ヒト分泌性IgMは腸管メモリーB細胞にクローン的に関連する形質細胞から出現し、非常に多様な常在菌をターゲットとする
ヒト分泌性IgMは腸管メモリーB細胞にクローン的に関連する形質細胞から出現し、非常に多様な常在菌をターゲットとする
ジュリアナ・マグリ、ラウラ・コメルマ、[...]、アンドレア・セルッティ
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概要
分泌型免疫グロブリンA（SIgA）は宿主と微生物叢の共生を促進するが、SIgMはまだ十分に理解されていない。我々は、腸管IgM+形質細胞（PC）がマウスよりもヒトでより多く存在し、腸全体に播種されるが全身リンパ系器官ではまれな記憶IgM+ B細胞の大きなレパートリーとクローン的に関連していることを見いだした。メモリーIgM+ B細胞は、メモリーIgA+ B細胞と腸管特異的な遺伝子シグネチャーを共有していることに加え、いくつかのIgA+クローン型と関連しており、T細胞非依存性またはT細胞依存性のシグナルに応答してIgAに切り替わることが明らかになった。これらのシグナルは豊富なIgMを誘導し、クローンに属するPCからのSIgMとともに粘液に包まれた常在菌を認識することがわかった。ヒトのSIgMが認識する細菌は、SIgAで二重に被覆されており、IgAのみで被覆された細菌や被覆されていない細菌に比べて、豊富で多様性に富むことが分かった。したがって、SIgMは新たに活性化されたナイーブなIgM+ B細胞ではなく、既存の記憶から出現し、SIgAが多様性の高い常在菌社会を粘液に固定するのに役立つ可能性がある。
キーワード：ヒト、IgM、IgA、腸、粘膜、メモリーB細胞、形質細胞、レパートリー、微生物叢
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はじめに
一般に微生物叢と呼ばれる複雑な常在菌群は、生後まもなく腸粘膜に定着し、宿主の代謝、免疫系の発達、腸のホメオスタシスに広く影響を及ぼす（Kamada et al.、2013）。腸管恒常性の中心的な要素は分泌型免疫グロブリンA（SIgA）であり、小腸と、より少ない程度ながら大腸に生息する常在菌と結合して、宿主と微生物叢の共生を促す抗体である（Bunker et al.、2015、川本 et al.、2014）。
常在菌に対するSIgA反応は、ほとんどがパイエル板を含む腸管濾胞の抗原侵入部位で開始される。これらの部位では、小葉細胞、マクロファージ、および樹状細胞による常在菌のサンプリングが、B細胞とT細胞の同族相互作用を含む持続的胚中心（GC）反応を促進し、続いてB細胞がクラススイッチ組み換え（CSR）および体細胞超変異（SHM）をそれぞれ介してIgMからIgAクラススイッチおよび親和性成熟を誘導する（Kawamoto et al.、2014年）。GCから出現した高親和性でIgAを発現するB細胞は、腸管ホーミング受容体を発現し、IgA分泌形質細胞（PC-As）へと分化が進み、腸管固有層（LP）にホーミングする（Macphersonら、2008年）。これらのPC-Asは高分子IgAを放出し、上皮細胞を越えて移行し、粘液に包まれた常在菌を被覆する内腔内SIgAを生成します（Kubinak and Round, 2016）。
T細胞依存性（TD）経路は、自然免疫系の様々な細胞による濾胞性B細胞およびおそらく濾胞外B細胞の活性化を伴うT細胞非依存性（TI）経路によって補完される（辻ら、2008）。相補的なTDおよびTI応答は、循環IgAクラススイッチメモリー（ME-A）B細胞を生成し、個体の発達中に微生物叢の構造を協調的に形成する（Planer et al.、2016）。しかし、ME-A B細胞の継続的な蓄積により、時間の経過とともにTD経路が優勢になることがある（Lindnerら、2012、Lindnerら、2015）。
ME-A B細胞は、PC-Aとともに腸管誘導部位から出現し、既存のGCにおけるSHMおよびPC-Aの分化誘導を含む微生物刺激による適応過程を経て、B細胞受容体レパートリーを継続的に多様化する（Lindnerら、2012年）。
腸粘膜には、PC-Aに加えて、高分子Ig受容体（pIgR）を介してSIgMを内腔に放出するIgM分泌PC（PC-Ms）が存在する（Macphersonら、2008年）。マウスでは、大腸の損傷を誘発するとSIgMの産生が増加し、常在菌の致死的拡散を防ぐ（Kirkland et al.） しかし、特にヒトにおけるSIgMの生合成、制御、および機能についてはほとんど知られていない。この粘膜抗体についての理解が深まれば、健康状態および疾患状態における宿主と微生物叢の相互作用がさらに解明されるかもしれません。実際、SIgAを選択的に欠く一次抗体欠損症患者は炎症性腸疾患をほとんど発症しないが、SIgMとSIgAの両方を欠く患者ではより一般的で非常に重症である (Agarwal and Mayer, 2009)。
我々は、ヒトのPC-Msが、PC-Msとクローン的に近縁な腸管特異的メモリーIgM+ (ME-M) B細胞やME-A B細胞、PC-Aといったこれまで認識されていなかった大きなレパートリーと共存していることを明らかにした。TDやTIのシグナルを受けたME-M細胞は、IgM-to-IgA CSRの誘導に加えて、PC-MのSIgMと同様に粘液包埋常在菌を標的とした大量のIgMを分泌した。 マウスとは異なり、ヒトSIgMはSIgAで二重に被覆された細菌を認識し、SIgAのみで被覆されたり非被覆細菌に比べて多様性が高いことが特徴的であった。したがって、SIgMは新たに活性化されたナイーブB細胞ではなく、既存のME-M B細胞から出現し、SIgAが非常に多様な微生物群集を腸管粘液に固定するのに役立つ可能性がある。
研究結果
腸管PC-Mはマウスよりヒトに多く存在する
腸管PC-Asは広く研究されているが、ヒトの腸管PC全体の約10%〜20%を占める腸管PC-Msについてはほとんど知られていない（Macpherson et al.） フローサイトメトリーにより、悪性腫瘍、ポリープ、血管異形成のために右半球回腸切除を受けた人の組織学的に正常な回腸末端および結腸近位部の切除組織において、PC-Asに加えてPC-Msを同定した（図1Aおよび図S1A）。PC-Mは大腸に比べ回腸でより多く存在し、ほとんどがPC-Aからなるクラススイッチ型PCと同様の表現型を示した（図1A-1C、S1B）。
図1
図1
ヒトPC-MsはME-M B細胞とともに腸に集積し、腸管指向性レセプターを発現する循環相を含む
ヒト腸管ナイーブB細胞と比較して、PC-MsはCD138、CCR10および/またはCCR9の発現を増加させていた。これらのPC関連分子の発現増加は、HLA-DR、CD20、濾胞関連ケモカインレセプターCCR7およびCXCR4のダウンレギュレーションと相俟って、PC-Msの発現を増加させた。PC-Msに類似しているにもかかわらず、クラススイッチPCはより多くのCD138を発現し、これはより進んだ成熟段階を反映していると考えられた（図1CおよびS1B；Nuttら、2015年）。
定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）はさらに、ヒト腸管ナイーブB細胞と比較して、PC-Msは、PC分化に必要な2つの転写因子であるBLIMP-1およびIRF4（図S1C）のより多くの転写物を含むことを決定した（Nutt et al.、2015年）。さらに、PC-Msは、腸におけるヒトPCの生存を維持し得る抗アポトーシスタンパク質であるBCL-2（図S1C）についての転写物をより多く含んでいた（Nairら、2016）。注目すべきは、免疫蛍光分析と組織ベースの細胞計数により、ヒト回腸LPと比較して、野生型C57BL/6マウスの小腸LPは、細胞内IgMを蓄積するPC-Mが少なく、PC-M/PC-A比が低いことが示された（図1Dおよび図1E）。フローサイトメトリーにより、マウス小腸および大腸におけるPC-Mの頻度は、PC-Aの頻度に比べてごくわずかであることが確認された（図S1DおよびS1E）。
PC-Asは、α4β7およびCCR9腸管ホーミングレセプターが関与するメカニズムによって循環から小腸LPにコロニー形成することから（Macphersonら、2008）、循環するPC-Msが腸管ホーミング性を発現するかどうかをさらに検証した。PC-Asと比較して、循環しているPC-Msの大部分はβ7とCCR9を共発現していたが、PC-G/Esはβ7とCCR9をほとんどあるいは全く示さなかった（図1Fおよび図1G）。このように、PC-Msはマウスではなくヒトの小腸に比較的豊富に存在し、腸管PC-Aに類似しており、腸管ホーミングレセプターを発現する循環分画を含んでいることがわかった。
腸管PC-MsはME-M B細胞の大規模なレパートリーと共存する
腸管PC-Aは、腸管誘導部位で多様化したME-A B細胞から出現することを考慮すると（Lindner et al, 2015）、我々はPC-Msがヒト腸管内のME-M B細胞と共存していると仮定し、IgM+IgDhiCD27+CD38- ME-M B細胞をIgM+IgDhiCD27-CD38- naive, IgM+IgDloCD27+CD38- marginal zone (MZ) および IgM-IgD-CD27+CD38- class-switched memory (ME-SW) B細胞と分離するために、公表されているゲーティング戦略と同等の分離手順で実施した (Berkowska et al., 2011, 2011、Descatoire et al.、2014）。注目すべきは、MZ B細胞は、抗原駆動型選択を含む、経時的に古典的記憶形質を誘導するGC応答への漸進的な採用により異質である（Aranburuら、2017、Descatooireら、2014、Kleinら、1998、Seifertら、2015）。それにもかかわらず、MZ B細胞は、IgDlo表現型に加えて、NOTCH依存性であるがGC非依存性のontogenyなど、ME-M B細胞と異なるいくつかの特性を示す（Aranburuら、2017、Berkowskaら、2011、Descatooireら、2014）。ME-M B細胞は回腸と結腸に豊富に存在したが、血液、脾臓、扁桃ではまれであった（図1Hおよび1I）。回腸におけるPC-Mの優勢な局在と一致して、ME-M B細胞は大腸と比較して回腸に濃縮され、ナイーブB細胞と比較して共刺激分子CD24、CD27、CD148の発現が増加するなど回腸ME-SW B細胞や脾臓MZ B細胞に似た表現型を示した（図1H-1JおよびS1F）。
次に、組織免疫蛍光法によりME-M B細胞の腸管内地理を解剖した。組織ベースの細胞計数により、表面IgMを発現しIgDを発現しないME-M B細胞は腸LPでは稀であり、GCの有無にかかわらずILFでは比較的に豊富であった（図2Aおよび図2B）。一貫して、腸管ME-M B細胞は、腸管ナイーブB細胞およびME-SW B細胞と同様に、濾胞保持性のCCR7およびCXCR4レセプターを発現していた（図2C）。しかしながら、κ-deleting recombination excision circle assaysは、腸ME-MおよびME-SWにおいてGC増殖の分子指紋（van Zelmら、2007）を検出したが、ナイーブB細胞では検出されなかった（図2D）。
図2
図2
ヒト腸管ME-M B細胞は粘膜濾胞に生息し、GC後の形質を示し、腸管ホーミングレセプターを発現する循環相を含み、生後早期に出現する。
ME-A B細胞は、腸濾胞誘導部位から腸LPに再循環する際に、α4β7およびCCR9腸管ホーミング受容体をアップレギュレートすることから（Macphersonら、2008、Nairら、2016）、さらに循環ME-M B細胞によるβ7およびCCR9発現を測定した。循環ME-A B細胞およびMZ B細胞と比較して、循環ME-M B細胞の大部分はβ7およびCCR9を共発現したが、ナイーブB細胞およびME-G/E B細胞はβ7およびCCR9をほとんどまたは全く共発現しなかった（図2Eおよび図2F）。
次に、腸粘膜が幼少期にME-M B細胞を生成しているかどうかを確認した。組織免疫蛍光分析により、ヒト腸管ME-M B細胞は、PC-MおよびPC-Aとともに、早ければ生後1.5カ月で同定された（図2G）。組織ベースの細胞計数およびフローサイトメトリーにより、ME-M B細胞は経時的に安定であったが、PC-Msは生後10年を通じて増加した（図S1GおよびS1H）。このように、ヒトの腸管PC-Msは、生後早期に出現し、主に腸濾胞に生息し、腸管ホーミング受容体を発現する循環分画を含む、大規模で安定したレパートリーのME-M B細胞と共存しているのである。
腸管ME-M B細胞は抗原経験を反映する遺伝子シグネチャーを発現している
ヒト腸管ME-M B細胞は、トランスクリプトミクスによってさらに特徴づけられた。これらの研究に先立ち、形態学的解析を行い、我々のソーティング手順の特異性を確認した（図3A）。
図3
図3
ヒト腸管ME-M B細胞は、ナイーブB細胞とは転写的に異なり、複数の活性化形質を含む組織特異的なメモリー遺伝子シグネチャーを発現している。
ME-M B細胞のグローバルな遺伝子発現プロファイルは、腸や脾臓のメモリーB細胞サブセット（脾臓MZ B細胞を含む）を用いたクロスコンパリティブ戦略によって解明された。このアプローチでは、各サブセットを組織特異的なナイーブB細胞と比較した。教師ありの階層的クラスタリングと頑健なマルチアレイ平均発現解析により、ME-M B細胞は、由来組織にかかわらず、ナイーブB細胞とは異なるが、ME-SW B細胞と同様の転写産物を発現することが示された（図3Bおよび図S2A）。さらに、腸管ME-M B細胞は215の転写産物を含む共通のメモリーB細胞シグネチャーを発現しており、それらは腸管ME-SW B細胞、脾臓ME-SWおよびMZ B細胞でも差次的に発現していた（図S2B）。この共通のメモリーB細胞遺伝子シグネチャーは、IgD（IGHD）、CD72、及びPC分化の転写抑制因子FOXO1、BTLA、及びBACH2の発現低下とともに、TACI（TNFRSF13B）の発現増加を含んだ（図S2C及びS2D；Kuroasakiら、2015年、Nuttら、2015年）。したがって、ヒト腸ME-M B細胞は、活性化、増殖、およびPC分化を受ける傾向の増加を反映する共通のメモリーB細胞遺伝子シグネチャーを発現している。
腸管ME-M B細胞は組織特異的な遺伝子シグネチャーを発現している
教師なし階層的遺伝子クラスタリングと主成分分析で示されるように、腸管ME-MおよびME-SW B細胞は組織特異的なシグネチャーも発現していた。実際、これらのB細胞は、脾臓のME-SWおよびMZ B細胞とは離れて一緒に集まっていたが、ナイーブB細胞はその起源組織に関係なく一緒に集まっていた（図3B、S2E、およびS2F）。一対の相関関係から、腸管ME-M B細胞は脾臓MZ B細胞よりも腸管ME-SW B細胞に強固に所属していることが確認された（図3C）。したがって、qRT-PCRと組み合わせたボルケーノプロット、ベン図、およびヒートマップ図は、ナイーブB細胞と比較して、脾臓ME-SWおよびMZ B細胞ではなく、腸ME-MおよびME-SW B細胞で差次的に発現する305件の転写物を示した（図3-3FおよびS3A）。
この組織特異的な記憶シグネチャーには、（1）FcRL4、CD11c（ITGAX）、Siglec-6などの活性化誘導型受容体、（2）RUNX2やRORAなどのIgA応答関連転写因子、（3）PC誘導型分子、例えばFcRL4、CD11c、RORAなどの転写物の発現増加が含まれる。(3）IL-10、IL10RA、CD70、および転写因子ZBTB32などのPC誘導分子；および（4）CCR1、CCR2、およびCCR9などの上皮標的ケモカイン受容体（図3-3FおよびS3A；Erhardt et al. , 2005, Jash et al., 2016, Nair et al., 2016, Rubtsov et al., 2015, Wang et al., 2012, Watanabe et al., 2010）。最後に、Ingenuityの上流制御因子解析は、脾臓ME-SWおよびMZ B細胞と比較して、腸ME-MおよびME-SW B細胞が、B細胞活性化およびPC分化に関連するIL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-15およびGM-CSF経路（図3G）からのシグナル伝達強化を予測する機能遺伝子群を発現したことを示している（Nuttら、2015年）。
これらのデータと一致して、腸ME-MおよびME-SW B細胞は、CD62リガンド発現のダウンレギュレーションと組み合わせたFcRL4、CD43、およびCD11cのアップレギュレーションを包含する活性化形質を発現した(図3H)。しかしながら、腸ME-SW B細胞と比較して、腸ME-M B細胞はまた、CD21、CD35、CD1c、及び接着分子CD66aの発現増加を含む、増強されたMZ様形質を示した（図3I）（Descatoireら、2014、Seifertら、2015）。これらの類似性にかかわらず、監視された遺伝子発現解析、フローサイトメトリー、及び遺伝子セット濃縮解析（GSEA）は、腸ME-M B細胞が脾臓MZ B細胞と異なることを示した（図S3B〜S3E）。実際、腸ME-M B細胞は、自然免疫様リンパ球によって高度に発現されるSLAMファミリーのメンバーであるCD84（図S3B）をあまり発現しなかった（Sintes et al.、2010）。さらに、腸管ME-M B細胞は、STATタンパク質を介したIL-2およびIL-6受容体シグナル伝達に関与する遺伝子産物をより多く発現したが、NOTCHシグナル伝達に関与する遺伝子産物はより少なかった（図S3C〜S3E）。このように、ヒト腸管ME-M B細胞は、免疫活性化の増大とPCを反映した組織特異的なメモリー遺伝子シグネチャーを発現しているが、MZ分化はしていないことがわかった。
腸管ME-M B細胞はPC-Msおよび一部のPC-Asとクローン的に関連している
次に、回腸と大腸の腸管ME-M B細胞のIg重鎖可変（IGHV）および接合（IGHJ）遺伝子レパートリーを解析し、ナイーブB細胞やPC-M、クラススイッチME-A B細胞やPC-Aと類似性と多様性の程度を大まかに決定した。IGHV遺伝子使用率のピアソンの相関係数解析により、腸のME B細胞およびPCサブセットは、腸のナイーブB細胞とは異なるが、発現アイソタイプ、由来組織、細胞タイプに基づいて互いに階層的にクラスター化することが示された（図4AおよびS4A）。腸管ME B細胞およびPCサブセットの抗原駆動型IGHV遺伝子再構成は、IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV4-34、およびIGHJ6遺伝子のネガティブ選択（図4BおよびS4A）およびIGHV3-7、IGHV3-23、およびIGHJ4遺伝子のポジティブ選択（図S4AおよびS4B）からも推察された。
図4
図4
ヒト腸管ME-M B細胞はGC後の変異プロファイルを発現し、腸管PC-Msおよび一部のPC-Asとクローン的に関連する
腸ナイーブB細胞と比較して、腸ME B細胞およびPCサブセットは、H-CDR3平均長が短い抗原結合可変領域をコードする変異IGHV遺伝子（図4C、S4C、およびS4D）、抗原駆動型選択の二つの追加の特徴（Lindnerら, 2012、Lindnerら, 2015、Tiptonら, 2015）を発現している。これらの共通性に加えて、腸管ME B細胞およびPCサブセットは、有意な差異を示した。特に、ME-M B細胞およびPC-Mは、回腸のME-A B細胞およびPC-Aと比較して、IGHV遺伝子変異が少なく、H-CDR3が短いが、結腸ではない（図4C、図S4C、および図S4D）。さらに、ME-M B細胞は、回腸のME-A B細胞と比較して、Ig軽鎖λ（Igλ）をより多く発現していたが、結腸では見られなかった（図4D）。これらの違いは、ME-M B細胞が、ME-A B細胞を制御するものとは異なる抗原駆動型の選択・分化プログラムに関与していることを反映している可能性がある。
次に、各ドナーから推定される腸管抗体レパートリーの動態を、すべてのクローンをクローンファミリーに折り畳み、得られた「コアレパートリー」と元の「拡張レパートリー」とを比較することによって調べた。IgMとIgAの両方を発現するクローンファミリーや回腸と結腸の両方に生息するクローンファミリーはコアレパートリーと比較して拡大したが、IgMまたはIgAのみを発現するクローンファミリーや回腸または結腸のどちらかに生息するクローンファミリーは拡大しなかった（図S4E）。これらの結果は、クローンの拡大がIgMからIgAへのクラススイッチの増加および腸管播種と関連していることを示唆している。次に、腸管ME-M B細胞と他のME B細胞およびPCサブセットとの個体発生的な関連性をサルコスプロットで可視化した。これらのクローン的に関連するME-M B細胞のほとんどは、同一または異なる腸管セグメントに生息するPC-Mに関連していたが、IGHV遺伝子変異の数を増加させたME-Mクローン型は、ME-A B細胞やPC-Aに関連していた（図4E、4F、S5A、およびS5B）。
クロノタイプの所属は、無関係な配列および同一の配列にそれぞれ0および1の値を帰属させるMorisita-Horn重複指数の計算によってさらに確証された（Lindnerら、2015年）。回腸ME-Mクロノタイプは、回腸PC-Mクロノタイプと非常に強固な関連性を示し、他のすべてのサブセットクロノタイプとの関連性はあまり強固ではなかった（図4GおよびS5C）。系統樹再構築解析によるクローンファミリーのさらなる解析から、回腸ME-M B細胞の一部は、CSRを伴うか伴わないSHMを誘導するGC経路に再突入すると、大腸PC-Msまたは回腸ME-A B細胞を生み出すことが示唆された（図4Hおよび図4I）。回腸からの追加の回腸ME-M B細胞は、CSRを誘導するがSHMを誘導しないGC外経路に入ることにより、大腸PC-Aを生成する可能性がある（図4J）。したがって、組織免疫蛍光分析により、CSR/SHM誘導酵素AIDおよび増殖分子Ki-67を発現するB細胞が、ILFを含む回腸のGCおよびGC外領域の両方で検出された（図4K）。
一部の腸管ME-M B細胞におけるIgMからIgAへのCSRの存在は、ヒト回腸からのME-Mではなく対照のナイーブB細胞における生殖細胞Iα1-Cα1およびIα2-Cα2ならびにスイッチサークルIα1/2-Cμ転写物の検出によって確認した（図4Lおよび図S5D）。回腸のIgM+ GC B細胞は、予想通りIα1-Cα1とIα1/2-Cμを含んでいたが、PC-Mは予想外にIα1/2-CμとIα2-Cα2を含んでいたがIα1-Cα1を欠落していた（図4L）。これらのPC-Mは、IgM-to-IgA CSR誘導シグナルを同時に受けて最近活性化したME-Mクローンから出現している可能性がある。このように、ヒトME-M B細胞は回腸と結腸の両方に播種され、GCに再突入するかGC外の経路を経てPC-MやクラススイッチPC-Aに分化する可能性がある。
腸管ME-M B細胞はIgMを分泌し、TDまたはTI刺激によりIgAにスイッチする。
TD（CD40LとIL-21）またはTI（CpG DNAとBAFFおよびAPRILの併用または非併用）シグナルへの曝露による細胞の増殖、CSRおよびPC分化を評価することにより、ヒト腸管ME-M B細胞の分化能をさらに検討した。IL-10 は、CSR と PC の分化を最大化するために補充された（Macpherson et al.、2008）。
CFSE希釈アッセイで示されるように、TDシグナルは腸管ME-MおよびナイーブB細胞の同等の増殖を誘導したが、TIシグナルは特にBAFFおよびAPRILの存在下で、腸管ME-Mの増殖を誘導したがナイーブB細胞の増殖はしなかった（図5Aおよび図5B）。さらに、ME-M B細胞はTDまたはTIシグナルに応答して増殖性のCD38hiCFSElo形質芽細胞に分化したが、ナイーブB細胞はTDシグナルに応答してのみそうなった（図5C）。注目すべきは、ナイーブB細胞ではなく活性化ME-M細胞から出現したプラズマブラストのかなりの部分が、IgAを発現したがIgMを欠いたことである（図5D）。
図5
図5
ヒト腸管ME-M B細胞は、TDまたはTIシグナルに応答して、増殖、PC分化、IgM分泌、IgAクラススイッチングを行う。
これらのデータと一致して、ME-M B細胞はTDまたはTIシグナルに応答して大量のIgMを分泌し、IgAの量は少なかった。一方、ナイーブB細胞はTDには反応するがTIシグナルには反応せず、弱いIgMおよびIgAを示した（図5E）。そこで我々は、CSRが、活性化された組織ベースのメモリーB細胞（Ehrhardt et al.） 実際、TDシグナルは、FcRL4-およびFcRL4+ ME-M B細胞の両方から形質芽細胞を生成したが、FcRL4+ ME-M B細胞でのみIgMからIgAへのCSRを誘導した（図5F）。したがって、腸のFcRL4+は、FcRL4- ME-M B細胞ではなく、CSR (およびSHM) 誘導酵素AIDの転写物を含んでいた (図5G)。このように、ヒト腸管ME-M B細胞は、TDまたはTIシグナルに応答して増殖し、PC-Mを生成し、さらにME-M B細胞のFcRL4+画分にIgMからIgAへのCSRが誘導されることがわかった。
腸管ME-M B細胞とPC-Msは、粘液包埋された宿主に対してIgMを放出する。
次に、EBVベースのプロトコルを開発し、ヒト腸管ME-M B細胞が自己の粘液包埋細菌に対してIgMを産生するかどうかを調べた（図6A）。最初のELISAでは、回腸ME-M B細胞のIgMは、ホスホリルコリン、β-グルカン、ラミナリン、ガラクトース-α-1，3-ガラクトース、莢膜多糖などの常在菌抗原を認識したが、回腸ナイーブB細胞からのIgMはしなかった（図6Bおよび図S6A）。さらにフローサイトメトリーでは、回腸ME-M B細胞のIgMは回腸ナイーブB細胞のIgMよりも効率よく粘液包埋型常在菌を認識することが示された（図6C）。
図6
図6
腸管ME-M B細胞由来のヒトIgMおよび腸管PC-Ms由来のSIgMは、SIgAで二重に被覆された細菌を含む粘液包埋性連鎖球菌を認識する。
次に、PC由来のSIgMとヒト回腸および結腸の粘液包埋微生物との結合を定量化した（図6D、S6B、S6C）。最初のELISAは、遊離SIgAよりも少ない量ではあるが、粘液中に遊離SIgMを検出した（図6E）。ほとんどの粘液サンプルは、有意なSIgA+SIgM+、SIgA+SIgM-、およびSIgA-SIgM-を含んでいたが、SIgA-SIgM+微生物相画分はごく僅かであった（図6F）。これらの分画の頻度は、個体間および同一個体の回腸と結腸の間で変動していた。マウス腸内のPC-Mの事実上の欠如及び公表された結果（Bunkerら、2015）と一致して、野生型マウスの小腸及び大腸からの微生物叢は、IgA-SIgM-及びSIgA＋SIgM-を含んでいたが、SIgA＋SIgM＋細菌画分を含んでいなかった（図6G）。マウスを特定病原体不在（SPF）バリアの外に収容して腸内細菌叢の複雑性を高めると、SIgA+SIgM+細菌もPC-MsもPC-Asも増加しないが、SIgA+SIgM-細菌は増加した（図S6Dおよび図S6E）。このように、ヒト腸管ME-M B細胞は、クローン関係にあるPC-Msと同様に常在菌を認識している。後者は、ヒトではSIgA被覆細菌を標的とする恒常的なSIgM応答を生じるが、野生型マウスでは生じない。
腸管PC-MsのSIgMは、SIgAで被覆された多様な常在菌と結合する。
次に、ヒト回腸または結腸の粘液包埋細菌を16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子配列決定によってプロファイルする方法を考案し、門と属のレベルで個体間変動を見出した（図S7A-S7C）。教師なし階層型クラスタリングで示されたように、同一ドナーからの回腸と結腸の間の細菌組成の違いは、ドナー間よりも顕著でなかった（図S7C）。Faithの系統的多様性とShannon indexを計算する希釈プロットは、系統的豊かさと種の多様性がドナー間で変化することを確認したが、組織間では変化しなかった（図S7DおよびS7E）。
SIgA+SIgM+、SIgA+SIgM-、SIgA-SIgM-画分の粘液包埋細菌を包括的かつ偏りのない方法で比較プロファイルするために、SIgM/Aベースのソーティングと16S rRNA遺伝子配列決定を組み合わせた（図7A）。各フラクションの組成は、門と属の両方のレベルで異なっていたが、すべてのフラクションで、ProteobacteriaとActinobacteriaよりもBacteroidetesとFirmicutesが多く見られた（図7Bと7C）。また、系統的な豊かさと微生物の種の多様性は画分によって異なり、SIgA+SIgM+からSIgA+SIgM-、SIgA-SIgM-画分へと全体的に減少している（図7D）。この知見は、SIgA+SIgM-およびSIgA-SIgM-画分に比べ、SIgA+SIgM+では細菌類が少なく、固形物が多いなど、門組織の違いと相関していた（図7E）。
図7
図7
SIgMとSIgAで二重にコーティングされたヒト粘液包埋常在菌は、コーティングされていない常在菌やSIgAのみでコーティングされた常在菌と比較して、豊かさと多様性が増加することが示された。
上記の門の違いを説明する微生物種を操作的分類単位（OTU）レベルで特定するために、対数ベースの濃縮指標を使用した（図7F）。OTUベースの濃縮指標を保守的に選択して適用した階層的クラスタリングアルゴリズムでは、SIgA+SIgM+画分とSIgA+SIgM-画分が、SIgA-SIgM-画分とは別にグループ化されていた（図7F）。有意に異なる濃縮指数を示した12のOTUのうち、7つのLachnospiraceaeとRuminococcaceaeは、SIgA-SIgM-細菌と比較してSIgA+SIgM+に濃縮されていた（図7FおよびS7F）。
したがって、フローサイトメトリーに基づくコーティングアッセイでは、EBV感染腸管ME-M B細胞株からのIgMは、Bacillus cereus、Roseburia intestinalis（Lachnospiraceaeに属する）およびRuthenibacterium lactatiformans（Ruminococcaceaeに属する）などのFirmicutesと強く結合することが決定された。また、IgMはBacteroides vulgatusなどのBacteroidetesに高い結合性を示したが、Bacteroides fragilis、Bacteroides thetaiotamicron、Escherichia coliなどの他のBacteroidetesやProteobacteriaにほとんど結合しなかった（図S7G）。このように、ヒトのSIgMはSIgAと協力して、有益な機能を持つとされるFirmicutesを含む多様な微生物群の粘液保持を実現している可能性がある。
考察
我々は、ヒト腸管PC-Mが、腸管関連濾胞に主に生息する、これまで認識されていなかった大規模なME-M B細胞のレパートリーとクローン的に関連していることを明らかにした。腸管ME-M B細胞は、TDまたはTIシグナルに応答してIgMからIgAへのCSRを行うほか、SIgMとともに粘液に包まれた常在菌を認識するIgMを大量に分泌していた。注目すべきは、SIgMでコートされた細菌はSIgAによって二重に標的化され、コートされていない、あるいはSIgAのみでコートされた細菌と比較して、多様性と明瞭な組成が増加したことである。このように、SIgMはSIgAが非冗長な微生物群集を粘液に固定するのを助けているのかもしれない。
腸のホメオスタシスにおけるSIgAの重要な役割は、B細胞、IgA、AID、またはpIgRを欠くマウスにおけるディスバイオーシスの出現から推測できる（Kubinak and Round, 2016）。ディスバイオーシスに加えて、抗体欠乏症の患者は、炎症性腸疾患を含む腸の炎症を発症する可能性があります（Agarwal and Mayer, 2009）。この合併症は、SIgMとSIgAを複合的に枯渇させた共通可変性免疫不全症例でより頻繁に起こる（Agarwal and Mayer, 2009）ことから、ヒトの腸の恒常性維持にはSIgMとSIgAの双方による微生物相のターゲティングが必要であることが示唆された。そこで、我々はPC-Mがマウスではなくヒトの腸管粘膜に蓄積していることを見出し、さらにSIgMがSIgAと組み合わせて、マウスではなくヒトの腸内細菌をコーティングしていることを明らかにした。
驚くべきことに、ヒトの腸管PC-Msは、脾臓や扁桃などの全身あるいは粘膜の腸管外リンパ系器官ではまれな腸管ME-M B細胞の大きなレパートリーと広範なクローン関係を確立していた。さらに、ME-M B細胞の顕著な腸管向性は、循環ME-M B細胞およびPC-Mの大部分にα4β7およびCCR9の強固な共発現を示す研究によって示された。 注目すべきは、α4β7およびCCR9誘導が主に小腸のリンパ系構造で起こり、腸ME-A B細胞および未熟PC-Aの小腸LPへの移動が促されるということだ（Macpherson et al.、2008）。従って、腸管ME-M B細胞は小腸粘膜からパイエル板とILFに主に生息し、PC-Mは小腸LPに主に集積していることがわかった。PC-Asと同様に、腸管ME-M B細胞とPC-Msは生後1.5ヶ月という早い時期から検出されるようになった。PC-Mは生後10年以上にわたってさらに蓄積されたが、ME-M B細胞は長期にわたって安定した数を維持した。これらの結果は、SIgMがSIgAと協力して発達中の個体の微生物叢を形成している可能性を示唆している（Planer et al.、2016）。
ヒト腸管におけるクローン的に関連するME-M B細胞とPC-Mの同定は、体液性記憶が単にME-GおよびME-A B細胞で構成されるのではなく、さらにME-M B細胞にまで及ぶことを示すマウス全身免疫モデルからの証拠を拡張するものである（Doganら、2009、Kuroasakiら、2015、Papeら、2011）。CD24、CD27、CD148などのカノニカルメモリー分子を発現するほか、ヒト腸管ME-M B細胞は、変異IGHV遺伝子のGC後発現と、自己反応性に富む抗体をコードするIGHV1-69、IGHV4-34、IGHJ6遺伝子のネガティブ選択を特徴とした（Tipton et al, 2015）。さらに、いくつかのME-M B細胞は、PC-M分化に加えて、SHMを促進するGC経路への再突入と一致するクローン特性を示した。
既存の記憶特異性からのヒト腸管PC-Mの多様化は、パイエル板からのGCにおける腸管ME-A B細胞の恒常性または免疫誘導性の多様化を示す研究をエコーする（Bemarkら、2016、Lindnerら、2012年、Lindnerら、2015年）。PC-Mに加えて、ヒト腸管ME-M B細胞は、SHMおよびCSRと結合したGC経路、またはSHMではなくCSRを促進するGC非依存経路のいずれかに入ることにより、いくつかのME-A B細胞およびPC-Aを生成していた。この結論は、ハイスループットIGHV遺伝子配列データの系統樹再構成解析、IgM-to-IgA CSR誘導シグナルに反応する活性化FcRL4+腸ME-M B細胞におけるAIDの検出、未分化ME-M B細胞におけるIgM-to-IgA CSRの確認、GCとGC外領域の両方のB細胞におけるAIDの検出によって支持された。
マウスでは、全身性のME-GおよびME-M B細胞は、それぞれ抗原に再接近すると速やかにPC-Gまたは二次的なGC反応を誘導すると考えられていた（Doganら、2009年、Papeら、2011年）。この見解は、全身ME-M B細胞がTIまたはTDシグナルに応答してIgGクラススイッチ型プラズマブラストに迅速に分化できることを示すマウス研究によって修正された（Krishnamurtyら、2016、Zuccarino-Cataniaら、2014）。したがって、ヒト腸管ME-M B細胞は、PC分化に加えてIgMからIgAへのCSRを促進するGC依存性およびGC非依存性の絡み合った経路に沿って進行した。腸管ナイーブB細胞は、TDに偏った弱い抗体応答を示したが、腸管ME-M B細胞は、TDまたはTIシグナルに応答して、IgMまたはIgAを分泌する形質芽細胞を比較的よく誘導した。注目すべきは、同様のシグナルがロタウイルス特異的な腸管ME-M B細胞を活性化することである (Narváez et al., 2012)。局所的なTDおよびTIの合図により、ME-M B細胞は、扁桃腺ME-G/A B細胞で報告されたものと同様の組織特異的な記憶シグネチャーをさらに刷り込まれた（Erhardtら、2005年）。このシグネチャーには、CD11c、Siglec-6、CCR9、IL-10、IL-10Rα、およびRORαの発現上昇が含まれ、これは非炎症性の活性化と粘膜ホーミングを反映していた。
腸管ME-M B細胞は、腸管および脾臓ME-SW B細胞と共通の記憶シグネチャーも発現していた。このシグネチャーには、TLRリガンドおよびBAFFまたはAPRILからのTIシグナルによる活性化の増加を示唆するFcRL4およびTACIのアップレギュレーション（Heら、2010、Sohnら、2011）、ならびにCD72、FOXO1、BACH2、およびBTLA4のダウンレギュレーション（増殖およびPC分化を受ける傾向の増加を示唆）があった（Kurosakiら、2015）。脾臓MZ B細胞と同様に、腸ME-M B細胞は、腸ME-SW B細胞と比較して、より多くのCD1c、CD21、CD35およびCD66aを発現しており、このことは、脾臓MZ B細胞が腸前駆体に由来することを示唆する最近の研究（Vossenkämperら、2013）を彷彿させる。しかし、腸管ME-M B細胞のグローバルなトランスクリプトームは、脾臓MZ B細胞のそれとは別にクラスター化していた。これらの後者と比較して、腸ME-M B細胞は、より少ないCD84、PC誘導IL-2およびIL-6シグナルに関連する多くの遺伝子産物を発現し、MZ B細胞の分化に必要なNOTCHシグナルに関連する遺伝子産物は少なかった (Descatoire et al., 2014)。
ME-M型B細胞は、IgM+およびIgA+クロノタイプとの所属を確立する以外に、生後早期に出現し、年齢依存的な蓄積を示さないクローン的に組織されたファミリーのコアレパートリーを形成していた。したがって、ME-M B細胞は、ILFのような抗原侵入部位において、安定的だが機能的に可塑性のある「免疫センチネル」プールを形成している可能性がある。これらの部位には、濾胞標的CCR7およびCXCR4レセプターを発現するスイッチングされていないME-MおよびナイーブB細胞の2つのレパートリーが並列して存在していた。これらのB細胞サブセットは、そのユニークな表現型、分子的、転写的、機能的特徴からわかるように、異なる問題に対してユニークな解決策を提供する可能性がある。ME-M型B細胞は、微生物叢の一時的な変化に対応するために、SIgMおよびSIgA応答を迅速に開始する一方で、ナイーブB細胞は、より持続的な微生物の擾乱に対抗するためにde novo SIgMおよびSIgA応答を誘導するかもしれない。常在菌の恒常的制御に関与していることと矛盾しないように、ME-M B細胞は粘液包埋細菌に対して、クローン関係にあるPC-MからのSIgMと同様にIgMを産生した。
ヒトに恒常的なSIgM反応が存在し、マウスに存在しないことは、マウスの腸内細菌叢の複雑さが低いことを反映しているのかもしれない（Kamada et al.、2013）。しかし、より複雑な微生物叢を保有する非SPFマウスでは、PC-MsもSIgM被覆細菌も増加しなかったことから、B細胞固有の違いも関与していることが示唆された。したがって、経口免疫したマウスのME-M B細胞は、脾臓および骨髄をコロニー化するが、腸濾胞をコロニー化しないことが示されている（Bemark et al.、2016）。驚くべきことに、SIgMは、SIgAによっても標的とされるヒトの微生物叢の一部をコーティングした。コーティングされていない、あるいはSIgAのみでコーティングされた細菌と比較して、SIgMとSIgAで二重にコーティングされた細菌は、腸の恒常性と関連するパラメータである多様性の増加を示した（Kamadaら、2013年）。補体を活性化することにより（Kirkland et al., 2012）、SIgMは一般的な常在菌の増殖を抑制し、それによってSIgAが微生物叢の多様性を最適化するのを助けているのかもしれない（Kubinak and Round, 2016）。したがって、SIgAの欠乏は、共通可変免疫不全症の患者のように、SIgMの欠乏と組み合わさることで、ディスバイオーシスと炎症性腸疾患を引き起こす（Agarwal and Mayer, 2009）。
SIgMとSIgAで被覆された細菌は、被覆されていない細菌と比較して、LachnospiraceaeとRuminococcaceaeを含むFirmicutesに富んでいた。食事性多糖類を免疫調節機能およびSIgA誘導機能を有する短鎖脂肪酸に分解することにより（Arpaia et al., 2013, Kim et al., 2016）、これらの常在菌は肥満や感染に対する防御を高める可能性がある（Biddle et al., 2013, Cho et al., 2012, Petrof et al., 2013）。そうであるならば、PC-Msおよびクローン的に関連するPC-Asは、SIgMおよびSIgAのpIgR由来の分泌断片との粘液相互作用を含む機構を介して、非冗長な微生物コンソーシアムの腸内保持を最大化することができる（Macphersonら、2008年）。この二重のアンカー戦略は、SIgAを選択的に枯渇させる一般的な病的状態において、微生物叢の恒常性を維持するために進化したのかもしれない。腸管IgAの大部分（Benckert et al., 2011）と同様に、腸管IgMは、一般的な微生物産物や、ファーミキューテスに加えてバクテロイデス属のような一部のバクテロイデスを標的としていることから、多面的な反応性を示すことがわかった。つまり、SIgMは新たに活性化されたナイーブなIgM+ B細胞ではなく、既存の記憶から出現し、SIgAが腸管粘液内の非常に多様で有益と考えられる常在菌群を選択、制御、保持するのに役立つ可能性があると言える。
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実験モデルおよび被験者の詳細
ヒト組織および血液サンプル 大腸腫瘍、切除不能ポリープ、血管異形成のために右半球切除術を受けた患者50名から、回腸末端および上行結腸の組織学的に正常な組織サンプルを入手した。これらの患者の年齢は28歳から89歳（平均68.8歳）で、男女比は1：1.2であった。末梢単核細胞は、死亡した臓器提供者または外傷後の脾臓摘出術を受けた人の組織学的に正常な脾臓から、緩衝液および脾臓細胞から分離された。扁桃腺は濾胞性過形成の成人患者から得た。血液および組織サンプルの使用は、Institut Hospital del Mar d' Investigacions Mèdiques の臨床調査倫理委員会の承認を得た（CEIC-IMIM 2011/4494/I）。新鮮な組織・粘液試料およびホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片は、患者の署名入りインフォームドコンセントのもと、Mar Biobanc組織保管所から収集した。すべての組織サンプルにはコード化された識別子が割り当てられ、関連する臨床情報は隠されたままであった。
マウス 雌の C57BL/6 マウス（Charles River Laboratories）は、Barcelona Biomedical Research Park の動物施設において、特定病原体フリー（SPF）または従来の飼育条件下で自家繁殖させた。すべてのマウスは8-12週齢で使用された。マウスは頸椎脱臼により安楽死させ、動物処置はバルセロナ生物医学研究公園の倫理委員会の承認を得て、スペインとヨーロッパの法律に従って実施した。
メソッドの詳細
サンプル処理 ヒト腸管サンプルから単核球を分離するために、外膜筋から粘膜と粘膜下層を剥離し、2～3mmに切り分けた。これらの断片は、まずカルシウムとマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄した後、5mM Dithiothreitol（DTT）と1mM Ethylenediaminetetraacetic acid（EDTA）を含むHBSSで37℃、20分インキュベートした。組織片を30mlのHBSSを入れたハヤブサチューブに移し、10秒間激しく2回振盪した。上皮内リンパ球画分を含む上澄み液は廃棄した。残りの画分は、1mg/mlコラゲナーゼIV（Thermo Fisher）、50ng/ml DNase（New England Biolabs）および0.5％ヒト血清（Sigma）を含むHBSSの溶液中で37℃で40分間撹拌しながらインキュベートすることによって消化された。固有層（LP）懸濁液を70μmフィルターに通し、洗浄し、10％牛胎児血清（FBS）入りRPMI1640培地（Thermo Fisher）に再懸濁した。マウスLPリンパ球を単離するために、PPを切除した後、小腸（SI）および大腸（LI）セグメントを縦方向に開き、5mm片に切断した。これらの断片は、ヒト腸管サンプルに用いたのと同じ手順で処理した。ヒト脾臓細胞および扁桃単核細胞は、1 mg/ml コラゲナーゼ IV（Thermo Fisher）、50ng/ml DNase（New England Biolabs）および 0.5% ヒト血清（Sigma）を含む HBSSの溶液中で37℃にて40分間組織を酵素消化し、その後 Ficoll-Hypaque gradient（GE Healthcare）上で分離して新鮮試料から入手した。末梢血単核細胞（PBMC）は、ヘパリン処理した血液試料からFicoll-Hypaque勾配で分離して得た。
フローサイトメトリー 細胞は、蛍光標識モノクローナル抗体（mAbs）の適切な「カクテル」を加える前に、Fcブロッキング試薬（Miltenyi Biotec）とともに4℃でインキュベートされた。死細胞は、4'-6'-ジアミジン-2′-フェニルインドール（DAPI）（Sigma）の使用により除外された。細胞はLSR Fortessa（BD Biosciences）で取得し、データはさらにFlowJo V10ソフトウェア（TreeStar）を用いて解析した。
セルソーティング セルソーティングのために、細胞懸濁液をFc-blocking reagent (Miltenyi Biotec) とともに4℃でインキュベートし、以下のモノクローナル抗体で30分間染色した。抗CD45 AF700（クローン：HI30）、抗CD19 PE-Cy7（クローン：HIB19）、抗CD38APC-Cy7（クローン：HIT2）、抗CD10 PE（クローン：HI10a）、抗IgM BV605（ クローン：MHM-88）（すべてBiolegend社製）、抗CD27 PerCpCy5． 5（クローン：M-T271）（BD Biosciences）、および抗IgD FITC（Southern）。CD45+CD19+CD38dullCD10-IgD2+ IgM+CD27- naive B細胞、CD45+CD19+CD38dullCD10-IgD+IgM2+CD27+ MZ B細胞、CD45+CD19+CD38intCD10+IgD-IgM+CD27+GC-M, CD45+CD19+CD38dullCD10-IgD-IgM+ CD27+ ME-M B細胞、CD45+CD19+CD38dullCD10- IgD-IgM-CD27+ ME-SW B細胞です。CD45+CD19+CD38intCD10+IgD-CD27+ GC B細胞、CD45+CD19+CD382+CD10-IgD-IgM+CD27+ PC-M および CD45+CD19+CD382+CD10- IgD-IgM+CD27+ switch PCはDAPI染色による死細胞排除後にFACSAria II (BD Biosciences) でソーティングを行いました。FCRL4+およびFCRL4- ME-Mのソーティングには、抗FCRL4 APC (clone: 413D12) を「カクテル」に添加した。この方法でソーティングされた細胞の純度は、一貫して95%以上であった。
細胞培養 ヒト選別された腸ナイーブおよびME-M B細胞（1×105／ウェル）を96ウェルU底プレート（Thermo Fisher）に播種し、10％FBSを補充した完全RPMI1640培地（Thermo Fisher）で6〜7日間培養した。200 ng/ml megaCD40L (Enzo Life Science), 50 ng/ml IL-10 (Peprotech), 500 ng/ml IL-21 (Peprotech), 1 μg/ml CpG ODN-2006 (Invivogen), 500 ng/ml BAFF (Alexis) and 100 ng/ml Mega APRIL (Alexis) を添加または無添加で、ペ ニシリンおよびストレプトマイシン (10 U/ml) を添加して、6-7日培養した。
増殖アッセイ 細胞増殖は、CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit (Thermo Fisher) を用いて、カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル (CFSE) を用いて評価された。簡単に言うと、選別したリンパ球を5％FBS添加PBSに1x106cell/mlで再懸濁し、1.25μM CFSE溶液と一緒に室温（RT）で5分間インキュベートした。染色した細胞を広範囲に洗浄し、特定の刺激を加えたまたは加えない完全なRPMI1640培地で6-7日間培養した。細胞分裂は、フローサイトメトリーによりCFSE蛍光の減少を測定することにより評価した。
EBV形質転換B細胞の生成EBV形質転換B細胞株の生成のために、選別したB細胞を、2.5μg/ml CpG ODN-2006 (Invivogen) およびEBV産生マーモセットB細胞株B95-8 (ECACC) からの30%上清を含む完全RPMI1640培地 (Thermo Fisher) の96 U-bottom plateにおいて5×104 cells/well で播種した。増殖した細胞は、2-3週間培養維持した後、凍結した。ポリクローナル免疫グロブリンを含む培養上清は、-80℃で保存した。
ELISA 培養上清の全 IgM と抗原特異的 IgA を自家製 ELISA で検出した。簡単に言えば、96ウェルELISAプレート（Thermo Fisher）を、1ug／mlのヤギ抗ヒトIg-UNLB（Southern Biotech）で一晩中コートした。特異的抗原に対するAb反応性を測定するために、ELISAプレートを、β-D-グルカン（50μg/ml；Sigma）または莢膜多糖類（1μg/ml；ATCC）、Gal-α1，3-Gal-HSA（3原子間隙）（10μg/ml；Dextra Laboratories）、ラミナリン（50μg/ml、Sigma）またはL-α-フォスファチジルコリン（0.5μg/ml；Bioresearch Technologies）でコートした。総Igについては、細胞培養上清の連続希釈液を2時間添加した。抗原特異的Igについては、上清を20μg/ml Ig濃度で使用し、PBSで1:10希釈を3回行った。すべての ELISA は、HRP 標識ヤギ抗ヒト IgM (0.2 μg/ml; cappel) または IgA Fc Ab (0.25 μg/ml; Southern Biotech) と TMB 基質試薬セット (BD Bioscience) で開発されたものだった。OD450を測定し、バックグラウンド（PBSコートプレート上の培養上清のOD450）を差し引いた後、Ab-reactivityを算出した。
免疫蛍光分析 ホルマリン固定パラフィン包埋した厚さ3μmのヒト組織切片を、キシレン、アルコール勾配の減少、蒸留水で処理し、組織の脱脂と再水和を達成させた。熱によるエピトープ回収はクエン酸緩衝液（pH6）またはTris-EDTA緩衝液（pH9）中で15分間行った。エピトープ回収後、組織切片をPBS中0.2% Triton X-100で透過処理し、5%ウシ血清アルブミンと5% Fc receptor blocking (Miltenyi Biotec) でブロックし、特異抗原に対する種々の組み合わせの抗体で染色を行った。ビオチン化抗体はストレプトアビジン-Alexa Fluorコンジュゲートで検出された。核DNAはDAPIで可視化し、カバースリップにはFluorSave試薬（Merck Millipore）を塗布した。画像は Leica TCS SP5 Upright 共焦点顕微鏡（Leica）または Nikon Eclipse Ni-E 顕微鏡（Nikon）で取得し、さらに ImageJ ソフトウェアを使用して解析した。
ギムザ染色 サイトスピン4装置（Thermo Fisher）を用いて、ソートした腸管集団から800rpm、5分間でサイトスピンを実施した。サブセットあたり約5,000個の細胞をアルブミンコートしたスライドで一晩乾燥させ、Giemsa Stain Kit (Jenner-Wright) (Agilent)で染色を行った。
RNA 抽出および逆転写 RNeasy Micro キット（QIAGEN）を用いて、製造業者のプロトコールにしたがって、全細胞 RNA を単離した。約2 ngのRNAをTaqMan® Reverse Transcription ReagentsとRandom hexamers (Thermo Fisher)を用いてcDNAに逆転写した。
定量的リアルタイムPCRと標準PCR 定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）は、Power Sybr Green PCR Master Mix（Thermo Fisher）および特定のプライマー対（表S1）を含む384ウェルのプレートで行い、QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System（Thermo Fisher）で解析した。遺伝子発現は、各サンプルについてβ-アクチンをコードする遺伝子（ACTB）の発現に正規化し、結果はナイーブB細胞と比較した相対発現（RE）として提示した。生殖細胞Iμ-Cμ、Iα-Cα1及びIα-Cα2転写物の分析のために、AmpliTaq Gold PCR Mastermix（Thermo Fisher）を用いて50μLのPCR容量で特定のプライマー（表S2）を使用してPCRを実施した。Iα-Cμ円転写物のネステッドPCR分析は、2組の特異的プライマー対（表S2）および以下のサイクル条件を用いて実施した。最初のPCRラウンドでは、外部プライマーを、95℃で9分間の最初の変性ステップに続いて、94℃で30秒間、60℃で1分間、72℃で10分間からなる30サイクルで使用した。2回目のRT-PCRでは、内部プライマーを用いて、95℃、9分間の初期変性と、94℃、30秒、60℃、1分、72℃、10分の25サイクルを繰り返した。PCR産物は確認のためサンガーシークエンスに供された。
KRECアッセイ QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)を用いて、ソートしたB細胞サブセットからゲノムDNAを単離した。B細胞サブセットの複製履歴を、以前に記載されたようにκ-deleting recombination excision circle（KREC）アッセイを用いて決定した（van Zelmら、2007年）。このアッセイは、qRT-PCRによるIgκ-欠失性転位（イントロンRSS-Kde）のコーディングジョイントおよびシグナルジョイントの定量化に基づいている。シグナルジョイントとコーディングジョイントの間のΔCTは、B細胞が受けた細胞分裂の回数を正確に表している。以前に確立された対照細胞株U698 DB01（van Zelmら、2007）は、ゲノムあたり1つのコーディングジョイントおよび1つのシグナルジョイントを含み、両方のリアルタイム定量-PCRアッセイの効率におけるわずかな差異を補正するために使用された。
グローバルトランスクリプトーム解析 総細胞RNAは、製造者のプロトコルに従うことにより、選別されたB細胞サブセットからRNeasy Microキット（QIAGEN）を用いて単離された。RNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent)を用いて評価した。高い完全性（RNA完全性番号7以上）を有するサンプルのみがトランスクリプトーム解析に使用された。増幅、標識、ハイブリダイゼーションは、プロトコル Ovation® Pico WTA System V2 と Encore Biotin Module (NuGEN) に従って行い、GeneChip Hybridization Oven 640 で GeneChip Human Gene 2.0 ST Array (Affymetrix) にハイブリダイズさせた。Expression Wash, Stain and Scan Kit (Affymetrix)とGeneChip Fluidics Station 450およびGeneChip Scanner 3000 7Gを含むAffymetrix GeneChip Systemを用いて洗浄およびスキャンを実施した。品質管理後、生データはバックグラウンド補正、分位数正規化され、Robust Multi Chip Average (RMA) システムにより遺伝子レベルにまとめられました。差次的に発現する遺伝子を検出するために、線形モデルをデータに当てはめ、Bioconductorのlimmaパッケージ（Wettenhall and Smyth, 2004）を使用して、経験的ベイズモデレート統計を計算した。p値の調整は、Benjamini-Hochberg手順を用いた偽発見率（FDR）の決定によって行われた。調整後の p 値が 0.05 未満で、かつ絶対的な fold change 値が 1.5 以上の遺伝子が有意であると判断された。Spearmanの順位相関は、異なる比較の正規化された遺伝子発現間の相関を研究するために使用された。解析はRと標準パッケージで行った。Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) による Comparison Upstream Regulator Analysis と Molecular Signature Database (MSigDB) (Subramanian et al., 2005) による GSEA を用いて、サンプル間の類似性と相違性を同定した。
Ig遺伝子レパートリーの次世代配列決定選別したB細胞からのcDNA産物のアリコート（表S3）を、高速液体クロマトグラフィー精製したVH1-VH6フレームワーク領域1に特異的なプライマー（50nM）および対応するIllumina Nextera配列決定タグを含むCαまたはCμ（250nM）と、High Fidelity Platinum PCR Supermix（サーモフィッシャー）を用いた25μL（4μLテンプレートcDNA）のPCR容量で混合された（表S4）。増幅は以下の条件で行った。95℃、5分間の最初のステップに続いて、95℃、30秒間、58℃、30秒間、72℃、30秒間を含む35サイクルを行い、72℃、5分間の最終伸長ステップを補足した。産物はminiElute PCR purification Kit (QIAGEN)で精製し、Nextera指標は以下の条件でPCRを介して付加した。72℃ 3分、98℃ 30秒、98℃ 10秒、63℃ 30秒、72℃ 3分のサイクルを5回繰り返した。PCR産物の精製にはAmpure XP beads (Beckman Coulter Genomics) を使用し、その後プールして変性させた。一本鎖産物は、500 Cycle v2 Kit（2 × 250 bp）を用いてMiSeq（Illumina）でペアエンドシーケンスを行った。合計で、4人のドナーから4,898,226のIGHV遺伝子配列が次世代シーケンシングによって得られた（表S3）。ペアエンド生シーケンシングリードをドナー特異的Ig遺伝子配列に処理し、pRESTO、IgBLASTおよびChange-Oに基づくバイオインフォマティクスパイプラインを用いてクローンファミリーにグループ化した（Guptaら、2015年、Vander Heidenら、2014年、Yeら、2013年）。まず、Phredスコアが20未満の生リードをフィルタリングし、CHおよびVH遺伝子のプライマーをマスクした。次に、対応するペアエンドリードをアライメントしてマージし（最小オーバーラップ6塩基）、ドナー、細胞型、アイソタイプの由来をアノテーションした。最後に、ドナー特異的なIgサブセットを結合し（VDJアノテーションの前に）、ドナー特異的なクローンファミリーを推定した。VDJの呼び出しと割り当ては、IgBLASTのデフォルトパラメータを使用し、2016年2月にダウンロードされた最新のヒトIGH IMGTデータベースを照会して実施された。ドナー特異的なクローン群は、Change-Oに実装された距離ベースのクラスタリング法を用いて推論した。VHおよびJHアノテーションが同一で、H-CDR3領域の長さが同一、ハミング距離が85％以上の配列を同一クローン群またはファミリーに属するとみなした。最後に、各クローンの生殖細胞系列を、Change-Oで実装されているアノテーションされたVDJ情報を用いて再構築した。ドナー特異的なクローン群をRCircosプロットで表現し、B細胞サブセット間の関係をクローンレベルで可視化した。Morisita-Horn Indexの推定値は、divo Rパッケージを使って計算した。両解析とも、ドナー、組織、細胞の種類によるサンプルサイズの偏りを考慮し、サブセットあたり10,000クローンの希薄化サンプルを使用した。MHIブートストラップ推定値は、各組織、細胞種、ドナーについて、10,000クローンのサブサンプルを1,000回再サンプリングして計算したものである。VHおよびJH遺伝子使用率は、各ドナーおよびB細胞サブセットについて推定され、バーはドナー間の平均値を表す。SHMレベルは、与えられたB細胞サブセットとドナーに属する各クローンの推定生殖細胞配列と比較した変異の数を平均することによって推定された。ドナーに特異的なクローン関連B細胞系統樹は、IgTree Software (Barak et al., 2008)を用いて再構築され、プロットされた。
粘液の収集と処理 右半球切除を受けた患者の回腸末端および上行結腸の、巨視的に影響を受けていない新鮮な組織サンプルの上皮表面を削り取ることによって、粘液を入手した。マウスSIおよびLIセグメントから腸管内容物を鉗子で取り出し、氷上で1.5 mLエッペンドルフチューブに入れた。粘液または腸内容物からの微生物試料のアリコートを秤量し、SIGMAFASTプロテアーゼ阻害剤タブレット（Sigma）からのプロテアーゼ阻害剤を含むPBS中に0.1mg/μLで再懸濁させた。サンプルを5分間激しくボルテックスすることによってホモジナイズし、次に400 gで5分間遠心分離して大きな破片をペレット化した。上清を滅菌した70μmセルストレーナーで濾過し、8000gで5分間遠心分離して微生物をペレット化した。この段階で、上清は遊離SIgMとSigの分析のために保存して-80℃で凍結し、微生物ペレットは細菌フローサイトメトリーとFACSortingに使用した。
細菌フローサイトメトリーおよびFACソーティング 腸内細菌に結合した内因性SIgMおよびSIgAを測定するために、微生物ペレットをPBS 5%FBSに再懸濁し、以下の組み合わせの抗体とともに氷上で30分間インキュベートした：抗ヒトIgM APC (clone: SA-DA4) (Southern Biotech) と抗ヒトIgA PE (Miltenyi Biotec). 最後に、菌体サンプルを洗浄し、SYTO BC (Thermo Fisher) を含むPBSに氷上で15分間再懸濁し、FCM解析を実施した。腸内細菌叢に対するEBV形質転換B細胞由来のIgMの反応性を測定するために、内因性細菌結合SIgsを、酸性クエン酸ナトリウム緩衝液（40 mMクエン酸ナトリウムおよび140 mM NaCl、pH 3.0）中で3分間インキュベーションした後に剥離させた。次に、微生物を素早くスピンダウンしてバッファーを除去し、pH中和のためにPBSを加えた。これらの試料をEBVで形質転換したB細胞からの上清（50μg/mlの総IgMで）と共に氷上で30分間インキュベートした。洗浄後、微生物ペレットをMACS 5％FBSに再懸濁し、抗ヒトIgM APC（clone：SA-DA4）（Southern Biotech）と共に氷上で30分間インキュベーションした。最後に、サンプルを洗浄し、SYTO BC (Thermo Fisher) を含むPBSに氷上で15分間再懸濁し、FCM分析に供した。特定の細菌種（Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis.）に対するEBV感染B細胞由来のIgMの反応性を測定するために、SYTO BC（Thermo Fisher社製）を用いて15分間氷上に懸濁した。Bacteroides thetaiotaomicron-all from ATCC and Ruthenibacterium lactatiformans and Roseburia intestinalis from DSMZ）、105から106個の熱不活性化細菌（65℃、20分間）を、EBV形質転換ME-M B細胞株からの段階的量のIgM（0から15 μg/ml総量）とともに、リアルタイムに15分間インキュベートした。 18から15μg/mlの総IgM)。洗浄後、微生物ペレットをPBSに再懸濁し、SYTO BC（Thermo Fisher）の存在下で抗ヒトIgM APC（clone：SA-DA4）（Southern Biotech）と共に15分間インキュベートした。汚染は、使用前にすべての緩衝液と培地を滅菌した0.22μmフィルターに通すことで最小限に抑えた。すべての設定において、細菌FCMは、FORTESSA Cytometer（BD Biosceince）を用いて、細菌の検出を可能にするために前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）の閾値を低く設定して実施された。FSCとSSCはLogスケールに設定され、サンプルはFSC+SSC+SYTO BC+にゲートされ、IgAおよびIgM染色が評価された。FACSAria II（BD Biosciences）装置を用いて、微生物サンプルをソーティングした。閾値設定はSSCの最小許容電圧に設定し、図7Aに示すように、SIgA-SIgM-、SIgA+SIgM-またはSIgA+SIgM+フラクションゲートから50,000イベントを収集した。各フラクション（通常50μL）は、細菌16S rRNA遺伝子のPCRおよび配列決定を行う前に-20℃で保存された。FACSortedフラクションの潜在的な汚染を最小化するために、複数の予防措置がとられた。これには、各ソーティングの直前にフローサイトメーターの液滴流（シース液）からサンプルを採取して、流体ライン中の潜在的な汚染物質を評価できるようにすることが含まれる。
細菌 16S rRNA 遺伝子解析 製造元の指示に従い、PureLink Microbiome DNA Purification Kit (Thermo Fisher) を用いて、ソートされていない粘液サンプルから DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域のアンプリコンを以下に記述するように作製した。FACSortされた細菌からの16S rRNAアンプリコンは、16S V3およびV4領域（表S4）を標的とするPCRプライマーを含むPlatinum® PCR SuperMix High Fidelity（Thermo Fisher）に各細菌画分の2.5μLを直接加え、20cμlの反応を3回繰り返して作製した。16S rRNA分析は、すべてのソートの前にフローサイトメーターの液滴流から採取したサンプル（シース液）に対して行い、これにより、ソートされたサンプルに由来しない配列の同定を可能にした。95℃、10分間の初期変性工程の後、95℃、30秒間、55℃、30秒間、72℃を35サイクル行い、72℃、5分間の終了工程を経て、以下のPCR条件が使用された。3回の反応をプールし、1%アガロースゲル電気泳動に供してPCR産物の存在を確認した（これらのゲルには陰性対照反応も含まれている）。プールしたアンプリコンをAMPure XP磁気ビーズ（Agencourt）で精製し、500 Cycle V2 Kit（2 × 250 bp）を用いてMiSeq装置（Illumina）で多重配列決定（ペアエンド250 nucleotide read）に供した。ペアエンドリードをフィルタリングし（Phred > 19）、fastq-joinアルゴリズムでマージした。脱多重化したリードは、Greengenesデータベースからのgg_13_5リリースと、IluminaリードのデフォルトオープンリファレンスQUIIMEパイプライン（Caporasoら、2010）を使用して、97%同一配列で運用分類単位（OTU）にクラスター化した。FACSorted画分と同様に、鞘液サンプルも配列決定し、推定汚染OTUを同定するための処理を行った。高バイオマス」サンプル（粘液）との比較を行い、「高バイオマス」サンプルでは見つからなかったが、鞘液では見つかった最も頻度の高い汚染OTUを選んだ。この参照汚染OTUは、鞘液またはFACSortedサンプルのいずれかで見つかった他のすべての汚染OTUを比例的に除去するために使用された。最後に、各サンプルに0.1%以上の相対量で検出されたOTUを選択し、「存在量フィルタリングデータセット」を作成した。このOTU表は、最小限のサンプルの深さ（27529リード）に希釈された。Shannon IndexとPhylogenetic Diversity (PD_whole_tree) のRarefied alpha diversity plotは、デフォルトのQIIMEスクリプトを使用して作成した。図7Fに示す式に従って、各OTUとサンプルについて対数変換したEnrichment Index (EI)を算出した。入力サンプルに少なくとも3回存在し、0.1%より高い頻度で存在するOTUのみが、最終的なEI分布を構築するために使用された。ヒートマッププロットは、EI分布の平均値を用いて作成した。OTUとフラクションは、階層的クラスタリングアルゴリズムによってグループ化された。
定量と統計解析 独立したグループからの平均値間の差は、Prism 5.03 ソフトウェア（GraphPad）および R studio を使用して評価した。2群の比較では、特に指定がない限り、P値は対応のない両側スチューデントのt検定で決定した。2群以上の比較では、Tukeyのポストホックテストを伴うone-way ANOVAにより有意な値を算出した。P値はプロットおよび図の説明文に記載した。(* p < 0.05, * * p < 0.01, * * p < 0.001).
データおよびソフトウェアの入手方法
本論文で報告したグローバル遺伝子転写解析のGene Expression Omnibusアクセッション番号は、GEO: GSE89282 です。配列データは、BioProject accession number BioProjectで公開されている。PRJNA355402で公開されています。
著者による貢献
G.M.とL.C.は実験の設計と実施、結果の分析、データの議論、原稿を執筆、M.P.は実験の設計、シーケンスデータの分析と議論、原稿を執筆、J.S.は研究の実施、結果の分析、データの議論、D.L., D.S.-G., S.B., A.Y. and M.U. は実験、C.G．E.K.G.とM.R.はデータについて議論し、M.C.V.Z.とE.M.は必須試薬を提供しデータについて議論し、R.A.-G., I.V., M.I., S.S., L.M. は組織と微生物相のサンプルを提供し、S.Mは実験のデザインとデータの議論をし、A.Cは実験のデザインとデータ議論と原稿執筆をした。
謝辞
IMIMのMicroarray Analysis Serviceによるグローバルな遺伝子トランスクリプトーム解析、UPFのGenomic Core FacilityとEmory UniversityのChristopher M. TiptonによるNGS、UPFとCRGのFACS Unitによる細胞ソーティングの協力に感謝する。支援：欧州先進グラント（ERC-2011-ADG-20110310）、MINECO（SAF2014-52483-R）、AGAUR（2014 SGR 832）、米国NIHグラントP01 AI61093、R01 AI57653、U01 AI95613（A.C. に提供）、Boeringher Ingelhe. )、Boeringher Ingelheim grant 134564-2 (to A.C.), NIH grant R01 DK 112296-01 (to A.C. and S.M.), and Fondo de Investigación Sanitaria ISCIII fellowships CD14/00060 and CM13/00136 (to G.M. and L.C...), に対して）。
備考
公開された。2017年7月11日付
脚注
Supplemental Informationには7つの図と4つの表が含まれ、この記事とともにオンライン（http://dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2017.06.013）でご覧いただけます。
補足情報
ドキュメントS1。図S1～S7、表S1～S4。
クリックで表示(2.2M, pdf)
資料S2. 論文と補足情報:
クリックすると表示されます(11M, pdf)
論文情報
Immunity. 2017 Jul 18; 47(1): 118-134.e8.
doi: 10.1016/j.immuni.2017.06.013
PMCID：PMC5519504
PMID: 28709802
Giuliana Magri,1,11,∗ Laura Comerma,1,11 Marc Pybus,1 Jordi Sintes,1 David Lligé,1 Daniel Segura-Garzón,1 Sabrina Bascones,1 Ada Yeste,1 Emilie K. Grasset,2,3 Cindy Gutzeit,2 Mathieu Uzzan,2 Meera Ramanujam,4 Menno C. van Zelm,5 Raquel Albero-González,6 Ivonne Vazquez,6 Mar Iglesias,6,7 Sergi Serrano,6,7 Lucía Márquez,8 Elena Mercade,9 Saurabh Mehandru,2 and Andrea Cerutti1,2,10,12,＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊＊＊。
1バルセロナ市立病院メディック研究所（IMIM）炎症性心血管系疾患研究プログラム
2医学部、免疫学研究所、アイカーン医科大学、ニューヨーク、ニューヨーク州10029、米国
3医学部、分子医学センター、カロリンスカ大学病院、カロリンスカ研究所、ストックホルム171 76、スウェーデン
4ベーリンガーインゲルハイム社免疫・呼吸器疾患研究部門、リッジフィールド、CT 06877、米国
5モナシュ大学・アルフレッド病院免疫学・病理学部門、メルボルン、VIC3004、オーストラリア
6スペイン、バルセロナ、デル・マル病院病理部
7バルセロナ自治大学（スペイン、バルセロナ、08003
8消化器内科、ホスピタル・デル・マール、バルセロナ、08003、スペイン
9バルセロナ大学生物・健康・環境学部（スペイン、バルセロナ、08028
10カタラン研究所（ICREA）、バルセロナ、スペイン、08003
Giuliana Magri: se.mimi@irgamg; Andrea Cerutti: se.mimi@ittureca
∗共著者 se.mimi@irgamg
**Corresponding author se.mimi@ittureca
11これらの著者は等しく貢献した
12主な連絡先
Received 2016 Dec 22; Revised 2017 Apr 7; Accepted 2017 Jun 16.
著作権 © 2017 The Authors
本論文は、CC BY-NC-NDライセンスに基づくオープンアクセス論文である（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。
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