非エンテロトキシジェニック・バクテロイデスの胆汁酸塩ヒドロラーゼは大腸がんを増強する
オープンアクセス
公開日：2023年2月10日
非エンテロトキシジェニック・バクテロイデスの胆汁酸塩ヒドロラーゼは大腸がんを増強する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36089-9
Lulu Sun, Yi Zhang, ...Frank J. Gonzalez Show authors
Nature Communications 14巻 記事番号：755 (2023) この記事を引用する
92 アクセス数
1 アルトメトリック
指標詳細
概要
バクテロイデス菌の胆汁酸塩加水分解酵素（BSH）は、肥満に関連する代謝性疾患の創薬ターゲットとして期待されているが、大腸腫瘍形成への関与は未解明であった。BSHを発現するBacteroidesは、肥満の大腸がん患者の便や高脂肪食（HFD）誘発CRCモデルマウスの糞便中に高濃度で検出される。B. fragilis NCTC9343株由来の組み換えbsh遺伝子を過剰発現させたB. fragilis 638RというBSH活性の低い菌株をコロニーに入れると、HFD処理下で大腸内の非共役胆汁酸が増加しCRCの進行が促進されます。高いBSH活性の存在下では、結果として生じる非抱合型デオキシコール酸およびリトコール酸の上昇は、Gタンパク質共役型胆汁酸受容体を活性化し、結腸腫瘍におけるβ-カテニン制御ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド28（CCL28）の発現増加をもたらす。β-catenin/CCL28軸の活性化は、腫瘍内の免疫抑制性CD25+FOXP3+Treg細胞の上昇をもたらす。β-catenin/CCL28軸の遮断は、免疫抑制を解除し、腫瘍内の抗腫瘍反応を高め、HFD治療下でCRCの進行を減少させる。BSHの薬理学的阻害は、β-カテニン/CCL28経路の抑制と同時に、HFDにより加速されたCRCの進行を減少させる。これらの知見は、肥満に関連したCRCの進行におけるバクテロイデスの発がん促進的役割に関する洞察をもたらし、BSHがCRCの予防および治療のための潜在的標的であることを特徴付けるものである。
はじめに
2020年の米国癌協会の統計によると、米国で2番目に多い癌死亡原因であるCRCは、遺伝、食事、環境因子によって引き起こされる不均一な疾患である1. 大腸腺腫症（APC）変異は、CRC患者の80％以上に見られるCRCのイニシエーションイベントです2。APCはWNT/β-カテニン経路の負の制御因子であり、APCの不活性化はCRCの病因に重要なWNTシグナルの過活性化をもたらす3。APC変異に基づき、Apcmin/+, Apc580S/+, ApcΔ242/+, Cdx2Apcf/wといったヒト大腸発がんを模倣したCRCマウスモデルが開発されている4。
臨床メタゲノミクスやメタボロミクス研究により、腸内細菌叢がCRCの発生や進行と密接に関連していることが明らかにされています。ポリケチド合成酵素陽性（pks+）大腸菌、Fusobacterium nucleatum、腸管毒素原性B. fragilis（ETBF）は、CRCの主要な微生物ドライバーとして考えられてきました5。ETBFは家族性大腸腺腫症（FAP）患者のポリープの大腸粘膜で検出される6。ETBFはB. fragilis fragilysinと呼ばれる発癌性毒素を分泌し、バリア透過性を高め7、βカテニンシグナルを増強し8、活性酸素種とDNA損傷を誘発する9。複数のマウスCRCモデルにおいて、ETBFは炎症反応を増大させ、エピジェネティック修飾を増強することにより、大腸発がんを促進する10,11。しかしながら、最近の糞便メタアナリシスでは、Bft（B. fragilis腸管毒素をコードする）の存在量に CRC 患者と対照群との間に有意差はないことが示されている12。最近の研究では、Bft 陰性であることが判明した非腸毒素性 B. fragilis (NTBF) がポリープ粘膜に豊富に存在することが判明した13。従って、NTBFもCRCの進行に重要であると思われる。
BSHは、宿主によって生成された共役胆汁酸から微生物によって修飾された非共役胆汁酸への変換を導くゲートウェイ反応を触媒し、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteriaなどヒト腸に定着する腸内細菌群のすべての主要フィラによって広く発現されている14。腸内細菌叢では、脂質代謝、コレステロール代謝、体重増加などの代謝経路に関与することから、代謝異常の有力な治療標的であることが示唆されています15,16,17。しかし、CRC の進行におけるその役割については、これまで検討されていない。
本研究では、NTBFがBSHの高活性、β-catenin-CCL28軸の活性化、結腸腫瘍におけるTreg細胞の浸潤の誘導に依存してCRCの進行を促進することを見出した。これらのデータは、大腸腫瘍形成におけるNTBF BSHの発がん促進効果を明らかにし、BSHがCRCの潜在的な治療標的であることを確立した。
研究成果
CRCではBSHを産生するBacteroides属が濃縮されていた
高脂肪食（HFD）は、胆汁酸負荷が増加する肥満関連CRCマウスモデルにおいて、腫瘍形成を加速することが明らかになった18。肥満が加速するCRCにおける特定の機能性腸内細菌叢の役割を明らかにするため、健常対照者（Lean/Overweight、Ctrl-L/O）とCRC患者（Lean/Overweight、CRC-L/O）から採取した便サンプルでメタゲノム解析と胆汁酸プロファイル解析を行った（補足 表 1）。健常対照者とCRC患者の便サンプルの多様性には有意差は認められなかった（補足図1a-d）。しかし、Bacteroidesのいくつかの種は4群間の分離に寄与し、体重過多の被験者で存在量が増加した（図1a）。これらの種のうち、B. dorei、B. fragilis、B. thetaiotaomicronは、太り過ぎのCRC被験者でさらに濃縮されていた（図1a）。Bacteroides属は胆汁酸の脱共役を担うBSHの供給源であることから19、変動腸内細菌叢種におけるbsh遺伝子量を解析し、さらに便サンプル中の胆汁酸プロファイルを定量化した。腸内細菌叢の変動種では、bsh遺伝子は主にBacteroides属の数種で検出され、CRC患者ではより濃縮されていた（図1b）。CRC患者では、チェノデオキシコール酸（CDCA）が増加し、抱合体のグリコチェノデオキシコール酸（GCDCA）は減少しており、CRCによって胆汁酸の脱共役化が促進されていることが示された（図1c）。デオキシコール酸（DCA）、リトコール酸（LCA）および総非共役胆汁酸はCRC患者で増加する傾向があった（図1c, d）。さらに、B. fragilisは、体重過多の被験者、特に体重過多のCRC患者において、LCAおよび総非共役胆汁酸のレベルと正の相関があった（図1eおよび補足図1e-g）。また、B. fragilisは太り過ぎのCRC患者において、太り過ぎの対照群と比較して有意に高い値を示した（Fig. 1fおよび補足Fig. 1h）。Eubacterium eligensとOdoribacter splanchnicusは便中CDCA濃度と正の相関があったが、Ctrl-O群とCRC-O群の間でその存在量は同程度だった（図1e, f）。
図1：CRC患者においてBSH産生バクテロイデス属菌が濃縮されている。
図1
a-f 45人［対照痩せ型群（Ctrl-L）14人；CRC痩せ型群（CRC-L）11人；対照太り型群（Ctrl-O）11人；CRC太り型群（CRC-O）9人］から便サンプルを採取し、ショットガンメタジェノミクスと胆汁酸分析を行った。a 4群間の差異につながった上位15種の腸内細菌叢 b変動する腸内細菌種におけるbshヒット c 便胆汁酸プロファイル。Kruskal-Wallis test with Dunn's post hoc test。CA: コール酸; UDCA: ウルソデオキシコール酸; T: タウリン; G: グリシン. d 総非共役胆汁酸. e 過体重の被験者における可変腸内細菌叢種と便の非共役胆汁酸レベルの間の相関のヒートマップ. 相関分析は両側性のスピアマンの順位検定により決定した。*p < 0.05, **p < 0.01。正確なp値は、p = 0.0239 (Bacteroides. dorei vs CA), p = 0.0051 (Bacteroides. fragilis vs LCA), p = 0.0104 (Bacteroides. fragilis vs Total), p = 0.0456 (Parabacteroides distasonis vs DCA), p < 0.0001（バクテロイデス属菌とDCA）であった。 0001（Eubacterium eligens vs CDCA）、p = 0.0043（Eubacterium eligens vs Total）、p < 0.0001（Odoribacter splanchnicus vs CDCA） f 過体重の被験者における変動腸内細菌叢の相対的存在量。Mann-Whitney U検定（両側）。データは(c, d, f)の平均値 +/- SEMとして提示されている。ソースデータはFig. 1のSource Data Fileとして提供されている。
フルサイズ画像
Apcmin/+マウスはCRC関連の研究で一般的に使用されているが、この系統には、ほとんどの腫瘍がApcmin/+マウスの小腸で発生する一方で、CRC患者では腫瘍の大部分が結腸および直腸に見られるため、ヒトの結腸腫瘍形成を正確に反映しない大きな制限がある（補足図2a-c）。そこで、本研究では、結腸特異的Apcノックアウト（Cdx2Apcf/w）マウスを用いた。さらに、肥満が加速するCRCの進行における特定の腸内細菌叢と胆汁酸の役割を明らかにするために、HFDで飼育したApcf/wおよびCdx2Apcf/wマウスモデルを作製した。このモデルでは、大きな腫瘍が主に結腸と直腸で検出され、小さな腫瘍は回腸遠位部で検出された（図2a, b）。腫瘍の発生は、大腸炎の指標である腸の長さに大きな影響を与えなかった（Fig. 2c）。次に、これらのマウスの腸内細菌叢組成を調べるために、メタゲノム解析が行われた。臨床データと一致するように、Bacteroidesのいくつかの種が両群の違いを占めた（図2dおよび補足図2d-g）。Bacteroidesのうち、B. vulgatus、B. dorei、B. fragilisおよびB. cellulosilyticusの種は、HFD食のApcf/wマウスと比較して、HFD食Cdx2Apcf/wマウスで有意に高いレベルで存在した(Fig. 2e)。CRCマウスモデルの変動種では、bshヒットは主にBacteroidesの数種で検出され、HFD飼育Cdx2Apcf/wマウスでより濃縮されていた（Fig.2f）。その結果、α/βMCA（α/β-muricholic acid）、HDCA（hyodeoxycholic acid）、DCAなどの非共役胆汁酸がHFD飼育Cdx2Apcf/wマウスでより豊富に認められた（図2gおよび補足図2h）。Lactococcus lactisとEnterococcus hiraeはHFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスで低い存在量を示したが（図2e）、CRC患者ではその差は観察されなかった（図1f）。これらの結果は、CRCが腸内細菌叢のホメオスタシスの変化と関連しており、それがCRCにおける腸内胆汁酸組成を変化させることを示唆するものであった。
図2：CRCマウスモデルでは、BSH産生菌であるバクテロイデス属細菌が濃縮されている。
図2
a-g Apcf/wおよびCdx2Apcf/wマウスに12週間HFDを与えた（Apcf/wはn = 8マウス、Cdx2Apcf/wはn = 5マウス）。a 回腸と結腸の代表的な写真で、腫瘍の発生が確認できる（赤丸の部分）。 b Cdx2Apcf/wマウス5匹の異なる腸管セグメントにおける腫瘍数、Duo：十二指腸、Jeju：空腸、Ile：腸。c 小腸と大腸の長さ d 2群間の差異をもたらした腸内細菌叢の上位15種 e 変動する腸内細菌叢の種レベルの相対的存在度。f 可変腸内細菌叢種におけるbshヒット。 g 大腸内容物における非共役胆汁酸プロファイル。Mann-Whitney U test with two-sided. ωMCA: ω-muricholic acid. データは(b, c, e, g)の平均値 +/- SEMで示した。ソースデータはFig.2のSource Data Fileとして提供されている。
フルサイズ画像
BSH産生バクテロイデス種のコロニー形成は、CRCの進行を促進させる
非腸毒性BSH産生バクテロイデス種の腫瘍形成能を調べるため、HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにB. fragilis NCTC 9343（BF、高BSH活性を持つNTBF）またはB. vulgatus（BV）16、17をコロニー形成した；熱殺B. fragilis 9343 (HBF) または B. vulgatus (HBV) はコントロールとして使用された。また，コロニー形成の効率を確認するため，別の常在菌（Bacteroides xylanisolvens）を対照として加えた．B. fragilis NCTC 9343株またはB. vulgatus株はマウス腸管に正常にコロニーを形成した（補足図2i）。腫瘍発生率は、回腸腫瘍発生率57.1％、結腸腫瘍発生率71.4％に対し、BF群では回腸腫瘍発生率77.8％、結腸腫瘍発生率100％とBFのコロニー化によって増加した（図3a-d）。さらに、BFのコロニー形成は、大腸腫瘍数の増加によって示されるように、主に大腸の腫瘍負荷を増加させたが、回腸腫瘍数には有意な変化はなかった（Fig. 3b-d）。また、B. fragilisが定着したCdx2Apcf/wマウスは、より進行したCRCを発症していることが、肉眼写真と組織学的解析から明らかになった（図3e、f）。NTBF BSHの増加の結果、BF9343コロニー化下で結腸胆汁酸プロファイルと総結腸胆汁酸負荷が増加した（図3g、h）。
図3：B. fragilis NCTC9343のコロニー形成は、CRCの進行を増加させる。
図3
a-h HFD飼育のCdx2Apcf/wマウスに、熱殺B. fragilis 9343（HBF）またはB. fragilis 9343（BF）を12週間コロニー形成した（HBF：n = 7マウス、BF：n = 9マウス）。 a 大腸の長さ。回腸（b）および結腸（c）の腫瘍発生率、および大きさの異なる腫瘍数（＜4mm2、＞4mm2、および両者の合計）。Mann-Whitney U 検定で両側。 d 腸の総腫瘍数。e, f 大腸の代表写真（左）、大腸の腫瘍の肉眼像（右上）、大腸腫瘍切片の H&E 染色（右下）。スケールバー g 大腸内容物中の非共役胆汁酸プロファイル。h 大腸内容物中の総非共役胆汁酸レベル．i 非腫瘍（NT）および腫瘍（T）結腸組織におけるWNT標的遺伝子の相対的mRNAレベル（n = 7 for HBF-NT; n = 9 for BF-NT; n = 5 for HBF-T; n = 9 for BF-T;)．j WNT標的遺伝子によってコードされるタンパク質のWBデータ、n = 3独立したサンプル/グループ。 k 増殖マーカーであるKi-67の代表的なIHC染色（n = HBFの5独立したスライド、n = BFの7独立したスライド）。スケールバー。100 μm。データは（a-d, g-i）の平均値+/-SEMとして提示されている。ソースデータは、Fig.3のSource Dataファイルとして提供されている。
フルサイズ画像
胆汁酸は、ヒトCRC2における主要な異常経路であるWNTシグナル18,20を活性化することが判明したので、HBFおよびBFマウスの結腸非腫瘍および腫瘍組織において、Ccnd1（サイクリンD1をコードする）、c-Myc（MYC原がん遺伝子をコードする）、Mmp7（行列メタロペプチダーゼ7をコードする）およびAxin2（軸阻害タンパク質2をコードする）などいくつかのWNT標的遺伝子mRNAの相対発現が、計測された。大腸腫瘍組織では、非腫瘍組織と比較してWNT標的遺伝子mRNAのレベルが著しく上昇し、特にMmp7とAxin2 mRNAが顕著であった（Fig.3i）。BFのコロニー形成により、Mmp7とAxin2のmRNAの相対発現はさらに増加し（図3i）、その結果としてのタンパク質レベルの増加は、ウェスタンブロット分析によりさらに確認された（図3j）。また、Cdx2Apcf/wマウスの腫瘍組織では、より高度な増殖が観察された（図3k）。B. fragilis NCTC 9343と同様に、BSHを発現するB. vulgatusのコロニー形成も、腫瘍発生率の増加や大腸腫瘍の重篤化を伴い、CRCの進行を促進した（補足図3a-f）。大腸の非共役胆汁酸プロファイルと総非共役胆汁酸レベルは、BV群ではHBV群よりはるかに高かった（補足図3g、h）。BV投与マウスは、HBV投与マウスと比較して、大腸腫瘍組織においてWNT/β-cateninシグナルがより活性化し、癌細胞の増殖を伴っていた（補足図3i-k）。以上のことから、BSHを発現するバクテロイデスのコロニー形成は、大腸の非抱合型胆汁酸負荷の上昇、WNT/β-カテニンシグナルの異常な活性化、CRC進行の上昇をもたらすことが明らかとなった。
B. fragilisにおけるBSHの過剰発現は、大腸の非抱合型胆汁酸負荷を増加させ、CRCの進行を誘発した
CRCにおける微生物BSHの役割をさらに調べるため、B. fragilis 9343 bsh遺伝子（BF9343_1433）を、ほとんどのタウリン共役胆汁酸に対する内因性BSH活性が低いB. fragilis 638R（BF BSHlow）株に挿入した21。BF9343_1433を挿入したB. fragilis 638RをBF BSHhighと定義した。BSHの過剰発現を確認するため、BF BSHlow株とBF BSHhigh株の培養液に共役胆汁酸を添加し、一晩培養を行った。ブランクと比較して、BF BSHlow株はタウロリソコール酸（TLCA）に対して低いBSH活性を示したが、他の抱合型胆汁酸に対しては活性を示さなかった（Supplement Fig.4a）。BSHとペニシリンVアシラーゼ（PVA）は関連酵素であり、Ntn（N-terminal nucleophile） linear amide C-N hydrolase enzyme superfamilyに属するcholoylglycine hydrolase（CGH）として分類されており22、BF BSHlowのTLCAに対する低いBSH活性はPVAの存在による可能性があるが、今後の研究でさらに確認が必要であろう。BSHを過剰発現させたBF BSHhighは、培養液中のすべての共役胆汁酸に対して広く強固な活性を示した（補足図4a）。HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにBF BSHlowとBF BSHhighを2週間コロニー形成させ（補足図4b）、回腸、盲腸、結腸の内容物を採取して腸の異なるセグメントにおける胆汁酸の定量を行った。回腸の胆汁酸プールは主に共役胆汁酸で構成され、非共役胆汁酸は非常に少なかった（図4a）。BF BSHhighのコロニー形成により、回腸の共役胆汁酸および総胆汁酸プールは著しく減少した（図4a, b）。盲腸内容物では、胆汁酸プールは非共役胆汁酸と共役胆汁酸の両方を含んでおり、非共役胆汁酸はBSH過剰発現により増加した（Fig. 4c）。盲腸の総胆汁酸量は増加する傾向にあったが、有意ではなかった（Fig. 4d）。しかし、大腸の胆汁酸プールを主に構成する非共役胆汁酸は、BF BSHhighによるコロニー形成によって著しく増加した（図4e, f）。腸の異なるセグメントでの胆汁酸分析に基づくと、BSH発現細菌は回腸または盲腸で共役胆汁酸を非共役胆汁酸に変換し、非共役胆汁酸の結腸への通過の増加を補助した（Fig. 4g）。これは、B. fragilisの主なコロニー形成場所である回腸下部、盲腸、結腸近位部において、微生物のBSH過剰発現により胆汁酸の空間分布のリモデリングが起こるという以前の発見と一致する23。
図4：B. fragilisにおける微生物BSHの過剰発現は、胆汁酸の結腸への逃避を促進する。
図4
a-f HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスに、低BSH活性（BF BSHlow）または高BSH活性（BF BSHhigh）のB. fragilis 638Rを2週間コロニー形成した（BF BSHlowはn = 7マウス、BF BSHhighはn = 8マウス）。回腸内容物中の胆汁酸プロファイル（a）および総胆汁酸量（b）。Mann-Whitney U test with two-sided (a); two-tailed Student's t test (b)。盲腸内容物の胆汁酸プロファイル（c）および総胆汁酸レベル（d）。Mann-Whitney U 検定で両側 (c). 大腸内容物の胆汁酸プロファイル（e）および総胆汁酸レベル（f）。g 共役胆汁酸がBSH発現細菌によって脱共役され、非共役胆汁酸の形で大腸に排出されることを示す模式図。BioRender.comで作成した。データはa-fの平均値+/- SEMで示される。ソースデータはFig.4のSource Data Fileとして提供される。
フルサイズ画像
次に、BSHの過剰発現がCRCの進行に影響を及ぼすかどうかを決定するために、HFD飼育Cdx2Apcf/wマウスのBF BSHlowおよびBF BSHhighの長期コロニー形成が実施された。一貫して、長期のBF BSHhighのコロニー形成は、大腸の非共役胆汁酸プロファイルを有意に増加させた（図5a、b）。HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスのBSHhighコロニー形成は、結腸の長さに大きな変化はなかったが、より重度の結腸腫瘍負荷を示した（図5c-gおよび補足図4c）。がん増強の表現型と一致して、BSHの過剰発現は、結腸腫瘍組織におけるがん細胞の増殖と同様に、WNT/cateninシグナルをより深く活性化させた（図5h-j）。これらの知見を総合すると、NTBFにおけるBSHの過剰発現は、共役胆汁酸から非共役胆汁酸への変換を促進し、それがさらに大腸に逃げ込み（図4g）、WNT/CATENINシグナルの活性化を伴ってCRC進行を加速させることが示唆された。
図5：B. fragilisにおける微生物BSHの過剰発現は、CRCの進行を増強させる。
図5
a-h HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにBF BSHlowまたはBF BSHhighを12週間コロニー形成した（BF BSHlowはn = 11マウス、BF BSHhighはn = 12マウス）。大腸内容物中の非共役胆汁酸プロファイル（a）および総非共役胆汁酸レベル（b）。Mann-Whitney U 検定で両側 (a). 両側スチューデントのt検定(b)。回腸（c）および結腸（d）の腫瘍発生率、および大きさの異なる腫瘍数（＜4mm2、＞4mm2、および両者の合計。Mann-Whitney U test with two-sided. e 腸の総腫瘍数。f, g 結腸の代表写真（左）、結腸の腫瘍の肉眼像（右上）、結腸腫瘍切片のH&E染色（右下）。スケールバー h 結腸非腫瘍（NT）および腫瘍（T）組織における WNT 標的遺伝子の相対的 mRNA レベル（BF BSHlow-NT では n = 10、BF BSHhigh-NT では n = 12、BF BSHlow-T では n = 8、BF BSHhigh-T では n = 10）。i WNTシグナルに関与するタンパク質のWBデータ（n = 3独立サンプル/グループ）。 j Ki-67の代表的なIHC染色（n = 8独立スライド、BF BSHlow; n = 9独立スライド、BF BSHhigh)。スケールバー。100 μm。データは（a-e, h）の平均値+/- SEMとして提示されている。ソースデータはFig. 5のSource Data Fileとして提供されている。
フルサイズ画像
微生物BSHの過剰発現は、腫瘍内免疫抑制特性を誘導した
CRCにおけるBSH過剰発現に起因する根本的な変化を包括的に決定するために、12週間のBF（BSHlowまたはBSHhigh）コロニー化後に、HFD飼育のCdx2Apcf/wマウスから結腸非腫瘍および腫瘍組織を採取し、RNA-seqを行った（補足データ3）。RNA-seqデータのPCAスコアプロットでは、2群（BSHlowとBSHhigh）の結腸非腫瘍組織において、近いクラスタリング遺伝子発現プロファイルが見られた（補足図5a）。さらに、ボルカノプロットでは、BSH過剰発現マウスでは、コントロールマウスと比較して、有意に発現が上昇した遺伝子が1つだけ存在することが示された（補足図5c）。これらのデータは、BSH過剰発現が大腸非腫瘍組織の遺伝子発現にほとんど影響を与えないことを示している。しかし、BF BSHlowとBF BSHhighで処理したCdx2Apcf/wマウスの大腸腫瘍組織では、明らかな分離が観察された（補足図5b）。ボルケーノプロットでは、2群間で結腸腫瘍組織で発現が異なる303のmRNA（287のアップレギュレーションと16のダウンレギュレーション）が含まれていた（Fig. 6a）。有意に異なる遺伝子mRNAのほとんどは、BSHの過剰発現によって増加した。これは、いくつかの腫瘍内腫瘍形成経路がBF BSHによって活性化されたことを示している。この仮説を検証するために、CRC進行中にアップレギュレートされた経路をKEGGパスウェイ解析でスクリーニングした（図6b）。BF BSH高発現マウスの大腸腫瘍組織でヒートマップに見出された有意にアップレギュレートされた遺伝子は、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用とCAM経路に関与していた（図6b, c）。これらの遺伝子の多くは制御性T（Treg）細胞表面マーカーであり、例えばIcos（inducible costimulatoryをコード）、Tigit（ITIMドメインを持つT細胞免疫グロブリンをコード）、Ctla4（細胞障害性T-リンパ球関連タンパク質4をコード）、IL2ra（Cd25とも呼ばれていた。Interleukin 2 receptor subunit αをコードする）、Il2rb（Interleukin 2 receptor subunit βをコードする）、Ccr2/4（C-C motif chemokine receptor 2/4をコードする）、あるいは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（Tnfrsf）24、25、26などTreg細胞の活性化に関連するものが挙げられる。Treg細胞集団を定量化するために、12週間のBF BSHlowまたはBF BSHhighコロニー形成後に結腸腫瘍の単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリー分析を行った（補足図6a）。mRNA解析と一致して、BF BSHhighコロニー化マウスのCD4+T細胞には、BF BSHlowコロニー化マウスのそれよりも高い部分の大腸CD25+FOXP3+Treg細胞が存在した（図6d, f）。その結果、細胞傷害性CD8+ T細胞集団およびTUNEL陽性アポトーシスがん細胞の減少によって示されるように、腫瘍内抗腫瘍免疫応答はBF BSHによって抑制された（図6e、g、hおよび補足図6b）。
図6：B. fragilisにおける微生物BSHの過剰発現は、腫瘍内免疫抑制性を誘発した。
図6
a-c HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにBF BSHlowまたはBF BSHhighを12週間接種し、そこから結腸非腫瘍（NT）および腫瘍（T）組織をmRNA配列決定に適用した（プールしたサンプルサイズ：BF BSHlow_NTについてn = 4個の独立したサンプル；BF BSHhigh_NTについてn = 4個の独立したサンプル；BF BSHlow_Tについてn = 4個の独立したサンプル；BF BSHhigh_Tについては、n = 3個の独立したサンプル）。a 大腸腫瘍組織で発現が増加している遺伝子と減少している遺伝子を示すボルケーノプロット。赤い点（アップレギュレート）と青い点（ダウンレギュレート）は、多重比較修正 P 値 < 0.05 および｜logFC｜ > 1 で有意に変化した mRNA として同定された。微生物によるBSH過剰発現下（BSHhigh vs BSHlow）の結腸腫瘍組織で発現が増加した遺伝子をKEGGパスウェイ解析により有意に（多重比較修正P値＜0.05）濃縮したパスウェイ項を示す。微生物産生BSH過剰発現下（BSHhigh vs BSHlow）でサイトカイン・サイトカイン受容体相互作用および細胞接着分子（CAM）に関与するすべての発現上昇遺伝子を示すヒートマップ（c）。d-g HFD 飼育の Cdx2Apcf/w マウスに BF BSHlow または BF BSHhigh を 12 週間コロニー形成し、そこから大腸腫瘍組織をフローサイトメトリー解析に適用した（n = 4 独立サンプル/群）。フローサイトメトリー解析により、大腸腫瘍組織中のFOXP3+CD25+ Treg細胞（d）およびCD8+ T細胞（e）を測定した。CD4+T細胞におけるFOXP3+CD25+Treg細胞の割合（f）および全T細胞におけるCD8+T細胞の割合（g）。h HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにBF BSHlowまたはBF BSHhighを12週間コロニー形成した（BF BSHlowはn=11マウス；BF BSHhighはn=12マウス）。アポトーシスマーカーであるTUNELの代表的なIHC染色（n = BF BSHlowの独立した8枚のスライド；n = BF BSHhighの独立した9枚のスライド）。スケールバー。100 μm。データは（f, g）の平均値+/- SEMとして提示されている。ソースデータは、図6のソースデータファイルとして提供される。
フルサイズ画像
CCL28による免疫抑制性Treg細胞の蓄積は、BF BSHによって加速されたCRCの進展を説明した。
注目すべきは、Treg細胞の輸送に関与する主要なケモカインであるCCL28をコードするCcl28が、BF BSH高集落化マウスの大腸腫瘍組織で顕著な誘導を示したことである（図6a、c、図7a、b）。BF BSH 加速型 CRC における CCL28 誘発免疫抑制の役割を探るため、抗 CCL28 または抗 CD25 中和抗体を適用して CCL28 または CD25+FOXP3+ Treg 細胞をブロックした27, 28. CCL28 または CD25 の阻害は Treg 細胞の蓄積を減少させ、結腸腫瘍組織における細胞傷害性 CD8+ T 細胞の増加をもたらした (Fig. 7c-f および補足 Fig. 6c-f)．抗体処理は、胆汁酸代謝を妨げなかった（補足図6g-j）。重要なことは、BF BSHによって加速されたCRCの進行は、抗CCL28または抗CD25抗体処理によって改善され、これは主にがん細胞のアポトーシスの増強に起因していた（図7g-n、補足図6k）。
図7：CCL28によるTreg細胞の蓄積は、B. fragilisによるCRC進行の加速に寄与した。
図7
a HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにBF BSHlowまたはBF BSHhighを12週間コロニー形成した（BF BSHlow：n＝8マウス、BF BSHhigh：n＝10マウス）。大腸腫瘍組織におけるCcl28の相対発現。c-f Cdx2Apcf/wマウスにHFDを10週間摂取させた後、BF BSHhighを接種し、IgGまたはmCCL28中和抗体をさらに2週間注射（i.p.）することにより、CCL28蛋白質量を測定した。大腸腫瘍組織をフローサイトメトリー解析に用いた（n = 4 独立したサンプル/群）。フローサイトメトリー解析により、大腸腫瘍組織中のFOXP+CD25+ Treg細胞（c）およびCD8+ T細胞（d）を測定した。CD4+T細胞におけるFOXP+CD25+Treg細胞の割合（e）および全T細胞におけるCD8+T細胞の割合（f）。両側スチューデントのt検定。 g-n HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスを6週間飼育し、BF BSHhighでコロニー形成し、さらに6週間IgG、mCCL28 AbまたはmCD25 Ab中和抗体を注射（i.p）した（IgG Abについてはn = 13マウス；mCCL28 Abについてはn = 8マウス； mCD25 Abについてはn = 9マウス）。回腸（g）および結腸（h）の腫瘍発生率、およびサイズの異なる腫瘍数（＜4mm2、＞4mm2、および両者の合計）。Mann-Whitney U test（両側）。 i 腸の総腫瘍数。j-l 結腸の代表写真（左）、結腸の腫瘍の肉眼像（右上）、結腸腫瘍切片のH&E染色（右下）。スケールバー。1.5mm（右上）、100μm（右下）。TUNELの代表的なIHC染色（m）および定量（n）（IgG Abについては依存性スライドでn＝10、mCCL28 Abについては依存性スライドでn＝7、mCD25 Abについては依存性スライドでn＝7）。スケールバー。100 μm。両側スチューデントのt検定。データは、（a、e-i、n）において平均値+/-SEMとして提示される。ソースデータは、図7のソースデータファイルとして提供される。
フルサイズ画像
胆汁酸はWNT/({{crm}}}-cateninシグナルを活性化し、Ccl28は胃癌細胞におけるβ-catenin標的遺伝子として同定された18,20,29。マウスCyp2c70の発現により、マウスではCDCAのほとんどが、ヒトではLCAを生成する代わりに、親水性のムリコール酸（MCA）に代謝される30,31。CRCマウスモデルでは、BSHを発現するバクテロイデスの影響で一部のムリコール酸が増加したが、臨床的には問題なかった。ヒトとマウスのデータを組み合わせることで、DCA/LCAの下流機序の可能性が探られた。報告されているように、DCAとLCAはファルネソイドX受容体（FXR）とGタンパク質共役型胆汁酸受容体1（GPBAR1、TGR5とも呼ばれる）を活性化し、LCAはビタミンD受容体（VDR）32を活性化する可能性があることがわかった。HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスにおいて、BSHhigh BFは結腸腫瘍組織のTGR5経路を活性化したが、FXRおよびVDRシグナルは増加しなかった（図8a）。非腫瘍組織と比較して、腫瘍組織ではFxrおよびVdr mRNAの相対レベルが低下しており、その結果、転写活性化活性が低くなっている可能性がある（Fig. 8b）。TGR5のβカテニン/CCL28軸における役割を明らかにするために、HFDで飼育したCdx2Apcf/wおよびCdx2Tgr5-/-Apcf/wマウスから結腸腫瘍オルガノイドを分離した (Fig. 8c)。TGR5の欠損により、単一の結腸癌細胞から得られた結腸オルガノイドは少なく、小さくなった（Fig. 8d）。TGR5欠損結腸腫瘍オルガノイドでは、MycやCcnd1などのβ-カテニン標的遺伝子の低発現が一貫して観察された（Fig. 8e）。β-カテニンの分解またはTGR5の欠如のいずれかが、結腸腫瘍オルガノイドにおけるCcl28の相対的発現を減少させた（図8f-h）。したがって、微生物によるBSHの過剰発現下でのCcl28の誘導は、主にWNT/βカテニンシグナル伝達の活性化に起因していた（図8i）。要約すると、NTBFのBSHは腫瘍内の免疫抑制性を誘導していた。さらに、CCL28はBSH過剰発現下でCD25+FOXP3+Treg細胞の輸送に重要な役割を担っていることがわかった。
図8：DCA/LCAは、β-カテニンの存在下でCcl28の発現を制御するTGR5シグナルを活性化する。
図8
a HFDで飼育したCdx2Apcf/wマウスに、BF BSHlowまたはBF BSHhighを12週間コロニー形成した（BF BSHlowはn = 8マウス、BF BSHhighはn = 10マウス）。大腸腫瘍組織におけるFxr、Tgr5、Vdrおよびそれらの標的遺伝子の相対発現量。結腸非腫瘍（NT）および腫瘍（T）組織における Fxr、Tgr5 および Vdr の相対発現（NT では n = 11、T では n = 8 の独立したサンプル）。c-e Cdx2Apcf/wおよびCdx2Tgr5-/-Apcf/wマウスにHFDを10週間以上投与し、大腸腫瘍を大腸オルガノイドとして分離し、さらに培養した（n = 3 independent samples /group）. c Tgr5の相対発現 d 継代後3日目の大腸腫瘍由来オルガノイドの代表画像. スケールバー：200μm。 e ({{{rm}}} - catenin target genesの相対的発現量。f 単離した結腸腫瘍オルガノイドを DMSO または MSAB（10μM、β-カテニン蛋白分解剤）で一晩処理した（n = 3 technical replicates/group）。Ccl28の相対的発現。g, h Cdx2Apcf/wおよびCdx2Tgr5-/-Apcf/wマウスにHFDを10週間以上投与し、大腸腫瘍を大腸オルガノイドとして分離し、さらに培養した（n = 3 technical replicates/group）. g Ccl28の相対的発現. h DMSO、DCA（100μM）、LCA（100μM）、MSABによる一晩処理でのCcl28の相対的発現量。i 結腸癌細胞において、DCA/LCA-TGR5シグナルがCcl28の発現を ({{{{rm{β}}}) -catenin の存在下で制御することを明らかにした図。BioRender.comで作成。データは(a-c, e-h)の平均値+/-SEMで示される。ソースデータはFig.8のSource Data Fileとして提供されている。
フルサイズ画像
微生物BSHの薬理学的阻害によるCRC進行の緩和
CRC 治療のための薬剤ターゲットとしての微生物 BSH の可能性を検証するために、BSH 阻害剤である化合物 7（C7）を使用しました33。C7 の BSH 阻害効果は、まず BF9343 の培養液で確認されました（補足図 7a）。C7のin vivo効果を調べるために、Cdx2Apcf/wマウスにHFDを10週間与え、その後、BF BSHhighをコロニー化して標準HFDまたはHFD含有C7をさらに2週間与える2群に分けた。BF BSHhighをコロニー化したマウスの大腸組織では、C7の投与によりCD25+FOXP3+ Treg細胞の集積が減少し、細胞障害性CD8+ T細胞が増加した（図9a-d）。次に、BF BSHhighをコロニー化したCdx2Apcf/wマウスにおいて、C7含有HFD長期飼育を行ったところ、肝毒性を示さなかった（補足図7b, c）。BSH過剰発現により、大腸の非抱合型胆汁酸過多はC7処理により緩和された（図9e、補足図7d）。C7 投与により、腫瘍負荷の軽減と WNT/β カテニンシグナルの低下が腸で観察されたが、結腸の長さには変化がなかった（図 9f-i および補足図 7e, f）。組織学的解析でも、BF BSHhighでコロニー形成したHFD飼育のCdx2Apcf/wマウスにおいて、C7処理によりCRCの進行が遅延したことが、癌細胞の増殖の低下とアポトーシスの増加によって示された（図9j-m、補足図7g）。In vitroでは、C7処理は、培養結腸腫瘍由来オルガノイドのβ-カテニン/CCL28軸に直接影響を与えなかった（補足図7h）。これらのデータは、CRC治療におけるC7の可能性が、主に微生物のBSHをターゲットにしていることを示唆している。
図9：微生物BSHの薬理学的阻害による大腸癌の緩和。
図9
a-d Cdx2Apcf/wマウスにHFDを10週間与え、その後マウスをBF BSHhighでコロニー化させ、HFDまたは化合物7を加えたHFDをさらに2週間与えた。大腸腫瘍組織をフローサイトメトリー解析に用いた（n = 4 独立したサンプル/群）。フローサイトメトリー解析により、大腸腫瘍組織中のFOXP+CD25+ Treg細胞（a）およびCD8+ T細胞（b）を決定した。CD4+T細胞におけるFOXP+CD25+Treg細胞の割合（c）および全T細胞におけるCD8+T細胞の割合（d）。e-k BF BSHhighコロニー形成下で、Cdx2Apcf/wマウスにHFDまたは化合物7を含むHFDを12週間与えた（ビヒクルについてはn＝13マウス；C7についてはn＝11マウス）。 e 大腸内容物の非共役胆汁酸プロファイル。Mann-Whitney U検定（両側）。回腸（f）および結腸（g）の腫瘍発生率、および異なるサイズの腫瘍数（＜4mm2、＞4mm2、および両者の合計）。h 結腸腫瘍組織における WNT 標的遺伝子と Ccl28 の相対的 mRNA レベル。i CCL28 と WNT シグナルに関与するタンパク質の WB データ（n = 3 独立したサンプル/グループ）。 j, k 大腸の代表写真（左）、大腸の腫瘍の肉眼像（右上）、大腸腫瘍切片の H&E 染色（右下）。スケールバー。1.5mm（右上）および100μm（右下）。Ki-67（l）およびTUNEL（m）の代表的なIHC染色。ビヒクルについてはn = 9個の独立したスライド；C7についてはn = 9個の独立したスライド。スケールバー。100 μm。データは、(c-h)の平均値+/-SEMとして示される。ソースデータは、図9のソースデータファイルとして提供される。
フルサイズ画像
考察
本研究では、BSHを発現するBacteroidesの濃縮が、2つのCRCマウスモデルにおいてCRCの進行を通じて腫瘍形成促進効果を発揮することが明らかにされた。遺伝子組換えB. fragilis株のBSH高発現コロニー形成により、BSH過剰発現は過剰な胆汁酸を大腸に逃がし、CRCの進行を促進することが明らかとなった。胆汁酸は、大腸腫瘍組織においてWNTシグナルを促進し、β-カテニン依存的にCCL28の発現を上昇させる。BSH過剰発現下では、より多くのCD25+FOXP3+ Treg細胞が、より大きなCCL28の輸送により大腸に侵入した。C7による微生物BSHの薬理学的抑制は、CRCの進行を遅らせるのに効果的であることが示された。
LC-MSメタボロミクスやメタゲノム解析などのマルチオミクスアプローチにより、腸内細菌叢、微生物代謝産物、CRC進行の間に強い関係があることが臨床で明らかにされています12,34,35,36,37,38,39。CRC動物モデルおよびヒトCRCデータの相関解析により、Fusobacterium nucleatum、Pks+ Escherichia coli、Bft+ B. fragilisなどいくつかの細菌の大腸発がん作用の可能性が明らかになりました10,40,41,42。本研究では、B. fragilis は HFD 飼育の Cdx2Apcf/w マウスに一貫して濃縮されていた。B. fragilis以外のBacteroides属も、HFD食のCdx2Apcf/wマウスではHFD食のApcf/wマウスより高濃度であった。HFD飼育Cdx2Apcf/wマウスの結腸内容物における非抱合胆汁酸レベルの増加は、微生物BSH活性がCRC進行中に増強されるという見解を支持する。Bacteroides BSHは、小腸内の特定の共役胆汁酸によって引き起こされる糖尿病や多嚢胞性卵巣症候群などの代謝性疾患に関与していることが示されている16,17。しかし、CRCの進行を通して、Bacteroides BSHがどのように大腸の胆汁酸代謝を変化させるかは不明です。胆汁酸は肝臓で産生され、胆汁の形で十二指腸に放出される43。門脈は小腸で胆汁酸の大部分を再吸収して再利用しますが、ごく一部が大腸に逃げ込みます43。今回の研究では、微生物によるBSHの過剰発現が、小腸から大腸への胆汁酸の通過を促進することが明らかになった。以前の追跡調査23では、胆汁酸の空間分布のリモデリングは回腸-結腸接合部におけるB. fragilisのコロニー形成部位と相関があることが明らかにされている。DCAとLCAは微生物のBSH遺伝子によって生産される胆汁酸ではなく、BacteroidesはDCA/LCA生産に関わる他の遺伝子を持っていないが、体重過多のCRC患者のBSHhigh BFと高いLCAをコロニー形成した後にDCAの増加が観察された。したがって、BSHhigh BFの増加は細菌の胆汁酸代謝を開始させ、腫瘍促進作用には二次胆汁酸産生菌の相乗作用が必要である可能性が考えられた。DCA、LCA、タウリン-β-ムリコール酸（TβMCA）など、いくつかの胆汁酸代謝物がCRCプロモーターとして同定された。腸内の DCA、LCA、TβMCA 濃度が上昇すると、WNT/β-カテニンおよび NF-κB シグナル経路18 の活性化などの細胞反応が起こり、DNA 酸化損傷および有糸分裂活性の増強44,45、さらにミトコンドリア酸化ストレス、チトクロム C 放出、細胞質カスパーゼなどの内在性アポトーシス経路の活性化45,46が引き起こされる。一貫して、結腸腫瘍組織におけるWNT/β-カテニンシグナル伝達の異常な活性化は、結腸内の非共役胆汁酸、特にDCAとβMCA負荷の増加を伴う微生物のBSH過剰発現下で観察されていた。多くのCRC研究は血清胆汁酸レベルにのみ着目しているが、微生物活動の変化によるin situの変化に反映される限界もある。本研究では、異なる腸管セグメントの内容物における胆汁酸リモデリングを調査し、CRCの回腸-結腸接合部における局所的な胆汁酸脱共役の変化を明らかにした。
さらに、微生物BSHがCRCの進行を促進するメカニズムを探るため、RNA-seqを実施した。高いBSH活性を持つB. fragilisのコロニー形成により、非腫瘍組織での遺伝子発現プロファイルには変化が見られなかった。しかし、大腸腫瘍組織では、BSH の過剰発現によりサイトカイン・サイトカイン受容体相互作用や CAM 経路に関与する複数の遺伝子の相対発現が上昇し、CRC の進行に伴って一貫して上昇した。このことは、微生物BSHはCRCの発症にはほとんど影響を及ぼさないが、腫瘍内微小環境を変化させることでCRCの進行を促進させることを示している。免疫関連サイトカイン・サイトカイン受容体相互作用およびCAM経路で上昇した遺伝子の大部分は、FOXP3+ Treg細胞の表面指標または活性化因子として同定された24,25,26。腫瘍への豊富なTreg細胞の浸潤は、いくつかの癌における臨床転帰不良の強力な予測因子と考えられているが、CRCにおけるTreg細胞の役割は議論の余地がある47。最近、腫瘍に浸潤するFOXP3+ Treg細胞は、異なるCRC予後と関連する機能的に異なる亜集団であることが判明し48、腫瘍内FOXP3+ Treg細胞の異なる亜型を特定するために、より包括的なマーカーを使用すべきであることが示された。それにもかかわらず、腫瘍組織からFOXP3+ Treg細胞を枯渇させることは、主に免疫抑制を緩和するため、CRCおよび他の悪性腫瘍に対する有効な治療法である49,50,51,52. 本研究では、微生物BSHの過剰発現は、結腸CD4+T細胞におけるFOXP3+Treg細胞の割合が大きくなることで証明されるように、免疫抑制を増強しました。
腫瘍内Treg細胞のリクルートメントに重要なケモカインであるCCL28は、低酸素下で腫瘍耐性と血管新生を促進する53。RNA-seq解析により、微生物BSHの過剰発現が結腸腫瘍組織におけるCcl28の相対的発現を高めることが明らかになり、腫瘍内免疫反応を制御するBSHの役割が示唆された。BF BSH高発現による腫瘍内FOXP3+ Treg細胞の増加は、CCL28を阻害することで部分的に回復し、CRC進行中の腫瘍内FOXP3+ Treg細胞のリクルートにおいてCCL28が重要な役割を果たすことが確認された。Ccl28はβ-カテニンによってポジティブに制御されていたため、微生物によるBSHの過剰発現によるCcl28のアップレギュレーションは、胆汁酸によるWNTシグナルの活性化に起因するものであることがわかった。CCL28 は胃癌細胞において β-catenin の標的遺伝子として同定され、β-catenin/CCL28 軸をブロックすることで Treg 細胞の浸潤と胃癌の進行が抑制される29。CCL28のトラフィッキング効果に加え、腸内細菌叢由来の胆汁酸代謝物は、Treg細胞の分化の重要な制御因子と考えられている54,55。さらに、胆汁酸プールは、大腸FOXP3+ Treg細胞、特にRORγ+ FOXP3+ Treg細胞の維持に必須である56。7α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（7α-HSDH）よりもむしろ、Bacteroidesの微生物BSHが大腸のRORγ+ FOXP3+ Treg細胞の誘導を担っている56。微生物BSHによる免疫反応の修飾に関与するCCL28以外の経路の存在を探るため、さらなる研究が必要である。
代謝異常の治療法として微生物産生BSHを阻害する可能性を検討するために、いくつかのBSH阻害剤が開発されました15,16,33,57。CRCの進行における治療標的としての微生物産生BSHの可能性は、この酵素と共有結合するBSH阻害剤であるC7を用いて検証されました。In vitroおよびin vivoで、C7は微生物BSH活性の強力な減少を示し、C7による長期のHFD処置は大腸胆汁酸負荷、免疫抑制およびCRC進行を緩和した。本研究は、バクテロイデスBSHとCRCの関連性、およびバクテロイデス由来BSHの腫瘍促進活性を説明する根本的なメカニズムを明らかにしました。Bacteroides BSHの阻害は、CRCの治療ターゲットとして有望であると考えられる。
研究方法
倫理規定
このヒト試料収集は、ヘルシンキ宣言で概説された倫理原則に準拠しており、この研究の倫理的承認は、北京大学第三病院倫理委員会（IRB00006761-LM2022557）から取得した。すべての被験者は、本研究への登録前にインフォームド・コンセント用紙に署名している。参加者への報酬は提供されなかった。すべてのマウスは特定病原体フリー（SPF）環境で維持され、マウス実験のためのすべての動物プロトコル（プロトコル番号：LM-027およびLM-092）は、米国国立衛生研究所（NIH）の動物管理・使用委員会（National Cancer Institute: NCI）によって承認された。
ヒト被験者
健康な人、および北京大学第三病院で大腸内視鏡検査によりCRCと診断された人、および/または大腸手術を受けた人が登録された。世界保健機関（WHO）のBMIカットオフ値により、BMI≧25kg/m2の人は過体重群に、BMI＜25kg/m2の人は痩せ型群に属している。除外基準は以下の通りである。(1) 抗生物質、プロバイオティクスを術前4週間使用した患者 (2) 炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の既往のある患者 (3) 他の悪性腫瘍の既往がある患者 (4) 腸管切除の既往がある患者 (5) 術前に新アジュバント療法を行った患者。最終的に45人（対照痩せ型14人、対照太り型11人、CRC痩せ型11人、CRC太り型9人）が研究に含まれた。健康状態に関連する情報（すなわち、年齢、性別、BMIおよび生化学的指標）を収集した（補足表1）。血液サンプルは、室温で30分後、825×gで15分間遠心分離した。上清を分離して血清試料を得、-80℃にて保存した。血液生化学指標（すなわち、TG、TC、AST、ALT）の濃度は、オートアナライザー（BioTek Instruments 800TS）を用いて測定した。糞便サンプルは採取後、直ちにドライアイスで凍結し、その後のメタゲノムおよびメタボローム試験のために-80℃で保存した。
マウス
本研究では、6〜8週齢のC57BL/6J（WT）、C57BL/6J-ApcMin/J（Apcmin/+、The Jackson Laboratory、#002020）、C57BL/6-Apctm1Tyj/J（Apcf/w、The Jackson Laboratory、#009045）およびB6.Cg-Tg (CDX2-cre)101Erf (The Jackson Laboratory、#009350)が適用されました。マウスはランダムに異なるグループに分け、1ケージあたり3-5匹を収容し、NIHのNCIで60% HFD (Bio-Serv, Cat#S3282) と水を自由に摂取できる標準実験条件（照明：8時から20時、温度：21-24℃、湿度：40-70%）で維持された。大腸特異的APC変異を得るために、Apcf/wマウスをCdx2プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを保有するB6.Cg-Tg (CDX2-cre)101Erf マウスと交雑させた。CRC進行中の腸内細菌叢をスクリーニングするために、6-8週齢の雄のApcf/wおよびCdx2Apcf/wマウスに60%HFDを12週間与えた。細菌のコロニー形成については、6〜8週齢の雄性Cdx2Apcf/wマウスに3日間の抗生物質カクテル水［1 mg/mL neomycin（Millipore Sigma、＃N1876）、1 mg/mL streptomycin（Millipore Sigma, #S19137 ）、および1 mg/mL bacitracin（Millipore Sigma, #B0125 ）]を投与し、その後マウスに200 μLの滅菌嫌気性PBS中の2 × 108 CFUの細菌を3日おきに経口投与した。短期的なCCL28遮断のために、6〜8週齢の雄性Cdx2Apcf/wマウスを60％HFDで10週間前処理した後、BF BSHhighでコロニー化し、50mg/kg IgG（clone#HRPN, Bio X Cell, Cat#BP0088）またはmCCL28 Ab（clone#134306, R&D systems, Cat#MAB533）をさらに2週間週2で注射を受けた。長期的なCCL28/Treg細胞遮断のために、6～8週齢の雄性Cdx2Apcf/wマウスを60% HFDで6週間前処理し、BF BSHhighでコロニー化し、IgG（25 mg/kg）、mCCL28 Ab（50 mg/kg）またはmCD25 Ab（25 mg/kg、clone#PC-61.5.3、バイオXセル、Cat#BP0012）の注入をさらに6週間、1週間に2回投与した。短期C7処理については、6〜8週齢の雄性Cdx2Apcf/wマウスを60%HFDで10週間前処理した後、BF BSHhighをコロニー形成し、10mg/kg/d消費に相当する1mg/g C7 (TargetMol) 含有60% HFDまたは60% HFDを摂取させた。長期的なC7処理については、6～8週齢の雄性Cdx2Apcf/wマウスをBF BSHhighでコロニー形成し、C7を含む60%HFDまたは60%HFDを12週間摂取させた。
細菌DNA抽出、16S rRNA配列決定およびショットガン・メタゲノミクス
臨床被験者については、ショットガンメタゲノミクス58 用に便サンプルから DNA を抽出した（700 ng/サンプル）。ゲノムDNAはランダムに短い断片に切断された。得られた断片は、末端を修復し、A-tailedにして、さらにIlluminaアダプターでライゲーションした。アダプターを取り付けた断片をPCR増幅し、サイズ選別、精製を行った。ライブラリーのインサートサイズはAgilent Bioanalyzer 2100システムで評価し、ライブラリーの定量はリアルタイムPCRで確認した。製造元の推奨とインデックスコードに従って、HiSeq 250 PE clustering suiteを採用し、インデックスコードされたサンプルをcBot clustering generation systemでクラスタリングし、Illumina Nova 6000プラットフォームをシーケンスに選択し、150 bp paired-end readsを作成した。
マウスを代謝ケージに24時間入れ、糞のサンプルを採取した。糞便サンプルは、ショットガンメタゲノミクスを用いた腸内細菌叢組成の測定に使用された。E.Z.N.A. stool DNA kit (Omega Bio-Tek, #D4015 ) を用いて、メーカーの説明書に従って糞便からゲノムDNAを抽出した。DNA濃度はNanoDropで測定した。ショットガンメタゲノミクスのために、サンプルはペンシルバニア州立大学ゲノミクスコア施設（University Park, PA）に提出し、NextSeq Mid-Output 150 × 150 paired end sequencingを行った。得られたdemultiplexed readsは、fastqc59を用いて品質をチェックした。メタゲノム配列からホストリードを除去するために、C57BL/6Jマウスのゲノムをアラインメントし、Kneaddata version v0.7.4を用いてトリミングリードのフィルタリングを行った。メタゲノム配列のクリーンリードは、RefSeqのすべての完全なバクテリア、ウイルス、およびアーキアルゲノムからなる標準KrakenデータベースのKraken 2 version 2.0.8-beta60 分類配列アプローチで解析された。各種生物種の存在量はBrackenを使用して推定しました。
メタゲノム配列から宿主のリードを除去するため、トリミングしたリードをC57BL/6Jマウスのゲノムとアラインメントし、Kneaddata61を用いてフィルタリングを行った。機能遺伝子解析のため、胆汁酸代謝に関わるすべてのKegg遺伝子63を用いて、Local Diamondデータベース62を作成した。フィルターしたリードは、Diamond version 0.9.36で、検索フラグsensitiveでローカルデータベースとアライメントした。アラインメント後、各遺伝子の高品質アラインメント（identity > 50%, e-value <1e-4, and bit-score > 40）をカウントした。これらのカウントを総リード数で正規化し、counts-per-millionに変換した。
コロニー形成効率の検出
Bacteroides属菌のコロニー形成後に盲腸内容物を採取し、QIAamp fast DNA stool mini kit (Qiagen, #51604 )を用いてゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNA濃度の測定にはNanoDropを使用した。16S rRNA遺伝子を標的とするBacteroides種特異的プライマーを用いて、10ng/μLのゲノムDNAを定量的リアルタイムPCR解析に供した。特定の16S rRNA遺伝子の相対レベルは、腸内細菌叢のユニバーサル16S rRNA遺伝子で正規化した。プライマーをSupplement Table 2に示す。
胆汁酸の定量
サンプル（25 mg）に内部標準物質［0.5 µM D4-UDCA (Cayman, #21892 )］を含む500 µLのアセトニトリルを添加した。上記組織サンプルをホモジナイズし、18000gで10分間遠心分離し、上清（組織：100μL、血清：150μL）をほぼ乾固するまで濃縮した。濃縮残渣は、200 µLのメタノールと水の混合液（3:7、v/v）で再構成し、機器分析のために注入バイアル/96プレートに移しました。胆汁酸代謝物は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）源を備えたAcquity® UPLC/G2Si QTOFMSシステム（Waters社製）で同定および定量されました。カラムはAcquity® BEH C18 (100 × 2.1 mm; 内径 1.7 mm; Waters Corp.)を使用した。移動相は0.1%ギ酸水溶液(A)と0.1%ギ酸アセトニトリル(B)の混合溶液とした。グラジエント溶出は、80%Aで4分間、11分間で60%A、5分間で40%A、1分間で10%Aと直線的に減少し、最後に80%Aで4分間増加させてカラムを再平衡化させた。カラム温度は45℃に保たれ、流速は0.4 ml/minであった。質量分析はネガティブモードで操作した。m/z 50-1200の質量範囲が取得された。胆汁酸の定量は、MassLynx Version4.2のTargetLynxで解析した。
顕微鏡および組織学的解析
回腸と結腸を採取してPBSで洗浄し、盲腸・結腸接合部から直腸末端までの結腸長を測定した。回腸と大腸を縦に開き、顕微鏡で分析する前に肉眼写真を撮った。腫瘍の数は、Jenoptikカメラとテレビモニターを備えた実体顕微鏡でカウントし、腫瘍サイズはさらにProgRes CaptureProバージョン2.10.0.1で解析し、すべての腫瘍サイズは、NIHの動物看護および使用委員会が許可する最大腫瘍サイズ（いずれの寸法でも2 cm）を超えなかった。組織学的分析のために、結腸腫瘍は10％ホルマリンで24～48時間固定し、固定した組織をパラフィン包埋し、さらに標準的なH＆E染色に処理した。
IHC染色では、組織切片を新鮮なキシレンを用いて室温で5分間3回脱パラフィンし、100％エタノールで室温で5分間3回洗浄した。スライドをエタノール洗浄液（90％、80％、70％、水）に室温で5分間ずつ浸し、試料を再水和させた。DeadEndTM Colorimetric TUNEL System（Promega, # G7130）を使用し、キットの説明書に従ってTUNELアッセイを行った。TUNELシグナル強度と面積の測定には、すべての画像を同じ設定下でKeyence BZ-X710で撮影し、バックグラウンド減算64した後にFijiソフトウェア（ImageJ version 1.53t; National Institutes of Health）上でシグナル強度を測定した。Ki-67染色には、Recombinant Anti-Ki67 抗体（clone#SP6, Abcam, Cat#ab16667, 1:100 dilution）およびVECTASTAIN® Elite® ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) (Vector, #PK -6101) を使用しました。脱パラフィンしたスライドを1×Antigen Unmasking Solution, Citrate-Based (Vector laboratories, #H -3300-250) で10分間加熱し、抗原を回復させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を消去するために、スライドを3％H2O2溶液で15分間インキュベートした。通常のヤギ血清で60分間インキュベートした後、切片をアビジン溶液で15分間、その後ビオチン溶液（Vector, Avidin/Biotin Blocking Kit, #SP -2001） で15分間インキュベートした。その後、2.5%正常ヤギ血清を含むPBSバッファーで希釈したKi-67抗体と4℃で一晩インキュベートした。希釈したビオチン化二次抗体と30分間インキュベートした後、スライドは調製したVECTASTAIN Elite ABC Reagentと30分間インキュベートした。HRP検出系にはImmPACT® DAB Peroxidase Substrate (Vector, #SK -4105) を使用した。
定量的リアルタイムPCR
組織を採取し、処理前に-80 ℃で保存した。組織は TrizolTM Reagent (Invitrogen, #15596026 ) で溶解し、フェノール/クロロホルムで total RNA を抽出した。1μg の total RNA から qSript cDNA SuperMix (Quantabio, #95048 ) で cDNA を合成した。本研究で適用したプライマー配列を付表2に示す。各mRNAの相対レベルは、ActbまたはGapdh mRNAで正規化した後、対照群と比較したfold changeとして算出した。
ウェスタンブロット解析
大腸非腫瘍組織および腫瘍組織をホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤カクテル添加 RIPA 溶解バッファーで溶解させた。タンパク質濃度は、PierceTM BCA protein assay kit (ThermoFisher, #23225 )を用いて定量した。タンパク質サンプルは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動でさらに分離し、ポリフッ化ビニル膜に移した。この膜を、ウサギ抗マウスポリクローナル抗AXIN2（Abcam、Cat#ab32197、1：1000希釈）、ウサギ抗マウスモノクローナルMMP7（clone#D4H5、Cell signaling、Cat#3801、1: 1000 倍希釈）、ウサギ抗マウスモノクローナル抗 ACTB（clone#13E5, Cell signaling, Cat#4670, 1:1000 希釈）、ウサギ抗マウスモノクローナル抗 CCL28（clone#G-2, Santa Cruz, Cat#sc-376654, 1:500 希釈）である。SuperSignal™ west dura extended duration substrate (ThermoFisher, #34075 )を用いてインキュベートした後、イメージアナライザーで特定タンパク質のバンドを可視化した。
マウスでの菌の培養とコロニー形成
B. fragilis 9343、B. fragilis 638 RまたはB. vulgatusをBHI（Brain-Heart Infusion medium）プレート上にストリークし、37℃の嫌気培養器で2日間培養した。単一のコロニーを選び、さらに種培養として5 ml PPS (supplemented Proteose Peptone media) に植え付け、37℃で一晩振とう培養をした。種培養物をさらに膨張培養し、15 mlコーニングチューブに分割して液体窒素で瞬間凍結した後、-80 ℃で保存した。37 ℃で30分間振盪して菌体を回収し、5 × 108 CFU/ml PBSで菌体懸濁液を作製し、マウスの経口投与に供した。3日間の抗生物質カクテル投与後，マウスに200 μLの菌懸濁液または同量の加熱殺菌（100 ℃，10分）した菌懸濁液を3日おきに経口投与した。
BF9343 bsh遺伝子を導入したBF638R株の構築
B. fragilis ATCC 25285染色体（NCTC 9343と同系）から、BF9343_1433モノシストロンオペロンのATG開始コドン上流182bpと停止コドン下流200bpを含む1569bp DNA断片をプライマー CGH-XbaI-FOR および CGH-PstI-REV を用いて増幅した。1569 bpのDNA増幅断片をXbaIとPstI酵素で消化し、pNBU2-bla-ermGb vector65のXbaI/PstI部位にクローン化した。この新規プラスミドBER-300を大腸菌S17-1 λpir66からB. fragilis 638R, Rifr67に既述のように二親交配により動員し68、BER-182を構築した。bsh遺伝子の存在により、BER-182では正の共役胆汁酸活性が付与される（BF BSHhigh）。陰性共役胆汁酸活性コントロール株（BF BSHlow）としては、pNBU-bla-ermGb空ベクターを導入したB. fragilis 638RをBER-154株で用いた。詳細な資料を補足表 3 に示す。
Bacteroides 培養下における共役胆汁酸の加水分解効率
細菌種培養液を2mlのPPS培地に接種し、タウロコール酸（TCA、Millipore Sigma、#86339）、TβMCA（Cayman、#20289）のタウリン共役胆汁酸混合物（各5μM)を含む。タウロヘノデオキシコール酸（TCDCA、Millipore Sigma、＃T6260）、THDCA（Millipore Sigma、＃T0682）、タウロデオキシコール酸（TDCA、Millipore Sigma、＃T0875）およびタウロリトコール酸（TLCA、Millipore Sigma、＃T7515）である。その後、これらの培養物を37℃で一晩嫌気培養した。この培養物全体を胆汁酸の測定に供した。BSH阻害剤の阻害効果を確認するために，接種時に10μMのC7を培養液に添加した。加水分解効果は、菌体培養液中に残存する抱合型胆汁酸の割合で判定し、ブランクコントロールを100％と定義して正規化した。
RNA-seqおよびパスウェイ解析
RNeasy plus mini kit（Qiagen, #74134 ）を用いて、結腸非腫瘍組織および腫瘍組織のtotal RNAを抽出した。mRNA-Seq サンプルはプールし、Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep を用いて NextSeq2000 でシーケンスし、National Cancer Institute Core Sequencing Facility で paired-end sequencing を行った。サンプルのリードは、Cutadaptを用いてアダプターや低品質塩基をトリミングした後、STARを用いて参照ゲノム（mm10）および注釈付き転写産物とアライメントを行いました。マッピング統計はPicardソフトウェアで計算されています。ライブラリーの複雑さは、PicardのMarkDuplicateユーティリティを用いて、マッピングされたリードに含まれるユニークフラグメントの数で測定されます。さらに、STAR/RSEMツールを用いて、全サンプルについて遺伝子発現定量解析を行った。生カウントはさらに、遺伝子発現およびKEGGパスウェイ解析のために、オンラインのNetworkAnalystプラットフォーム（https://www.networkanalyst.ca）にアップロードされた。
フローサイトメトリー解析
腫瘍のある結腸を摘出し、縦に開き、冷PBSで洗浄した。腫瘍を回収し、さらに冷えた colon buffer69 で洗浄し、小さな断片に切断して、100 U/mL collagenase E (Millipore Sigma, #C2193 ) を含む 10 mL 前温 colon buffer で gentleMACS™ C Tubes (Miltenyi Biotec, #130 -093-237) に移し替えた。細胞解離は、gentleMACS™ Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) を用いて行った。単離した単細胞（～1×106）を FACS バッファーに再懸濁し、LIVE/DEADTM fixable yellow dye（ThermoFisher, #L34959 ）と細胞表面マーカーで染色した（1: 100）、ウサギ抗マウスモノクローナル CD45-FITC（clone#30-F11, eBioscience, Cat#11-0451-82）, ハムスター抗マウスモノクローナル CD3e-BUV395（clone#145-2C11, BD Biosciences, Cat#563565）、ラット抗マウスモノクローナル CD4-BUV737（clone#RM4-5, BD Biosciences, Cat#612843）、ラット抗マウスモノクローナル CD8a-PE-Cy7（clone#53-6. 7, BD Biosciences, Cat#552877）、ラット抗マウスモノクローナルCD25-PE（clone#3C7, BD Biosciences, Cat#553075）。さらにラット抗マウスモノクローナルFOXP3（clone#PCH101, eFluor 660, eBioscience, Cat#50-4776-42）抗体を用いて核FOXP3（1：50）で染色する前に、eBioscienceTM FOPX3/転写因子染色バッファセット（サーモフィッシャー、#00-5523-00）で固定・透過処理を施した。フローサイトメトリー解析は、LSRFortessa SORP I（BD Biosciences社製）により行った。
大腸腫瘍オルガノイドの分離と培養
腫瘍のある大腸を採取し、冷PBSで洗浄した後、縦に開いた。大腸腫瘍オルガノイドの単離と培養は、既報の通り行った70。簡単に言えば、大腸腫瘍を顕微鏡下でハサミで切除した。大腸腫瘍組織はさらに小片に切断され、正常な腸上皮を除去するために、氷上で 60 分間 EDTA キレートバッファーとインキュベートされた。キレート後、結腸腫瘍組織をさらに、200 U/ml IV型コラゲナーゼ（STEMCELL technologies、#07247）および125 μg/ml II型ディスパーゼ（Millipore Sigma、#D4693）を含む消化バッファとともに37℃、120分間インキュベートした。単一腫瘍細胞懸濁液を、冷えたMatrigel（Corning、#354230）-基礎培養液混合液で再懸濁し、24ウェルプレートに播種し重合させた。単離した単一腫瘍細胞は、50 ng/mL マウス EGF (R&D systems, #2028 -EG) を含む基底培養液中で結腸腫瘍形成オルガノイドを形成する。
データ解析
データ分析中に除外されたデータはなく、統計データの収集と分析にはMicrosoft Excelバージョン16.68とGraphPad Prismバージョン9.0が使用された。すべてのデータは平均値±SEMで示し、有意性判定には両側Studentのt検定、Mann-Whitney U検定、Tukeyのポストホック検定を伴う一元配置分散分析、Kruskal-Wallis検定に続いてDunnの検定が行われた。P値＜0.05を有意とした。フローサイトメトリーデータ解析は、Flow Jo Version 10（BD Biosciences社製）を用いて実施した。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの入手方法
バルクmRNA-seqの結果はSupplement Data 3に記載されており、オリジナルのシーケンスデータセットはGEOデータベースにアクセッションコードGSE190298で寄託されている。ヒトおよびマウスのショットガンメタゲノム解析結果は、Supplementary Data 1および2に記載されており、配列決定データセットは、マウスについてはPRJNA786913、ヒトについてはPRJNA881471のアクセッションコードで、National Library of Medicineの公開データベースにアップロードされている。残りのデータは、論文、補足情報またはソースデータファイル内で利用可能です。ソースデータは本論文に添付されています。
コードの入手方法
本研究で実施した解析に使用したコードは、GitHub (https://github.com/bipinrimal/Lulu_BfragBSH/) でアクセスでき、Zenodo71 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7460215) に保存されています。
参考文献
Siegel, R. L. et al. Colorectal cancer statistics, 2020（大腸がん統計、2020年）。CA Cancer J. Clin. 70, 145-164 (2020).
論文
Google Scholar
Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer（ヒト結腸・直腸癌の包括的分子特性）。Nature 487, 330-337 (2012).
論文
ADS
Google Scholar
Fodde, R., Smits, R. & Clevers, H. APC、シグナル伝達、大腸癌における遺伝的不安定性。Nat. Rev. Cancer 1, 55-67 (2001).
論文
CAS
Google Scholar
Romano, G., Chagani, S. & Kwong, L. N. The path to metastatic mouse models of colorectal cancer（大腸がん転移マウスモデルへの道）。オンコジーン 37, 2481-2489 (2018).
論文
キャス
Google Scholar
Garrett, W. S. The gut microbiota and colon cancer（腸内細菌叢と大腸がん）. サイエンス 364, 1133-1135 (2019年).
論文
ADS
キャス
Google Scholar
Dejea, C. M. et al. 家族性腺腫性ポリポーシス患者は、腫瘍原性細菌を含む大腸バイオフィルムを保有する。サイエンス 359, 592-597 (2018).
論文
ADS
キャス
グーグル スカラー
Wu, S., Rhee, K. J., Zhang, M., Franco, A. & Sears, C. L. Bacteroides fragilis toxin stimulates intestinal epithelial cell shedding and gamma-secretase-dependent E-cadherin cleavage. J. Cell Sci. 120, 1944-1952 (2007).
論文
CAS
Google Scholar
Bacteroides fragilis enterotoxinは、c-Mycの発現と細胞増殖を誘導する。Gastroenterology 124, 392-400 (2003).
論文
CAS
Google Scholar
Goodwin, A. C. et al. ポリアミン異化作用は、腸内毒素原性バクテロイデス・フラジリスによる結腸腫瘍の発生に寄与する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, 15354-15359 (2011).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Liu, Q. Q. et al. Enterotoxigenic Bacteroides fragilis induces the stemness in colorectal cancer via upregulating histone demethylase JMJD2B. Gut Microbes 12, 1788900 (2020).
論文
Google Scholar
Cao, Y. et al. Enterotoxigenic Bacteroidesfragilisは、エキソソームパッケージのmiR-149-3pfを阻害することにより、腸の炎症と悪性腫瘍を促進させる。Gastroenterology 161, 1552-1566.e12 (2021).
論文
CAS
Google Scholar
Wirbel, J. et al. 糞便メタゲノムのメタ解析により、大腸がんに特異的なグローバルな微生物シグネチャーが明らかになりました。Nat. Med. 25, 679-689 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Kordahi, M. C. et al. 早期大腸癌に関与する粘膜共生生物のゲノムおよび機能的特徴づけ。Cell Host Microbe 29, 1589-1598.e1586 (2021).
論文
CAS
Google Scholar
このような背景のもと、「胆汁酸加水分解酵素の機能的・比較的なメタゲノム解析」を行い、胆汁酸加水分解酵素の活性を明らかにした。Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 13580-13585 (2008).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Huang, F. et al. Pu-erh茶のテアブラウニンは、腸内細菌叢と胆汁酸代謝の調節を介して高コレステロール血症を軽減する。Nat. Commun. 10, 4971 (2019).
論文
ADS
Google Scholar
Sun, L. et al. Gut microbiota and intestinal FXR mediate the clinical benefits of metformin.腸内細菌叢と腸内FXRがメトホルミンの臨床的利益をもたらす。Nat. Med. 24, 1919-1929 (2018).
論文紹介
キャス
Google Scholar
Qi, X. et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome.腸内細菌叢-胆汁酸-インターロイキン-22軸は、多嚢胞性卵巣症候群を形成する。Nat. Med. 25, 1225-1233 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Fu, T. et al. FXR Regulates Intestinal Cancer Stem. Cell Prolif. Cell 176, 1098-1112.e1018 (2019).
キャス
Google Scholar
Song, Z. et al. 世界的なヒト腸内細菌群に基づく細菌性胆汁酸塩ヒドロラーゼ（BSH）遺伝子の分類学的プロファイリングと人口パターン。マイクロバイオーム 7, 9 (2019).
論文
Google Scholar
Farhana, L. et al. Bile acid: a potential inducer of colon cancer stem cells.胆汁酸：大腸がん幹細胞の潜在的な誘導因子。Stem Cell Res. Ther. 7, 181 (2016).
論文
Google Scholar
Yao, L. et al. 選択的な腸内細菌胆汁酸塩ヒドロラーゼが宿主の代謝を変化させる. Elife 7, e37182 (2018).
記事
Google Scholar
Daly, J. W., Keely, S. J. & Gahan, C. G. M. BSHおよびPVA酵素の機能的および系統学的多様性. Microorganisms 9, 732 (2021).
論文
CAS
Google Scholar
Xu, W. et al. In vivo 代謝標識による新規バクテロイデス・フラジリス株のイメージング. Front. Microbiol. 9, 2298 (2018).
論文
Google Scholar
Romano, M., Fanelli, G., Albany, C. J., Giganti, G. & Lombardi, G. Past, Present, and Future of regulatory T cell therapy in transplantation and autoimmunity（移植と自己免疫における制御性T細胞治療の過去、現在、未来）. Front. Immunol. 10, 43 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Ohue, Y. & Nishikawa, H. Regulatory T (Treg) cells in cancer: Can Treg cells be a new therapeutic target? Cancer Sci. 110, 2080-2089 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Mahmud, S. A. et al. tumor-necrosis factor receptor superfamilyを介したコスト刺激は、TCRシグナル強度を制御性T細胞の胸腺分化にカップリングさせる。Nat. Immunol. 15, 473-481 (2014).
論文
CAS
Google Scholar
Wang, P. et al. CCL28は、制御性T細胞のリクルートを介して脊髄損傷後の運動器回復を促進します。Aging 11, 7402-7415 (2019年)。
論文
キャス
Google Scholar
Clemente-Casares, X. et al. Expanding antigen-specific regulatory networks to treat autoimmunity（抗原特異的制御ネットワークの拡大による自己免疫の治療）. ネイチャー530, 434-440 (2016).
論文
ADS
キャス
Google Scholar
Ji, L. et al. βカテニン誘導型CCL28の遮断は、Treg細胞浸潤の抑制を介して胃癌の進行を抑制する。Cancer Res. 80, 2004-2016 (2020)に掲載されました。
論文
CAS
Google Scholar
本多明彦ほか 疎水性胆汁酸組成モデルマウスにおける胆汁酸代謝の制御. J. Lipid Res. 61, 54-69 (2020).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Takahashi, S. et al. Cyp2c70は、マウスとヒトの胆汁酸代謝の種差に関与する。J. Lipid Res. 57, 2130-2137 (2016).
論文
CAS
Google Scholar
Pols, T. W., Noriega, L. G., Nomura, M., Auwerx, J. & Schoonjans, K. The bile acid membrane receptor TGR5 as an emerging target in metabolism and inflammation.胆汁酸膜受容体は代謝と炎症における新たな標的である。J. Hepatol. 54, 1263-1272 (2011).
論文
CAS
Google Scholar
Adhikari, A. A. et al.腸内細菌型胆汁酸加水分解酵素の共有結合阻害剤の開発。Nat. Chem. Biol. 16, 318-326 (2020)に掲載されました。
論文
CAS
Google Scholar
Weir, T. L. et al. 大腸がん患者と健常成人の便のマイクロバイオームとメタボロームの違い。PLoS One 8, e70803 (2013).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Yu, J. et al. Metagenomic analysis of faecal microbiome as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for colorectal cancer.大腸癌の標的非侵襲的バイオマーカーに向けた糞便マイクロバイオームのメタゲノム解析。Gut 66, 70-78 (2017).
論文
キャス
Google Scholar
Yachida, S. et al. Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinct stage-specific phenotypes of the gut microbiota in colorectal cancer.メタゲノム解析とメタボローム解析により、大腸がんにおける腸内細菌叢の段階特異的な表現型が明らかになった。Nat. Med. 25, 968-976 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Dai, Z. et al. Multi-cohort analysis of colorectal cancer metagenome identified altered bacteria across populations and universal bacterial markers. マイクロバイオーム 6, 70 (2018).
論文
Google Scholar
Feng, Q. et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma-carcinoma sequence（大腸腺腫-癌の配列に沿った腸内細菌の発達）。Nat. Commun. 6, 6528 (2015).
論文
ADS
キャス
Google Scholar
Kuhn, T. et al. Prediagnostic plasma bile acid levels and colon cancer rsk.（診断前の血漿胆汁酸レベルと大腸がんrsk: プロスペクティブスタディー。J. Natl Cancer Inst. 112, 516-524 (2020).
論文
Google Scholar
Brennan, C. A. & Garrett, W. S. Fusobacterium nucleatum - symbiont, opportunist and oncobacterium（フソバクテリウム・ヌクレアタム：共生菌、日和見菌、腫瘍菌）。Nat. Rev. Microbiol. 17, 156-166 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Pleguezuelos-Manzano, C. et al. 遺伝毒性pks(+) E. coliによる大腸癌の変異シグネチャー(Mutational signature in colorectal cancer). Nature 580, 269-273 (2020).
論文
ADS
キャス
Google Scholar
Cougnoux, A. et al. 細菌のジェノトキシンであるコリバクチンは、老化に関連した分泌表現型を誘導することにより、大腸腫瘍の成長を促進する。Gut 63, 1932-1942 (2014).
論文
CAS
Google Scholar
Foley, M. H., O'Flaherty, S., Barrangou, R. & Theriot, C. M. Bile salt hydrolases: gatekeepers of bile acid metabolism and host-microbiome crosstalk in the gastrointestinal tract.消化管における胆汁酸代謝の門番と宿主微生物間のクロストーク。PLoS Pathog. 15, e1007581 (2019).
論文
Google Scholar
Nusse, R. & Clevers, H. Wnt/β-カテニンシグナル伝達、疾患、および新たな治療法. Cell 169, 985-999 (2017)。
論文
キャス
Google Scholar
Jia, W., Xie, G. & Jia, W. Bile acid-microbiota crosstalk in gastrointestinal inflammation and carcinogenesis.（消化管の炎症と発癌における胆汁酸-微生物相のクロストーク）。Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 15, 111-128 (2018).
論文
CAS
Google Scholar
Gadaleta, R. M., Garcia-Irigoyen, O. & Moschetta, A. Bile acids and colon cancer: Is FXR the solution of the conundrum? Mol. Asp. Med. 56, 66-74 (2017).
論文
CAS
Google Scholar
Betts, G. et al. Regulatory T cellsによる腫瘍特異的CD4+ T細胞の抑制は、ヒト大腸癌の進行と関連している。Gut 61, 1163-1171 (2012).
論文
CAS
Google Scholar
Saito, T. et al. 2つのFOXP3(+)CD4(+)T細胞亜集団が大腸癌の予後を明確に制御している。Nat. Med. 22, 679-684 (2016).
論文
CAS
Google Scholar
Olguin, J. E. et al. 大腸炎に伴う大腸がん発症中のCD4(+)Foxp3(+)制御性T細胞の早期かつ部分的減少により、腫瘍形成を抑制するCD4(+)とCD8(+)のT細胞活性化が誘導される。J. Cancer 9, 239-249 (2018).
論文
Google Scholar
Pastille, E. et al. 制御性T細胞の一過性のアブレーションは、大腸炎関連結腸癌の抗腫瘍免疫を改善する。Cancer Res. 74, 4258-4269 (2014).
論文
CAS
Google Scholar
Sato, K. et al. 近赤外線光免疫療法による腫瘍関連制御性T細胞の空間選択的なディプリーション。Sci. Transl. Med. 8, 352ra110 (2016)に掲載されました。
論文
Google Scholar
Arce Vargas, F. et al. Fc最適化抗CD25は腫瘍浸潤制御性T細胞を枯渇させ、PD-1遮断と相乗して確立腫瘍を撲滅します。Immunity 46, 577-586 (2017).
論文
キャス
Google Scholar
Facciabene, A. et al. Tumour hypoxia promotes tolerance and angiogenesis via CCL28 and Treg cells.腫瘍の低酸素は、CCL28とTreg細胞を介して寛容と血管新生を促進する。Nature 475, 226-230 (2011)。
論文
CAS
Google Scholar
Hang, S. et al. 胆汁酸代謝産物は、TH17およびTreg細胞の分化を制御する。Nature 576, 143-148 (2019年)。
論文
ADS
キャス
Google Scholar
Campbell, C. et al. 胆汁酸の細菌代謝は、末梢性制御性T細胞の生成を促進する。Nature 581, 475-479 (2020).
論文
ADS
キャス
Google Scholar
Song, X. et al. 微生物の胆汁酸代謝産物が腸内RORγ(+)制御性T細胞のホメオスタシスを調節する. Nature 577, 410-415 (2020).
論文
CAS
Google Scholar
Adhikari, A. A. et al. A gut-restricted lithocholic acid analog as an inhibitor of gut bacterial bile salt hydrolases（腸内細菌胆汁酸ヒドロラーゼの阻害剤としての腸内限定リトコール酸アナログ）。ACS Chem. Biol. 16, 1401-1412 (2021)に掲載されました。
論文
CAS
Google Scholar
Wu, Q. et al. 腸管低酸素誘導因子2αは乳酸レベルを制御し、腸内細菌叢を形成し、熱産生を変化させる。Cell Metab. 33, 1988-2003.e1987 (2021).
論文
CAS
Google Scholar
Wingett, S. W. & Andrews, S. FastQ Screen: マルチゲノムマッピングと品質管理のためのツール。F1000Res 7, 1338 (2018).
論文
Google Scholar
Wood, D. E., Lu, J. & Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2（クラーケン2によるメタゲノム解析の改善）。Genome Biol. 20, 257 (2019)。
論文
キャス
Google Scholar
Beghini, F. et al. bioBakery 3による多様な微生物コミュニティの分類学的、機能的、および株レベルのプロファイリングの統合. Elife 10, e65088 (2021).
論文
CAS
Google Scholar
Buchfink, B., Xie, C. & Huson, D. H. DIAMONDを用いた高速かつ高感度なタンパク質アライメント。Nat. Methods 12, 59-60 (2015).
論文
CAS
Google Scholar
KEGGによるパスウェイとゲノムの分類学的解析(KEGG for taxonomy-based analysis of pathway and genomes). Nucleic Acids Res. 51, D587-D592(2022).
FUS封入体は、キネシン1を封入し、微小管のデチロシン化を阻害することにより、RNA局在を乱す。J. Cell Biol. 216, 1015-1034 (2017).
論文
キャス
Google Scholar
Koropatkin, N. M., Martens, E. C., Gordon, J. I. & Smith, T. J. Starch catabolism by a prominent human gut symbiont is directed by the recognition of amylose helices.ヒト腸内共生生物によるでんぷん異化作用は、アミロースヘリックスを認識することによって行われる。Structure 16, 1105-1115 (2008).
論文
CAS
Google Scholar
生体内遺伝子工学のための広範な宿主域動員システム：グラム陰性菌におけるトランスポゾン変異誘発。Bio/Technol. 1, 784-791 (1983).
論文
CAS
Google Scholar
バクテロイデス・フラジリスの亜種間における多剤耐性菌の移行。J. Infect. Dis. 139, 97-101 (1979).
論文
CAS
Google Scholar
テトラピロール合成能を欠くバクテロイデス類の間で保存されているuroSおよびyifB遺伝子は、実験的腹腔内感染および腸管コロニー形成におけるバクテロイデス・フラジリスのヘム同化および生存に関与していることを示した。Infect. Immun. 88, e00103-20 (2020).
論文
Google Scholar
McManus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. A. J. & Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase E.J. Vis. Exp. 26, 10.3791/59821 (2019).
グーグル スカラ
Xue, X. & Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors（マウス大腸腫瘍の体外培養）. J. Vis. Exp. 17, e50210 (2013).
Google Scholar
Sun, L., Rimal, B. & Gonzalez, F. et al. https://doi.org/10.5281/zenodo.7460215 (2022)。
参考文献のダウンロード
謝辞
この研究は、主に米国国立衛生研究所、国立がん研究所、がん研究センター、NIH U01 DK119702の学内研究プログラムによる資金援助を受けて行われたものである。ヒトサンプルの収集と処理は、中国国家自然科学基金（番号62173005）および中国国家衛生家族計画委員会基金（番号2020YB57）の支援を受けている。
資金提供
米国国立衛生研究所（NIH）よりオープンアクセスの資金提供を受けた。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Lulu Sun, Yi Zhang.
著者と所属
米国国立がん研究所がん研究センター代謝研究室（20892, MD, Bethesda, USA
Lulu Sun, Jie Cai, Yuhong Luo, Bora Kim, Yaozong Chen, Kristopher W. Krausz, Shogo Takahashi & Frank J. Gonzalez
北京大学第三病院癌センター一般外科 〒100191 中国 北京市楠町1-1-1
Yi Zhang & Zhipeng Zhang
ペンシルバニア州立大学獣医・生物医学部分子毒性学・発がんセンター（米国ペンシルバニア州ユニバーシティ・パーク、16802
Bipin Rimal、Robert G. Nichols、Andrew D. Patterson
イーストカロライナ大学医学部微生物学・免疫学教室、グリーンビル、ノースカロライナ州、27834、USA
エドソン R. ロシャ＆ジェームス P. コールマン
米国国立がん研究所がん研究センター発がん研究室（米国メリーランド州ベセスダ、20892
チェンラン・チャン＆カーティス・C・ハリス
寄稿
L.S.とF.J.G.が研究をデザインし、L.S.、J.C.、S.T.、Y.L.、B.K、および Y.C が研究で報告されたほとんどの実験を行い、 Y.Z と Z.Z がヒト試料の収集と加工を手伝いました。B.R. と R.G.N. は 16S rRNA とメタゲノム配列の決定とデータ解析を行い、E.R. と J.P.C. は BF BSHlow 株と BF BSHhigh 株を作製しました。C.Z.は大腸でのフローサイトメトリー解析のセットアップに協力した。K.W.K.は胆汁酸の検出を支援した。C.C.H.とA.D.P.はコンセプトに関する助言を行い、L.S.、J.C.、F.J.G.は原稿を書き、全著者が編集にあたった。
連絡先
Andrew D. Patterson, Zhipeng Zhang, Shogo Takahashi, または Frank J. Gonzalez に連絡すること。
倫理に関する宣言
利益相反
著者らは，競合する利益を宣言しない。
査読
査読情報
Nature Communicationsは、この論文の査読に貢献したFranck Housseau氏、Jie Hong氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。
補足情報
補足情報
追加補足ファイルの説明
補足データ1
補足データ2
補足資料3
報告書概要
ソースデータ
ソースデータ
権利と許可
オープンアクセス この記事はクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可しています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたが意図する利用が法令上の規制で許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
CrossMarkで通貨と真正性を検証する
この記事の引用
Sun, L., Zhang, Y., Cai, J. et al. Bile salt hydrolase in non-enterotoxigenic Bacteroides potentiates colorectal cancer（非腸管毒性バクテロイデスの胆汁酸ヒドロラーゼは大腸がんを増強する。Nat Commun 14, 755 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41467-023-36089-9。
引用文献のダウンロード
受領日
2022年1月31日
受理済
2023年1月16日
掲載
2023年2月10日発行
DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-36089-9
この記事を共有する
以下のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。
共有可能なリンクを取得する
コンテンツ共有イニシアチブ「Springer Nature SharedIt」により提供されます。
対象者
大腸がん
腫瘍免疫学
コメント
コメントを投稿することで、私たちの規約とコミュニティ・ガイドラインに従うことに同意したことになります。もし、不適切な内容や、規約やガイドラインに反する内容を発見された場合は、不適切であるとしてフラグを立ててください。
ネイチャーコミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723(オンライン)
ネイチャー・ドット・コム サイトマップ
ネイチャー・ポートフォリオについて
ネイチャーズについて
プレスリリース
プレスオフィス
お問い合わせ
コンテンツ検索
ジャーナルA-Z
テーマ別記事
ナノ
プロトコル交換
ネイチャー・インデックス
出版ポリシー
ネイチャー・ポートフォリオ方針
オープンアクセス
著者・研究者サービス
リプリントとパーミッション
研究データ
言語編集
科学編集
ネイチャー・マスタークラス
ネイチャーリサーチアカデミー
リサーチソリューション
図書館・機関
図書館サービス＆ツール
図書館員ポータル
オープンリサーチ
図書館に推薦する
広告とパートナーシップ
広告・宣伝
パートナーシップとサービス
メディアキット
ブランデッドコンテンツ
キャリア開発
ネイチャーズキャリア
ネイチャーコンファレンス
ネイチャーイベント
地域別ウェブサイト
ネイチャーアフリカ
ネイチャー・チャイナ
インド
ネイチャー・イタリア
ネイチャー・ジャパン
ネイチャー・コリア
ネイチャー・ミドルイースト
プライバシーポリシー クッキーの使用 クッキーの管理/私のデータを売らない 法的通知 アクセシビリティに関する声明 利用規約 カリフォルニア プライバシーに関する声明
シュプリンガー・ネイチャー
© 2023 シュプリンガー・ネイチャー・リミテッド
この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？