 to C.Z.; no. 81400855 to C.Y. and no. 82170893 to Q.T. ）からの補助金によって行われた。この研究はまた、中国国家重点研究開発プログラム助成金番号2018YFC1106300（C.Z.へ）、上海自然科学基金助成金番号21ZR1448600（C.Y.へ）、上海市科学技術委員会助成金番号14pj1407200（C.Y.へ）により支援されました。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Peng Ding、Qiyuan Tan、Zhanying Wei
著者および所属
上海交通大学附属第六人民病院整形外科
Peng Ding、Qiyu Chen、Changqing Zhang、Chen Yao
上海交通大学附属第六人民病院内分泌代謝科
譚 季源
上海交通大学附属第六人民病院骨粗鬆症・骨格障害部
魏燦英・王淳
中国蘇州市蘇澳大学第二附属病院内分泌・代謝科
斉陸悦
米国イェール大学医学部内科学内分泌学教室
李 文
寄稿
C.Y.、Q.T.、C.Z.、C.W.が実験をデザインした。P.D.、Q.T.、Q.C.、L.Q.が実験を実施した。Z.W.はすべてのMicroCTスキャンと解析を行った。C.Y.，Q.T.，L.W.，C.Z.はデータを解析した。C.Y.，P.D.，L.W.は原稿を作成した。
連絡先
Changqing ZhangまたはChen Yaoにご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。
補足資料
補足資料
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可しています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法令上の規制で許可されていない場合、または許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
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この記事の引用
Ding, P., Tan, Q., Wei, Z. et al. Toll-like receptor 9 欠損は、腸内細菌が関連する全身性慢性炎症を介して破骨細胞性骨損失を誘発する。Bone Res 10, 42 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41413-022-00210-3。
引用文献のダウンロード
受領日
2021年7月1日
改訂版
2022年02月06日
受理
2022年3月13日
発行
2022年5月27日