セルゲイ・ウィノグラツキー：現代微生物学の創始者、最初の微生物生態学者
FEMS微生物学レビュー 欧州微生物学会連合（Federation of European Microbiological Societies
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セルゲイ・ウィノグラツキー：現代微生物学の創始者、最初の微生物生態学者
マーティン・ドゥワキン、デイヴィッド・ガトニック
FEMS Microbiology Reviews, Volume 36, Issue 2, March 2012, Pages 364-379, https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2011.00299.x
公開日：2012年3月1日 記事履歴
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要旨
セルゲイ・ウィノグラツキーは1856年にロシアで生まれ、近代微生物学の創始者となった。サンクトペテルブルク大学で酵母Mycoderma viniの栄養と成長生理学に関する修士号取得後、彼はストラスブルクのアントン・デバリの研究室に加わった。そこで硫黄酸化細菌Beggiatoaの研究を行い、化学石器栄養学の理論を確立することになった。その後、チューリッヒのスイス工科大学に移り、細菌の硝化に関する記念碑的な研究を行いました。彼は、硝化細菌の最初の純粋培養物を分離し、それらがアンモニアを亜硝酸に、亜硝酸を硝酸塩に変換する個別のステップを実行することを確認しました。これは、自然界における硫黄と窒素の循環の概念に直接つながるものであった。彼はロシアに戻り、そこで初めて自由生活型の二窒素固定細菌を単離した。成功の暁には、科学界から引退し、ウクライナの実家の土地で15年間を過ごした。しかし、ロシア革命によって、彼はロシアを脱出しなければならなくなった。彼はパリのパスツール研究所に入り、残りの24年間を微生物生態学の分野を開拓し、発展させることに費やした。1953年に死去。
ウィノグラツキー、ベギアトア、硫黄酸化、硝化、化学石灰化、化学異栄養症
課題欄 総説
ウィノグラツキーの初期
ウィノグラツキーの影響を受けた幸運な人々は、偉大な精神、輝かしい人格、深い思想家、そして真の実験科学者としての忘れがたい思い出を持ち帰ることができた。ウィノグラツキーに会って、巨匠の存在を感じなかった人はいない。彼は、本当の意味での西欧人であり、生まれは貴族だが、精神的には民主主義者であった。また、科学者であり、哲学者であり、優れた音楽家でもあった。
(ワックスマン, )
セルゲイ・ウィノグラツキー(図1)は、1856年9月1日にウクライナのキエフで生まれ、1953年2月24日にフランスのブリーで没した。彼は正教会の鳴り響く鐘に囲まれて育ったが、大人になってからは『私はただすべてを忘れ、神秘主義も年をとるにつれてすべて消え、子供時代の傾向も跡形もなくなった』。(Waksman, )と述べている。
図1
S. N. Winogradskyのサイン入り写真（インディアナ大学L. S. McClungコレクションより）。
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S. N. Winogradskyのサイン入り写真（インディアナ大学L. S. McClungコレクションより）。
1870年代後半、ウクライナの生活と経済は大きく変化しました。甜菜の栽培と甜菜糖の商業が急成長し、ウクライナ、特にキエフを大きく変えました。父親が新しく設立された銀行の頭取となり、ウィノグラツキー家の富は飛躍的に増大した。こうして、幼いセルゲイは富と特権に囲まれて育った。幼少期の教育は、父親がラテン語とギリシャ語の両方を教えるという理由で選んだ地元の体育館で行われた。このように明らかに有利な環境であったにもかかわらず、若き日のウィノグラドスキーは授業を「...おもしろくない、不快なだけでなく、肉体的にも道徳的にも憂鬱であった」と感じていた。(ワクスマン, ). 学業成績で金メダルをもらうと、すぐにそれを売ってしまったという事実が、そこでの学問的経験に対する彼の軽蔑を表している。このことは、彼が生涯を通じてたびたび遭遇することになる学問的、科学的な平凡さに対する彼の焦りを予感させるものであった。
卒業後、彼はキエフ大学に入学し、2年間法律を学んだが、予想通り退屈なものであった。また、学生たちの間で起こっていた革命的な活動にも興味がなく、イライラしていた。彼は、自然科学部に移り、未熟ながらも強い創造的衝動のはけ口を見つけようとした。しかし、分析的な科学はなく、授業も退屈で散漫なものだった。
この時点で、この聡明で創造的な青年が、自分の人生の軌道を確立するのに苦労していたことがよくわかる。左脳から湧き出るような衝動を捨て、右脳にシフトした若き日のウィノグラツキー（当時20歳）は、名門サンクトペテルブルク音楽院に入学し、ピアノを学ぶことになる。彼は音楽的にシンパシーを持った家庭の出身で、子供の頃からピアノを習っており、世界的なピアノ教師であり教育者であるテオドール・レシェティツキーに師事することを許されたのだから、相当な才能を持っていたに違いない。しかし、残念なことに、1年余りでその道も断たれてしまった。「脳の活動を伴わない美的感情だけでは十分でない」（ワクスマン、）と判断したためである。彼の決断は、ヨーロッパのもう一人の偉大な生物学者、ノーベル賞学者ジャック・モノの進路を思い起こさせる。彼もまた、指揮者としての音楽の道を歩むか、科学の道に進むかで悩んだのだ（Judson, )。幸いなことに、ウィノグラツキーもモノーも微生物学者としての道を歩むことになった。
しかし、サンクトペテルブルクはキエフではなく、大学も優秀であった。彼は再び自然科学部に入ったが、今度はずっと幸運だった。化学ではドミトリー・メンデレーエフ、生物学ではエリー・メチニコフという優秀な教授陣がおり、ウィノグラツキーは「やっと自分の進むべき道が見えてきた」と確信した。3年後、世界的に有名なカリスマ植物学者アンドレイ・ファミンツィンの研究室を見つけ、植物生理学を専攻することになった。ファミンシン氏は、ウィノグラッドスキー氏を学部生として受け入れ、ウィノグラッドスキー氏のメンターとして指導することに同意してくれた。そして、ウィノグラツキーは卒業後、修士課程に進み、ファミンチンの研究室で研究することになった。
ファミンツィンは、ストラスブルグの著名な植物学者アントン・デバリーに師事しており、この事実は、ウィノグラツキーの大学院での研究において重要な意味を持つことになった。デバリの研究室からサンクトペテルブルクに戻ったファミンツィンは、単細胞藻類スピロギラの成長に及ぼす光の効果に着目し、藻類の成長のパラメーターとして細胞内のデンプン粒の顕微鏡的・微量化学的観察を行った。この実験的アプローチは、後にStrassburgのBeggiatoaの研究においてWinogradskyによって採用され、細胞内硫黄顆粒の出現と消失から、彼は化学石器栄養の理論、そして最終的には自己肥大の理論を打ち立てるに至ったのである。
植物生理学の研究室にいたにもかかわらず、彼はドイツのフェルディナンド・コーンやロベルト・コッホのような初期の微生物学者の研究を知っていて、それに感銘を受けていた。パスツールは、事実の正確さにこだわり、論理的な実験手法と、実験から明確で説得力のある結論を導き出す能力で、ウィノグラドスキーのキャリアに基準を与えたと言ってよいだろう。ファミンツィンの研究室で修士号を取得するために、ウィノグラツキーが担当した生物がMycoderma viniであったことは、幸運な偶然というか、運命的なものであった。この菌は、甜菜産業にとっての疫病であると同時に、パスツールが「ビールについての研究」を完成させ、微生物と化学変化との間に因果関係があるという概念への画期的なパラダイムシフトを行った生物でもある。
ファミンツィンの研究は、生物の栄養と生理的特性の関係に重点を置いたものであった。そして、植物と動物の間に位置する酵母M.viniを選んだことは、ファミンツィンにとって、この生物を研究する機会を提供することになった。
ウィノグラツキーは、M.ビニの純粋培養物を希釈を重ね、ついに単一細胞を単離した。(コッホは、数年前に固体培地を用いて純粋培養を行うことを発表していた。このニュースはまだサンクトペテルブルクには伝わっていなかったようだ）。彼は次に、様々な有機化合物や無機化合物、酸素濃度の変化が生物の増殖に及ぼす影響を調べた。パスツールは、ガイスラー室（図0002）と呼ばれる独創的な装置を使って、これを行いました（Pasteur, )。このチャンバーを使うことで、酵母を純粋培養として長期間維持し、特定の栄養素を加えたり、培養条件を変えたりして、酵母の成長と挙動に及ぼす影響を観察することができたのです。セルマン・ワクスマンは、この研究を次のように紹介している。
図2
ガイスラーチャンバー（Pasteur, ）。(a）チャンバーは扁平なガラス管で、培養液がゆっくり通過するようになっている。(b)顕微鏡で見たガイスラーチャンバー。
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ガイスラーチャンバー（Pasteur, ）。(a) チャンバーは扁平なガラス管で、培養液がゆっくりと通過する。(b)ガイスラーチャンバーと顕微鏡。
若き日のウィノグラツキーが行ったこれらの実験は、純粋培養における微生物の増殖に制御された環境が及ぼす影響について、明確に定義された実験条件下で行われた最初の慎重な調査のひとつと見なすことができるだろう。
(Waksman, )。
この研究は出版されなかったが、1883年に大学の植物学部門の会議でWinogradskyによって発表され、Botanische Zentralblattに要旨が報告された（Winogradsky, )。この抄録は出席した教員の一人、アレクサンダー・ボロディンによって書かれ、脚注に「筆者は講演者がファミンツィンの研究室で展示した培養物の純度に感服した」と記されている。(化学の教授であったボロディンは、有名な「ポロヴォツィア舞曲」の作曲者でもあったことは興味深い）。
1883年、ウィノグラツキーは理学修士号を授与された。彼は、教授陣からサンクトペテルブルグ大学に残り、同大学の教授になるための訓練を受けるようにと誘われたが、これを断った。彼は、学問の世界には興味がなかったし、今後も興味を持つことはないだろう。その頃、彼はジナイダ・アレクサンドロヴナ・ティコホトスカヤと結婚しており、彼女は60年後に亡くなるまで、彼の妻であり、最愛の伴侶であった。
ウィノグラツキーは、当初から「化学変化の原因は微生物であり、結果ではない」というパスツールの結論を全面的に受け入れ、大学院生活の初期にはパスツールの実験を何度も繰り返した。また、フェルディナンド・コーン（Ferdinand Cohn）の細菌に関する注意深い観察と、細菌は固定的で安定した性質を示すという彼の主張にも感銘を受けた。ロベルト・コッホが示した純粋培養の微生物学の技術と威力は、なくてはならないものだった。そして、ファミンツィンが行った顕微鏡観察と栄養学的、生理学的実験との結合は、ウィノグラツキーが継続的に行っている手法となった。こうして、ウィノグラツキーのキャリアは、次の重要な局面を迎えることになる。
サンクトペテルブルクの気候は厳しく、体の弱いジナイーダには厳しいものであった。二人はサンクトペテルブルクを離れ、日当たりの良いクリミアにしばらく居を構えた。当時のロシアは、暗殺されたばかりの皇帝アレクサンドル2世の自由主義的な改革に対する反動で、その勢いはとどまるところを知らなかった。後継者のアレクサンドル3世は、革命派、異端者、ユダヤ人、非ロシア系外国人をすべて排除し、民族主義的なスラブ主義に戻ろうと考えていた。これは、若い革新的な科学者にとって、最適な環境ではなかった。クリミアでの1年を経て、ウィノグラツキーとジナイーダはより自由な西ヨーロッパへと旅立ち、1885年、ウィノグラツキーはストラスブルク大学の有名な隠微植物学者アントン・デバリの研究室に入った。
ストラスブルグ、ベギアトアと化学石灰化
新しい生存様式を発見した。
(Anton deBary)
ストラスブールは、若かりし頃のウィノグラツキーにとって、そのドイツ的な効率性、デバリのような優れた科学性、そして世界中から外国人科学者が集まる科学の中心地としての役割に、大きな衝撃を受けたに違いない。彼は、ロシアのアカデミズムのしがらみから解放され、家族的な義務からも解放され、少なくとも当面はロシアで研究職に就くという心配もせずに済んだ。
当時、微生物学は、単形態論者と多形態論者の考え方の対立を解決しようと苦心していた。古典的な植物学者たちは、バクテリアのイデオシンクラシーをまったく知らず、バクテリアの多様性や遍在性の程度を知る手がかりもなく、天然素材に存在する万華鏡のように多彩な形や振る舞いに当惑していたのである。彼らは、バクテリアは数種類しか存在せず、それらは一連の未決定の変数によって決まる複数の形態を示すと主張した（例えば、Zopf, )。もちろん、彼らは混合培養の一般的な使用によって、誤解を招いた。
フェルディナンド・コーンに率いられた単形態論者は、自分たちの病因論的成功に熱中し、細菌分類学という新しい学問に興味を持ちました。一貫した分類学は、安定した固定形態に依存しており、単形態論者は多形態の混沌を侮蔑することに不屈でした。
デバリは、単形態主義に固執しており、この聡明な若いロシア人を自分のグループに迎え入れることを切望していた。ウィノグラツキーは、バクテリアは固定的で安定した定義可能な性質を持つので、植物学的な分類が可能であるというデバリの立場を確認するために配属された。彼は、糸状菌ベギトアという細菌を選び、その安定した性質を検証することで、デ・バリの単形性についての立場を支持することを期待した。ベギトアはすでに報告されており、自然環境にあるときには硫黄顆粒を蓄積することが示されていた（Cramer, ）。コーエンは、硫黄泉を生息地とする他のバクテリアにも同様の顆粒が存在することを指摘し、これは生物学的にユニークであると述べている（Cohn, )。
ウィノグラッ ドスキーは、ストラスブルグにあるベギトアスの培養液を使うこともできたが、彼の深い直観は、この生物を できるだけ自然環境に近い状態で研究することを目指させた。そこで、スイスやドイツの硫黄泉を訪れ、そこに生えている白い糸状の塊のサンプルをたくさん採取した。研究室に戻ってから、ベギトアスの純粋培養を試みたが、うまくいかなかった。ベギトアスの純粋培養が可能になったのは、Keil in and Pringsheim ()の研究によるものであったから、これは驚くべきことではない。このため、ウィノグラツキーはベギトアスの最適な生育条件を決定するために一連の栄養実験を開始した。そしてここで、ファミンツィンの研究室での菌類学の経験が貴重なものとなった。彼は、Mycodermaで使用したGeisslerチャンバーと同様のマイクロ培養をセットアップした（Ackert, ）。ベギトア糸はガイスラーチャンバーの側面にぴったりとくっつき、細胞を新鮮な培地で何度も洗うことができたので、汚染物質のほとんどを洗い流すことができた。また、細胞の反応を顕微鏡で観察しながら、培地の成分を変えることもできる。ウィノグラッ ドスキーは、硫黄泉から取り出したばかりの細胞が、硫黄顆粒をたくさん含んでいること をすぐに確認した（図0003）（Winogradsky, ; Strohl & Larkin, )。このことが、彼の中で、硫黄顆粒の発生源や硫黄泉におけるH2Sの役割に関する議論を再び呼び起こした。これは、デバリが設定した目標ではなかったが、この珍しい顆粒がベギトアスの生活でどのような役割を果たしているかを理解したいという誘惑は、抗しがたいものであったに違いない。
図3
(a) Winogradskyが描いたベギトアスの硫黄顆粒の図（Winogradsky, )。(b)位相差による硫黄顆粒を持つベギアトア。(c)暗視野。バー：10μm（Strohl & Larkin, ）。
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(a) WinogradskyによるBeggiatoaの硫黄顆粒の図（Winogradsky, ）。(b)位相差による硫黄顆粒を持つベギアトア（Beggiatoa）。(c)暗視野。バー：10μm (Strohl & Larkin, )。
文献上では、温泉水に硫酸塩が含まれていることに着目して、様々な仮説が立てられていた。Cohnは、温泉水が他のほとんどの生物にとって致死的なH2Sで飽和していることを指摘し、H2Sは硫黄細菌が温泉中の硫酸塩を還元した結果であり、ベギトアスはそれを硫黄に酸化して無毒化するとした (Cohn, ). Lothar Meyer () は、Landeck温泉の水を4ヶ月間培養すると、H2Sが4倍に増加することを明らかにしていた。Plauchud () はその実験を繰り返し、水をクロロホルムで処理したり、煮沸したりすると、H2Sの発生が本質的になくなることを示した。このことから、このプロセスは生物学的なものであることが明らかになった。Etard & Olivier () は、Beggiatoaは硫酸塩がないと顆粒を失うが、硫酸塩を培地に再導入すると顆粒が再び出現することを示した。Duclaux () は、硫黄細菌は確かに硫酸塩をH2Sに還元しているが、硫酸塩の一部は硫黄に部分的に還元されただけで細胞内に蓄積している、と提唱した。あるいは、H2Sは大気中の酸素によって酸化され、細胞内に蓄積されるという仮説が好まれた。
このように、ウィノグラッドスキーが最終的に化学石器栄養（inorgoxydation）という素晴らしい洞察を得るに至った重要な問題は、「ベギトアスの細胞内の硫黄は、硫酸塩の還元によって生成されるのか、それともH2Sが酸化されることによって生じるのか」（ウィノグラッドスキー、）であった。彼はこの問いに、単純明快で美しい実験で答えた。彼は、小さな生育室で、細胞を硫酸塩を含む湧水中またはH2S中で培養して、顕微鏡で観察したのである。結果は明らかだった。H2Sに浸したフィラメントは、24時間以内に硫黄の粒でいっぱいになり、CaSO4に浸したフィラメントはやがて死んでしまった。Winogradskyは、『硫黄顆粒の発生はH2Sの酸化中にのみ起こる。このプロセスが、あるときは硫酸塩の還元によって、あるときはH2Sの酸化によって起こると結論づけることはできない』(Winogradsky, ) と結論づけた。
硫黄への酸化に必要な酸素の存在下で硫化水素が持続することは問題であり、25℃の好気的環境における硫化水素の半減期は約1時間である(Jorgensen et al., ). したがって、ベギトアはH2SとO2の両方が共存できる狭い界面に正確に位置しなければならない。Winogradskyは、このことを次のような優雅で単純な実験によって証明した。ベギトアスのフィラメントをカバースリップの下に収めたスライド培養を用いたのである。H2Sを含まない培地では、糸状菌はカバースリップの中央に集まり、ボール状に固まっていた。H2Sの希薄溶液をカバースリップの端にかけると、フィラメントは中央から移動してきたが、端から約1mmのところで止まり、そこで細胞列が形成されるようになった。彼はこの実験を楽しんだに違いない。彼は、細胞が行ったり来たりする振動を、ほとんど詩的な表現で「非常に優雅で生き生きとした絵」（'ein äusserst elegantes und belebtes Bild!'）と表現した（Winogradsky、）。
この問題の核心は、ベギトアスがなぜこれほど多くの硫黄を必要とするのか、その生命現象にどのような意味があるのか、ということである。硫黄は同化するのか、それとも排泄されるのか......。これは長い間、私にとってのパズルだった」（Winogradsky, ）。ウィノグラッ ドスキーはすぐに、実験条件下で健康な細胞が硫黄を継続的に蓄積し、自然環境では硫黄で満たされていることを観察した。そして、細胞から硫黄を取り除くと、24時間以内に顆粒が消失するという重要な観察結果を得た。そこで、「...硫黄は溶解して細胞に吸収・同化されたのか、それとも排泄されたのか」という疑問が生じた。彼は、細胞内の硫黄の体積は細胞質の体積をはるかに超えており、細胞のタンパク質の合成にこれほど多くの硫黄が必要であるとはとても考えられないと計算した。そして、彼はまた素晴らしい発想の飛躍をした。H2Sの酸化が起こった後、細胞内の硫黄はさらに酸化されて、最も酸化状態の高いH2SO4になることだ』（『H2SO4』。(Winogradsky, )。
ウィノグラツキーは、この仮説にたどり着いた瞬間を、よりくだけた表現で回顧録の中に記している。ある日、硫化水素や硫黄を含む化学の仕事で疲れて帰る途中、イル運河沿いを歩いていると、突然、ベギトアによって硫黄が酸化されて硫酸になるかもしれないと思いついたのです。そのとき、私は自分の推測の意味するところをすべて理解し、それが私の問題を解決してくれると信じて疑わなかった。そうすると、今まで叩かれていたのが嘘のように、自分自身が成長するんです。それでも、この発見が画期的な発見となり、私のこれからの研究の方向を決定づけ、微生物学と生理学の新しい章を開くことになるとは、私には思えなかった」。(Zavarzin, )。科学研究の醍醐味である「アハ！」の瞬間を見事に表現している。
彼は次に、硫黄顆粒が枯渇した細胞の上澄み液について、硫酸バリウムの沈殿をH2SO4のパラメータとして用いて、一連の注意深い微生物化学的測定を行い、この仮説を検証することを進めた。その結果、確かに細胞は硫黄顆粒の消失と同時に硫酸を排泄していたのである(Winogradsky, )。次の一文にドキッとしないわけにはいかない。これらの生物における硫黄は唯一の呼吸源であり、その意味では他の生物における炭水化物と同じ役割を担っている」（Winogradsky, )。デバリーは、彼の学生の発見を次のように紹介している。「Sie haben einen neuen Modus vivendi gefunden. (Zavarzin, )」と述べている。そして、実際にそうなったのである。しかし、このとき彼は、H2S、NH3、Fe2+などの還元性無機化合物の酸化によってエネルギーを得るバクテリアの能力であるケモリソトロフィーの概念を打ち立てており、これがやがて自然界の硫黄・窒素循環の概念全体につながっていったのである。
チューリッヒと硝化
生物学の研究において、方法の優美さ、推論の確かさ、思考の大胆な独創性において、硝化細菌の発見に匹敵するようなものはほとんどないだろう。
(Stanier, )
1888年、ウィノグラドスキーはデバリの研究室での大学院での研究を終えていた。ロシアに戻って学問的な職を探し始める時期が来たのだ。キエフ、サンクトペテルブルクと回ったが、いずれも職が見つからなかった。そして、ストラスブルグに戻ると、デバリは顎に重い癌を患っており、間もなく死亡することが分かった。この時、ウィノグラッドスキーには、次のキャリアを歩む時期が来ていることがはっきりと分かった。それは、還元態窒素の酸化的変換、すなわち硝化に関する微生物学的研究であった。
この物語は、土壌細菌学の創始者の一人と呼ばれることもあるフランスの傑出した科学者、ジャン・ジャック・シュロシングから始まります（Doetsch、）。1868年、SchloesingはÉcole des Tabacsの所長であり、彼の最初の論文の1つは、尿とタバコジュースに含まれる硝酸塩からガス状の窒素が放出されることを報告した（Schloesing, )。こうして、自然界における窒素の生物学的変換、特に脱窒現象に対する科学的関心が高まったのである。脱窒は、嫌気性細菌が、好気性生物と同様に、酸素ではなく硝酸塩を還元することによって、代謝的に生成されたプロトンと電子を廃棄するプロセスである。還元によって生じる生成物は、特定の生物にもよるが、亜酸化窒素や窒素ガスなど、何らかのガス状の窒素である。いずれにせよ、このプロセスの結果、土壌中の貴重な硝酸塩肥料が枯渇してしまうのである。この還元的なプロセスと、それと同じように硝酸塩を土壌に還元する酸化的なプロセスが相殺されなければ、このような一方通行のプロセスはいずれ破滅的なものになることは明らかだった。土の中で起こるこのプロセスが認識されたことで、農業関係者の間にかなりの不安が生まれた。「少数の衛生技師や発酵科学者に知られていた奇妙な反応が、突然農業界全体にとって脅威に思えるようになった...その見通しは呆気なかった」。(ペイン, )。さらに、硝酸塩は火薬に不可欠な成分であり、その重要性は最近のナポレオン戦争で証明されていた。
1861年、ルイ・パスツールは、逆のプロセス、つまりアンモニアが酸化的に硝酸塩に変換される現象が起こり、それが生物学的プロセスであることを示唆した（Pasteur, )。しかし、1877年、国立農学研究所の農芸化学教授になったシュローシングが、この考えを2番目の論文で実験的に証明した。当時は、下水道の水を浄化して肥料として使うことが一般的であった。シュロエジングとマンツの論文()は、それまで疑われていたことを決定的にした。下水道水を培養すれば、水中の有機アンモニアは最終的に硝酸塩に変換され、さらにその過程は生物学的であることを示したのである。その後、フランスのガヨンとデュペティ（1882年）が一連の微生物学的実験結果を発表し、硝酸塩のガス生成と嫌気性還元がバクテリアによって触媒されることを説得力のある形で示した。ここで重要なのは、イギリスの化学者ロバート・ワリントンが果たした役割で、彼の研究はウィノグラツキーの概念と実験の舞台となった。
ワリントンは、無機アンモニアの酸化的変換という逆の過程がバクテリアによって行われることを示したのである。さらに、この変換は、アンモニアから亜硝酸塩への酸化と亜硝酸塩から硝酸塩への酸化の2段階のプロセスであることを示したのである。彼の実験は、この2つの過程が2つの別々の生物によって行われていることを示したが、彼はそれらを分離することも、説得力のある形で証明することもできなかった（Warington, 1891）。Waringtonは硝化の歴史において軽視されてきたが、彼の研究はWinogradskyのその後の研究の先駆けであった。
ウィノグラッ ドスキーは、化学研究所で有名なスイス工科大学のチューリッヒ校で科学的な訓練を受けることにした。そこで彼は、物理化学者として知られるエルンスト・シュルツの研究室で、硝化研究に必要な分析技術を学び、完成させたのである。
また、細菌の分離培養の技術にも磨きをかけようと、コッホ派の細菌学者オットー・ロートの研究室にもしばらく滞在した。「研究室はボスのように醜く、衛生研究所の分室であった。このロートはチューリッヒ大学の医師を対象に6週間の細菌学講座を開いていたが、これはドイツでロベルト・コッホの学校が企画した講座と全く同じようなプログラムであった。このロートは、チューリッヒ大学で医師を対象に6週間の細菌学講座を開いていた。正直言って、こんなバカな教授は後にも先にも見たことがない」。(Zavarzin, )。
彼が硝化の研究をするためにチューリッヒに行ったという直接的な証拠はないが、あらゆる証拠が、実際にそうであったことを示唆している。
こうして、バクテリアの自家増殖のプロセスと、自然界の循環におけるその役割について明確な証拠を提供する、硝化に関する記念碑的研究が始まったのです。そして、個人的な意味において、この研究はウィノグラツキーが植物生理学者から微生物生態学者へと転身したことを示すものであった。実際、アッカート（）は、ウィノグラツキーが最初の微生物生態学者というだけでなく、この分野の創始者であると考えることができると指摘している。
Winogradskyが硝化に関する画期的な研究を始めたとき（Winogradsky, ）、彼は、硝化がアンモニアから亜硝酸への酸化と亜硝酸から硝酸への酸化という二段階で進行し、これらの過程が二つの別々の生物によって行われるというWaringtonの発見も、アンモニア酸化剤の純粋培養を終末希釈法で分離したというFrankland & Franklandの論文（ ）も知りませんでした。しかし、彼は、コッホの定理の論理は、細菌と病理学的過程との因果関係を立証するだけでなく、パスツールが発酵酵母で行ったように、微生物と化学的過程との関係を立証することが必要であると説得されたのである。当初、彼は、シュロシングとマンツの研究は説得力があるが、原因となる生物を分離し、純粋培養で硝化を行う能力があることを示す必要があることを認識し、デュクロー（）と同意していた。そこで彼は、純粋培養で硝化細菌を分離し、純粋培養で独立栄養転換を行うことができることを実証することを目標としたのです。
彼は、歴史に残る5つの論文のうちの最初の論文で、硝化細菌を単離するための過去の試みに関する文献の包括的なレビューを始めた（Winogradsky, ）が、それらはすべて失敗に終わっていた。しかし、ウィノグラッ ドスキーは、自分が成功すると確信していた。硫化水素の酸化だけを役割とする生物、鉄塩を酸化できる生物がいるとすれば、アンモニアを豊富なエネルギー源として酸化できる特別な生物の存在を想定しなければならない」(Winogradsky, )。(と述べている（Winogradsky, ）。彼は「...ゆっくりだが確実に進めていく」と意思を表明している。(lentement mais sûrement) (Winogradsky, ) と述べている。彼の戦略は、硝化（アンモニウム塩の硝酸塩への変換を重要なパラメータとする）を行うことができる液体培養物を得るための条件を最適化し、次に固体培地上の硝化コロニーを得ることであった。そして、分離したコロニーを再び液体培地に戻したときに、硝化を行うことができるかどうか、つまりコッホの第3法則のようなものを最終的に証明するのである。
ウィノグラツキーの研究の第一段階は、非常に簡単に進んだ。ベギアトアの研究と同じように、ヴィーニを育てるための栄養学的、生理学的条件を最適化しなければならなかったファミンツィンの研究室での訓練は、ここでも貴重なものであった。アンモニウム塩の種類や濃度、pH、植え付け液の性質、添加する有機物の効果などを変え、最終的に硝化が速やかに起こる培地を得ることができた。これは、事実上、濃縮培養あるいは選択培養の発明であり、特定の栄養型あるいは生理型の微生物を単離するための強力な手段であることが証明されたのである。
しかし、次のステップはそう簡単にはいかなかった。当時の主流であったゼラチンで固めた培地で硝化コロニーを増殖させようとしても、有機栄養の汚染物質が増殖するばかりで、どうやら液体培養の中に十分な有機物を見出して、繰り返し再培養に耐えることができるようであった。さらに、ガラス器具は酸洗浄を繰り返し、チューリッヒ湖の純水を使い、アンモニウム塩も焼却処分した。そして、アンモニウム塩だけをエネルギー源とするゲル化培地にプレーティングしたところ、たった1つの頑強で持続性のあるコロニータイプ（硝化を行うことができない）しか確認できなかった。ここで、ウィノグラッドスキー氏の実験の機敏さが発揮された。彼は、逆選択培養というのをやったのだ。彼は、液体の無機塩類培地では、フラスコの底にゾウリムシのような塊ができ、不溶性の炭酸マグネシウムの結晶の層が厚い細菌の層で覆われていることに気づいていた（バイオフィルムの初期の観察例）。彼は、これが求めていた硝化菌であると推測した。彼は、これらの結晶をいくつか取り出し、滅菌蒸留水で注意深く洗い、ゲル化した培地の表面に沈着させた。(脚注に、M・ペトリが最初に使った小皿を使ったと書いてある）。6日間培養した後、彼は結晶を付着させた場所を調べ、コロニーが成長していない場所を選びました。これは、おそらく残存している硝酸塩が含まれていて、汚染物質が含まれていないのだろう。コロニーはないが硝化細菌がいると思われるこれらの固形培地を液体培地に再投入すると、アンモニウム塩を硝酸塩に変えて増殖した。そして、彼はこう言った。
J'avais donc fini par isoler le microbe nitrifiant. ('I have finally isolated the nitrifying microbe.') と。
(ウィノグラッドスキー, )
残念なことに、彼は自分自身を欺いたのである。培地の窒素源はアンモニウム塩であり、Winogradskyは硝酸塩のジフェニルアミンテストを硝化のパラメーターとして使っていたので、彼は間違いなく純粋培養ではなく、アンモニアと亜硝酸塩を酸化するバクテリアの両方を含むものを持っていたのである。55年後に出版された回顧的大著（Winogradsky, ）では、この件に関してかなり慎重になっており、最終的に、硝化が2段階で進行すること、2つの別々の生物が関与することを証明したワリントンの関連論文4つすべてに言及している。
この論文では、2つの別々のグループのメンバーが分離され、アンモニアを亜硝酸に酸化し、亜硝酸を硝酸塩に酸化する能力があることが実証されたことが述べられています。
このシリーズの2番目の論文（Winogradsky, ）では、Winogradskyが硝化の原因であると考えた生物について述べている。当時、ワリントンはまだ硝化が2段階で進行することを示す研究を発表していなかったので（それは翌年に実現する）、ウィノグラツキーは、彼が入手した硝化培養物が単一の硝化生物から構成されているとまだ信じていたのである。この硝化菌は、培養液の中で最も優勢な、あるいは顕微鏡で見える唯一の生物である可能性が高く、ウィノグラドスキーは、新しく分裂したときは小さく楕円形で、ほとんど球形であると述べている。細胞は分裂後長軸方向に分離し、フィラメントも胞子も形成せず、分裂周期のある段階では運動性があった。(グラム染色は、1894年までクリスチャン・グラムによって記述されていない）。当時は、まっすぐな棒状の細菌はすべてバチルスと名付けられた。しかし、ウィノグラツキーはすでに細菌の生理的種類という概念を導入しており、生物の名前と説明には形状ではなく、そのパラメータを使うことにしたのである。彼は、細菌の形が限られているのに対して、細菌の生理的タイプはたくさんあるはずだということを、すでに予感していたに違いない。したがって、彼の培養物には明らかにニトロソモナスと、現在我々がニトロバクターと分類しているものの両方が含まれていたにもかかわらず、彼はこれをニトロソモナスと名づけたのである。論文の続きはこちら ウィノグラツキーは、硝化細菌が後に独立栄養細菌と呼ばれるようになる代謝を行うことができると結論づけるための実験を行った。つまり、有機炭素がなくても成長できる能力を持ち、光合成を行う生物に匹敵する無色透明の生物である。現代の私たちが当たり前のように使っているものからすると、それがいかに新しいパラダイムであったかは想像に難くない。有機基質ではなく無機基質の酸化や、クロロフィルによる光エネルギーの取り込みから得られるエネルギーを代用できる生物、おそらくは一群の生物がここにいたのである。
有機物を添加しない状態で、本当に生物が成長し、細胞物質を合成しているのかどうかを確かめるため、彼は、培地から有機物を徹底的に排除することを進めた。そのため、二重蒸留水、焼塩、酸で洗ったガラス器具を使用した。そして、硝化培養を行い、培養液中の有機物をすべて燃焼させ、発生したCO2を回収・測定し、植菌していない培養液から発生したCO2を差し引くと、かなりの量の有機物が純合成されていることが決定的なデータとして得られたと結論づけたのである。彼は、一般的な生理学的重要性を持つ新しい真実、すなわち、「...生物の作用による有機物の完全な合成が、太陽エネルギーとは無関係に我々の地球上で達成された」という結論に達した。(Winogradsky、)と述べている。
有機炭素のない培地から細胞成分を合成するバクテリアの能力は、まったく予想外のものだった。このシリーズの3番目の論文（Winogradsky, ）は、その結論を確認し、測定値を改良することに着手したものである。彼は、1mgの細胞性炭素の生産には35.4mgのアンモニア性窒素を回転させる必要があることを示し、これらの生物の成長が遅いのは、細胞が細胞性物質を合成するために大量の基質を回転させなければならないからに違いないとコメントした。さらに今回は、単にアンモニウムが硝酸塩に変わるのを測定するのではなく、亜硝酸塩と硝酸塩の両方を測定したところ、硝酸塩が硝化の最終生成物であるにもかかわらず、培養物中の亜硝酸塩量が硝酸塩量をはるかに上回っているという予想外の結果になった。これは、アンモニアが亜硝酸塩に酸化される過程で、酸素など硝化に不可欠な物質が消費された結果ではないかと考えたのです。しかし、この仮説を検証するために行った実験は、すべて失敗に終わった。この時彼は、不幸にも最近見たばかりのワリントンの論文()に、亜硝酸塩が硝化細菌の培養の最終生成物であると書かれていたことを思い出した。(ワリントンはその後まもなく、硝化はアンモニアから亜硝酸、亜硝酸から硝酸の2段階で進行し、それぞれの段階は異なる細菌によって行われると報告している）（Warington, )。
今にして思えば、Winogradskyはまだ二枚舌の培養をしていたため、データの化学量論的分析を正確に解釈することが困難だったことは明らかである。このメモワールは「Elles sont profondes et plus compliquées」（Winogradsky, ）というコメントで終わっている。
4番目のメモワールでは、Winogradskyは、硝化プロセスにおいて誰が何をしているかという問題の最終的な解決のための舞台を設定している（Winogradsky, )。彼は、最初のメモワールでは、硝化細菌の純粋培養を単離したという主張が単純化されすぎていることに気づいているようだ。彼は純粋な硝化菌の単培養体を得る手段としての希釈という戦略を否定しており（Winogradsky, ）、最初のメモワールで説明した、ゼラチンプレートの成長が見られなかった部分から液体培地に戻すという戦略について、彼は現在、「...成長できないことは硝化菌の独占的な性質ではないので、そのような否定的な証拠は証拠とはならない」としている（Winogradsky, )。(Winogradsky, )と述べている。彼は、有機物の存在が硝化細菌の増殖を妨げると確信し、M. W. Kuhne () がもともと述べていた方法、すなわち固体培地を調製するためのゲル化剤としてケイ酸を使用する方法を選択したのである。これは見事な決断であり、結果は良好であった。シリカゲルで固めたアンモニウム塩培地に非硝化細菌が生育していることをWinogradskyは確認したが、それらはほとんど見えない薄い膜となっていた。このように、最初のメモワールについて述べたのと同じ問題が浮かび上がってくる。培地には、亜硝酸塩ではなく、唯一の窒素源として硫安が含まれていた。では、どうして純粋なコロニーから硝酸塩が生じたのだろうか？試験した材料には、アンモニアと亜硝酸塩を酸化するバクテリアの両方が含まれていたはずである。
このシリーズの最後となる第5回目（1891年）で、ウィノグラツキーは、硝化がアンモニアから亜硝酸塩への酸化と亜硝酸塩から硝酸塩への酸化の2段階で進行することを確認する説得力のある証拠を提示しました。また、硝化細菌は有機炭素がなくても、炭酸塩の形で炭素を同化し、細胞材料を合成することができることを示した。このように、硫黄細菌が無機基質の酸化からエネルギーを得ていること、すなわちリソトロフィーの発見に、今度は硝化細菌がCO2のみから細胞物質を合成する能力、すなわちオートトロフィーの概念を加えたのである。そして重要なことは、土壌や自然界で実際に起こっていることを理解しようとするならば、実験室の液体純粋培養で観察されるものを再検討し、再解釈する必要があるという彼の認識の始まりを見ることである。これは間違いなく、微生物生態学という分野の始まりです。
化学者は硝化を、本質的にアンモニアを硝酸塩に変換するプロセスであると考えています。そして、自然界でも、実験室でも、このプロセスの一部として亜硝酸塩が生成されることはほとんどない、と。
1890年、ウィノグラツキーは自分の研究に2つの目標を掲げていた。1つ目は、この過程が2つの連続したステップで行われ、2つの別々の生物によって実行されていることを確認すること。2つ目は、純粋培養で原因となる生物を分離し、それぞれが2つの変換のうちの1つだけを行う能力があることを証明することである。
最初の目標は、土壌を接種した粗混合培養でアンモニアを硝酸塩に完全に変換することは可能だが、下培養を繰り返すと、最終的にアンモニアを亜硝酸塩にしか変換できない培養物になるというワリントンの初期の発見によって混乱が生じたことだった。間接的ではあるが、この観察からワリントンは、この過程が2段階で行われると結論付けたのである。しかし、この観察によって、彼は後に亜硝酸塩を硝酸塩に変換するだけの培養液を得ることができなくなった。ウィノグラツキーは、この観察を確認した上で、彼特有の分析的手法で、培養の進行に伴う亜硝酸塩と硝酸塩の出現とアンモニアの消失の動態を注意深く分析し、この観察を拡張したのである。そして、注意深く観察すれば、その両方の過程を培養で示すことが可能であることを示したのである。
アンモニアを基質とする培養液に、10月11日に土を植え付けた。11月3日には、検出可能な量の亜硝酸塩が検出された。11月12日には亜硝酸塩の反応が激しくなり、11月24日には安定した状態になった。11月20日にはアンモニアがすべて消え、12月16日には亜硝酸塩がすべて消え、硝酸塩に置き換わりました。ウィノグラッドスキー氏は、硝化には確かに2つの段階があり、亜硝酸塩から硝酸塩への変換は、元の基質であるアンモニアが消失するまで起きないと結論づけた。
そして、混合液体培養からシリカゲルプレートへのストリークを進め、アンモニアを亜硝酸に変換する細胞を分離することに成功した。この純粋培養液を無菌の土壌に接種すると、亜硝酸塩が生成された。そして、ウィノグラツキーは、「我々は今、一方のアンモニアの酸化と他方の亜硝酸塩の酸化の原因は異なると結論付ける段階にいる」（Winogradsky, ）と慎重に述べている。
彼は、亜硝酸塩を基質とする選択培養に土壌を接種し、同じ培地で連続的に継代培養を行うことで、亜硝酸塩酸化細菌を単離することができた。この過程でアンモニア酸化菌は除外され、シリカゲルプレートにプレーティングすると、アンモニアを酸化できない亜硝酸酸化菌が得られた。
この第5回目のメモワールの次のセクションでは、ウィノグラドスキーが微生物生態学者であることを示す、おそらく史上初の明確な証拠が示されています。彼は、土壌での硝化が、実験室培養での硝化とプロセスや生成物に関して同じパターンをとるかどうかを問うているのです。彼の実験は次のようなものであった。庭の土のサンプルを2つ用意し、それぞれに硫酸アンモニウムを加えた。一方は未滅菌で、もう一方は滅菌した。滅菌した土にアンモニア酸化細菌の純粋培養物を植え付けた。
10日間培養した結果、未滅菌の土壌にはかなりの硝酸塩が含まれ、硝化が進んでいた。亜硝酸塩はほとんど感じられなかった。3週間後、そして3ヶ月後には、十分な硝酸塩が存在したが、亜硝酸塩は検出されなかった。植え付けられた土壌では、3週間後に測定可能な亜硝酸塩があり、3ヶ月後には十分な亜硝酸塩があった。検出可能な硝酸塩が存在しなかったのです。
ウィノグラツキーの研究から得られた確かな結論は次のようなものであった。
硝化は生物学的なプロセスである。
硝化は、アンモニアから亜硝酸への変換と、亜硝酸から硝酸への変換という2つのステップで行われる。
それぞれは生理的に特異な生物群によって行われ、その正確な性質は土壌によって異なる可能性がある。
硝化の動態や2つの細菌群の相互作用は、土壌と液体培養で異なっている。しかし、これはきっと、土壌と実験室での培養の物理的な違いを反映しているのでしょう。
硝化の過程も、彼が硫黄細菌について述べた化学石器栄養の一例であるが、それに加えて、無機塩の酸化と二酸化炭素の固定を結びつける生物の能力によって、後に自家増殖と呼ばれる過程にある細菌を増殖させることができる（Winogradsky, )。
こうして、硝化の生物学に関する物語の第一章が終わった。ルイ・パスツールがこのプロセスが生物学的であると最初に示唆した一方で、シュロエシングとマンツが実際にそうであることを最初に実験的に証明し、ワリントンがこのプロセスが生化学的に2つの別々のプロセスから構成されていることを示した。ウィノグラツキーは、まさに微生物生態学者の第一人者であった。
ロシアに戻る
葉緑素を持たないが、無機物からすべての細胞材料を合成できる生物がいるという考えは、生物学の新しいパラダイムとして、科学界を席巻した。ウィノグラツキーは、このプロセスを光合成と区別して「化学合成」と名付けた。農学者、植物生理学者、微生物学者の考えを一変させ、ウィノグラツキーに仕事の依頼が殺到する結果となった。その中で最も魅力的だったのは、1891年にパスツール研究所のルイ・パスツールからの使者として、エリー・メチニコフが自ら届けたものだった。ウィングラドスキーは、同研究所の微生物学部長として、自由に使える研究室を提供されることになった。ウィングラッドスキー自身の言葉を借りれば
しかし、別の申し出があり、私の決断は翻された。1891年、パスツール研究所と同じような目的を持った研究所が、オルデンブルグ公によって設立され、サンクトペテルブルグの帝国国立実験医学研究所として、公から贈られたのである。私は、この研究所の一般微生物学部長を務めることになった。パスツールの申し出を受けると、私は少しずつ国外に移住しなければならなくなるが、それを望まなかった。だから、私はサンクトペテルブルクの申し出を受けたのだ。
(ウィノグラツキー、)
1891年3月、残念ながらもはや一般的ではなくなった礼儀正しさの特徴的な行為として、ウィノグラツキーは特別にパリに行き、パスツールに自ら決断の理由を知らせた。しかし、パスツールは、ウィノグラツキーがパスツール研究所の精神と雰囲気に感銘を受けながらも、自分の考えを変えようとはしないので、再度招待し、思いとどまらせようとした。
興味深いのは、ロシア研究所の所長は、もともとメチニコフに決まっていたが、メチニコフがパスツール研究所を選び、ウィノグラツキーを誘ったことである。しかし、その時には、ウィノグラツキーは、かつての恩師ファーミンツィンの推薦でサンクトペテルブルグの研究所に移籍していた（Zavarzin, ）。
彼はこの研究所に15年間留まり、彼の科学者としてのキャリアの中で重要な第二段階を迎えた。この時期には多くの重要な発見があり、そのうちの1つが自由生活型の窒素固定装置を初めて単離したことであった。
生物学的窒素固定という考え方は新しいものではありませんでした。生物学的脱窒、つまり固定された窒素を窒素ガスに還元することが発見され、窒素ガスを土壌に還元する同等の反対プロセスが存在することが明らかになったのである。Winogradskyの硝化に関する研究により、類似の酸化的プロセスが示された。さらに1888年には、HellriegelとWillfarthがマメ科植物における共生窒素固定について述べ、バクテリアがこのプロセスのパートナーであることを示した（Hellriegel & Willfarth, )。しかし、自由生活型の窒素固定は、フランスの化学者ベルテロによって提案されてはいたが、実験的に実証されたわけではなかった。ウィノグラツキーは、自分の専門であるエキゾチックな生理的細菌群の培養を生かす好機だと考え、それを実行に移したのであろう。その成果は、フランス科学アカデミーに2つの短報として発表された(Winogradsky, )。
彼は、硝化細菌の分離のために、固定窒素を徹底的に排除した鉱塩培地と、炭素とエネルギーの源としてのグルコースからなる、彼が発明した選択的培養法を用いた。つまり、土壌に植え付けた後に増殖するには、微生物がガス状窒素を窒素源として利用している必要があることは明らかだった。彼は、実際にかなりの生育を確認し、混合培養の支配的な生物は大きな胞子形成性の桿菌で、他に2種類のはっきりとした異なる種を伴っていることを突き止めた。彼は、培養物に固定された窒素の量を測定し、それが添加したグルコースの量と相関していること、生物が酪酸、酢酸、水素ガス、二酸化炭素を生成することを示した。
彼は、嫌気性菌に特徴的な最終生成物を認識し、その見識に基づいて窒素固定菌の純粋培養物を分離し、クロストリジウム・パストリアナム（後に他の研究者によってクロストリジウム・パストリアヌムと改名）と名付けたのである。彼は、ニンジンのスライスを接種し、嫌気条件下で培養することによって、この培養物を単離した。
そして、C. pastorianumは窒素ガス雰囲気下では純粋培養が可能であるが、好気的条件下ではそれが不可能であることを示した。また、付随する汚染物質も、窒素雰囲気では生育できないが、固定窒素源のある好気的条件下では生育できることを示した。そこで彼は、なぜ最初の分離培養では、嫌気性窒素固定因子も好気性汚染物質も好気的条件下で生育できたのか、と考えた。そこで、C. pastorianumを液体培地を薄く塗った培養フラスコに入れたところ、生育不能に陥った。そこで、2種類の好気性汚染物質を添加したところ、C. pastorianumが生育し、特徴的な発酵産物が生成された。彼は、好気性菌の増殖によって酸素張力が十分に低下し、クロストリジウムが嫌気的に増殖できるようになったため、本来好気性の土壌で共存できるようになったと結論づけたのである。微生物生態学者の登場である。
興味深い余談がある。ウィノグラツキーが最初の論文を発表した後、フランスの化学者ベルテロは次のようなコメントを残している。
2ヶ月ほど前にアカデミーで読んだメモワールの方法と結果が非常によく似ていることは、誰の目にも明らかであろう。私が8年前に紹介した土壌中の下等生物による窒素固定という考えは、少しずつ発展しており、そのメカニズムに対する理解は日々深まっている。
(Berthelot、)」。
当時の優先順位は、明らかに今と同じように切望されていた。
50年以上潜伏した後、Winogradskyはそれに応えている(1949年)からだ。
このような優先権の主張は、この巨匠の特徴的な態度である。しかし、この主張がどのような根拠に基づいているのか、理解するのは難しい。
彼は、窒素を固定するバクテリアの種が存在するという、ベルセローのかなり曖昧な示唆に触れ、ベルセローの無批判な実験と、明らかに窒素を固定する純粋培養を自ら分離したことを比較し、こう結論づけた。
このように、共生的窒素固定という発見が、なぜ微生物学の一部の人々によってベルセローに帰結するのか理解しがたい。ましてや、ある結果や考えを、それを支える有効な実験的証拠なしに、断固として受け入れることが、その創造者と認められるために十分であるとは思えない。
サンクトペテルブルクでの生活は、自然の循環や微生物の生態に関するウィノグラツキーのより洗練された考えの始まりであったが、挫折や気晴らしの連続であった。オルデンブルク公には、このような研究所を円滑に運営するための科学的専門知識も行政的才能もなかった。これは、目標や夢がインフラや現実を上回ることが多かった19世紀のロシアならではのジレンマであった。さらに、1904年から1905年にかけての日露戦争は、研究所の財政問題を深刻化させた。
ウィノグラツキーの言葉を借りれば、科学的に優れた成果を上げた科学者が、その成果から見放されることで報いを受けるという、よく聞く悲哀のようなものである。
私は、研究所の科学出版物を組織し、ロシア語とフランス語で出版される『生物科学アーカイブス』の編集長を務めた。1903年から1906年まで、私は研究所の所長をしていた。この間、私は、ストラスブルグやチューリッヒのように、自由に科学研究に時間を割くことができなかった。事務的な仕事、相談事、その他の仕事が常に大きな比重を占めていた。そして、研究所の業務以外では、私は帝国医学高等研究所のメンバー、農業省科学委員会のメンバー、微生物学会の会長などをしていたのである。
(Winogradsky, )。
1898年から1899年にかけて、ウィノグラツキーはインフルエンザにかかり、腎炎を患った。サンクトペテルブルクの厳しい冬は、夫妻にとってますます厳しいものであることは、すでに明らかであった。1899年、彼らはフランスのリビエラで冬を過ごした。この頃になると、研究所での仕事はますます重荷になっていた。個人的な研究活動はほとんど不可能になり、官僚的な雰囲気が漂う研究所は息苦しくなっていた。もともと政治的な駆け引きに長けていたわけでもないウィノグラツキーは、医学中心の研究所のあり方に次第に違和感を覚えるようになった。ウクライナのゴロドクの邸宅で過ごすことが多くなり、1905年に研究所長を辞した。しかし、1910年に研究所を完全に去るまで、彼は研究所のメンバーとして留まった。
早期退職と農場への復帰
こうして1905年、当時50歳そこそこのウィノグラツキーは、早期退職をした。ウクライナのゴロドクにある実家の土地に戻り、残りの人生を紳士的な農夫として、あるいはポミエストチク（大規模な土地所有者）として過ごそうと考えていた。そして、自分の農園に、ひいてはロシアの農業に、西洋的で科学的な先進的経営をもたらそうと考えた。ロシアは、アレクサンドル2世の改革が頓挫したとはいえ、基本的には封建社会であり、エカテリーナ大帝の夢であった世界のリーダーとしての地位の確立に向け、なおも奮闘中であった。
彼は林学を学び、自分の領地にある巨大な森林の管理を近代化するために利用した。果樹園を作り、近代的な酪農を始め、馬を飼い、父親が作った甜菜糖工場や製粉所にも参加し、現在も領地内で稼働している。
彼は音楽に戻り、仕事がないときは、娘とピアノや室内楽のデュエットをすることに時間を費やした。冬になると、一家はスイスのクラレンス近郊にある別荘に出かけていった。のどかな生活だったに違いない。しかし、1914年に戦争が始まると、その生活は一変する。ロシアにとって、この戦争は1917年3月の第1次革命につながる一連の敗戦であり、戦争への参加と引き換えに、一方ではボルシェビキ、他方では白ロシア、ドイツ、ポーランド、西側連合国との間で残忍な内部闘争が続き、1917年11月にボルシェビキの勝利で第2次革命が起こったのであった。1917年11月、ボリシェヴィキは第二次革命に勝利し、土地所有者、貴族、そして敗者であるヴィノグラツキーも逃げ出さなければならなくなった。1921年、オデッサでフランスの軍艦に乗り込み、マルセイユからスイスの別荘に向かった。そして、ベオグラード大学農学部の教授に任命され、喜び勇んでベオグラードに向かった。ロシア滞在中にも招聘を受けたが、それまではユーゴスラビアへの移住を積極的には考えていなかった。
しかし、ベオグラードに到着してみると、研究所には、彼が科学者としてのキャリアを再開できるような初歩的な設備さえもないことが分かった。実験室も科学機器も、書籍や雑誌のある図書館さえもない。そのため、実験ができないばかりか、予定していた講演もできない。しかし、幸いにも『Centralblatt für Bakteriologie 2.Abteilung』のコピーが入手できた。しかし、幸いにも『細菌学中央文献』2.Abteilungが入手でき、ゴロドック滞在中に細菌学の分野で何が起こったかを確認することができた。
ロシアを追われ、妻ジナイーダと離ればなれになっていたヴィノグラツキーが、ゴロドックに滞在している間に、細菌学の分野で何が起こっていたかを確認することができた。ロシアからポーランドに脱出し、ベオグラードで合流した。1922年2月、パスツール研究所の所長だったエミール・ルー氏からありがたい手紙が届いた。
あなたがパスツール研究所に来て、そこで研究生活を送ってくれるなら、私も同僚もとてもありがたい。あなたはパスツール研究所に自分の科学的名声をもたらし、そこで教職に悩まされることなく、あなたの壮大な研究を進めることができるでしょう。メチニコフに続いて、ウィノグラツキーをわれわれの仲間に加えることを誇りに思うだろう。君は土壌の細菌学に関する問題で我々の指導者になるだろう......。
(ウィノグラツキー、)」。
パスツール研究所は、当時ヨーロッパにおける微生物学の中心地であり、この招待はウィノグラツキーにとって祝福の言葉として受け取られたに違いない。しかし、それは30年前、彼が拒絶することを選んだ招待状の、皮肉な後日談でもあった。このようにして、ウィノグラツキーの人生とキャリアの最後の時期が始まった。この時期は、後に微生物生態学として知られるようになる考え方や教訓の形成に費やされることになるのだ。
パスツール研究所と微生物生態学
ウィノグラドスキーは、1923年、まだベオグラードに滞在していた時に書いた論文でその口火を切った（Winogradsky, ）。彼は、50年前のパスツールの発酵に関する細菌説が発酵産業で大きな成功を収め、コッホの研究が微生物の病原学で大きな成果を上げたのに対し、土壌科学はまだ同等の収穫を得るに至っていないと指摘したのである。多くの土壌微生物が分離され、純粋培養されていたが、自然界における実際の役割や、共同的・競争的な相互作用は研究されていなかったのである。彼は、「...人工環境における純粋培養の条件は、自然環境における条件とは決して比較にならない」という考えと、「...いかなる生物競合からも守られ、贅沢な餌を与えられて培養された微生物が、ホットハウス培養となり、短期間のうちに、特別な研究なしにその原型を特定できない新しい種となるよう誘導されるという考えには、誰も反対できない」（Winogradsky、）ことを主張している。
ウィノグラツキーが生涯を過ごし、科学者としてのキャリアを積んだ研究室は、パリ市から20マイルほど離れたブリー・コント・ロベールという小さな村にあるパスツール研究所の一部であった。研究所に寄贈された約12エーカーの敷地の一部で、ウィノグラドスキーの実験室となる小さな家と、ウィノグラドスキーとその家族の住居となる大きな家で構成されていました（図0004）。
図4
ブリー・コント・ロベールの農業微生物学研究室（Ackert, ）。
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ブリー・コント・ロベールの農業微生物学研究室（Ackert, ）。
1924年から1953年に亡くなるまで、ウィノグラツキーは微生物生態学に力を注いでいた。
彼は、「一般微生物学」と呼ばれるものと「土壌微生物学」とを区別し、微生物学の明確な下位区分とみなしていたことを強調した。彼は、細菌の生理的性質や可能性を理解するための純粋培養微生物学の力を認めながらも、自然環境における細菌の活動の実態を研究する際には、その限界にこだわった。自然界における生物の役割の実態を理解するためには、その生物をできるだけ自然環境に近い状態で研究することが必要であった（Winogradsky, )。
ウィノグラッ ドスキーは、土壌の微生物学を研究するために、彼が「直接法」と呼ぶ方法を開発した。その基本的な構成は次のようなものであった。
原則として、ストックカルチャーを使用しない。実験には、できるだけ短時間で直接的な方法で土壌から分離した新鮮な菌株を用いる。
土の中で利用されると思われる栄養分を与えること。
土壌の構成要素間の競争は、それぞれの機能を決定する主要な要因であるから、土壌集団の全体としての反応を研究することを特に重視する。
土壌集団の研究に固体培地を使用する場合、シリカゲル培地を使用し、土壌の微粒子を接種することが推奨されている（Winogradsky, )。
Winogradskyは、土壌で起こる複雑な微生物プロセスの性質を調べるよりも、土壌の農学的健全性と可能性を評価するための技術として直接法を使用しました。そのため、窒素循環のさまざまな有益な側面を強化する微生物の能力を判断するための技術を開発し、改良していきました。30年代前半には、土壌を死んだ有機物や無機物の塊としてではなく、「...生物の特徴的な機能を備えた集合体としての生活環境」（Winogradsky, ）として捉えるという考えを広め始めた。彼は、土壌を、呼吸し、有機分子と無機分子を変換し、土壌の構成要素を動的に健全なバランスに保つ存在とみなしたのである。この視点が、「生物圏は巨大な有機体である」というラブロック（）のガイア仮説を先取りしていたことを、ザヴァルジン（）は指摘している。
化学変化の担い手として微生物という概念を導入したのはルイ・パスツールだが、その視点を土壌に向けたのはウィノグラツキーである。ベギトア菌が硫化水素を酸化的に元素状硫黄に変え、さらに硫酸塩に変えること、そして細菌が硫酸塩を還元的にH2Sに戻すことを発見し、硫黄循環が生まれたのである。パスツールは硝化が生物学的プロセスであることを最初に示唆し、シュロエジングとマンツ、ワリントン、そして最後にウィノグラドスキーの研究によって、それが実際にそうであることが示された。窒素固定による還元的な窒素ガスの同化は、窒素循環があることを明らかにした。このように、ウィノグラツキーが土壌微生物学の目標を、単に土壌から純粋な培養物を分離して調べることではなく、土壌という複雑な生物界で実際に何が起こっているかという問題に取り組む科学として捉え始めたのは必然的なことであった。彼の「直接法」は、その問題にアプローチする試みであった。こうして生まれたのが微生物生態学である。
ウィングラッドスキーが現代の微生物学に残した遺産は、岩石肥料の驚くべき発見や、硝化の微生物学に関する見事な解明、自由生活型の窒素固定細菌を初めて分離したことだけではなく、より大きな意味で、複雑な自然の集団における化学変化を触媒する微生物の役割を理解しようとするなら、それらの集団を、共生生物や抗生物質の相互作用を豊富に持つ自然環境の現場で、あるいはできるだけ近くで研究しなければならないことを認識したことです。
さらに大きな意味では、ウィノグラツキーの研究が、微生物生態学という新しい学問の誕生においてのみならず、生態学全般の変革に果たした役割を認識することが重要であると、アッカート（, ）が指摘している。彼のバクテリアに関する研究は、それまで厳密に歴史的、観察的、推測的、仮説的であったものに、厳密な実験的方法論を挿入するのに役立ったのである。
窒素や硫黄の自然な変換における微生物の役割を解明した結果、有機物、無機物を問わず、生物学的物質は酸化と還元のサイクルを繰り返しているという考え方が定着した。その結果、有機物、無機物を問わず、生物は酸化と還元のサイクルを繰り返していることがわかり、生命の循環という考え方が生まれ、その中で微生物が果たす役割が認識されるようになったのである。ウィノグラドスキーの考えは、まさに「生態系」という考え方につながっていった。これは、知的な地殻変動であり、後にクーンが「革命的な科学」と呼ぶものでした （Kuhn, )。(ほとんどの初級微生物学実験コースでは、「ウィノグラツキー・カラム」の製作が含まれており、これは事実上、カラムの中の微生物生態系である。(http://ecosystems.mbl.edu/SES/MicrobialMethods/MicrobialBiogeochemistry2010.pdf ）。
さらに、ウィノグラッ ドスキーのバクテリアに関する研究は、それまで厳密に歴史的なものであったものに、実験 的な方法論を挿入するものであった。これらの新しいパラダイムは、生物学に新しい学問をもたらしただけでなく、土壌生物学者に、農学や土壌学の実際的な側面に対処するための強力な新しいアプローチを与えたのである。
土壌を直接顕微鏡で調べるという彼の研究は、ある意味で、複雑な自然界の集団を検出し研究するメタゲノム解析の先駆けであった。複雑な微生物集団の相互作用のダイナミクスを、高度化するシステム解析によって理解しようとする試みを今日見ることができたら、彼はきっと喜んでくれるだろう。
ウィノグラッ ドスキーは100年先を行っていたのです。彼が今日の微生物学や微生物生態学を見たら、さぞかし感激することだろう。
後日談
1951年、テキサス大学は、新しい実験科学棟の建設計画の最終段階に入っていました。この建物の目玉は、さまざまな分野の偉大な科学者の名前が書かれた、建物の上部に沿ったエンタブレチャーであった。そのため、教授陣から「この人を推薦してください」と呼びかけがあった。ただし、もう亡くなっている偉人の名前であることが条件であった。細菌学教室のジャクソン・フォスター教授が、微生物学の巨人の一人としてセルゲイ・ウィノグラツキーを推薦した。しかし、ウィノグラツキーはまだ生きているのだからと、却下された。しかし、フォスター氏は、ウィノグラツキーは当時95歳であり、この建物が完成するころには亡くなっているはずだ、と反論した。これは妥当なことで、1952年にウィノグラドスキーの名前の入ったビルが建った。(図0005）。ウィノグラツキーはまだ生きていて、彼らしい潔さと謙虚さでフォスターに感謝した。
図5
テキサス大学実験科学棟、テキサス州オースティン、1952年。写真：Martin Dworkin。
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テキサス州オースティンのテキサス大学実験科学部、1952年。写真提供：Martin Dworkin
新校舎のコーニスを飾る素晴らしい（sic）名前のギャラクシーに私の名前を入れていただいたことに、どれほど深く感動しているか、とても言葉で言い表すことはできません。こうして私は、あなたの仕事を精神的に主宰し、科学的な祝福を与えるという気持ちを持つことになるのです。
(Winogradsky、).
Winogradskyの最後の論文(Winogradsky, )は1952年に発表された。1953年2月24日死去(表0001)。
表1 セルゲイ・N・ウィノグラツキーの略歴（Georgi A. Zavarzin教授よりご提供いただきました。）
1881年 サンクトペテルブルグ大学で農学修士号取得。
1884年 サンクトペテルブルグ大学より植物学博士号取得。
1891年 - サンクトペテルブルグ国立試験医学研究所の一般微生物学研究員
1892年 - ハリコフ大学より名誉博士号（植物学）を授与される。
1902年 - サンクトペテルブルク国立衛生研究所所長に就任
1922年 - ブリー・コント・ロベール（セーヌ・エ・マルヌ県）にあるパスツール研究所の微生物学研究室長
1894 - ロシア科学アカデミーの通信員
1902年 - パリ科学アカデミーの通信員
1903年 - パリ国立農学会通信員
1924年 - ロシア科学アカデミー名誉会員
1924年 - フランス学士院会員、フランス科学アカデミー・アソシエート・エトランジェの称号を得る
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参考文献
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編集者 デビット・ガトニック
© 2012 ヨーロッパ微生物学会連合.
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