NKT細胞による腸管上皮恒常性の制御
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論文43巻12114948号2024年12月24日オープン
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IFN-γ依存的
NKT細胞による腸管上皮恒常性の制御Marta
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)01299-3
Lebrusant-Fernández1, 2,5 ∙ Tom Ap Reese1、 2,5 ∙ Rebecca Jimeno1,3 2,5 ∙ Tom Ap Rees1,2,5 ∙ Rebecca Jimeno1,2,6 ∙ Franca Fraternana 3,4 ∙ Vivienne SW Lee2 ∙ Patricia Barral1,2,7 patricia.barral@kcl.ac.uk. .. 続きを表示所属
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腸管
NKT細胞は、基礎活性化の特徴を持つ転写プログラムを持つ-
NKT
細胞由来のサイトカインは、IECの生存能と分化を制御する-
In vivoでのNKT
細胞活性化は、IFN-γ依存的な上皮アポトーシスを引き起こすSummary腸管の
恒常性は、腸管バリアの完全性を維持するために協働する上皮細胞と免疫細胞の複合機能によって維持されている。しかし、免疫細胞集団が腸管上皮細胞（IEC）の恒常性を制御するメカニズムは不明なままである。ここでは、マルチオミクスアプローチを用いて免疫と上皮のクロストークを研究し、CD1dに制限されたナチュラルキラーT（NKT）細胞がIECの生物学の重要な制御因子であることを明らかにした。NKT細胞は小腸近位部に多く存在し、定常状態では活性化の特徴を示すことがわかった。その後、NKT細胞は、インターフェロン-γ（IFN-γ）とインターロイキン-4の分泌を介して、腸オルガノイドにおけるIECの生存と転写および細胞組成のランドスケープを制御する。in vivoでは、NKT細胞の欠乏はIECのターンオーバーの増加をもたらし、一方、NKT細胞の活性化はIFN-γ依存的な上皮のアポトーシスをもたらす。我々の発見は、NKT細胞がIECの恒常性制御に寄与するサイトカインの強力な産生細胞であることを示唆している。
GraphicalアブストラクトGraphical
アブストラクトundfig1キーワードNKT
細胞腸管
上皮細胞腸管
オルガノイドIFN-γ研究
テーマ（複数可）
CP：免疫学はじめに
腸管上皮は、栄養吸収において重要な機能を果たすと同時に、腸内細菌叢のコンパートメントを維持するバリアとしても機能している。腸管内膜は腸管上皮細胞（IEC）の単層からなり、この細胞は緊密な制御と大きなターンオーバー能力を特徴としている。腸管幹細胞（ISC；腸管陰窩に位置する）は分裂して新しいIECを産生し、通過増幅（TA）細胞に分化し、TA細胞は吸収細胞（腸細胞）または分泌細胞（Paneth、杯細胞、房細胞、腸内分泌細胞）へと分化する。WNT、NOTCH、骨形成タンパク質（BMP）経路などのシグナル伝達経路は、自己複製と系列分化のバランスを制御している1。免疫系は腸の恒常性維持に不可欠な役割を果たしており、免疫細胞やその分泌産物は、IECの増殖、アポトーシス、分化を直接促進したり阻害したりする2。例えば、3群自然リンパ球（ILC3）は、IECの恒常性と修復を促進するインターロイキン-22（IL-22）を強力に産生する3,4。一方、ILC1はCD44v6+上皮陰窩の拡大を促進するトランスフォーミング増殖因子-β1を分泌する5。免疫-IECクロストークにおける興味深い役割として、主要組織適合複合体（MHC）依存性のT細胞-IEC相互作用が提唱されている6。逆に、T細胞由来のサイトカインはISCの分化を制御しており、炎症性シグナルはISCの分化を促進し、制御性サイトカインは分化を抑制する6。これらの集団の中で、ナチュラルキラーT（NKT）細胞は、抗原提示分子CD1dによって提示された内因性、外因性の脂質をT細胞レセプター（TCR）を介して認識するユニークな能力を持っている10。NKT細胞は、定常状態でも、侵害に反応したごく初期でも、サイトカイン（IFN-γ、IL-4、IL-10など）の主要な産生細胞であり、免疫細胞や非免疫細胞の動員、活性化、機能を調節している。NKT細胞は、腸内細菌のコロニー形成を制御することが提唱されている14,15,16が、腸内細菌叢の形成における直接的な役割は不明なままである17。さらに、NKT細胞は、他の腸管免疫細胞（B細胞、制御性T細胞、ILCを含む）の機能と動員を調節することができ、腸管の恒常性に影響を及ぼす可能性がある8,14,20,21。例えば、トランスジェニックマウスでCD1dを過剰発現させると、NKT細胞の応答が調節されなくなり、自然発生的に腸の炎症が引き起こされる22。また、炎症性腸疾患患者の腸ではCD1dの発現が変化しており23、オキサゾロン誘発性大腸炎モデルでは、NKT細胞が炎症の主要な調節因子となっている24,25,26。これらのデータにもかかわらず、腸のNKT細胞の機能的特徴や、NKT細胞がIECの恒常性と分化を調節しているかどうか、またどのように調節しているかについては、まだよくわかっていない。
本研究では、IECの運命と機能の制御におけるNKT細胞の機能と、これらのプロセスを支えるメカニズムを明らかにするために、免疫と上皮のクロストークを調査した。その結果、NKT細胞は小腸近位部に多く存在し、定常状態では活性化の特徴を示す独特の転写プログラムを持っていることがわかった。IECの生物学に対するNKT細胞の直接的な影響を調べるために、我々は腸NKT細胞と小腸オルガノイド（SIOs）との共培養系を開発し、NKT細胞がIECの分化、炎症プログラム、生存／アポトーシスを直接調節できること、また腸オルガノイドの形態と転写産物の変化を誘導し、胎児上皮の特性を獲得することを実証した。このNKT細胞依存的なIEC制御は、サイトカイン分泌とIECにおけるCD1d発現の独立性によって媒介される。in vivoでは、NKT細胞の枯渇は陰窩上皮細胞のターンオーバーを増加させ、IECの炎症プロファイルに変化をもたらす。逆に、in vivoでのNKT細胞の活性化は、IFN-γ依存的な上皮のアポトーシスを引き起こす。我々の発見は、腸管上皮の転写および細胞ランドスケープの制御におけるNKT細胞の未認識の役割を明らかにし、上皮の恒常性制御のための機能的軸を浮かび上がらせた。
結果腸管
NKT細胞は、基礎活性化の特徴を持つユニークな遺伝子発現プログラムを持っている
腸管ホメオスタシスの制御におけるNKT細胞の機能を調べるために、まず腸管コンパートメントにおけるNKT細胞集団の特徴を明らかにした。PBS57を負荷したCD1d四量体（CD1d-tet-PBS57；PBS57はα-ガラクトシルセラミド（αGalCer）という代表的な脂質抗原の類似体）とTCR-βの共染色によって、腸管固有層（LP）からNKT細胞を同定した（図1AおよびS1A）。NKT細胞は小腸近位部（十二指腸）に多く、その頻度は腸に沿って着実に減少する（図1A）。予想通り、これらの細胞はCD1dノックアウト（KO）マウスの組織には存在せず、C57BL/6バックグラウンドのマウスの組織で報告されているように、細胞の大部分（約90％）が転写因子T-betを発現しており、NKT1細胞として分類される11,27（図1Aおよび1B）。これと同様に、小腸LP（SI-LP）から選別精製されたNKT細胞は、αGalCerによるin vitro刺激に応答して、Tヘルパー1細胞（Th1）様サイトカインを分泌し、活性化マーカーをアップレギュレートする（図S1B）。
図1 腸管NKT細胞の特徴的な転写プログラム
キャプション全文を表示NKT
細胞は主に組織常在集団として存在し、その表現型と機能は局所的な組織環境によって形成される。腸管NKT細胞の特徴を偏りなく概観するために、SI-LPから単離したNKT細胞の遺伝子発現プロファイル（バルクRNAシーケンス［RNA-seq］による）を調べ、同じ動物のリンパ組織（胸腺、脾臓、腸間膜リンパ節［mLN］、鼠径リンパ節［iLN］）から単離したNKT細胞のそれと比較した33（図1C-1E）。RNA-seqデータセットの主成分分析（PCA）により、腸管NKT細胞のサンプルはリンパ系NKT細胞から分離していることが明らかになり（図1C）、別個の転写プログラムが存在することが示唆された。実際、リンパ系組織のNKT細胞間では、比較的少ない数（約200-300）の差次発現遺伝子（DEG）が検出されたが33、SI-LP NKT細胞では、リンパ系NKT細胞と比較して2,000以上のDEGが検出された（調整p < 0.05）。遺伝子発現解析を用いたところ、腸管NKT細胞は、Tbx21、Nkg7、Xcl1などのNKT1細胞マーカーに富んでいたが、NKT2およびNKT17マーカー（Zbtb16、Ccr7、Il7r）29,34の発現は低く、リンパ節におけるNKT2/NKT17の高い存在量と一致していた33,35（図1D）。さらに、細胞活性化に関連する遺伝子（Nr4a1、Cd69、Il2ra、Fos、Jun、Cd40lg）およびサイトカインの分泌（Ifng、Il4）の発現が、腸管とリンパ節のNKT細胞で上昇していることが確認された（図1D）。これと同様に、MSigDB Hallmarkデータセットの遺伝子セット濃縮解析（GSEA）では、核因子κB（NF-κB）を介した腫瘍壊死因子α（TNF-α）シグナル伝達、炎症反応、IL-2/STAT5シグナル伝達、IL6-Jak-Stat3シグナル伝達など、活性化／炎症シグナル伝達に関連する経路が腸管NKT細胞で濃縮されていることが示された（図1D）。TNF受容体スーパーファミリー-NF-κB（TNFRSF-NF-κB）軸は、メモリーT細胞や制御性T細胞を含む非リンパ組織T細胞集団のアイデンティティの重要なマーカーとして記述されている36。したがって、バリア組織（腸、皮膚）のT細胞は、トランスデューサー（Traf1、Traf4）、エフェクター（Nfkb1、Nfkb2）、インヒビター（Nfkbia、Nfkbiz、Nfkbid）など、この経路のいくつかの要素の発現によって特徴づけられる。さらに、定常状態におけるNKT細胞の活性化の程度は、そのNKT細胞が存在する組織と特異的に関連しているようである。同様に、SI-LP NKT細胞は、活性化に関連する遺伝子（例えばNr4a遺伝子）や抗原体験に関連する遺伝子（例えばKlrg1）の保存された発現により、脂肪組織や肺のシグネチャーの濃縮を示している（図1E）。従って、これらのデータを総合すると、腸管NKT細胞は別個の転写プログラムを持ち、ベースラインでは活性化の兆候を示していることがわかる。
NKT細胞/CD1dをin vivoで切除すると、IECの増殖と転写プログラムが変化する
SI-LPにNKT細胞が豊富に存在することから、IECのホメオスタシスの制御に寄与しているのではないかと推測した（図2、S2、S3）。これを検証するため、まず野生型（WT）マウスとCD1d-KOマウス（NKT細胞を欠く；図S2AおよびS2B）のIECを特徴付けた。H&E染色では、CD1d-KOマウスの腸の肉眼的形態に目立った変化は見られなかった（図S2B）。しかしながら、定量的解析の結果、CD1d-KOマウスの腸では絨毛：陰窩の比率が変化しており、このことはこれらのマウスのIECに根本的な変化が生じている可能性を示唆している（図S2B）。NKT細胞の欠如による分子変化を調べるため、WTおよびCD1d-KOマウスの近位SI陰窩から分離したばかりの上皮細胞（EpCAM+CD45-CD31-Ter119-）からバルクRNA-seqを行った（図2A）。これらの解析により、CD1d-KOマウスとWTマウスの腸管から分離したIEC間で発現が異なる612遺伝子が明らかになった（252遺伝子が発現上昇、360遺伝子が発現低下；調整p<0.05）。MSigDB HallmarkデータセットのGSEAにより、CD1d-KO上皮では増殖（MYCターゲット、E2Fターゲット）と代謝（脂肪酸および胆汁酸代謝）に関連するパスウェイが濃縮されていることが同定された。対照的に、免疫・炎症反応に関連するパスウェイ（IFN-γ反応、IFN-α反応、炎症反応、同種移植反応）は、CD1d-KOマウスのIECにおいて負に濃縮されていた（図2BおよびS2C）。
図2 CD1d/NKT細胞はin vivoでIECのトランスクリプトームを制御しているShow
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腸上皮は、様々なシグナル伝達経路（NOTCH、WNT、BMPなど）と重要な転写因子（Atoh1、Neurog3など）の複合的な作用に依存して、自己複製と分化のバランスを制御している。WT/CD1d-KOのIECのトランスクリプトームデータセットをこれらの経路の遺伝子セット38と比較したGSEA解析では、CD1d-KOのIECではNOTCH経路が陽性に濃縮され、BMP経路が陰性に濃縮された（図2C）。しかしながら、上皮アイデンティティーの主要な制御因子（例えば、Atoh1、Neurog3）の発現は変化しなかった（図S2D）。変化したIECトランスクリプトームの影響を機能的に評価するために、腸管幹細胞性のin vitroアッセイとして上皮陰窩のオルガノイド形成能を利用し、WTおよびCD1d-KOマウスのSI陰窩からオルガノイドを作製した（図2D）。CD1d-KOマウスの腸管陰窩を播種して5日目には、WTマウスに比べ、SIOの数が一貫して多く、EpCAM+細胞も多く回収され（図2D）、陰窩細胞の幹細胞数および／または増殖能の増加が示唆された。この表現型は、外因性WNT3aの存在下および／または非存在下でオルガノイドを播種しても維持されたことから、外因性WNT3aの培地補充とは無関係であり（図2E）、GSEAはCD1d-KO IECsにおけるWNTシグナル伝達39に変化がないことを示した（図2C）。我々のRNA-seqデータを一般に公開されているデータセット41,40と比較したところ、CD1d-KO上皮では、幹細胞およびTAシグネチャー、ならびに腸陰窩増殖性細胞に関連する遺伝子が濃縮されていた（図2FおよびS2E）。実際、CD1d-KOマウスの腸上皮では、CD44hiCD24int細胞（増殖性陰窩に濃縮されている5,42,43）の頻度が増加していた（図2GとS2F）。これと同様に、細胞周期解析では、CD1d-KOマウスの上皮ではKi-67+の頻度が増加し、非増殖性（G0）陰窩細胞（CD44hiCD24int）が減少していることが確認された（図2Hおよび2I）。また、CD1d-KO陰窩由来のSIOは、播種後5日目にWT対照と比較して有意に出芽が増加した（図2J）。われわれのシークエンシングデータを、胎児スフェロイドや成熟成体オルガノイドから作成された公表データセット44と比較したところ、CD1d-KO IECsの遺伝子シグネチャーは成熟成体オルガノイドに類似していたが、胎児スフェロイドのシグネチャーは発現が低下していた（図S2G）。最後に、組織学的解析から、OLFM4+ ISCの数はWTとCD1d-KOの腸で同程度であることが示された（図S2H）。これらの実験から、CD1d/NKT細胞は陰窩上皮細胞のターンオーバーを制御しているが、ISC数は変化していないことが示唆される。
私たちはさらに、CD1d-KO腸におけるIECの機能分化の変化を、私たちのRNA-seqデータセットと、小腸全体の上皮細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析から作成された発表済みのデータセットとを比較することによって調べた40（図S3AおよびS3B）。CD1d-KOの腸では、腸細胞、腸内分泌、およびパネス細胞のシグネチャーが有意に濃縮され、一方、房細胞および杯細胞のシグネチャーはネガティブに濃縮された（図S3A）。これらの変化にもかかわらず、組織学的解析では、WTとCD1d-KOの腸の間で、房細胞（DCLK1+）、杯細胞（MUC2+）、腸内分泌細胞（CHGA+）の数に差は見られなかった（図S3B）。これらのデータから、NKT細胞/CD1d欠損はin vivoでの分泌細胞数の量的変化にはつながらないが、質的な転写状態の変化を引き起こす可能性が示唆される。
腸管上皮は、LP免疫細胞由来のシグナルを含む腸管ニッチからのシグナルに応答する6,7。ニッチ由来のシグナルが、あるいはCD1d45,46そのものが、CD1d-KO IECにおける上記の変化を引き起こすかどうかを調べるために、WTマウスとCD1d-KOマウスから単離したばかりの腸陰窩を4継代以上培養し、樹立したオルガノイドの特性を調べた。重要なことは、in vivoでCD1d-KO腸管で観察された主な表現型が、in vitroでSIOを培養すると回復することである。したがって、CD1d-KO陰窩のSIO形成効率の増加は、樹立したオルガノイドのコロニー形成アッセイを行うと失われた（図2K）。同様に、CD44+ IECの頻度は、増殖細胞やアポトーシス細胞の頻度と同様に、WTとCD1d-KOの樹立したSIOで同等であった（図2KおよびS3C）。また、免疫および代謝遺伝子の発現は、CD1d-KOマウスとWTマウスから単離したばかりのIECでは変化していたが、数回継代して完全に樹立されたオルガノイドではこのような差は消失していた（図2L）。これらのデータは、CD1d-KOの腸管ニッチに由来するシグナル（内在性のCD1d45,46ではなく）が上皮の恒常性を制御していることを示唆している。
NKT細胞はSIOsの生存能、分化、転写プロファイルを直接制御するin
vivoでのIECの分化と機能は、腸管ニッチに存在する様々な細胞タイプに由来するシグナルによって制御されており6、したがって様々なシグナル伝達経路の組み合わせは、直接的なNKT細胞効果の同定を隠蔽し、混乱させる可能性がある。実際、CD1d-KOマウスの腸における骨髄系およびリンパ系集団の表現型解析から、LP（NK細胞）および上皮内リンパ球（TCR-β+細胞；図S4A）のリンパ球集団が偏っていることが明らかになり、CD1d-KO腸におけるIECホメオスタシスの変化にさらに寄与している（および／または隠蔽している）可能性がある。IECの生物学的変調に対するNKT細胞の直接的な寄与を調べるために、我々はSIOと初代NKT細胞（WTマウスのSIから単離した；図3A-3CおよびS4B）との共培養を最適化した。細胞はIL-7とIL-15（NKT細胞の生存と恒常性をサポートする47,48）の存在下で、抗原や刺激物質のない状態で培養される。これらの共培養では、樹立したSIO（4継代以上）を機械的に破壊し、腸管NKT細胞の存在下および／または非存在下に播種する。共培養3日後、NKT細胞がオルガノイドの外側を取り囲み、一部の細胞はIECと直接接触していることがわかった（図3Bおよび3C）。NKT細胞とIECのクロストークの影響を調べるため、共培養3日後にIECを精製してバルクRNA-seqを行った（図3D）。NKT細胞は上皮のトランスクリプトームに有意な変化を誘導し、PCAでは培養条件（±NKT細胞）によってサンプルが分離することが明らかになった。これと一致して、1,426のDEGがSIOとSIO+NKT細胞の間で検出された（図3D；630のアップレギュレートと796のダウンレギュレート；調整p<0.05）。SIO+NKT細胞対SIOのサンプルで行ったMSigDB Hallmark遺伝子セットによるGSEA（図3E）では、IFN-αおよびIFN-γ応答、炎症応答、またはIL-2/STAT5シグナル伝達を含む免疫関連経路の正の濃縮、ならびにアポトーシスのアップレギュレーションが同定された。しかしながら、NKT細胞の共培養は、幹細胞性と細胞増殖に関連するmammalian target of rapamycin complex 1シグナル伝達のダウンレギュレーションを誘導し（図3E）、胎児性オルガノイドシグネチャー44のポジティブな濃縮を誘導した（図S4CとS4D）。
図3 NKT細胞はSIOの遺伝子発現と生存に影響を与える
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NKT細胞によって誘導される転写プログラムの機能的関連性を調べるために、SIO-NKT細胞共培養3日後のIEC数と表現型を測定した（図3F-3J）。その結果、NKT細胞共培養後のSIOでは、IECの回収数が減少し、切断型カスパーゼ3の増加が検出された（図3Fおよび3G）。これは、転写レベルで検出されたアポトーシスの増加と一致している。さらに、アネキシンV+染色を用いて、CD44hi IEC内のアポトーシス細胞の増加と生存細胞（アネキシンV-ヨウ化プロピジウム陰性[PI-]）の減少を測定したところ、NKT細胞がクリプト細胞のアポトーシスを誘導していることが示された（図3H）。また、転写の結果と一致して、NKT細胞共培養後のSIOでは炎症関連遺伝子がアップレギュレートされた（図3I）。最後に、NKT細胞によって駆動される濃縮された胎児様シグネチャーと一致して、共培養後に回収されたSIOにおいて、Ly6a発現の増加と出芽の減少が検出された（図3J）。従って、これらのデータは、NKT細胞が腸オルガノイドの生存能力を変化させ、その形態とトランスクリプトームの変化を誘導することを示唆している。
次に、NKT細胞がIECの機能分化を直接制御できるかどうかを調べた（図3K、3L、S4E、S4F）。そのために、SIO±NKT細胞のトランスクリプトームデータセットを、小腸全体の上皮細胞のシングルセル・トランスクリプトーム解析から作成された発表済みのデータセットと比較した40（図3K）。NKT細胞共培養後のSIOでは、Tuft、腸内分泌、腸細胞、TA細胞のシグネチャーが有意に変化していた（図3KおよびS4F）。それに伴い、NKT細胞共培養後のSIOでは、転写レベルでも染色でも、Tuft細胞マーカーDCLK1の発現増加がqPCRと免疫蛍光染色で検出された（図3LとS4E）。また、腸細胞シグネチャーと腸細胞マーカーApoa4は、NKT細胞共培養後に増加した（図3KとS4E）。これらのデータを総合すると、NKT細胞はIECの分化、生存、免疫プログラムを直接制御できることが示唆される。
NKT細胞由来のサイトカインがIECを制御する
次に、NKT細胞がIECを制御するメカニズムについて調べた。CD1dがNKT細胞とIECのクロストークに必要であるかどうかを検討した。