Bifidobacterium animalis subsp. lactis Probio-M8はglcU変異により宿主適応進化を遂げ、授乳期を経て口腔・腸管・乳腺ルートで乳児の腸管に移行している

2022年11月29日 10:13

オープンアクセス
公開日：2022年11月22日
Bifidobacterium animalis subsp. lactis Probio-M8はglcU変異により宿主適応進化を遂げ、授乳期を経て口腔・腸管・乳腺ルートで乳児の腸管に移行している
Zhi Zhong, Hai Tang, ...Heping Zhang 著者紹介
Microbiome 10巻記事番号：197（2022）この記事を引用する

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指標詳細

概要
背景
母親から乳児への微生物相の伝播現象を証明しようとした先行研究のほとんどは、観察的で、属・種レベルの解像度でしか行われず、非培養ベースの方法論に完全に依存しており、解釈を妨げていた。

研究成果
本研究では、バイオマーカー株であるBifidobacterium animalis subsp.lactis Probio-M8（M8）を用いて、培養依存／非依存の統合的手法により、母体摂取菌の垂直伝播を直接評価することを目指した。培養とメタゲノム解析の結果、少量の母体摂取菌が授乳期を経て、口腔・腸管・乳腺の経路で乳児の腸管に移行することが明らかになった。興味深いことに、母子分離されたM8ホモログ株の多くは、非変異株と比較して、糖トランスポーター遺伝子（glcU）に高頻度の非同義変異を示し、糖質利用の嗜好性や能力が変化していた。これは、M8が単純な糖欠乏下腸環境においてよりよく生存するための適応進化を遂げたことを示唆するものであった。

結論
本研究は、授乳期を通じた母子間細菌伝播の直接的かつ株レベルの証拠を提示し、乳汁微生物叢が乳児の腸内コロニー形成に与える影響について洞察を与えるものである。

ビデオアブストラクト

背景
乳児の腸内細菌叢は、免疫系、代謝系、神経系の発達に重要な役割を果たしている[1,2,3]。しかし、乳児の腸内細菌叢の形成や個人差を引き起こす要因については、まだ完全には解明されていない。母親と乳児の自然な絆の観点から、母親の腸、皮膚、膣、唾液からの微生物[4,5,6]を含む母親の微生物叢が乳児の微生物叢の主要な供給源と考えられているが、いつ、どのように母親の微生物叢が乳児に移行するかについてはまだ多くの論争がある[8]。最近の報告では、母親の胎盤、臍帯、羊水に細菌が存在することが明らかになり、出産前から乳児の腸内細菌叢が存在していた可能性が強く支持されているが、この仮説についてはまだ議論の余地がある [12、13]. さらに、多くの周産期の条件、例えば分娩様式、授乳の種類、抗生物質の使用なども、乳児の腸内細菌叢に影響を与える可能性がある [4、14]。しかし，一般に，乳児の腸内細菌叢は，腸内細菌叢が成熟する3歳までの生後数年間に劇的に再形成されると考えられている [15]．したがって、特に母親の食事と授乳を通して、腸内細菌叢をプログラムする機会の窓を把握することは興味深く、実に重要なことであろう。

腸内細菌叢が授乳期を通じて母親から乳児に垂直感染することが報告されているが、ほとんどの研究は観察的であり、属や種レベルに限定した比較的低い分類学的解像度で行われている[16,17,18,19]。さらに、腸、膣、母乳に通常存在する微生物叢の間には重複が多いため、属や種のレベルで作成された研究成果は特異性に欠ける[7]。これらの問題は、乳児の腸内細菌叢の正確な解釈や、ターゲットとなる変調のための戦略のさらなる開発を妨げている。最近のメタゲノム技術の進歩により、ディープシークエンスによる母子間細菌伝播の調査研究が可能となり、このような現象に対するさらなる観察的証拠が得られたとしても[6, 20]、実験室での培養、分離、特定菌株の生化学的特性評価などの統合的機能解析により、メタゲノムによる知見を完全に検証する必要がある[7]。

本研究の目的は、授乳期における母親の細菌摂取を介した母親から乳児への細菌の垂直伝播の直接的な証拠を提供することであった。母乳を介した母子感染を追跡するために、バイオマーカー株であるBifidobacterium (B.) animalis subsp.lactis Probio-M8 (M8) を選択した。実験室での培養と同定、菌株レベルでのメタゲノム解析、Phenotype MicroAssay解析などの方法を組み合わせて、母親に与えられたM8乾燥粉末、母乳および母子ペアの糞便サンプルからM8同族分離株を検出・回収した。さらに、分離株の多様性、遺伝的変異、炭素利用の嗜好性と能力について解析した。本研究の長期的な目標は、乳児の腸内細菌叢のプログラミングにプロバイオティクスを介入させ、ヒトの健康を改善するための指針を提供することであった。

研究方法
細菌株
M8株は、中国内蒙古農業大学乳酸菌収集センターから入手した。ヒト母乳由来株である[21]。細菌は，強化クロストリジアル培地（RCM; HopeBio, Qingdao, China）を用いて，37℃で嫌気的に増殖させた（80% N2, 10% H2, 10% CO2）。

研究デザインおよびサンプル収集
授乳期の健康な母子11組を本研究のために募集した（補足表1）。除外基準は、早産、あらゆる粉ミルク給餌、新生児期における薬剤投与（母親および/または新生児）、および胃腸障害や免疫障害など、母親および/または新生児の微生物叢のバランスに影響を及ぼすことが知られているあらゆる変数であった。試験中、授乳中の母親は毎日、個別包装された小袋の形でM8ドライパウダーを摂取した（1日1袋、6×1010 cfu M8を含む）。M8ドライパウダーは、GMP（Good Manufacturing Practice）ガイドラインに準拠した少量生産で、社内で製造された。残念ながら、この研究はCOVID-19の流行開始時期と重なるため、M8を摂取していない対照群を含めることができず、対象となる母子ペアの募集がさらに困難となった。人間を対象としたすべての手順は、内蒙古医科大学附属病院倫理委員会の承認を得た（プロジェクト番号：KY(2020011)）。KY(2020011)）に承認されました。成人参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。

母乳、母子の糞便は、M8介入開始後8-15週間、週1-2回継続的に採取した（補足表1）。新鮮な糞便（10-15 g）を50 mLの滅菌サンプリングチューブに採取した。母乳を搾乳する前に、乳房と乳頭部を無菌石鹸で洗浄した。母乳は、前乳を捨てた後、無菌の電動さく乳器を用いて採取した。10ミリリットルの母乳を15mLの滅菌済みサンプリングチューブに採取した。サンプルは4℃で輸送し、80％N2、10％H2、10％CO2の雰囲気の無菌室で2時間以内に処理した。母乳（0.5 mL）と糞（0.5 g）のサンプルは直ちに培養し、残りのサンプルはRNA/DNA用サンプルプロテクター（TaKaRa、日本、滋賀）で混合し、DNA抽出とメタゲノム配列決定に先立ち-80℃で保存した。

母乳および糞便サンプルからのB. animalis subsp.lactisの培養と分離
母乳サンプル（各0.5 mL）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS; 8.0 g of NaCl/L, 0.2 g of KH2PO4/L, 1.15 g of Na2HPO4/L; pH 7.2) で10-1と10-2に薄め、糞便サンプル（各0.5 mL）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS; 8.0 g of NaCl/DH4/L, 3.5 g of Na2HPO4/L)で希釈した。糞便サンプル（各約0.5g）をPBSで10-5および10-6に希釈した。次に，希釈した各母乳および糞便サンプル200μLを3組のRCM寒天平板に広げ，37℃で72時間嫌気培養（80％N2，10％H2，10％CO2）して，B. animalis subsp.lactisとした．B. animalis subsp. lactisの形態的特徴を有するコロニーをストリークにより純度よく分離し，液体培地にて培養した。分離株の純度を顕微鏡で確認した後、遠心分離（8000 g、10分）して細胞ペレットを採取し、DNA抽出の前に-20℃で保存した。一方，生細胞は20%(v/v)グリセロール中で-80℃にて凍結保存した。

M8ドライパウダーからのB. animalis subsp.lactis の単離
試験前に、M8製品の中から無作為に2袋のM8ドライパウダーを選び、参加者に配布して摂取してもらった。これらの小袋に含まれる菌体粉末をPBSに再懸濁し、十分にボルテックスした。24個のコロニーを純度の高い状態で再濾過し、液体培地で培養した。分離株の純度を顕微鏡で確認した後、遠心分離（8000 g、10分）して細胞ペレットを採取し、DNA抽出の前に-20℃で保存した。一方、生細胞は20% (v/v) グリセロール中で-80℃にて凍結保存した。

16S rDNA配列決定および全ゲノム配列決定のためのDNA抽出
各単離株の凍結細胞ペレットを解凍し、TIANamp Bacteria DNA Kit (Tiangen, Beijing, China) を用いて、製造者の指示に従って全DNAを抽出した。抽出したDNAの濃度と純度は、Nanodrop spectrophotometer (Thermo Fisher, Madison, USA)で確認した。

16S rDNA 配列決定による分離株の同定
精製したDNA（50μL）を100ng/μLの濃度に希釈し、16S rDNA増幅を行った。B. animalis subsp. lactis 16S rDNAを標的とするプライマー（フォワード（5′-GGTGGTAATACCGATG-3′）およびリバース（5′-GACCATGCACCTGTGAA-3′））は、プライマープレミア5.0により設計した。16S rDNAの配列決定は、Majorbio Bio-Pharm Technology Corp.（中国、上海）にて行った。NCBIのBLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) を用いて配列の相同性検索を行い、各単離株の同一性を確認した。

各単離株の全ゲノムシークエンス
全てのB. animalis subsp. lactis分離株の全ゲノムのディープシーケンスは、Illumina HiSeqプラットフォーム（Illumina Inc, San Diego, CA, USA）で、150 bpペアエンドライブラリを生成することにより行った。各ゲノムについて少なくとも1.0GBのクリーンデータを取得した。ペアエンドリードは、まずSOAPdenovo v1.06 [22]を用いてde novoアセンブルを行った。GapCloser (http://sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/) を用いて、局所的なインナーギャップを埋め、1塩基エラーを修正しました。Glimmer v3.02は、推定コード配列の予測に使用されました[23]。予測されたオープンリーディングフレーム（ORF）の機能アノテーションには、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [24] と Clusters of Orthologous Genes (COG) [25] データベースを利用しました。

コアゲノムの構築
予測されたすべてのORFは、以前の研究[26]に記載された方法に従って対応する遺伝子ファミリーに分類され、識別されたすべての遺伝子ファミリーはコアゲノムの構築に含まれるようになった。コアゲノム構築には、検出された遺伝子を相同遺伝子ファミリーに分類するSiLiXソフトウェア[27]を使用した。

系統樹の構築
B. animalis subsp. lactis のコア遺伝子の系統樹を構築した。コア遺伝子の塩基配列は、オンラインソフトウェアMUSCLE v3.8.31 [28]を用いてアラインメントを行った。GblocksとGubbinsは、それぞれアライメントがあいまいな領域と遺伝子内相同組換えを除去するために適用された[29]。次に、FastTree 2.1.8 [30]を用いて、連結されたアラインメントから最尤法（1000回ブートストラップ反復法）を用いて系統樹を構築しました。系統樹は、Interactive Tree Of Life (iTOL)[31]を用いて可視化した。

ゲノム構造変異の同定
M8ゲノム配列（GenBankデータベース、アクセッション番号CP047190）と比較することにより、M8相同株のゲノム構造変異を同定した。本研究で作成したペアエンドリードをBWAでM8ゲノムにマッピングし[32]、SAMtoolsを用いて一塩基多型（SNPs）および挿入・欠失（InDels）を同定した[33]。同定されたSNPsとInDelsは、以下の基準でフィルタリングされた。(a) ペアエンドリードのカバー率が20倍以上、(b) SNPまたはInDelを支持するリードの比率が0.7以上、(c) 繰り返し領域にないこと。

変異の検証
glcU遺伝子で同定されたSNPは、フォワード（5′-TCGACGGCAAGCCAAGTCAG-3′）およびリバース（5′-ATCGCCATAAGCACCGCACC-3′）を用いたPCRによって検証された。増幅されたDNA断片は、Majorbio Bio-Pharm Technology Corp.（中国、上海）により配列決定された。

メタゲノム配列決定、アセンブル、ビニング、およびアノテーション
母子の代表的な糞便サンプル（M8摂取4週間後および8週間後に採取）をディープメタゲノムシークエンスに供した。母子便のDNA（1サンプルあたり約100 mg）は、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて抽出した。メタゲノム配列決定は、Illumina Hiseq Xtenプラットフォーム（Illumina, Inc.、San Diego, CA, USA）を用いて処理した。得られた150 bpペアエンドRAWリードは、まずTrim Galore（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）を用いてデフォルト設定で品質トリミングを行った。各サンプルについて、少なくとも50GBのクリーンデータを取得した。各サンプルのクリーンリードは、MetaSPAdes [34]を用いて、"-meta -k 21,33,55,77 "のパラメータでde novoアセンブルを行いました。足場は、Maxbin v2.2.3 [35]を用いて、テトラヌクレオチド頻度と配列カバレッジに基づいてゲノムビンに整理されました。メタゲノム集合ゲノム（MAG）の完全性と汚染度は、系統特異的なtRNAとマーカー遺伝子セットの表現に基づいて、CheckM v1.0.5 [36]を用いて推定しました。再構築されたMAGの分類は、CAT v5.0.3 [37]を用いて決定されました。再構築された MAG の遺伝子は、Prodigal v2.6.3 [38]を用いてタンパク質に予測・翻訳され、その後 NCBI-nr データベースに対する BLAST を用いてアノテーションが行われた。

表現型マイクロアレイ解析
嫌気性菌の同定・解析用に設計されたAN MicroPlateTM上のPhenotype MicroArray (PM) Technology (Biolog, Inc., Harvard, CA, USA)により、分離株の炭素源利用に対する嗜好性と能力を解析した。低温保存された分離株は、RCM寒天培地プレート上でシングルコロニーを2回ストリーキングすることで再活性化し（各ラウンドで72時間培養）、嫌気性細菌（色素なし）については、製造元の指示に従って細菌の表現型同定のために新鮮なコロニーを摘出した。接種液ANに細菌を添加し、透過率を測定して65%に調整した。接種液ANに懸濁した細胞を自動マルチチャンネルピペッターでAN96ウェルマイクロプレートに分注（100μL/ウェル）した。ANマイクロプレートを脱酸素剤入りポリ袋に入れ、直ちにヒートシールし、37℃で72時間培養した後、MicroLogプレートリーダーおよび関連ソフトウエアを用いて読み取った。培養中の吸光度の変化は、呼吸する細胞によるテトラゾリウム色素の還元に起因し、OmniLogシステムにより15分間隔で測定された。単培養の成長曲線と、個々の分離株の成長と炭素源利用の嗜好性を表す曲線下面積（AUC）は、R 3.6.3 ソフトウェアの Omnilog OPM パッケージを用いて解析・可視化した [39]。さらに、分離株間の炭素源利用率の有意差は、ANOVA検定により確認した（P<0.05）。

結果
M8乾燥粉末から回収されたM8分離株の多様性
M8ドライパウダーの菌株内多様性を説明するために、2袋のM8ドライパウダーから分離した24クローンを選択し、Illumina HiSeqプラットフォームを用いたディープシーケンスを行った（補足表2）。各ゲノムについて平均1139.00 Mbの高品質データが生成され、554.83倍から612.39倍のシーケンス深度に相当した。NCBIデータベースから検索した参照M8ゲノムと比較すると、1株を除くすべての分離株がSNPsを有していた。各SNP保有株の平均SNPs数は3.0SNPsで、1SNPs（6株）〜8SNPs（1株）であり、M8乾燥粉末内に既存の株内多様性が存在することが示唆された。

母乳、母体および乳児の糞便から回収されたM8株の同族性
本試験では、授乳期の健康な母子11組を募集した（補足表1）。試験期間中、授乳中の母親は毎日M8乾燥粉末を摂取した（6×1010 cfu/d）。母乳、母子の糞便は、M8介入開始後8-15週間、週1-2回継続的に採取した（Supplementary Table 1）。採取したすべての試料について、形態学的特徴から2800以上の細菌コロニークローンが分離された。16S rDNA同定の結果，母乳から28株，母親の糞便から148株，乳児の糞便から46株，合計222株のB. animalis subsp. これらの分離株のゲノムをIllumina HiSeqプラットフォームで配列決定し、さらなる系統樹とゲノム解析を行った（補足表3）。各ゲノムについて平均1235.54 Mbの高品質データが生成され、507.19から989.73倍の配列深度に相当した。

M8が授乳期を経て母親から乳児へ直接伝播するという我々の仮説を検証するために、母子分離222株、M8乾燥粉末から回収した24株、M8オリジナル株、2つの市販株（BB-12とV9）、タイプ株（DSM 10140T）の1488個のコア遺伝子に基づいてクローン祖先を再構築する系統樹を作成した（図1）。B. animalis subsp. lactisは株間のゲノム類似性が高いため、M8相同株と参加母親の腸内にもともと存在する他のB. animalis subsp. lactis株との鑑別は困難であると予想された。そこで、本解析では、いくつかの参照菌株を用いた。その結果、系統樹は不均衡なトポロジーを示し、主要なクレードは、M8乾燥粉末回収株やM8とは系統的に分離できない母子分離株195株から構成されていた。残りの母子分離株27株、BB-12、V9、DSM 10140Tはこのクレードに属さなかった。興味深いことに、主要なクレードに属する母子分離株195株は、ゲノムレベルではM8とほぼ同一であり、SNPsの平均距離（5.2SNPs）および最大距離（11SNPs）は非常に小さいだけであった。これらの結果は、M8がこれらの母子分離株とM8ドライパウダー分離株の最も新しい共通祖先である可能性を示したが、これらの195株が母親の内因性腸内細菌叢の一部である可能性は、プロバイオティクス粉末を摂取しない母親の陰性対照群がないため、完全に否定することはできない。

図1
図1
Bifidobacterium animalis subsp. lactisの250ゲノムのコア遺伝子を基に構築した系統樹。250ゲノムの1488個のコア遺伝子のDNA配列を用い、1000回のブートストラップ反復により最尤法で樹形図を構築した。250ゲノムの内訳は、母子分離222株（黒文字）、M8ドライパウダー24株（青文字）、M8、BB-12、V9、DSM10140Tの4つの参照株（緑文字）である。系統樹は大枝（赤）と小枝（黒）に分かれている。大きな枝（赤）の分離株は系統的に分離できないもので、母子分離の195株、M8ドライパウダーからの24株すべて、およびM8が含まれた。小さな枝は母子分離27株、BB-12、V9、DSM10140Tからなる。

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これらの195のM8相同クローンは、母親の糞便サンプルのすべて（145株、11/11）、母乳サンプルの大部分（21株、10/11）、乳児の糞便サンプルの約半分（29株、6/11）から分離された（表1）。すなわち、M8の相同株はすべての母子で母糞から分離され、5組の母子の3種類の検体すべてから顕著に分離された。

表1 母子1組から分離されたBifidobacterium animalis subsp. lactis Probio-M8（M8）の相同株数
原寸表
メタゲノム解析により、M8の母親から乳児への垂直感染が確認された
M8摂取4週間後および8週間後に採取した母親および乳児の糞便サンプルをディープシーケンスにかけた（サンプルあたり50GBのシークエンスデータを生成）。MetaSPAdesにより、合計16の高品質なB. animalis subsp.lactisゲノムをアセンブルした（補足表4）。2番目の系統樹は、上記と同じ方法とパラメータ設定を用いて構築されました。250のゲノムとは別に、新たにアセンブルした16のB. animalis subsp. これらの MAG をデータセットに加えた結果、コア遺伝子の数は 1488 個から 1271 個に減少した。

図2
図2
Bifidobacterium animalis subsp. lactisの266ゲノムのコア遺伝子を基に構築した系統樹。266ゲノムの1271個のコア遺伝子のDNA配列を用い、1000回のブートストラップ反復により最尤法で樹形図を構築した。266ゲノムは、16のメタゲノム集合ゲノム（MAG；接頭辞に「meta」をつけ、茶色で表記）、母子分離222株（黒で表記）、M8乾燥粉末からの分離24株（青で表記）、M8、BB-12、V9、DSM 10140T（緑で表記）という4つの参照株から構成されている。系統樹は大枝（赤）と小枝（黒）に分かれている。大きな枝（赤）の分離株は、13のMAG、母と子のペアからの分離株195、M8ドライパウダーからの分離株24すべて、およびM8を含み、系統的に分離不可能であった。小さな枝は、3つのMAG、母子分離27株、BB-12、V9、DSM 10140Tのゲノムで構成されていた。

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2番目の系統樹のトポロジーは、1番目の系統樹と非常によく似ており（図1）、大きな枝と小さな枝から構成されていた。大枝には13のMAGが分布し、M8ドライパウダーや母子分離から回収されたM8およびM8相同株とは系統的に不可分であり、M8株との高い相同性が示唆された。乳児の糞便3検体および母体の糞便5検体のメタゲノムから、それぞれ5株および8株のMAGが構築された。培養に依存しない方法、この場合メタゲノム解析で得られた結果は、従来の培養・分離で得られた結果とほぼ一致したが、ほとんどの母子ペアで実験室培養法がMAGよりも多くのクローンを回収していた。例外として、家族Qの乳児の糞便からはM8関連クローンが分離されなかったが、メタゲノム解析では2つのMAGが回収された。

母子感染ペアから回収されたM8相同株の遺伝的多様性
母子分離されたM8相同株195株において、合計499個のSNPが同定された（図3A）。このうち、9つのSNPはM8乾燥粉末と母子分離株の両方に共通して検出され、M8の染色体の53,155位、698,170位、777,230位のSNPなど、高頻度に検出される変異型も含まれていた。残りの490のSNPは、非コード領域に69、同義語変異100、非同義語変異321を含み、母子分離の相同株にのみ同定された（補足表5）。

図3
図3
母子感染ペアのM8相同分離株で同定された一塩基多型（SNPs）。A M8の染色体におけるSNPsの分布。プロットの下から上への白と灰色のストライプは、それぞれM8ドライパウダー（Powder）、ファミリーB、D、F、G、L、J、Q、S、N、T、X（family）の分離株を表している。B 18種類のClusters of Orthologous Genes（COG）機能カテゴリーに渡る非同義語SNPsの分布。水平方向の縦軸の下の文字は機能カテゴリーを表す。G] 糖鎖輸送・代謝 [R] 一般的な機能予測のみ [E] アミノ酸輸送・代謝 [L] 複製・再結合・修復 [P] 無機イオン輸送・代謝 [M] 細胞壁・膜・包膜形成 [J] 翻訳・リボソーム構造・形成 [S] 機能不明 [K] 転写 [C] エネルギー生産・変換 [F] ヌクレオチド輸送・代謝 [H] コエンザイム輸送・代謝 [T] シグナル伝達機構 [D] シグナル伝達機構 [T】シグナル伝達機構【O】翻訳後修飾、タンパク質代謝、シャペロン【I】脂質輸送・代謝【V】防御機構【D】細胞周期制御、細胞分裂、染色体分配【Q】二次代謝物の生合成、輸送、異化 C M8乾燥粉末と母子ペアのサンプル（母親の糞、母乳、幼児の糞）から分離したSNPs検出個体数。データは平均値±SEMで表した。P値はt検定により作成した。D glcU遺伝子のSNPsの染色体位置ごとの分布。この遺伝子のすべてのSNPは非同義であった。

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91%以上のSNP(450 SNP)は1つの単離株のみで同定され、それらはランダムな変異であることが示された。一方、非同義変異は代謝関連機能遺伝子、特に糖質およびアミノ酸の輸送と代謝に優位に偏在しているように見えた（図3B）。母子分離株では、M8ドライパウダーより有意に多くのSNPが検出され（P<0.01）、母親の糞便、乳児の糞便、母乳では有意差が見られなかったことから、変異は主に母親で生じたと考えられる（Fig. 3C）。

興味深いことに、糖トランスポーターをコードする960bpのglcU遺伝子（M8PIadj_1109、M8株の染色体上の位置：1259472〜1260431）に非同義変異が比較的高い割合（20/321；6.23％）で集中した。検出された非同義変種はPCRで確認された（データは示さず）。興味深いことに、これらの変異体は母子分離株にのみ認められ（8組の母子分離株195株中96株；母体糞便、乳児糞便、母乳からそれぞれ77、15、4株）、M8乾燥粉末関連株24株には全く認められなかった（図3D；補足表6）。この遺伝子は様々な場所で20個の非同義語の変異を示すが、各分離株は1つの部位にのみ変異を持つことが分かった。また、変異はある特定の位置に優先的に発生していた。例えば、1,260,085と1,260,332のゲノム位置ではそれぞれ20と29の変異が検出され、他の遺伝子座よりも有意に頻度が高かった（Fig. 3D）。

また、母子分離株では、glcU以外にもいくつかの高頻度変異部位が検出された（補足表5）。このうち、非同義語変異4個、同義語変異1個、遺伝子間領域変異1個を含む高頻度変異上位6個所のそれぞれで5個以上の分離体が点変異を示した。ゲノム位置700,045の非同義変異は、5組の母子分離株18株（母体糞便、乳児糞便、母乳からそれぞれ11、1、6株）において確認された。この変異はphosphatidylglycerol lysyltransferase-encoding gene上にあり、その遺伝子産物はリシル-ホスファチジルグリセロールの生合成を担っている[40]。他の3つの非同義語変異（ゲノム位置203,327、424,251、1,916,533）はそれぞれ6、8、6分離株で確認された。これらの変異は、それぞれ分岐鎖アミノ酸ABCトランスポーター基質結合タンパク質、3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase、溶菌性トランスグリコシラーゼをコードする遺伝子に位置していた。これらの変異が環境適応に関係しているかどうかは、さらなる研究が必要である。

変異体における炭素源利用能力の向上
代謝関連遺伝子、特にglcUにかなりの割合で非同義変異が起きていたため、変異体の炭素利用能力の変化を調べた。具体的には、Biolog Phenotype MicroArrayを用いて、glcU変異体7株（G4M3、G9C4、G7R82、T6M7、T12M12、T16C12、T16C15）の95種類の糖および有機酸を72時間にわたって、glcU変異を持たないM8乾燥粉末の数株（M8-1、M8-3、M8-6）と比較した（Fig.4A；補足図1）。4A; 補遺図1)。ほとんどの炭素源の利用効率は、3つのM8乾燥粉末関連株で非常に類似しており、これは異なる炭素源を試験した際の呼吸動態曲線のパターンが非常に類似していることに反映されている。一方、変異株は非変異株と比較して、異なる炭素源に対する増殖反応に明らかな差異が見られた。炭素利用プロファイルには、興味深いクラスタリングパターンが観察された（Fig.4A）。このクラスタリングパターンは、ファミリーGの3つの変異株間の炭素利用プロファイルが、ファミリーTやM8乾燥粉末関連分離株よりも高い類似性を持っていることを示唆している。また、T科の4株とM8株はそれぞれ2つのサブクラスタを形成しており、これら2つのグループの間で炭素利用能に明らかな違いがあることが示唆された。この結果は、同じ母子から分離された菌株は、非血縁者から分離された菌株と比較して、より類似した炭素利用嗜好性を持っていることを反映している。

図4
図4
Biolog ANマイクロプレートを用いたPhenotype MicroArray解析における、glcU遺伝子変異を持つ変異体と持たない変異体の炭素源利用効率の比較。A 10株（glcU遺伝子に非同義変異を有する母子分離株7株）の各基質の呼吸動態曲線の曲線下面積（AUC）のクラスターヒートマップ。G4M3、G9C4、G7R82、T6M7、T12M12、T16C12、T16C15、およびglcU遺伝子に変異を持たないM8乾燥粉末関連株3株）の各基質に対する呼吸動態曲線のAUCを求めた。M8-1、M8-3、M8-6）。クラスター分析は、unweighted pair group method with arithmatic mean (UPGMA)によって行われた。カラースケールはAUCを表す。値が高いほどAUCが大きいことを表す。B 10 株の 12 種類の代謝炭素源の呼吸速度曲線。時間単位の時間と、観測された代謝シグナルをOmniLog単位でそれぞれX軸とY軸に表している。C glcUに変異を有する母子分離株（glcU変異体）とglcUに変異を有しないM8乾燥粉末関連分離株（非glcU変異体）の間の12の炭素源の利用能力における代謝的な差異。データは平均値±SEMで表した。P値はt検定により作成した。

フルサイズ画像
基礎基質（a-D-グルコース、a-メチル-D-グルコシド）と有機酸（フマル酸、a-ketobutyric acid、a-ketovaleric acid.）を含む12の特定炭素源の動力学的細菌増殖曲線。ピルビン酸、L-アラニンアミド、L-フェニルアラニン、L-バリン、L-バリン＋L-アスパラギン酸、サリシン、イノシン）、変異株はM8乾燥粉末を持つ分離株と比較して明らかに良好な増殖を示した（Fig. 4B）。定常期に到達するのに必要な時間が短いことから明らかなように（例えば、, a-D-グルコース）、あるいはモニタリング期間中／終了時のAUCが大きくなった（L-アラニンアミド、a-ケト酪酸、a-ケト吉草酸、ピルビン酸など）ことが明らかになった。特に、いくつかの基質（例えば、フマル酸、a-ケト酪酸、a-ケト吉草酸、ピルビン酸、L-アラニンアミド）の成長曲線では、特徴的なラグ相がなく、定常期に到達しないことから、古典的な細菌の成長パターンを識別することは難しく、最適でない成長を示唆するものであった。しかし、これらの基質で培養した場合、ほとんどの変異株はより強いシグナルを示したことから、glcU遺伝子に変異のない株では通常あまり優先的に利用されない基質を異化して利用する能力が向上していることが示唆された。これらの12種類の炭素源で培養した場合、変異株全体のAUCはM8乾燥粉末関連株よりも大きくなり（P<0.05、ANOVA；図4C）、これらの基質が非変異株に比べて変異株の成長を促進したことが示された。これらの結果は、glcUの非同義変異が、通常あまり好まれない有機酸基質を利用する炭素代謝能と効率を実際に向上させたことを示唆するものであった。

考察
母親の微生物叢が乳児に垂直感染することを支持する文献は数多くあるが、直接的な証拠、特に細かい分類レベルでの証拠はまだ得られていない。そこで本研究では、母親が摂取した細菌が授乳期を経て乳児の腸管に移行するという仮説を検証した。授乳期の健康な母子11組を募集し、授乳中の母親は毎日M8乾燥粉末を摂取した。母親の糞便、母乳、乳児の糞便を1週間ごとに採取し、従来の培養法とハイスループットシーケンスの両方を用いてバイオマーカーM8株の回収を行った。この研究は、母親が摂取した後の母乳および母子ペアの糞便サンプル中のバイオマーカーM8株を追跡することにより、直接的かつ株レベルでのエビデンスを提供するものである。さらに、菌株内の多様性と代謝表現型の解析から、これらの細菌はゲノム多型、特に糖トランスポーターglcU遺伝子において、新しい環境ニッチに適応できることが示された。

本研究では、従来の培養法とハイスループットシークエンサーの両方を組み合わせて、母親摂取後のM8の垂直伝播を確認した。どちらの方法でもM8相同分離株の検出を成功させるための前提条件として、サンプル中に十分な量の標的菌が存在することが必要であった。サンプル中に大量の標的細菌が存在することは予想されていなかったため、菌株の回収と同定は困難であり、確率的な事象となっていた[41]。M8相同菌を回収する機会を最大化するため、1日に摂取するM8の量は、市販されている他の類似のプロバイオティクス製品の1日の推奨経口投与量の数倍から数十倍と、かなり多めに設定した（6×1010 cfu/d）。このような高用量のプロバイオティクスを使用することは、標的株の検出を強化する上で非常に重要であった。実際、我々の予備調査では、標準的な1日量（1×1010 cfu/d）を使用したが、M8の垂直感染がまだ起こっている可能性があるにもかかわらず、統計的に有意ではない数のM8相同株を回収した（データは示されていない）。プロバイオティクスの投与量を増やす以外に、さらなる試験のために膨大な数のクローンを採取することにも多大な労力が費やされた。実際、2800を超える細菌コロニーを手作業で採取し、さらなる分類学的同定のために培養したが、その中でB. animalis subsp. 11組の母子の全サンプルからM8相同クローンを回収しようと真剣に何度も試みたが、乳児の糞便5サンプルと母乳1サンプルから目的の細菌クローンを回収することができなかった。しかし、母体糞便11検体すべてと母乳の大部分からM8クローンの回収に成功した結果は、我々の手順が有効であり、技術的に正しいことを示唆するものであった。同様に、ディープシーケンスを用いて大量のメタゲノム・データ（1サンプルあたり〜50G、すなわち通常のメタゲノム研究に比べて約10倍のデータ量）を取得したにもかかわらず、少ない家族数のサンプル（母体および乳児糞便サンプル、それぞれ5家族および3家族）からしかM8相同マグネットを組み立てることに成功していない。これらの結果から、サンプル中には極微量のM8相同性菌しか存在せず、場合によっては適用した手法の検出限界以下であることが一貫して示唆された。

この研究は、COVID-19の流行開始時期と一部重なる時期に行われたため、対象となる母子ペアの募集がさらに困難となった。最終的に、授乳期の健康な母子11組のみが採用され、研究を完了した。募集人数が少なかったため、プロバイオティクスを摂取していない女性の陰性対照群は研究デザインに組み込まれなかった。したがって、プロバイオティクスを摂取していない被験者の糞便および母乳サンプル中のB. animalis subsp. それでも、興味深い傾向が観察された。すべての母親の糞便サンプルがM8相同株式に対して陽性であったことは、驚くべきことではありませんでした。特に、M8はヒトの消化管内を通過する際に強い耐性と高い生存率を持つことが以前に示されている[21]。また，ほとんどの母乳試料から高い頻度でM8相同株が回収されたこと（10/11；90.9%）は，口腔-乳腺の細菌移行経路が存在し，ほとんどの人に共通していることを強く支持し，同様の細菌移行メカニズムの存在が以前から提唱されている[18, 42]．ミルク微生物叢が存在することは間違いないが、ミルク微生物叢が乳児の腸内コロニー形成に与える影響はまだ未解決の問題であり [43]、乳児の糞便サンプル対応でM8相同菌を同時に追跡することで部分的に答えることができるだろう。3つの異なる存在-非存在の組み合わせが観察された。まず、母親と乳児のペアのほとんど（6/11；54.5％）が、3種類の試料すべてにおいてM8相同性菌（培養クローンおよび/またはMAG）を含んでいました。この場合、M8相同性菌は母乳の摂取によって乳児の腸内に入り込んだと考えるのが妥当である。次に、4組の母子（4/11；36.4％）の母体糞便および母乳からM8相同菌が分離されたが、乳児の糞便からは分離されなかった。乳児の糞便中に陽性クローンが検出されなかったのは、単に検出対象菌が少なかったか、あるいはこれらの個体の腸内でM8相同菌が生存またはコロニー形成できない生物学的理由によるものであると思われる。細菌コロニー形成の成功は、宿主因子とマイクロバイオームの特徴の両方に関連する個別化されたプロセスであると報告されている[44]。最終的な組み合わせはF家のみで、母親の糞便と乳児の糞便の両方で陽性クローンが検出されたが、母乳サンプルでは検出されなかった。このような結果から、M8相同性菌が母乳に全くアクセスしなかったのか、という疑問が生じた。しかし、ほぼすべての母子で母乳中に少数の陽性クローンが検出されたことから、M8相同性菌はごく微量にしか存在しないことが示唆された。したがって、F家の母乳サンプルでバイオマーカー菌が検出されなかったのは、単に、検出限界よりはるかに低い可能性のあるわずかな量の対象菌の存在から正しいクローンを選ぶ確率が低かったためである可能性もないとは言えません。また、この研究で採用した細菌検出のための「スクリーニング」戦略は、手間がかかるものであった。残念ながら、本研究のバイオマーカー株はB. animalis subsp.lactisであり、この亜種の株は高度に保存されている[45]。株間のゲノム類似度が非常に高いため、M8相同株と参加した母親の腸内にもともと存在する同様の株とを区別することは非常に困難であった。さらに、適用されたM8株は、他の類似性の高い株との鑑別を助ける特徴的なマーカーを持っておらず、この試験の性質上、そのための外来性の遺伝子バイオマーカーを導入することは不可能であった。一方、このケースでは、経口および乳腺経由以外の、まだ特定されていない別の経路で垂直感染が起きている可能性もあった。

もう一つの興味深い点は、ヒトの腸内環境の変化に対応してゲノム適応を行うM8ホモロジクローンが多数分離されたことである。その多様性と炭素利用の嗜好性と能力を分析した結果、明らかになった。M8乾燥粉末関連株24株はSNPsと株内多様性を示したが、SNPs数および多様性は母子分離株より有意に低かった。母子分離株のSNPsは、炭水化物やアミノ酸の輸送・代謝に関わる遺伝子に多く見られ、より生存しやすいように栄養素や炭素の獲得・利用においてゲノムに基づいた代謝適応が行われていることが強く示唆された。このような推測は、グルコースの取り込みを担う糖トランスポーターをコードするglcU遺伝子に高い頻度で非同義変異が観察されたことからも支持される。この遺伝子の変異頻度は195の母子分離株で49.2%と高い。この遺伝子は8組の母子分離株で検出され、極めて強い方向性の選択圧があることが示唆された。これらの変異体は、glcU遺伝子にSNPのない変異体と比較して、炭素利用能が著しく向上していることが表現型解析から明らかになった。また、フマル酸、イノシン、バリンなど12種類の一般的な炭素源を利用する能力が著しく向上し、幅広い代謝レパートリーを持つことが明らかとなった。このような代謝シフトは、ヒトの腸内細菌叢の特徴により合致している[46]。ほとんどの実験室での培養や工業生産プロセスでは、細菌の増殖を最適化するために、主要な炭素源として十分なグルコースが提供されます。一方、ヒトの消化器系では、グルコースを含む単糖の大部分が小腸で吸収され [47, 48]、下部消化管にはグルコースやその他の単糖が供給されなくなる。したがって、M8株は競争力や生存力を高めるために、母親の腸にアクセスした後、環境的に代謝レパートリーを拡大し、他の細菌が発酵で生成する中間生成物を炭素源として利用する効率を高めたと考えられる。特に、ビフィズス菌と腸内細菌叢の間では、代謝的なクロスフィーディングがしばしば起こることが知られている[49]。

本研究の潜在的な懸念として、参加した母親によるサンプルの取り扱いおよび収集の際に、母子ペアのサンプルが汚染されることが挙げられる。被験者は毎日M8ドライパウダーを摂取するため、皮膚や周囲の空気がM8で汚染されるリスクが高まる可能性がある。このようなリスクは、本研究を開始する前に慎重に検討された。そこで、本試験開始前に被験者に試料の採取と取り扱いの適切な方法を教育し、試料採取作業を標準化することにより、可能な限り汚染を回避するようにした。しかし、汚染の可能性を完全に排除することはできなかった[50]。一方、母子分離株はSNVパターンが異なり、glcU遺伝子の変異頻度が高いことから、M8乾燥粉末関連株との分岐が示唆され、試料混入の観点を否定するものであった。

本研究の強みは、従来の微生物学からメタゲノム解析に至る最先端の技術を応用し、母親から感染した細菌が乳児の腸に最初に定着するという興味深いテーマを、摂取した菌株のゲノム解析と宿主の大腸環境における代謝的適応という独自の観点から取り上げたことである。この仮説は、標準的なin silicoおよびin vitroのアプローチも駆使して詳細に検証されました。本研究で得られた知見は、母子間の細菌伝播に関する理解を深め、乳児栄養、特に授乳期における乳汁中の微生物叢や母親のプロバイオティクス摂取が乳児の腸内コロニー形成をどのように形成するかについて直接影響を与え、基礎科学と産業用プロバイオティクス製品開発の両方に洞察を与えるものである。

ビフィズス菌は、ヒトの腸内に最も早く定着した細菌の一つで、ヒトの体内には存在しない特定の糖質代謝酵素を有しています。これらの酵素は、母乳中のヒト乳オリゴ糖の分解を助け、栄養の消化と吸収を促進する[51]。以前の研究では、乳児初期にコロニー形成されたビフィズス菌の割合が低いほど、その時およびその後の人生で腸内細菌叢がアンバランスになる確率が高いことが示されている[8]。また、新生児のビフィズス菌は、免疫の恒常性の維持や過剰な免疫反応の抑制に役立つと考えられています[52]。したがって，新生児にビフィズス菌を適切に補充することは，短期的にも長期的にも健康に有益であり，プロバイオティクスを直接補充する場合と比較して，母親が授乳を通じてビフィズス菌を摂取することは，より安全で効果的であることは間違いない．

結論
本研究では、M8をバイオマーカー株として用いることで、母児ペアの半数以上において、母親が摂取した少量の細菌が口腔および乳腺経由で乳児の腸管に移行することが示され、授乳を通じてビフィズス菌やその他のプロバイオティクス細菌を乳児に栄養補給することが可能であることが示唆された。例えば、母子間の細菌伝播経路はこれだけなのか、細菌の移動経路は正確なのか、細菌のコロニー形成の結果になぜ個人差が見られたのか、この経路へのアクセスや乳児の腸への最終的なコロニー形成に種や株の選好性や特異性があるのか、摂取されたプロバイオティクス細胞の量と検出された細胞の量に相関があるのか、プロセスの効率を高めるにはどうすればよいか、等々である。しかしながら、我々の発見は、乳児の腸内コロニー形成に及ぼすミルク微生物叢の影響と、新生児にプロバイオティクスを補充する代替手段についての洞察を与えるものであった。

データおよび資料の入手方法
B. animalis subsp. lactis基準株4株（M8, V9, BB-12, DSM 10140T）の全ゲノム配列は、DDBJ/ENA/GenBankデータベースからそれぞれCP047190、CP001892、CP001853、CP001606で検索された。本研究で得られたゲノムおよびメタゲノム解析データは、それぞれBioproject accessions PRJNA819840 (Supplementary Table 2), PRJNA819217 (Supplementary Table 3), PRJNA810575 (Supplementary Table 7)としてDDBJ/ENA/GenBankデータベースに収録された。

略号
AUC:
曲線の下の面積

COG:
相同遺伝子のクラスター（Cluster of orthologous genes

InDels:
挿入と欠失

KEGG:
京都遺伝子・ゲノム百科事典

M8:
ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクチス・プロビオM8

MAGs:
メタゲノム解析されたゲノム

PBS:
リン酸緩衝生理食塩水

RCM:
強化クロストリジウム培地

SNPs:
一塩基多型（Single-Nucleotide Polymorphisms）。

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参考文献のダウンロード

謝辞
Shaojing Wangの技術協力に感謝します。

資金提供
本研究は、内モンゴル自治区科学技術重点プロジェクト（2021ZD0014）、中国国家自然科学基金（31720103911）、CARS-36重点基金、内モンゴル自治区科学技術計画プロジェクト（2021GG0080）の支援を受けて行われました。

著者情報
著者ノート
Zhi ZhongとHai Tangは、この研究に等しく貢献した。

著者と所属
内蒙古農業大学教育部酪農生物工学重点実験室、フフホト、010018、中国

Zhi Zhong, Hai Tang, Tingting Shen, Xinwei Ma, Feiyan Zhao, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Menghe Bilige & Heping Zhang（鄭志宏、唐海涛、沈廷婷、孫志宏、孟河吏戈、張和平

内蒙古農業大学農業農村部乳製品加工重点実験室、フフホト、010018、中国

Zhi Zhong, Hai Tang, Tingting Shen, Xinwei Ma, Feiyan Zhao, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Menghe Bilige & Heping Zhang.

内モンゴル自治区酪農生物工学重点実験室、フフホト、010018、中国

Zhi Zhong, Hai Tang, Tingting Shen, Xinwei Ma, Feiyan Zhao, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Menghe Bilige & Heping Zhang.

寄稿
H.Z.、M.B.、Z.Z.は本研究を企画し、全体を通して指導した。Z.Z.、H.T.、T.S、X.M、F.Zは定期的なサンプリングと細菌の分離を実施した。Z.Z.、H.T.、Z.S.はゲノム解析とメタゲノム解析を行った。H.T.とZ.Z.はPhenotype MicroArray実験を実施した。Z.Z.、H.T.、L.K.は原稿を執筆した。H.Z.とM.B.は作業を監督した。著者らは最終原稿を読み、承認した。

共著者
Heping Zhangに連絡する。

倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
内蒙古医科大学附属病院倫理委員会（プロジェクト番号：KY(2020011)）により、人間を対象としたすべての処置が承認された。KY(2020011)）に承認された。また、成人参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。

論文発表の同意
該当なし。

競合する利益
著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。

追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。

補足情報
追加ファイル1：補足表1.
健康な母子11組の情報とサンプル収集。補足表2. M8ドライパウダーから回収された24株のゲノム情報。補足表3. Bifidobacterium animalis subsp.lactis のゲノム情報。補足表4. メタゲノム解析されたBifidobacterium animalis subsp.lactisのゲノム情報。補足表5. 母子分離されたM8株195株の一塩基多型（SNPs）情報。補足表6. glcU遺伝子の一塩基多型（SNPs）の情報。補足表7. 母子糞便サンプルのメタゲノム情報。

追加ファイル2：補足図1.
10株（変異株7株、M8乾燥粉末関連株3株）のBiolog ANマイクロプレート上でのPhenotype MicroArray解析による呼吸動態曲線。時間単位での時間と観測された代謝シグナルをそれぞれX軸とY軸に表した。

権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。

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この記事の引用
Zhong, Z., Tang, H., Shen, T. et al. Bifidobacterium animalis subsp. lactis Probio-M8 undergo host adaptive evolution by glcU mutation and translocation to the oral-entero-mammary routes through lactation. Microbiome 10, 197 (2022)。https://doi.org/10.1186/s40168-022-01398-6。

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受領日
2022年4月11日

受理済
2022年10月20日

掲載
2022年11月22日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01398-6

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