抗生物質不使用の膣内細菌叢移植によるドナー生着、腸内細菌叢異常の解消、および再発性妊娠喪失後の生児出産：概念実証症例研究

論文|第61巻、102070号、2023年7月

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抗生物質不使用の膣内細菌叢移植によるドナー生着、腸内細菌叢異常の解消、および再発性妊娠喪失後の生児出産：概念実証症例研究

https://www.thelancet.com/journals/eclinm/article/PIIS2589-5370(23)00247-X/fulltext

ティネ・ルンディング
キリアン・フォムスタイン
エルケ・F・ボスマ
ブリンユルフ・モーテンセン
ヘンリック・ウェスト
ジュリー・エルム・ハインツ
他
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オープンアクセス掲載:2023年6月26日DOI:https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2023.102070
PlumXメトリクス

概要
背景
膣内細菌叢異常症は、細菌、ウイルス、および真菌の組成の変化によって定義される膣内細菌叢の不均衡を対象とし、双胎妊娠喪失、早産、不妊症、または細菌性膣炎と関連している。膣内細菌叢異常症を持つ女性の大部分は、何の症状も経験しない。抗生物質が伝統的な治療法であり、最近では局所的なプロバイオティクスを併用するケースもある。抗生物質で病原体を除菌した後、ユビオティック膣内細菌叢を用いた膣内細菌叢移植（VMT）が5例の症例研究で成功しているが、抗生物質を使用しないVMTは行われていない。
方法
これは概念実証のケーススタディである。患者は2021年6月23日にデンマークのコペンハーゲン大学病院HvidovreのRPLクリニックで膣内異常膣症を発見された。彼女は、同情的使用事例として、VMTという形で実験的治療を受けることを提案され、受け入れた。VMTとは、乳酸桿菌優位の膣マイクロバイオームを持つ健康なドナーから、ディスバイオティックな膣マイクロバイオームを持つレシピエントへの頸膣分泌液（CVS）の移植である。CVSは、腟内に存在する粘液、細菌、代謝産物などの混合物である。ドナー候補は、STIが存在しないかどうか徹底的にスクリーニングされ、本研究の特定の患者に最も適したドナーサンプルは、in vitroマイクロバイオーム競合アッセイによって決定された。
所見
妊娠27週目（2019年）、17週目（2020年）、23週目（2020年）にそれぞれ2回の死産と1回の妊娠中期敗退を経験し、すべての妊娠で悪化した膣の炎症と分泌物を訴えた30歳の患者。彼女の膣マイクロバイオーム組成は、90％がGardnerella属であった。1回のVMT後、マイクロバイオーム組成は81.2％のL. crispatusと9％のL. jenseniiに完全にシフトし、同時に膣症状が消失した。一塩基多型解析の結果、彼女のマイクロバイオームはドナー由来であることが確認され、VMTから1年半後の現在も安定している。VMTから5ヵ月後に妊娠し、無事正期産で健康な赤ちゃんを出産した。
解釈
ここでは、ドナー株移植が確認されたVMTの成功例と、妊娠後期敗産・死産を繰り返した後の妊娠・出産の成功例を報告する。この所見は、VMTが重症の膣内細菌異常症に対する潜在的治療法であることを示唆している。さらに大規模な研究が必要である。
資金提供
本研究の一部（すなわち解析費用）は、Freya Biosciences Aps, Fruebjergvej, 2100 Copenhagen, Denmarkから資金提供を受けた。
キーワード
膣内細菌叢移植
VMT
膣マイクロバイオーム
ショットガンメタゲノミクス
一塩基変異体
再発妊娠損失
流産
研究の背景
はじめに
健康な膣マイクロバイオームは、通常、単一または数種の膣乳酸菌（L. crispatus、L. gasseri、L. iners、L. jensenii）1, 2, 3によって支配されている。これらの乳酸菌による乳酸の産生は、pHをpH4.5以下まで低下させ、この膣内環境の酸性化は、個体にとって有益である4。ビフィドバクテリウム・バギナーレ（旧ガードネレラ・バギナリス）、ファニーヘッセア・バギナエ（旧アトポビウム・バギナエ）、ガードネレラ属菌、プレボテラ属菌などの他の細菌が優勢な、より多様な膣マイクロバイオームは、膣内ディスバイオーシス（VD）と表現される。 1, 2, 3 VDは女性の18-29%に見られる5,6。VDは、体外受精（IVF）での妊娠確率の低下、異数性妊娠喪失のリスクの上昇、および膜早期破裂（PPROM）や早産などの産科合併症と強く関連している7、 8, 9, 10 VDの女性の多くは、においやおりものなどの膣症状を訴えず、婦人科的評価を受けても、それ以外は健康であるように見える。
従来、症候性VDは、メトロニダゾールやクリンダマイシンなどの抗生物質を経口または経腟投与することで治療されており、治療後1ヵ月での治癒率は80～90％である1,12,13。しかし、症候性VDに対する抗生物質治療には、治療後12ヵ月以内の再発率が最大60％12であることや、膣炎関連細菌に抗生物質耐性が生じる危険性があることなど、いくつかの大きな欠点がある14、 15,16さらに、経口投与された抗生物質は腸内細菌叢の乱れを引き起こす可能性があり17、抗生物質の局所適用はしばしばその後の外陰膣カンジダ症につながる18。VDの抗生物質治療に関連するリスクを最小限に抑えるために、2019年の研究では、抗生物質レジメンに続いて健康なドナーからの膣内細菌叢移植（VMT）で治療された再発性VDの女性5人が報告された。その結果、4人の女性が抗生物質とVMTの併用療法を3回まで受けた後、長期的な臨床的寛解を経験しており、非常に勇気づけられるものであった19。
本報告は、9年間VDを再発し、臨床的VD症状が顕著で、1度妊娠に成功し た後、3度の妊娠後期流産を経験した30歳の女性の報告である。概念実証として、抗生物質の前処置なしで初めてVMTに成功した経過を概説する。
方法
患者
患者は30歳の女性で、過去に4回の妊娠歴があった。最初の合併症のない妊娠では男児を生んだが（2017年）、その後2回の死産と1回の妊娠後期の流産を含む合併症妊娠歴があった。彼女は、2021年6月23日にデンマークのコペンハーゲン大学病院Hvidovreの再発性妊娠喪失クリニックに紹介された。27週目（2019年）の最初の死産は胎盤剥離によるものであった。剖検では異常なしと報告された。2回目の妊娠は17週目（2020年）に終了し、子宮頸管機能不全が原因であった。そのため、患者は次の妊娠の妊娠13週目に予防的子宮頸管閉鎖術を受けた。残念なことに、その妊娠は感染の臨床的徴候のないPPROMにより終了し、妊娠23週目（2020年）に死産となった。最初の死産後、患者は抗リン脂質症候群（APLS）と血栓症のスクリーニングを受けたが、結果は陰性であった（表1）。以前のすべての妊娠中、患者は、黄色/緑色を呈する多量の膣分泌物、悪臭、かゆみ、痛みと表現されるVD症状に悩まされていたと報告した。抗真菌薬による治療を繰り返したが、全く効果がなかったか、数週間後に症状が再発したと報告した。死産後の2019年には陰性であったが、2021年8月にβ2-糖蛋白1-IgGの上昇が確認され、病歴からAPLSと診断された。腟症状が持続したため、腟スワブを採取し、ショットガンシークエンスで解析した結果、VDが確認された。2021年の再発妊娠喪失（RPL）の評価結果を表1に示す。これらのデータを総合すると、膣内細菌叢を乳酸桿菌優位の細菌叢に置き換える介入により、妊娠転帰の改善が達成される可能性が示された。彼女は、VDの実験的治療としてコンパッショネート・ユース（CU）のVMTを提案され、それを受け入れた。彼女は、Freya Biosciences Aps社（デンマーク、コペンハーゲン、Fruebjergvej 3）およびコペンハーゲン大学病院Hvidovre婦人科（デンマーク、コペンハーゲン）とインフォームド・コンセントに署名した。Freya Biosciences Apsはドナーの頸管膣分泌液（CVS）採取とセレクションアッセイを行い、VMT手技のためにドナーのCVS材料を提供した（補足資料と方法、補足表S1参照）。
表1標準化ガイドライン（ESHRE-guideline）に従った再発妊娠喪失（RPL）評価結果。
正常値／基準値 2019年8月 2021年5月 2021年8月
血液学
 ホモシステイン<15 umol/L n/a 17.8 umol/L
 凝固第Ⅱ＋Ⅶ＋Ⅹ因子 <1.2 <1.0 0.9
 アンチトロンビン 0.83-1.15 IU/L 1.07 IU/L 1.14 IU/L
 ループスアンチコアグラント 0 1.14 0
 プロテインC 0.7-1.3 IU/L 1.27 IU/L 1.34 IU/L
 プロテインS 0.57-1.3 IU/L 1.04 IU/L 1.06 IU/L
 F2変異 Neg. 野生型 野生型
 FVライデン変異 Neg. 野生型 野生型
代謝
 HbA1C <48 mmol/mol n/a 35 mmol/mol
 グルコース <7.7 mol/L n/a 5.8 mol/L
 コレステロールHDL >1 mmol/L n/a 1.5 mmol/L
 コレステロールLDL <3 mmol/L n/a 3.4 mmol/L
 コレステロールVLDL <0.9 mmol/L n/a 0.8 mmol/L
 トリグリセリド <2 mmol/L n/a 1.7 mmol/L
内分泌
 チロトロピン（TSH） 0.4-4.8 IU/L n/a 1.85 IU/L
 サイロキシン（T4） 12～22 IU/L n/a 15.8 IU/L
 甲状腺ペルオキシダーゼAb <35 IU/L n/a 159 IU/L
自己抗体
 ANA <0.7 n/a 0.2
 PCNA抗体 陰性
 CHD-4-抗体-IgG [Mi-2] 陰性。
 抗dsDNA-IgG 陰性。
 抗DNAトポイソメラーゼ1-IgG Neg.
 抗EXOSC10-IgG Neg.
 抗フィブリラリン-IgG 陰性。
 Jo1抗体-IgG 陰性。
 抗 Major centromere B-IgG Neg.
 抗リボソームタンパク質-IgG Neg.
 RNA pol III RPC1抗体-IgG Neg.
 シェーグレン症候群 [SSA]-IgG Neg.
 シェーグレン症候群 [SSB]-IgG Neg.
 スミス抗体-IgG Neg.
 U1 snRNP (70 kDa + A + C)-抗体-IgG Neg.
 トランスグルタミナーゼ抗体-IgA [tTG] n/a <1 kU/L
 サイログロブリン抗体 n/a 85 units/L
 抗β2-糖蛋白質1-IgM <20 kU/La n/a <0.9 kU/L
 抗β2-糖タンパク質1-IgG <20 kU/La 12 kU/L 34 kU/L 31 kU/L
 カルジオリピン抗体-IgG <20 kU/La <10 UI/L 8.2 UI/L
 カルジオリピン抗体-IgM <20 kU/La <10 UI/L 3.8 UI/L
この患者は、2019年の最初の死産後、抗リン脂質症候群（APLS）の検査は陰性であった。5回目の妊娠前の2021年8月にAPLS陽性が確認された。太字の数字と文字はレベルの上昇を示す。
a David Garcia, MD, et al. Diagnosis and Management of the Antiphospholipid Syndrome.による。N Engl J Med 2018; 378:2010-21。https://doi.org/10.1056/NEJMra1705454。
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患者の膣マイクロバイオーム収集
VMT前後の膣マイクロバイオームサンプリングのタイムポイントを図1に示す。臨床および自宅でのサンプリングには、Zymo Collection Swab, 80XX（Zymo research, California, US）のスワブを使用し、COPAN（Brescia, Italy）の容器に保管した。
図サムネイルgr1
図1妊娠前後のマイクロバイオーム組成の概要。最初の膣内微生物叢移植（VMT）は2021年9月に実施され、その結果、異バイオーシスは速やかに消失し、ラクトバチルス・クリスパタス優勢となった（VMT後7～153日目までの妊娠前の期間）。2022年2月、患者は妊娠した。妊娠6週目、マイクロバイオーム解析の結果、41.8％のガードネレラ属菌が検出され、2週間後に同じドナーのCVSによる2回目のVMTが計画された。2回目のVMT当日（VMT後+224日、太字で表示）に採取した膣サンプルを分析したところ、患者は2回目のVMT前にすでにL. crispatus優勢に転換していた。
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CVSサンプルの処理とpH測定
CVSサンプルは、生理用カップ（The Flex Company社製Softdisc menstrual cup、「Flex disc」の名称でも販売）を用いて、十分な説明の後に自己採取した。患者は滅菌手袋をはめて月経カップを膣内に縦方向に挿入し、そのまま10秒間放置した後、カップをねじりながら取り外した。その後、患者はCVSを塗布した月経カップを50mLのファルコンチューブ（米国コーニング社製）に入れ、直ちに処理した。50mLチューブを190g、4℃で5分間遠心分離（Eppendorf Centrifuge 5810 R）し、CVSを回収した。その後、月経カップを取り出し、50mLチューブを再秤量した。mgの検体あたり2.5μLの滅菌生理食塩水を加えた。希釈したサンプルは、バイオバンキングとDNA抽出のためにクライオバイアルに分注した。希釈試料150μLをpH測定用エッペンドルフチューブに入れ、室温で15分間静置した。pHメーター（VWR pHenomenal pH 1100LとVWR pH電極pHenomenal MIC 220）を用いてpHを3回測定し、平均pHをさらなる分析に用いた。
倫理的承認
患者は同情的使用例であり、Copenhagen University Hospital - Hvidovre, Kettegaard allé 30, Hvidovre 2650, DenmarkおよびFreya Biosciences Aps, Fruebjergvej, 2100 Copenhagen, Denmarkの産科婦人科の両方でインフォームド・コンセントに署名した。ドナー選択のためのセットアップであるVMT製品は、この場合Freyaが所有しFB101と命名され、Freya Biosciences社内のドナープログラムである。この製品をどのようにテストし適用するかは、デンマーク当局、デンマーク倫理委員会（Journal-nr: H-20068230）およびデンマークデータ保護庁（Pactius）により承認された無作為化比較試験の一部である： P-2020-1080. 無作為化比較試験はClinicalTrials.gov IDで報告されている： NCT04855006で報告されている。
ドナーのスクリーニングと提供の設定
ドナーは、VMTのためにCVSを提供するのに適した女性を特定するために、フレイア・バイオサイエンシズの大規模なプログラムの一環としてスクリーニングされた。簡単に説明すると、膣サンプルをショットガン配列決定し（Seqbiome社、コーク、IE）、上述の方法に従ってマイクロバイオーム構成を決定した。膣内ラクトバチルス属菌（すなわち、L. crispatus、L. jensenii、L. gasseri、L. iners）の相対存在量が80％を超え、選択された膣内ディスバイオシス関連細菌（すなわち、Atopobium spp、 Fannyhessea vaginae、Bifidobacterium vaginalis、Prevotella spp.）を対象に、膣内検査と膣超音波検査を含む内科的検査と婦人科的検査を行い（TFP Stork fertility clinic、コペンハーゲン、DK）、標準的な診断検査を用いて以下の病原体と病態について検査した： ヒト免疫不全ウイルス（HIV p24抗原および/またはHIV 1/2に対する抗体）、B型肝炎ウイルスs抗原、B型肝炎ウイルスc抗体（総体）、B型肝炎表面抗体、C型肝炎ウイルス抗体、サイトメガロウイルス（CMV）抗体（IgGおよびIgM）およびトレポネーマ・パリダム抗体、ヒトパピローマウイルス（HPV 6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、 42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、69、70、73、82）、単純ヘルペスウイルス（HSV）1および2のTMA増幅mRNA検査、培養尿路感染症、 クラミジア・トラコマティス、淋菌DNA/RNA PCR、トリコモナス膣炎培養、マイコプラズマ・ジェニタリウムDNA/RNA PCR、レンサ球菌A群、B群、C群、G群培養、カンジダ属菌培養。の培養を行った。健康診断では、病歴や服薬状況、人口統計、心拍数、血圧測定など、一般的な健康チェックを行った。上記の膣マイクロバイオーム基準を満たし、病原体検査が陽性でなく、内科的検査と婦人科的検査で異常所見がない人がドナーに適しているとみなされた。承認されたドナーは、最大40日間の提供期間にわたってサンプルを提供し、その間、以下の制限が適用された：膣および肛門性交の禁欲、水泳の禁止、膣内製品（タンポン、石鹸など）の使用禁止。各訪問時に、ドナーは一般的な健康上の質問とともに、これらの制限の遵守を確認するための質問票に記入した。提供期間終了後、最初のスクリーニングと同じ検査が再度行われ、すべてに合格するとドナーは完全に承認された。ドナーの検体は、患者のCVS検体と同様に自己採取した。ドナーは合計15回の提供を行った。CVS検体のうち2検体が本研究に使用された（検体および検体処理、ならびにドナー選択のためのin vitroアッセイの詳細については、補足資料と方法および補足表S1を参照のこと）。
膣マイクロバイオーム解析／抽出
MolYsis™ Complete5 DNA抽出キット（Cat# D-321-100; Molzym GmbH & Co. KG, Bremen, Germany）によるDNA抽出には、各膣スワブサンプル1mLまたは150μLのCVSを用いた。サーモシェーカーで細菌を250 rpm、37 °C、30分間溶解し（β-メルカプトエタノールは添加せず）、次いで56 °C、10分間ヒーティングブロックでProteinase K処理した（サンプルは短くボルテックスし、3分後と7分後に元に戻した）。溶出したDNAは、ライブラリー調製を開始する前に、5℃で最大24時間保存した。DNA ライブラリーは、Nextera XT DNA Sample Preparation Kit（イルミナ社）を用いてメーカーの説明書に従って調製し、MiSeq（イルミナ社、米国サンディエゴ）で2 × 150 bp ペアエンドリードを用いてシーケンスした。
マイクロバイオームバイオインフォマティクス
クオリティトリミング前後のfastqcリードの品質は、FastQC v.0.11.8で評価した20。fastp v.0.20.1を用いて、qualified_quality_phredを20、最小リード長を50としてリードをクオリティトリミングした21。 21 bowtie2 v. 2.3.4.122を用い、エンド・ツー・エンドのアライメントを行い、有効なペアエンドアライメントの最大フラグメント長（-X）を2000として、トリミングしたリードをヒトゲノム（hg38、University of California, Santa Cruz）にアライメントし、ヒト配列を除去した。Kraken 2 v.2.1.223を用い、古細菌、バクテリア、ウイルス、プラスミド、ヒト、UniVec Core、原虫、真菌のRefSeqゲノムを含むPlusPFデータベースを用いて、ヒトDNA欠失リードの微生物プロファイリングを行った。種および属レベルの存在量は、Bracken v.2.6.2を使用してKraken 2レポートから推定した。検出された細菌の種および属の相対的な存在量は、細菌として分類されたリードの総数に対する相対値として計算した。
VMT手順
VMT産物はクライオバイアルに入れて-80℃の冷凍庫で保存した。解凍手順は以下の通り： 室温で1時間後、37℃の加熱室で30分。その後、180 mmの子宮内人工授精用カテーテル（Wallace, 180 mm Catheter, Cooper Surgical, CT, USA）を装着した10 mLシリンジにVMT製剤を注入した。その後、鏡を使用せずにカテーテルを膣内（フォルニクスまで）に導入し、シリンジの内容物を注入した。カテーテルを完全に空にするために、さらに0.5mLの空気をシリンジに注入し、同様に注入した。
一塩基変異（SNV）分析
2回のVMTの前後、および患者が妊娠した前後のSNVプロファイルを作成するのに十分なカバレッジが高いすべての時点の検体を解析に使用した。L. crispatusのSNVプロファイルは、デフォルト設定でMetaSNVを使用し、公開されているNCBI L. crispatusゲノムを用いて参照データベースを作成した。リードはまずBowtie2を用いてデータベースにアライメントされ、45塩基対より小さく、同一性が97%未満のアライメントを除外するようにフィルタリングされた。その後、フィルタリングされたリードを用いて各メタゲノムサンプルのSNVプロファイルを作成し、プロファイル間のマンハッタン距離を算出した。
資金提供者の役割
本研究の資金提供者は、研究デザインと患者データ収集には関与しなかったが、以下に明記するように、ドナーの選択とデータ解析には関与した。全著者は本研究の全データにアクセスでき、論文投稿の決定に対する最終的な責任を有していた。
結果
VMT前
2021年7月（妊娠前、VMT施行89日前）の最初の患者検体では、91.3％がガードネレラ属菌で占められており、ラクトバチルス属菌は欠如していた（図1）。この時、患者はかゆみ、悪臭、緑色/黄色の多量の膣分泌液を訴えた。評価の結果、膣粘膜の炎症が認められ、膣液の臭いと変色の存在が確認された（表2）。予定されたVMTの直前に採取されたサンプルにより、ガードネレラ属が持続的に優勢であること（図1）、VDに関連した症状が存在することなど、微生物の異常繁殖が確認された（表2）。
表2妊娠前および妊娠中の症状、pH測定、子宮頸管長（妊娠中のみ）測定の概要。
VMT前後の日数 VMT前の日数 VMT後の日数 VMT後の日数 (妊娠)
-26 0 +14 +35 +68 +153 +209 GA: 5 + 2 +245 GA: 10 + 3 +273 GA: 15 + 301 GA: 19 + 2 +322 GA: 22 + 4 +367 GA: 25 + 2 +392 GA: 32 + 2 2022年12月 GA: 37 + 5
臨床観察（MD）
 におい（＋/÷）＋＋÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷÷
 膣分泌液の色 緑・黄色 黄色 白色 白色 白色 しこり 白色 白色 白色 白色 白色
 粘膜の刺激 ＋ ＋ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷
 CVSにおけるpH 4.25 3.87 4.5 4.26 3.83 3.78 3.81 3.74 3.86 3.86 4.49
 子宮頸管長（mm） 50.3 40.5 46.72 39.08 30.6 48.11 44.4
患者が報告した症状
 かゆみ・痛み (+/÷) + + ÷ ÷ + ÷ ÷ + ÷ ÷ ÷ ÷ ÷
 臭い (+/÷) + + ÷ ÷ ÷ + ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷ ÷
 膣分泌液の色 緑・黄色 緑・黄色 白色 透明 白色 白色 透明 白色 白色 白色
 膣分泌液の量 重い 重い 軽い 軽い 重い 軽い 軽い 軽い 軽い
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ドナー選択のための体外アッセイ
患者への移植が成功する可能性が最も高いドナーサンプルを「適合」させるために、in vitro競合アッセイを実施した（補足資料と方法を参照）。乳酸桿菌を主体とする微生物叢を持つ、十分にスクリーニングされた健常人ド ナ ー 4 名 か ら 得 ら れ た 頚 膣 分 泌 液 （CVS）のアリコートを、プレート拡散アッセイを用いて、患者 CVS 中の VD 関連菌の阻害について評価した。5日後、ドナー1人とドナー2人の原液は、ドナーCVSの周囲に等しく大きな阻止領域（直径3mm）または「ハロー」を示し、VD関連菌が同様に阻止されていることが示された（表3、補足図S1）。その後、ドナーのCVSサンプルも5倍に希釈してプレーティングを行ったが、その結果、ドナー1ではハローがわずかに減少し（1.5-2 mm）、ドナー2では阻害効果が消失した。ドナー3および4のCVSは、いずれの濃度でも微生物の増殖を抑制する効果はなかった。これらの結果から、ドナー1から得られたCVSが患者への投与に選択された。
表3ドナー選択のためのin vitroアッセイにおけるドナーサンプルの特性と阻害ゾーン（ハロー）の概要。
ドナー L. crispatus % L. gasseri % L. iners % L. jensenii % その他の乳酸桿菌 % 選択された膣内細菌異常症関連菌 % pH 有活性細胞またはCFU/投与量 ハロー(mm) 希釈前 ハロー(mm) 5倍希釈液
1 88.7 <0.05 4.0 7.2 <0.05 0 4.1 3.1E08 3 1.5-2
2 97.6 0 0.3 2.0 0.1 0 3.8 9.9E08 3 0
3 97.3 2.2 0 0.1 0.2 0 4.0 3.4E08 0 0
4 0 0 99.6 0 0 0.1 3.9 1.0E11 0 0
各生物種のパーセンテージは、アッセイに使用したドナーサンプルの全メタゲノムショットガンシークエンシングによって決定された相対存在量である。pH と CFU は、アッセイに用いたドナーサンプルの pH と CFU である。生菌数または CFU は新鮮なサンプルで測定した。選択したドナーサンプルの保存サンプルの CFU については表 2 を参照。
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移植、VMT
2021年9月の月経周期10日目に、抗生物質の前処置なしでVMTを行った。VMT当日の膣内細菌叢は、80.4％がGardnerella属、14％がF. vaginaeでdysbioticであることが確認され（図1）、CVSのpHは4.25であった（表2）。VMTに使用したドナーのCVSの組成は、L. crispatus 88.7％、L. jensenii 7.2％、L. iners 4％で、pHは4.1であった（補足表S1）。VMT後14日目、患者のマイクロバイオームはL. crispatus 81.2％、L. jensenii 9％に変化し（図1）、CVSのpHは3.87であった（表2）。この患者は、VMT後139日目にL. crispatusがドナーのCVSにも存在したL. inersとL. jenseniiと混在していた1回を除き、4ヶ月の追跡期間中、6回のサンプリングで主にL. crispatusによる乳酸桿菌優勢を維持していた（図1）。
この患者は、VMT後わずか2日目からVMT後4ヶ月間を通して、膣分泌物の量が減少し、CVSの色が透明/淡白色に変化し、かゆみや痛みなどの症状が消失し、VD症状が著しく改善した（表2）。
VMT後の妊娠
2022年2月、患者は自然妊娠した。新たに抗リン脂質症候群と診断されたため、妊娠検査薬陽性時から妊娠38＋0週までアセチルサリチル酸75mgを1日1回、妊娠検査薬陽性時から産後6週まで低分子ヘパリン4500IEを1日1回処方された。妊娠中は3〜4週間ごとに病院で診察を受けた。子宮頸管長を測定するための腟超音波検査、婦人科的診察、マイクロバイオーム解析のための腟スワブ採取、pH測定のためのCVS採取、腟症状に関する問診がこれらの診察中に行われた（表2）。
VMTから209日後の妊娠5＋2歳の時点で、マイクロバイオーム解析の結果、41.8％のガードネラ属菌が検出された。しかし、2回目のVMT当日に採取された膣サンプルを分析したところ、患者はその間にドナー由来のL. crispatus優勢に自然転化していた（次項参照）。図1は、残りの妊娠期間を通じて安定したL. crispatus優位の膣内マイクロバイオームを示している。
子宮頸管長は妊娠期間中3cm以上で安定しており、膣内pHの測定値はすべてのサンプルで4.5を大きく下回っていた（表2）。以前の妊娠とは対照的に、患者は今回の妊娠中、VD症状に悩まされることはなかった。
患者は、妊娠年齢37＋5歳で計画的かつ合併症のない帝王切開を受け、男児を出産した。
SNV解析によるドナー生着の確認
ドナーのL. crispatus株の移植を確認するために、VMTに使用したCVS、VMTに使用しなかった他のドナーから得たCVS（コントロール1-3）、およびVMT後の患者のL. crispatusのゲノムプロファイルを比較するためにSNV解析を行った。VMT後の患者のL. crispatusのSNVプロファイルは、VMTに使用した2つのCVSサンプル（ドナー1Aおよびドナー1B）と一貫して類似していた（図2AおよびB）。ドナーサンプルのSNVプロファイルもまた、VMTに使用されたL. crispatusの安定した存在を反映して、互いに非常に類似していた。さらに、患者の治療に使用されなかった他のドナーのCVS中のL. crispatusゲノムと比較すると、VMT後の患者サンプル中のL. crispatusは、他の健常対照者よりもVMTドナーと類似していることが示された。このことは、VMT後の患者に観察されたL. crispatusは、ドナーのCVS材料に存在し、最初のVMTから1年後までの妊娠期間を通じて優勢な変異体であったL. crispatusと同じ変異体であることを強く裏付けている（図1および2A）。
図のサムネイルgr2
図2ドナーと対照のマイクロバイオームの比較。(A）CVSサンプルのメタゲノムシークエンシングから得られた一塩基変異（SNV）プロファイル間のペアワイズマンハッタン距離を示すヒートマップ。距離のスケールは、近いプロファイルから遠いプロファイルをそれぞれ黒から白で示している。レシピエントサンプルの時間は、最初のVMTから採取された時間を示す。ドナーサンプルには、同じドナーから採取され、2つの異なる時点（本文参照）でVMTに使用された2つのサンプル（投与1、投与2）、およびVMTに使用されなかった3人の別の個人からの他の3つのサンプル（対照1、対照2、対照3）が含まれる。ヒートマップはhttps://metasnv.embl.de。(B）ヒートマップ（図2A）の作成に使用したSNVプロファイル間の同じペアワイズマンハッタン距離の特定の縦断的傾向を示す折れ線グラフ。横軸のラベルは、メタゲノム配列決定のためにサンプルを採取した最初のVMT投与からの時間を示す。縦軸は、低いプロファイルから高いプロファイルまで、それぞれ近いプロファイルから遠いプロファイルを示す。各線は、経時的なレシピエントサンプルとドナーサンプルのペア間の距離を示している。VMTに使用された同じ個体から得られたサンプルはAdministration 1とAdministration 2と表示され、VMTに使用されなかった3人の別の個体から得られた他の3つのサンプルはControl 1、Control 2、Control 3と表示されている。
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考察
ここで我々は、VMTの成功により、抗生物質による前処置を行うことなく、VDを根絶し、長期にわたって持続的な効果を示したことを報告する。さらに、ドナーのマイクロバイオームの生着が株レベルで確認された初めてのVMTを紹介する。
VDは、不妊症、妊娠損失、PPROMや早産などの産科的合併症を引き起こす、女性の健康における世界的な深刻な課題である。
VDの治療法としてVMTを適用するという概念は、2019年に、再発性の症候性VDに罹患し、抗生物質投与後にVMTによる治療を受けた5人の患者のデータを報告する中で紹介された。この研究は有望な結果を示したが19、抗生物質の前処置があったため、5人中4人の患者に認められた良好な効果は前処置のみによる可能性があることに注意しなければならない。さらに、5人中3人の患者は、症状が消失するまでに2-3回のVMTを受けており、1人の患者ではドナーの変更が必要であった。このことは、本研究で行われたような他の方法に基づくドナー選択の威力を強調している。前述の研究では、レシピエントとドナーの両方のサンプルで16S rDNAとショットガン配列決定が行われたが、PCA解析を除いて、著者らはレシピエントで見つかった乳酸菌の変異体がドナー由来であることを証明することはできなかった。さらに、VDの寛解の診断は、臨床症状の消失や、乳酸菌優勢微生物叢の光学顕微鏡による診断などの臨床的基準に基づいていた。
ここでは、ショットガンメタゲノムシーケンスを用いて、異なる変異を示す一塩基多型について細菌種を鑑別した。SNV解析により、ドナーCVSのL. crispatusとVMT後の患者のL. crispatusの間に高い類似性が観察され、VMTに使用されなかった他のドナー候補のCVSのL. crispatusとはいずれも非類似であった。したがって、VMTの成功はドナーのL. crispatus変種の生着によるものであり、すでに存在する低存在変種や外部からの自然転換によるものではないと結論づけるのが妥当であると思われる。ドナーの生着を確認するこのアプローチは、これまでに発表された5例のVMTと比較して新しいものである19。
27,28。研究により異なるが、これは非腟菌種の使用、送達方法、または単一菌株の構成に起因する可能性がある。消化管のデータから、再発性クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）大腸炎の管理に対する糞便微生物叢移植（FMT）の有効性は、健康で持続可能なマイクロバイオームの確立には、単一の菌株ではなく、群集が存在する必要があるという概念に基づいていることが示唆されている29、 30, 31, 32 VMTには、複数の乳酸菌株を含む細菌、バクテリオファージ、タンパク質、サイトカイン、脂質、抗菌ペプチドなど、安定したコロニー形成の歴史を持つコミュニティーシステム全体が含まれている。これらの相互作用が、持続的な生着と再発リスクの低減の鍵となる可能性がある。VMTがどのようにして生着率を向上させ、膣内微生物群全体に持続的な効果をもたらすのか、そのメカニズムや、VMTの成功に影響を与える可能性のある他の多くの変数については、まだ不明である。
前回の妊娠がVMTによるものなのか、APLSの治療によるものなのか、 あるいは両方の組み合わせによるものなのかは、まだ不明である。患者は2019年にAPLSの検査を受けたが、結果は陰性であった（表1）。APLSは後天性血栓症36であり、血栓症は確かにその時点では存在しなかったが、そこから発症し、3回目の流産後に診断されたと主張したい。VD症状はすべての妊娠で認められました。したがって、今回の妊娠がAPLS治療のみによるものかどうかは判断できない。しかし、患者は臨床的に症状が緩和され、微生物学的にもVDが消失した。今後のランダム化比較試験により、VDとRPLや不妊症などの妊娠合併症を持つ女性に対する治療法として、VMTを使用する可能性についての洞察が得られるだろう。
本報告では、一連の妊娠後期敗産／死産を経験した女性において、抗生物質の前処置なしでVMTに成功し、臨床的VD症状の即時的かつ持続的な緩和とドナー株の生着が確認され、その後妊娠と出産が成功したことを初めて報告する。このことは、VDに関連した妊娠／体外受精合併症の可能性がある症例だけでなく、膣内異常膣症を繰り返す症例においても、抗生物質を温存する治療法としてのVMTの潜在的役割をさらに研究する必要性を示している。
貢献者
患者のリクルート、臨床成績、サンプリング： Henriette Svarre Nielsen、Kilian Vomstein、Tine Wrønding。ドナープログラム、in vitroアッセイデザイン： Brynjulf Mortensen、Laura M. Ensign、Elleke F. Bosma、Tine Wrønding、Henriette Svarre Nielsen。最初の原稿を執筆： Tine Wrønding、Kilian Vomstein、Elleke F. Bosma、Henriette Svarre Nielsen。重要な知的内容のために批判的に原稿を改訂した： Tine Wrønding、Kilian Vomstein、Henriette Svarre Nielsen、Elleke F. Bosma、Brynjulf Mortensen、Henrik Westh、Julie Elm Heintz、Sara Mollerup、Laura M. Ensign、Kevin DeLong、Johan van Hylckama Vlieg、Anne Bloch Thomsen、Andreas Munk Petersen。膣マイクロバイオーム解析およびバイオインフォマティクスの実施： Julie Elm Heintz、Sarah Mollerup、Kevin DeLong、Henrik Westh、Andreas Munk Petersen。Tine Wrønding、Henriette Svarre Nielsen、Kilian Vomstein Sarah Mollerup、Kevin DeLongが基礎データを検証した。すべての著者が研究のセットアップ、データの解釈、原稿の修正に大きく貢献した。最終原稿は出版前に全著者が承認した。
データ共有声明
本研究のために作成・分析されたデータセットは、合理的な要求があれば、出版後に対応する著者から入手可能である。
利益宣言
Elleke F. Bosma、Brynjulf Mortensen、Kevin DeLongおよびJohan van Hylckama Vliegはフレイア・バイオサイエンスの社員である。Johan van Hylckama Vlieg、Anne Bloch ThomsenおよびLaura Ensignはフレイヤ・バイオサイエンスの株主です。Elleke F. BosmaとBrynjulf Mortensenは、RPLのためのVMT使用に関する特許出願の発明者として記載されている。Laura EnsignはFreya Biosciencesの科学諮問委員会の委員長であり、Freya Biosciencesからコンサルティング料を受け取り、ジョンズ・ホプキンス大学が所有するVMTに関する特許出願の発明者である。アンネ・ブロッホ・トムセンは、ファイザーのカントリー・メディカル・ディレクター、ファイザー・デンマークおよびアイスランドのCMO、ファイザー・デンマークの取締役、EMPROS Pharma Swedenの取締役として、ファイザーに常勤している。Henriette Svarre Nielsenは、Freya Biosciences、Ferring Pharmaceuticals、BioInnovation Institute、Ministry of Education、Novo Nordisk Foundation、Augustinus Fonden、Oda og Hans Svenningsens Fond、Demant Fonden、Ole Kirks Fondから科学助成金を受けている。HSNは、Ferring Pharmaceuticals、Merck、Astra Zeneca、Cook Medical、IBSA Nordicから、講演やプレゼンテーションに対して個人的な支払いや謝礼を受けている。Henrik Westh、Andreas Munk Petersen Sarah Mollerupは、Freya Biosciences社から研究費の提供を受け、研究機関に謝礼を支払った。Tine Wrønding、Kilian Vomstein、Julie Elm Heinzは、本発表に関して利益相反はない。
謝辞
本研究の一部（すなわち解析費用）は、Freya Biosciences Aps, Fruebjergvej, 2100 Copenhagen, Denmarkから助成を受けた。フレイヤ・バイオサイエンス社の研究助成に感謝する。さらに、新しく重要な知識の提供に参加してくれた女性とその家族に感謝する。
付録A. 補足データ
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補足資料と方法、図S1、表S1
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論文情報
出版履歴
出版 2023年6月26日
受理 受理：2023年6月14日
改訂版受理 受理：2023年6月13日
受理：2023年6月13日 受理日：2023年3月15日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2023.102070

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図
図サムネイルgr1
図1妊娠前後のマイクロバイオーム組成の概要。2021年9月に1回目の膣内微生物叢移植（VMT）を施行し、その結果、異種膣症は速やかに消失し、乳酸菌クリスパタス優位となった（VMT後7～153日目までの妊娠前）。2022年2月、患者は妊娠した。妊娠6週目、マイクロバイオーム解析の結果、41.8％のガードネレラ属菌が検出され、2週間後に同じドナーのCVSによる2回目のVMTが計画された。2回目のVMT当日（VMT後+224日、太字で表示）に採取された膣サンプルを分析したところ、患者は2回目のVMT前にすでにL. crispatus優勢に転換していた。
図サムネイルgr2
図2ドナーと対照のマイクロバイオームの比較。(A）CVSサンプルのメタゲノムシークエンシングから作成された一塩基変異（SNV）プロファイル間のペアワイズマンハッタン距離を示すヒートマップ。距離のスケールは、近いプロファイルから遠いプロファイルをそれぞれ黒から白で示している。レシピエントサンプルの時間は、最初のVMTから採取された時間を示す。ドナーサンプルには、同じドナーから採取され、2つの異なる時点（本文参照）でVMTに使用された2つのサンプル（投与1、投与2）、およびVMTに使用されなかった3人の別の個人からの他の3つのサンプル（対照1、対照2、対照3）が含まれる。ヒートマップはhttps://metasnv.embl.de。(B）ヒートマップ（図2A）の作成に使用したSNVプロファイル間の同じペアワイズマンハッタン距離の特定の縦断的傾向を示す折れ線グラフ。横軸のラベルは、メタゲノム配列決定のためにサンプルを採取した最初のVMT投与からの時間を示す。縦軸は、低いプロファイルから高いプロファイルまで、それぞれ近いプロファイルから遠いプロファイルを示す。各線は、経時的なレシピエントサンプルとドナーサンプルのペア間の距離を示している。VMTに使用された同一個体から得られたサンプルには投与1、投与2と表示し、VMTに使用されなかった別の3個体から得られたサンプルには対照1、対照2、対照3と表示した。
表
表1標準化されたガイドライン（ESHREガイドライン）に従った反復性妊娠喪失症（RPL）の評価結果。
表2妊娠前および妊娠中の症状、pH測定、子宮頸管長（妊娠中のみ）測定の概要。
表3ドナー選択のためのin vitroアッセイにおけるドナーサンプルの特性と阻害ゾーン（ハロー）の概要。
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