腸管関連二次リンパ臓器に由来する高IgM症候群の未免疫マウスモデルでは、胚中心が存在しない場合でも腸管IgAレベルが上昇する
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Front. Cell. Infect. 微生物学、2023年6月29日
第1章 細菌と宿主
第13巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1172021
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下痢性疾患の病因と生態学的三要素：宿主、病原体、環境
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腸管関連二次リンパ臓器に由来する高IgM症候群の未免疫マウスモデルでは、胚中心が存在しない場合でも腸管IgAレベルが上昇する
Felipe Hernandez-Cazares1、Raul Antonio Maqueda-Alfaro1、Catalina Lopez-Saucedo2、Jesus Martinez-Barnetche3、Juan Carlos Yam-Puc4、Sergio Estrada-Parra5、Leopoldo Flores-Romo1†、Teresa Estrada-Garcia2*。
1細胞生物学部門、CINVESTAV-IPN、シウダー・デ・メヒコ、メキシコ
2分子生物医学部門、CINVESTAV-IPN、シウダー・デ・メヒコ、メキシコ
3メキシコ、モレロス州クエルナバカ、国立公衆衛生研究所、感染症研究センター
4英国ケンブリッジ大学MRC毒性学ユニット
5メキシコ、メキシコ国立政治学院、国立生物科学高等研究院、免疫学部門
はじめに ヒト高IgM症候群（HIGM）患者は乳幼児期から肺や消化管の感染症を発症し、ほとんどの患者はCD40リガンド（CD40L）遺伝子に変異を有する。ほとんどのHIGM患者は健常人と比較して血清中IgM濃度が高く、IgG、IgA濃度が低いが、腸管抗体濃度は不明である。活性化T細胞上のCD40LはB細胞上のCD40と相互作用し、二次リンパ器官（SLO）内の胚中心（GC）の形成に必須であり、そこで高親和性抗体、長寿命の抗体分泌形質細胞、記憶B細胞が産生される。C57BL6-CD40リガンド欠損マウス（C57BL6-cd40l-/-）は、血清免疫グロブリン濃度がHIGM患者で観察されるレベルと同等であり、糞便中IgA濃度が高いことから、HIGMのモデルである。マウスでは、TGFβやその他のサイトカインがIgA産生を誘導する。
目的：免疫していないC57BL6-cd40l-/-マウスとC57BL6-野生型（WT）マウスの腹腔洗浄、非腸管関連SLO、脾臓/鼠径リンパ節（ILN）、腸管関連SLO、腸間膜リンパ節（MLN）/パイエルパッチ（PP）におけるB細胞集団とIgA産生形質細胞を比較・評価する。
材料と方法 8-10週齢のC57BL6-cd40l-/-マウスおよびWTマウスから腹腔洗浄液、脾臓、ILN、MLN、PPを得た。臓器の凍結切片を免疫蛍光法で、B細胞集団とIgA陽性形質細胞懸濁液をフローサイトメトリーで分析した。
結果 免疫していないWTマウスでは、GCは腸関連SLOでのみ観察されたが、C57BL6-cd40l-/-SLOのすべてでGCは認められなかった。C57BL6-cd40l-/-マウスのPPとMLNでは、IgA産生細胞数がWTマウスより有意に多かった。C57BL6-cd40l-/-マウスの脾臓およびILNでは、IgA産生細胞は有意に減少したが、IgM陽性形質細胞は増加した。C57BL6-cd40l/-マウスのB-1細胞はすべてのSLOでより豊富であったが、WTマウスではほとんどのB-1細胞は腹腔内に含まれていた。MLNのC57BL6-cd40l-/- B細胞は、WTマウスよりも高いTGFβレセプター-1を発現していた。マウス系統の小腸微絨毛（MV）では、IgA陽性細胞の頻度は同程度であった。
考察： これらの結果は、PPとMLNが腸誘導部位としての役割を担っていることを裏付けるものであり、その特徴は、GCが存在しない場合でも、これらの解剖学的部位でIgA優先的免疫応答産生を開始することである。IgA抗体は、腸内の潜在的な病原体や微生物の中和、排除、制御に極めて重要な役割を果たしている。
はじめに
ヒト高IgM症候群（HIGM）患者は通常、乳児期に発症し、肺や消化管の感染症や合併症を起こしやすい（Moazzami et al.） HIGM症候群は1961年に初めて報告され、1992年にCD40リガンド（CD40L）遺伝子の変異として初めて分子学的に特徴づけられた（Cabral-Marques et al.） 患者は、健常人と比較して血清IgM濃度が高いか同程度であるが、IgG、IgA濃度が低いか、IgE濃度がないことが特徴であり、したがって、血清IgG免疫グロブリンの補充は、これらの患者の慢性感染症を減少させるための有効な宿主治療である（Davies and Thrasher, 2010; Yazdani et al.） CD40L欠損症は、原発性免疫不全症の28番目に頻度の高いタイプにランクされ、さらにCD40L（48〜70％）分子に対する欠損は、世界中でHIGM症候群の最も一般的な原因である（Yazdani et al.）
CD154としても知られるCD40Lは、主に活性化T細胞や血小板で発現するII型膜貫通タンパク質であり、好塩基球、単球、ナチュラルキラー、肥満細胞でも炎症条件下で発現が誘導される（Meng et al.） 対照的に、CD40は構成的に発現するレセプターであり、当初はB細胞で特徴付けられ、樹状細胞（DC）、単球、血小板、マクロファージ、多くの非造血細胞（筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞）でも発現する（Elgueta et al.） 例えば、活性化T細胞上のCD40LによるB細胞のCD40シグナル伝達は、二次リンパ器官（SLO）内の胚中心（GC）の形成に不可欠である。GCは、クローン性増殖と親和性成熟が進行中のB細胞からなる、高度に特殊化された微細構造である（Klein and Dalla-Favera, 2008; Victora and Nussenzweig, 2022）。GC内では、B細胞はダーウィン的な体細胞多様化のプロセスを経て、高親和性（IgG、IgA、IgE）抗体を産生する免疫グロブリン、長寿命の抗体分泌形質細胞、記憶B細胞の親和性駆動型選択を受け、これらが一体となって、病原体の排除や再感染からの宿主保護など、効果的な体液性免疫に不可欠である（Klein and Dalla-Favera, 2008; Victora and Nussenzweig, 2022）。
恒常性維持期の腸管抗体産生に焦点を当てると、IgA産生が支配的であることはよく知られているが、腸管B細胞のIgGクラススイッチングも低レベルながら起こっている（Fleming et al.） さらにマウスでは、MLNとPPの常在性反応性IgG2bとIgG3応答が証明されている。これらの応答は主にT細胞（TI）とは無関係に生成され、B細胞のToll様受容体（TLR）シグナルを必要とする。したがって、腸内細菌によって誘導されるIgG抗体は主にIgG2bとIgG3であり、マウスのTI IgG3応答は主に微生物の炭水化物抗原を標的とすることがよく知られている（Poneら、2010；Rawlingsら、2012；Kochら、2016；Flemingら、2022）。
さらに、従来のB-2細胞集団に加えて、B-1細胞として知られる別のB細胞集団が存在し、それぞれB細胞上と活性化T細胞上のCD40とCD40L間のシグナル伝達を必要としない抗体を産生する。B-1細胞は胸膜腔や腹膜腔に多く、常に微生物にさらされている解剖学的領域である（Kroeseら、1989；Gaoら、2012）。そのため、B-1細胞はSLOと腸管固有層の両方に移動し、外因性免疫の非存在下で、主に病原性微生物叢微生物に存在するものを含む非タンパク質抗原に対する天然のIgM、IgA、IgG3抗体を自発的に分泌する（Meyer-Bahlburg, 2015; Prieto and Felippe, 2017; Castro-Dopico and Clatworthy, 2019）。B-1細胞は、特定の可溶性サイトカインにさらされると、他のB細胞集団（B-2）よりも容易にIgA発現に切り替わる、 トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、増殖誘導リガンド（APRIL）、B細胞活性化因子（BAFF）、あるいはTLR4を介してシグナル伝達するリポ多糖（LPS）のような細菌分子にさらされると、CD40L-CD40相互作用がない場合、すなわちT細胞非依存的にIgA産生が起こる（Lebman and Edmiston, 1999; Cerutti, 2008）。
C57BL6-CD40L欠損マウス（C57BL6-cd40l-/-）は、ヒトHIGM症候群の生理病理を明らかにするのに役立つモデルである（Bernal-Reynagaら、2013；Lopez-Saucedoら、2015）。これらのマウスは、免疫を受けていない場合、血清中のIgM濃度が上昇または同程度であり、IgGおよびIgA濃度は低下し、ヒトのHIGM症候群で観察されるIgEは発現しないことが示されている（Renshawら、1994；Bernal-Reynagaら、2013）。この動物モデルは、宿主とヒトおよびマウスの消化管病原体（それぞれ、腸管毒素原性大腸菌やシトロバクター・ロデンティウム（C. rodentium）など）との相互作用を研究するための優れたツールとなっている（Bernal-Reynagaら、2013；Lopez-Saucedoら、2015）。C57BL6-cd40l-/- C. rodentiumモデルでは、この細菌病原体に対する免疫後、特異的血清IgG濃度はWTマウスより低かったが、それでもC. rodentiumに対して殺菌効果を示すことから、機能的であることが明らかになった（Lopez-Saucedo et al.） WTマウスと比較して、C57BL6-cd40l-/-マウスの腸管IgA濃度は有意に高く、IgG1およびIgG2は有意に低く、IgG3レベルはマウス系統間で同程度であった。これらの理由から、本研究では、免疫していないC57BL6-cd40l/-マウスとWTマウスとの間で、腸管関連（PPおよびMLN）および非腸管関連SLO（脾臓およびILN）の両方におけるGC、IgA産生細胞、およびB細胞集団の存在と局在を比較・評価することを目的とした。
材料と方法
マウス系統
WTおよびC57BL6-cd40l/-マウスは、一般的なマウス腸管病原体について年1回、大腸菌について集中的にスクリーニングしたセンチネル動物のコロニーに由来する。すべての実験には、6～8週齢の病原体および大腸菌を含まないマウスを用い、動物飼育および実験に関する施設動物ガイドライン（プロトコル番号：0070-13、UPEAL-CINVESTAV-IPN）に従って実施した。
測定
WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスから脾臓、ILN、MLNおよびPPを採取した。採取した組織から脂肪を除去した後、PBS（pH7.4）で洗浄し、バーニアを使用して（センチメートル単位で）測定し、Canon Rebel 5Tiカメラ（Huntington, Nueva York, U.S.）で撮影した。
インサイチュ免疫蛍光法
ナイーブB細胞およびIgA陽性形質細胞の同定
WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウス（6/群）から、脾臓、ILN、MLN、およびPPを前述と同様に採取し、Tissue Tek（Leica, IL, USA）に包埋し、液体窒素に浸漬し、使用するまで-70℃で保存した。凍結した臓器をLeica cryostat（Leica Microsystems）で5-6μmに切開し、Poly-L Lysine処理したスライドグラスにマウントし、冷アセトンで15分間固定し、風乾後、-20℃で保存した。スライドをBSA 0.2%で再水和し、Power Block試薬（BioGenex, CA, USA）で15分間ブロックした後、一次抗マウス抗体：抗IgD（BD Pharmingen, 553438）、抗IgM（Southern Biotech, 10-20-08）、抗CD138（BD Pharmingen, 553712）で1時間インキュベートし、洗浄後、すべてのスライドを二次抗ラットAlexa Fluor-594（Life Technologies, A21209）で室温で1時間染色した。その後、すべてのスライドを抗IgAビオチン化（eBioscience, 13-5994-82）でさらに染色し、Alexa Fluor-488標識ストレプトアビジン（Invitrogen, 511223）と共に室温で30分間インキュベートした。最後に、DNA染色のためにスライドをDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）と5分間インキュベートした。スライドを洗浄し、グリセリンでマウントした。すべてのサンプルは、オリンパスBX51顕微鏡/オリンパスRFL-T-蛍光ランプ、U-CMAD3-オリンパスカメラ（オリンパス株式会社製）を用いて可視化した。画像はImage-Pro Plus 7.0 software (Media Cybernetics, Rockville, USA)とFiji Image J software (National Institutes of Health, USA)で解析した。
B細胞集団は以下のように同定された：ナイーブB細胞（IgM+IgD+）、活性化B細胞（IgM+）形質細胞（CD138+）、IgA陽性細胞（IgA+）、IgA陽性形質細胞（CD138+IgA+）。
胚中心の同定
GCは脾臓、ILN、MLN、PPs濾胞内でIgD陰性B細胞により同定された。スライドを上記のように処理し、一次抗体として抗IgD、二次抗体として抗ラットAlexa Fluor-594を用い、DAPIで染色した。
フローサイトメトリー
脾臓、ILN、PP、MLN細胞懸濁液
WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウス（各群6匹）の脾臓、ILN、MLN、PPを採取後、機械的破砕により細胞懸濁液を得、Power Blockで15分間ブロッキングした、 そして、抗CD19-BV605（BD Pharmingen, 563148）、抗CD11b-PerCp（BD Pharmingen, 550993）、抗IgD-PE（eBioscience, 12-5993-83）、抗IgM-FITC（Southern Biotech, 1020-02）、および抗IgAビオチン化で30分間染色した。分離したチューブ内で抗CD138（BD Pharmingen, 561070）により形質細胞を同定し、1500rpmで5分間3回洗浄し、20分間透過処理（BD Cytofix/Cytoperm San Jose, CA）し、抗IgM-FITC、抗IgG-APC（Southern Biotech, 17-4010-82）および抗IgAビオチン化により1時間細胞内染色した。PBS（pH7.4）で洗浄後、抗IgAで染色した標識細胞懸濁液のみをAlexa Fluor-488標識ストレプトアビジンと15分間インキュベートした。最後に、すべての細胞懸濁液をPBSで洗浄し、1％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich, St.
B細胞集団は以下のように同定された： 全B細胞（CD19+）、ナイーブB細胞（IgM+IgD+）、IgA陽性B細胞（CD19+IgA+）、B-1細胞（CD19+CD11b+）、全形質細胞（CD19+CD138+）、 IgA陽性形質細胞（CD19+CD138+IgA+）、IgG陽性形質細胞（CD19+CD138+IgG+）、IgM陽性形質細胞（CD19+CD138+IgM+）。フローサイトメトリーのゲーティング戦略は補足図1に記載されている。
腹腔洗浄、細胞計数およびサイトスピンアッセイ
マウスに5mlのPBS（pH7.4）を腹腔内注射し、腹膜をマッサージして細胞を剥離させた後、シリンジ（21G x 32mm）でPBSを除去した。腹膜洗浄を6匹/群で実施し、IgD、IgM、IgA、CD19、CD11b、CD138陽性細胞を同定するための細胞染色を上記のように実施した。サイトスピンアッセイでは、腹膜洗浄細胞をノイバウアーチャンバーを用いてカウントし、3～5万個/100mLとなるように計算した。次に、腹膜洗浄液100mLをローディングチャンバーに入れ、350rpmの速度で5分間サイトスピンした（Shandon Cytospin 4, Thermo, Walthan, Massachusetts, U.S.）。
細胞の割合と総数
mLあたりの細胞懸濁液中の細胞の総数を計算するために、ノイバウアーチャンバーを用いた。各集団の総数は、FlowJoソフトウエアで各集団について得られたパーセンテージを用いて算出した。
統計解析
数値は平均値±平均値の標準誤差（SEM）で表した。統計学的有意性は、WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスを比較するStudent's t-testを行うことにより算出した。P値＜0.05を統計的に有意とみなした。統計解析にはGraphPad Prism software ver.8.0.2（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いた。
結果
免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの二次リンパ器官における生殖細胞の同定
免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-成体マウスのいくつかの腸関連（PPおよびMLN）および非腸関連（脾臓およびILN）SLOにおけるGCの存在を調べた。IgD染色（赤）でナイーブB細胞を標識し、DAPIで核を標識した。WTマウスでは、IgD染色陰性のPP（図1A左下）とMLN（図1A左上）内にGC（白点線）が確認されたが、WTマウスでは非腸関連SLO内にGC形成は観察されなかった（補足図2）。C57BL6-cd40l-/-マウスのすべてのSLOでGCは観察されなかった（図1A右パネルおよび補足図2右パネル）。どちらの系統のマウスでも、ナイーブB細胞（IgD陽性細胞）はB細胞ゾーン（BZ）に見られた
図1
図1 免疫していないWTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスにおけるMLNとPPのIgDと胚中心（GC）のin situ分布。(A）WTマウス（左パネル）とC57BL6-cd40l-/-マウス（右パネル）のMLNとPPのナイーブB細胞（赤）。細胞はDAPI（青）で染色した。MLNとPPのGCは白い点線で強調し、赤い部分はB細胞ゾーン（BZ）を示し、濾胞外ゾーンは青で染色した。GCはWTマウスで観察され、C57BL6-cd40l-/-では認められなかった。白棒は200µmに等しい。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン、EZは濾胞外ゾーン、MVは微絨毛。6回の独立した実験から得られた代表画像。(B）二次リンパ器官の構造図：赤はB細胞ゾーン（濾胞とも呼ばれる）、青は濾胞外ゾーンまたはT細胞ゾーン、白はBZ内のGC。GCの倍率は、体細胞超変異（SHM）を受けるB細胞を含む暗色ゾーンと、B細胞を積極的に選択する濾胞樹状細胞を有する明色ゾーンを示す。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン、EZは濾胞外ゾーン。図1のスキームBは、BioRenderソフトウェア（https://www.biorender.com/）、契約番号BH25GW7T75を用いて作成した。
免疫していないWTマウスおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの腸管関連二次リンパ器官におけるIgD陽性細胞およびIgA陽性細胞の存在
MLNとPPをナイーブB細胞（赤）、IgA陽性細胞（緑）、DAPI（青）で染色した結果、IgD陽性細胞とIgA陽性細胞の標識パターンがマウス系統間で異なっていることが明らかになった。WTマウスでは、PPとMLNの両方で、ナイーブB細胞はGC領域外（白点線）で観察されたが、IgA陽性細胞はこれらの臓器のGC内で同定された（図2左パネル）。図2右上図に示すように、GCを欠損したC57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgA陽性細胞とIgD陽性細胞がBZ内に一緒に散在していたが（白矢印）、PPではそうではなく、ナイーブB細胞のみがBZ内に観察され、さらにC57BL6-cd40l-/-マウスのMLNとPPではTZに少数のIgA陽性細胞が認められた（白矢印）。興味深いことに、両マウス系統とも微絨毛（MV）に数個のIgA陽性細胞が観察された。補足図3に示すように、WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスのIgD陽性細胞およびIgA陽性細胞については、脾臓とILNの間に有意差は観察されなかった。
図2
図2 免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの二次リンパ臓器におけるIgDおよびIgAのin situ分布。WTマウス（左パネル）およびC57BL6-cd40l-/-マウス（右パネル）のMLNおよびPPを、IgD陽性細胞（赤）、IgA陽性細胞（緑）およびDAPI（青）で染色し、GCを白点線で強調した。WTマウスでは、MLNとPPの両方で（左のパネル）、すべてのIgA陽性細胞は、右下隅の正方形拡大図（40倍）にも示すように、GCの点線の白線内にあり、すべてのナイーブB細胞（赤）はBZ内のGCの外にあった。GCを欠損したC57BL6-cd40l-/-マウス（右パネル）では、右下隅の正方形拡大図（40X）に示すように、IgA陽性細胞（白矢印）とBナイーブ細胞（赤）が、BZ内に見られた。白棒は200μmに等しい。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン。6つの独立した実験からの代表画像。
免疫していないWTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスにおける二次リンパ器官サイズ、顕微鏡的局在、および形質細胞を含むB細胞の定量化。
脾臓
脾臓の長さ（cm）を測定した結果、C57BL6-cd40l-/-マウスの脾臓はWTマウスの脾臓よりも有意に大きい（P=0.0057）ことが観察された（図3A）。図3Cに示すように、WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウス由来の脾臓B細胞集団を比較したところ、C57BL6-cd40l-/-マウスでは、全B細胞の割合（%）および数（#）が有意に高かった（%P=0. 045, #P =0.0468）、ナイーブB細胞（%P=0.0279, #P =0.0455）、IgA陽性B細胞（%P=0.0054, #P =0.0308）が有意に多かった。
図3
図3 免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスにおける脾臓および脾臓B細胞集団（形質細胞を含む）の特徴と局在。(A）WTおよびC57BL6-cd40l/-マウスの脾臓の代表的な画像とその長さ。全体的にC57BL6-cd40l-/-マウスの脾臓はWTマウスの脾臓より有意に大きかった（P=0.0057, CI (0.06516 to 0.3063)）。N=7/群。(B）両マウス系統の凍結保存脾臓切片におけるナイーブB細胞とIgA陽性形質細胞の顕微鏡像。両マウス系統のナイーブB細胞（IgD+赤色IgM+緑色、マージ黄色）はBZ内にあった（上図）。WTマウスでは脾臓形質細胞（緑）とIgA陽性形質細胞（黄／橙）がそれぞれBZ外に局在するクラスターを構成していたが、C57BL6-cd40l/マウスでは脾臓周囲に散在する形質細胞（緑）のみが観察された。白棒は200μmに等しい。BZ、B細胞ゾーン。TZ、T細胞ゾーン。EZ、濾胞外領域。4回の独立した実験からの代表画像。(C）フローサイトメトリーによる両マウス系統の脾臓における全B細胞（CD19+）、ナイーブB細胞（IgD+IgM+）およびIgA陽性B細胞の定量。全B細胞％P＝0.045、CI（0.2748〜19.89）＃P＝0.0468、CI（350911〜40720024）、ナイーブB細胞％P＝0.0279、CI（1.252〜17.58）＃P＝0.0455、CI（457822〜36890358）、IgA陽性B細胞％P＝0. 0054, CI (0.08325 to 0.3667) #P = 0.0308 CI (49407 to 823819)の割合および数は、WTマウスと比較してC57BL6-cd40l-/-マウスで有意に高かった。(D）フローサイトメトリーによるWTマウスおよびC57BL6-cd40l/-マウスの脾臓における総形質細胞、IgA陽性形質細胞、IgG陽性形質細胞およびIgM陽性形質細胞の定量。総形質細胞の割合と数は、両マウス系統間で同程度であった（上図）。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgA陽性形質細胞P=0.0452, CI (35163 to 460)とIgG陽性形質細胞P=0.000402, CI (22201 to 621)が有意に少なく、IgM陽性形質細胞P=0.0457, CI (4932 to 84227)が有意に多かった（下図）。(E）WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの脾臓における全B-1細胞の定量。C57BL6-cd40l-/マウスとWTマウスを比較すると、B-1細胞の割合P=0.0416, CI (0.03276 to 1.381)および総数P=0.0194, CI (4958 to 44954)はC57BL6-cd40l-/マウスで有意に高かった。フローサイトメトリーデータは、それぞれ3匹のマウスによる2回の独立した実験の代表値である。統計的有意性は、対にしないstudent´s t-testを用いて計算した。黒丸はWTマウス、白三角はC57BL6-cd40l/-マウスを表す。*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005。信頼区間(CL)=95%。n.s.=有意でない。
脾臓ナイーブB細胞（IgM+緑色およびIgD+赤色）のin vivoおよびin situにおける局在は、両マウス系統で同様に観察された（図3B）。WTマウスでは、形質細胞（CD138+緑）およびIgA陽性形質細胞（CD138+緑、IgA+赤）がBZの外側にクラスターを形成しているのが明瞭に観察された（白矢印）。一方、C57BL6-cd40l-/-マウス脾臓では、IgA陽性形質細胞は見られず、SLO周辺に散在する総形質細胞（CD138+緑）のみが観察された（図3B）。
図3Dに示すように、脾臓の形質細胞の割合と総数は、両マウス系統間で同様であったが（上段）、C57BL6-cd40l/-マウスでは、IgA陽性形質細胞（P=0.0452）とIgG陽性形質細胞（P=0.000402）の総数はWTマウスで観察された数よりも有意に少なく、IgM陽性形質細胞（P=0.0457）はWTマウスで観察された数よりも有意に多かった（下段）。
B-1細胞はIgMとIgA、IgG3抗体を産生するため、WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスでB-1細胞の割合（P=0.0416）と総数（P=0.0194）を比較したところ、WTコントロールで観察された数と比較して、変異体脾臓では有意に高い値を示した（図3E）。
鼠径リンパ節
図4のパネルAに示すように、ILNの長さ（cm）は両マウス系統で同様であった。ILN組織切片におけるナイーブB細胞（IgM+緑、IgD+赤）およびIgA陽性形質細胞（CD138+緑、IgA赤）のin situおよびin vivoでの同定と局在を図4Bに示す。両マウス系統において、ナイーブB細胞（黄色）はBZ内に観察され（上図）、ILN組織ではIgA陽性形質細胞（黄色）は全く観察されず（下図）、さらにBZおよびTZではごく少数の形質細胞（緑色）が同定された（下図）。
図4
図4 免疫していないWTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスにおける鼠径リンパ節（ILN）とB細胞集団（形質細胞を含む）の特徴と局在。(A）WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスILNの代表的な画像と長さの比較。両マウス系統のILNの長さは同程度であった。N=14/群。(B) 両マウス系統のILNの凍結保存切片におけるナイーブB細胞とIgA陽性形質細胞の顕微鏡的同定と局在。両マウス系統のナイーブB細胞（IgD+赤色IgM+緑色、黄色）はBZ内に存在した（上図）。C57BL6-cd40l-/-マウスおよびWTマウスでは、形質細胞（緑色）はほとんど見られず、IgA陽性形質細胞（黄色/オレンジ色）は見られなかった。白棒は200μmに等しい。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン。4つの独立した実験からの代表画像。(C）フローサイトメトリーによるILNの定量と両マウス系統のB細胞集団の比較。ナイーブB細胞（IgD+IgM+）の割合P=0.0428, CI (0.2265 to 11.24)、数P=0.0431, CI (12443 to 651845)は、WTマウスと比較してC57BL6- cd40l-/-マウスで有意に高かった（中段）。C57BL6-cd40l-/-マウスとWTマウスの間では、B細胞（CD19+）およびIgA陽性B細胞の割合および総数に有意差はなかった。(LeHおよび右パネル）。(D）フローサイトメトリーによるWTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスのILNにおける形質細胞（全形質細胞、IgA陽性、IgG陽性、IgM陽性）の定量と比較。全形質細胞の割合と数は、両マウス系統で同程度であった（上図）。IgA陽性形質細胞のILN総数はマウス系統間で同程度であったが（左下パネル）、WTマウスと比較したC57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgG陽性形質細胞はP=0.00025、CI(101.9 to 28.98)、IgM陽性形質細胞はP=0.0442、CI(129.8 to 1396)で、それぞれ有意に少なかった（中・右、下パネル）。(E）WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスのILNにおけるB-1細胞の総数と割合。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、B-1細胞の割合P=0.0063, CI (0.4100 to 1.913)および総数P=0.0046, CI (4058 to 16941)がWTマウスよりも有意に高かった。フローサイトメトリーデータは、各3匹のマウスによる2回の独立した実験の代表値である。統計的有意性は、対にしないstudent´s t-testを用いて計算した。黒丸はWTマウス、白三角はC57BL6-cd40l-/-マウスを表す。*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005。信頼区間(CL)=95%。n.s.=有意でない。
フローサイトメトリーによる全B細胞およびIgA陽性B細胞のILN解析では、その割合および数は両マウス系統間で同程度であった（図4C左および右）が、ナイーブB細胞の割合（P=0.0428）および数（P=0.0431）はWTマウスと比較してC57BL6-cd40l-/マウスで有意に高かった（図4C）。
図4D（上段と左下のパネル）は、ILNにおける全形質細胞およびIgA陽性形質細胞の割合と総数が、両マウス系統で同程度であったことを示している。C57BL6-cd40l-/マウスのILNでは、ILN WTマウス（右下パネル）と比較して、IgG陽性形質細胞の総数は有意に少なく（P=0.00025）（中下パネル）、IgM陽性形質細胞の総数は有意に多かった（P=0.0442）。
図4Eに示すように、C57BL6-cd40l-/-マウスのILNでは、B-1細胞の割合（P=0.0063）および数（P=0.0046）がWTマウスに比べて有意に高かった。
腸間膜リンパ節
C57BL6-cd40l-/-マウスとWTマウスのMLNの長さ（cm）を比較した結果、C57BL6-cd40l-/-マウスのMLNの長さはWTマウスよりも有意に長い（P=0.0182）ことが観察された（図5A）。
図5
図5 免疫していないWTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスにおける腸間膜リンパ節（MLN）とB細胞集団（形質細胞を含む）の特徴と局在。(A）WTマウスとC57BL6-cd40l/-マウスMLNの代表的な画像と長さの比較。全体的にC57BL6-cd40l/-マウスのMLNは有意に大きかった。P=0.0182、CI(0.05292〜0.4699)はWT MLNより大きい。各群N=7。(B）両マウス系統の凍結保存MLN切片におけるナイーブB細胞とIgA陽性形質細胞の顕微鏡的同定と局在。WTマウスでは胚中心（GC、白抜き線）が同定されたが、C57BL6- cd40l-/-マウスのMLN切片ではGCは同定されなかった。両マウス系統において、ナイーブB細胞（IgD+赤 IgM+緑、黄）はBZ内に観察され（上図）、形質細胞（CD138+緑）およびIgA陽性形質細胞（CD138+緑、IgA+赤）は主にTZに存在した（白矢印）。C57BL6-cd40l-/-マウスのMLNでは、IgA陽性形質細胞（黄色）の数がWTマウスよりも多いようである。白棒は200μmに等しい。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン。4つの独立した実験からの代表画像。(C）B細胞（CD19+）、ナイーブB細胞（IgD+IgM+）およびIgA陽性B細胞のフローサイトメトリーによる定量と両マウス系統のMLN間の比較。ナイーブB細胞の割合P=0.0071, CI (2.136 to 10.46)および数P=0.0332, CI (166632 to 3263944)はC57BL6-cd40l-/-マウスで高く、全B細胞数P=0.0377, CI (113232 to 3158067)およびIgA陽性B細胞数P=0.044, CI (4699 to 62975)はWTマウスで観察された数と比較して高かった。(D）フローサイトメトリーによるWTマウスおよびC57BL6-cd40l-/-マウスのMLNにおける形質細胞（全形質細胞、IgA-、IgG-およびIgM）の定量と比較。総形質細胞の割合と数は両マウス系統で同程度であった（上図）。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、WTマウスと比較して、IgA陽性形質細胞の総数が有意に多く（P=0.0048, CI (363 to 1543)）、IgG陽性形質細胞の総数が有意に少なかった（P=0.0024, CI (1372 to 396)）。IgM陽性形質細胞は両マウス系統で同程度であった（下図）。(E）WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスのMLNにおけるB-1細胞の総数と割合。B1細胞の割合P=0.0035, CI (0.2729 to 1.047)および総数P=0.0033, CI (41356 to 156631)は、WTマウスよりもC57BL6-cd40l-/-マウスで有意に高かった。フローサイトメトリーデータは、各3匹のマウスによる2回の独立した実験の代表値である。統計学的有意性は対にしないstudent´s t-testを用いて計算した。黒丸はWTマウス、白三角はC57BL6-cd40l-/-マウスを表す。*p < 0.05、**p < 0.005。信頼区間(CL)=95% n.s. = 有意でない。
ナイーブB細胞（IgM+緑色およびIgD+赤色）のin vivoおよびin situにおける局在と分布を、両マウス系統の凍結保存MLN切片を用いて評価した。WTマウスではGCが同定されたが（白点線）、C57BL6-cd40l-/-マウスのMLNではGCは認められなかった（図5B）。両マウス系統の血漿細胞（CD138+ 緑色）およびIgA陽性血漿細胞（CD138+ 緑色、IgA+ 赤色）は主にTZ（白矢印）に位置していたが、両血漿細胞集団の数は定量されていないにもかかわらず、これらの細胞の数はWTマウスよりもC57BL6-cd40l-/マウスで多いようであった（図5B）。
両マウス系統のMLNをフローサイトメトリーで解析した結果、全B細胞集団とIgA陽性B細胞集団の割合は同程度であったが、これら2つの細胞集団の総数はC57BL6-cd40l-/-マウスで有意に多かった（それぞれP=0.0377およびP=0.044）。C57BL6-cd40l/-マウスのMLNでは、ナイーブB細胞の総数（P=0.0332）および割合（P=0.0071）は、WTマウスのMLNよりも有意に高かった（図5C）。
図5Dのグラフに示すように、両マウス系統のMLNでは、総形質細胞の割合と数、およびIgM陽性形質細胞の数は同程度であった（上段と右下段）。C57BL6-cd40l-/-マウスのMLNでは、IgA陽性形質細胞の数がWTマウスのMLNより有意に多く（P=0.0048）、IgG陽性形質細胞の数は有意に少なかった（P=0.0024）（下パネル）。
C57BL6-cd40l-/-マウスのMLN懸濁液中のB-1細胞の割合（P=0.0035）および総数（P=0.0033）は、フローサイトメトリーによりWTマウスのMLNよりも有意に多かった（図5E）。
パイエル板
C57BL6-cd40l-/-マウスのPPはWTマウスのPPより有意に小さかった（P=0.0002）（図6A）。
図6
図6 免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスにおけるパイエルパッチ（PP）およびB細胞集団（形質細胞を含む）の特徴と局在。パネル(A) WTおよびC57BL6-cd40l/-マウスのPPの代表的な画像と長さ。全体的にC57BL6-cd40l/-マウスのPPは、WTのPPよりも有意に小さかった P=0.0002, CI (0.05055 to 0.02470)。N=56/群（7匹/群）。パネル(B) 両マウス系統の凍結保存PP切片におけるナイーブB細胞（IgD+IgM+黄色）とIgA陽性形質細胞（黄色）の顕微鏡的同定と局在。WTマウスでは胚中心（GC、白点線）の存在が観察され（左上パネル）、IgM陽性細胞でいっぱいであった。C57BL6-cd40l-/-マウスではGCは存在しなかった（右上図）。両マウスのPPでは、非常に少数の形質細胞（緑）とIgA陽性形質細胞（黄）（白矢印）が観察され、そのほとんどがTZ内にあった（下パネル）。WTマウスの微絨毛（PP領域外の構造）内では、数個の形質細胞（緑色）とIgA陽性細胞（赤色）が観察された。C57BL6-cd40l-/-マウスの微絨毛では、IgA陽性形質細胞（黄色）の頻度は低く、形質細胞（緑色）は認められなかった。白棒は200μmに等しい。MVは微絨毛、BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン。4つの独立した実験からの代表画像。パネル(C) 両マウス系統のPPのB細胞（CD19+）、ナイーブB細胞（IgD+IgM+）およびIgA陽性B細胞のフローサイトメトリーによる定量と比較。全B細胞およびIgA陽性B細胞の割合および数は、両マウス系統で同様であった。C57BL6-cd40l-/-マウスのPP懸濁液では、WTマウスのPP懸濁液と比較して、ナイーブB細胞の割合が有意に高かった P=0.0027, CI (10.64 to 37.93)。パネル(D) フローサイトメトリーによるWTマウスおよびC57BL6-cd40l-/-マウスのPPにおける形質細胞（総形質細胞、IgA陽性、IgG陽性、IgM陽性）の定量と比較。総形質細胞の割合と数は、両マウス系統で同程度であった（上図）。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgA陽性形質細胞の総数がWTマウスより有意に多くP=0.0496, CI (79 to 3330)、IgG陽性形質細胞はWTマウスより有意に少なくP=0.0415, CI (282 to 19)、IgM陽性形質細胞は両マウス系統のPP懸濁液間で同程度であった（下パネル）。パネル(E) フローサイトメトリーによるWTおよびC57BL6-cd40l-/-のPP中のB-1細胞の総数と割合。B-1細胞の総数はC57BL6-cd40l-/-で有意に多かった（P=0.0411, CI (550 to 21921)）。フローサイトメトリーデータはそれぞれ3匹のマウスによる2回の独立した実験の代表値である。統計的有意性は、対にしないstudent´s t-testを用いて計算した。黒丸はWTマウス、白三角はC57BL6-cd40l-/-マウスを表す。*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005。信頼区間(CL)=95%。n.s.=有意でない。
図6Bに示すように、WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスのPPの凍結保存切片の濾胞には、ナイーブB細胞（IgM+緑色およびIgD+赤色）が観察された。WTマウスではGCのみが存在し（白点線）、IgM陽性細胞（緑）でいっぱいであった（左上Bパネル）。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、PPにGCは存在せず、BZ内ではナイーブB細胞（黄色）が最も多く、TZにはIgM陽性細胞（緑色）はほとんど確認されなかった（右上Bパネル）。
図6Bに示すように、両マウス系統とも、PP TZではごく少数の形質細胞（CD138+ 緑）とIgA陽性形質細胞（CD138+ 緑、IgA+ 赤）が同定された（白矢印）。WTマウスの腸管凍結切片（左下パネル）では、IgA陽性GC（赤色細胞、点線内）、IgA陽性細胞（赤色）、および数個の形質細胞（緑色）が、PP領域外のMV構造内でも観察された。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgA陽性形質細胞（黄色）はほとんど観察されず、形質細胞（緑色）はMV内に観察されなかった（右下パネル）。
図6Cに示すように、両マウス系統のPPをフローサイトメトリーで解析した結果、全B細胞およびIgA陽性B細胞の割合と数に有意差はなかった（左および右パネル）。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、WTマウスに比べてナイーブB細胞の割合が有意に高かった（P=0.0027）（図6C）。
形質細胞の割合および総数、IgM陽性形質細胞数は同様であった。両マウス系統のPP懸濁液において（図6D）。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgA-形質細胞の数がWTマウスより有意に多く（P=0.0496）、IgG陽性形質細胞の数はWTマウスより有意に少なかった（P=0.0415）（図6D）。
B-1細胞の割合はマウス系統間で同程度であったが（図6E）、C57BL6-cd40l-/-マウスのPP懸濁液中のB-1細胞数はWTマウスのPP懸濁液よりも有意に多かった（P=0.0411）。
免疫していないC57BL6-cd40l-/-およびWTマウスの腹膜洗浄懸濁液中のB細胞および形質細胞集団
図7Aに示すように、腹膜洗浄液中の全B細胞（CD19陽性細胞）の割合および数は、両動物系統で同程度であったが、C57BL6-cd40l-/-マウス腹膜洗浄液中のIgA陽性B細胞数（P=0.0254）は、WTマウスと比較して有意に少なかった。
図7
図7 免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの腹腔洗浄懸濁液における形質細胞を含むB細胞集団の特徴。(A）両マウス系統の腹膜洗浄液懸濁液中の全B細胞（CD19+）およびIgA陽性B細胞をフローサイトメトリーで定量し比較した。総B細胞の割合と数は両マウス系統で同程度であった。IgA陽性B細胞の総数は、C57BL6-cd40l-/-マウスの方がWTマウスよりもP=0.0254, CI (17244 to 1408)で多かった。(B)両マウス系統のサイトスピンによる腹膜洗浄懸濁液上のIgA陽性細胞（緑色）の顕微鏡的同定。C57BL6-cd40l-/-マウスの腹膜洗浄懸濁液中のIgA陽性細胞はWTマウスよりも少なかった（上図）。下図は上図の拡大図であり、IgA陽性細胞（緑色）を明瞭に示している。白いバーは200μmに等しい。4つの独立した実験から得られた代表的な画像。(C）フローサイトメトリーによるWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの腹膜洗浄懸濁液中の形質細胞（総細胞、IgA-、IgG-およびIgM）の定量と比較。C57BL6-cd40l-/-マウスの腹腔洗浄液懸濁液では、血漿細胞の総数P=0.000393, CI (9314 to 288)およびIgG陽性血漿細胞の数P=0.0457, CI (88 to 5)は、WTマウスの腹腔洗浄液よりも有意に少なかった。IgA陽性およびIgM陽性形質細胞の数は、両マウス系統の腹膜洗浄懸濁液で同程度であった。(D）C57BL6-cd40l-/-マウスおよびWTマウスの腹腔洗浄液中のB-1細胞の総数と割合。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、B-1細胞の割合P=0.0049, CI (14.61 to 3.437)および総数P=0.0172, CI (680175 to 83643)がWTマウスと比較して有意に低かった。フローサイトメトリーデータは、各3匹のマウスによる2回の独立した実験の代表値である。統計的有意性は、対にしないstudent´s t-testを用いて計算した。黒丸はWTマウス、白三角はC57BL6-cd40l-/-マウスを表す。*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005。信頼区間(CL)=95%。n.s.=有意ではない
両マウス系統の洗浄液懸濁液中のB細胞集団の顕微鏡分析では、C57BL6-cd40l-/-マウスの腹膜洗浄液では、IgA陽性細胞はWTマウスの腹膜洗浄液よりも少なかった（図7B）。
血漿細胞の総数（P=0.000393）およびIgG陽性血漿細胞の数（P=0.0457）は、C57BL6-cd40l-/-マウスの腹膜洗浄懸濁液では、WTマウスの腹膜洗浄懸濁液よりも有意に少なかった。両動物系統の腹膜洗浄懸濁液には、同程度の数のIgA-およびIgM-陽性形質細胞が検出された（図7C）。
図7Dに示すように、C57BL6-cd40l-/-の腹膜洗浄液では、B-1細胞の割合（P=0.0049）および総数（P=0.0172）は、WTマウスの腹膜洗浄液と比較して有意に低かった（図7D）。
免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの全B細胞表面におけるトランスフォーミング増殖因子β受容体1の評価
図8に示すように、脾臓B細胞上のTGFβ受容体1（TGFβR1）をフローサイトメトリーで解析した結果、受容体膜の発現は両マウス系統で同程度であったが、C57BL6-cd40l-/-マウスのMLN B細胞膜上のTGFβR1の発現は、WTマウスのMLN B細胞と比較して有意に高かった（P=0.047）。
図8
図8 免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの脾臓B細胞およびMLN B細胞の膜上におけるトランスフォーミング成長因子β受容体1（TGFβR1）の発現。(A）フローサイトメトリーによる、WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスの脾臓B細胞上のTGFβR1の平均蛍光強度の比較。TGFβR1の受容体膜発現は両マウス系統間で同様であった。右のヒストグラムは、WTマウス（灰色）とC57BL6-cd40l-/-マウス（赤）のB細胞膜上のTGFβR1の蛍光強度を示している。(B）フローサイトメトリーによるWTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスのMLN B細胞膜上のTGFβR1の平均蛍光強度（MFI）の比較。C57BL6-cd40l-/-マウスのMLN B細胞膜上のTGFβR1の発現は、WTマウスのMLN B細胞上の発現よりも有意に高かった P=0.047, CI (0.5585 to 64.96)。右のヒストグラムは、WTマウス（灰色）とC57BL6-cd40l/-マウス（赤）のB細胞膜上のTGFβR1の蛍光強度を示している。フローサイトメトリーデータは、1群あたり合計5匹のマウスを用いた3回の独立実験の代表値である。統計学的有意性は、対にしないstudent´s t-testを用いて計算した。黒丸はWTマウス、白三角はC57BL6-cd40l-/-マウス。*P< 0.05. 信頼区間(CL)=95% n.s.=有意ではない
免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l/-マウスの小腸におけるIgA陽性細胞の評価
両動物系統の小腸凍結保存切片を評価した結果、IgA陽性細胞の存在、頻度、局在（微絨毛内）は同様であった（図9）。
図9
図9 免疫していないWTおよびC57BL6-cd40l-/-マウス小腸におけるIgA陽性細胞。WT（左パネル）とC57BL6-cd40l-/-マウス（右パネル）の小腸微絨毛（MV）におけるIgA陽性細胞（緑）、細胞はDAPI（青）で染色した。MV IgA陽性細胞の頻度はマウス系統間で同程度であった。白棒は200µmに等しい。Lは内腔、MVは微絨毛。4つの独立した実験から得られた代表的な画像。
考察
ラテンアメリカ6カ国（アルゼンチン、ブラジル、チリ、コスタリカ、ペルー、メキシコ）におけるHIGM症候群の重要性が2014年に報告され、ほとんどのHIGM患者（94.5％）がcd40l遺伝子に変異を有することが明らかになった。著者らはまた、細菌サルモネラ属、真菌ミクロスポリジウム属、原虫クリプトスポリジウム・パルバム、ジアルジア・ラムリア、エンタモエバ・ヒストリチカ、イソスポラ・ベリが、ラテンアメリカのHIGM患者の慢性下痢に関連する最も一般的な微生物であることを記述した（Cabral-Marques et al.）
我々は初めて、免疫していないC57BL6-cd40l-/-マウスが、WTマウスと比較して糞便中のIgA濃度が有意に高いことを報告した（Bernal-Reynaga et al.） IgAは腸管で最も豊富な免疫グロブリンであり、腸内微生物からの刺激シグナルを受けたB細胞に由来し、T依存性およびT非依存性の様式で発現する。腸内細菌に対するマウスの腸管IgA応答は、細菌のトポグラフィー、組成、増殖、侵入性を形成し、さらには宿主の免疫代謝機能や免疫応答の調節にも寄与している（Chen et al.） そこで、免疫していないC57BL6-cd40l-/-マウスの腸管IgA濃度が高いという現象を理解するために、WTマウスとC57BL6-cd40l-/-マウスの腸管関連SLO（MLNとPP）と非関連SLO（脾臓とILN）において、いくつかのB細胞集団と形質細胞（総形質細胞、IgA陽性形質細胞、IgG陽性形質細胞、IgM陽性形質細胞）の有病率を測定した。
免疫していないWTマウスでは、GCは腸管関連SLOに存在したが、非腸管関連SLOには存在しなかった。これは、よく確立されているように、微生物や食物抗原によって腸管SLOが継続的に抗原刺激を受けていることに起因している可能性がある（Forchielli and Walker, 2005; Van den Broeck et al.） これに伴い、WTマウスにオバルブミン-コレラ毒素を経口免疫した後、IgA陽性細胞は脾臓および他の非腸関連リンパ節内にそれぞれ存在しないか、または少数しか存在しないことも記載されており（Weibergら、2018）、抗原SLOs刺激が免疫部位に影響されることも示している（Drayson、1986）。対照的に、WTマウスのPPとMLNでは、抗原主導型反応で示されているように、IgA-GCと呼ばれるGC内のIgA陽性細胞の頻度が高いことが観察された（Mora and von Andrian, 2008）。IgA陽性細胞は、GC非存在下でもC57BL6-cd40l-/-マウスの腸関連SLO内に観察され、IgA陽性細胞の存在量と局在に差があることが明らかになった。全体的な結果から、免疫を受けていないマウスでは、GCの形成とIgA陽性細胞の産生は、主に微生物や食物抗原に常にさらされている腸関連SLOに限定されることが示唆された（Suzuki et al.）
C57BL6-cd40l-/-マウスの非腸管関連SLO（脾臓とILN）においてGCが存在しないことは以前報告したが、我々はC57BL6-cd40l-/-マウスの腸管関連SLO（PPとMLN）においてもGCが存在しないことを初めて報告した。さらに、CD40受容体欠損C57BL6マウスも、腸関連（PPとMLN）SLOにおいてGCを欠いていた（Castigliら、1994；Bergqvistら、2006）。これらの結果を総合すると、CD40（B細胞上）とCD40L（活性化T細胞上）の相互作用がGCの形成に必須であることが確認された（Kawabeら、1994；Renshawら、1994；Takemoriら、2014）。
非免疫マウス系統の非腸管関連SLOおよび腸管関連SLOにおけるIgA陽性細胞のin vivoおよびin situでの特徴を調べたところ、非腸管関連SLO（脾臓およびILN）では、IgA陽性細胞はTZ内に同定され、その頻度は非常に低いことが明らかになった。一方、WTおよびC57BL6-cd40l-/-マウスの小腸MVでは、同程度の数のIgA陽性細胞が観察された。ほとんどの腸管IgA産生は、CD40-CD40L相互作用やGC形成を必要とせず、T非依存的様式から生じることが確認された（Flemingら、2022）。
C57BL6-cd40l-/-マウスでは、IgM陽性形質細胞の総数がWTマウスSLOと比較して、調査したすべての非腸関連SLOで有意に多く、IgA陽性形質細胞は有意に少なかった；C57BL6-cd40l-/-マウスが、血清IgM抗体を多く、または同数産生し、IgA抗体を少なく産生することを裏付けている（Bernal-Reynaga et al、 2013）、HIGM患者に匹敵する（Mengら、2018）。
C57BL6-cd40l-/-マウスの腸管関連SLOとは逆に、IgA陽性形質細胞はWTマウスの腸管関連SLOと比較して有意に高く、C57BL6-cd40l-/-マウスの糞便中のIgA濃度がWTマウスよりも高いという以前の報告（Bernal-Reynaga et al.） また、C57BL6-cd40l-/-マウスの糞便中のIgGは、WTマウスよりも有意に低いことが報告されている（Bernal-Reynaga et al., 2013）。これと同様に、C57BL6-cd40l-/-マウスでは、SLOのIgG陽性細胞頻度がWTマウスよりも非常に低いか、存在しないことが観察され、IgG反応のほとんどがGCで起こることが確認された（Elsner and Shlomchik, 2020）。私たちの結果を合わせると、PPとMLNが粘膜誘導部位としての役割を担っており、その特徴はこれらの解剖学的部位でIgA優先的免疫応答産生を開始することであることが確認された（Koch et al.） IgA抗体は、腸内の潜在的な病原体や微生物の中和、排除、制御に極めて重要な役割を果たしている（Gommermanら、2014；Takeuchi and Ohno、2021）。
さらに、我々は、C57BL6-cd40l-/-マウスにC. rodentiumを免疫したところ、補体を介したC. rodentiumに対する殺菌効果があることを明らかにしており、実際に、C57BL6-cd40l-/-マウスの血清中には、補体を固定することができるIgM抗体とIgG2b抗体が含まれていることが観察された（Lopez-Saucedo, 2014; Takeuchi and Ohno, 2021）。(Lopez-Saucedoら、2015）；したがって、C57BL6-cd40l-/-マウスでは、腸管IgMおよびIgGも腸内細菌病原体に対して殺菌効果を有する可能性があるが（Lopez-Saucedoら、2015）、糞便中のIgG2bの存在を示さなければならない。
分泌型IgAおよびIgM天然抗体の重要な供給源である腸管および肺粘膜のB-1細胞は、両動物系統の腹膜洗浄液およびSLOにおいても同様に特徴づけられた（Suzuki et al. (Suzuki et al., 2010a; Baumgarth, 2011; Prieto and Felippe, 2017）。特筆すべきは、C57BL6-cd40l-/-マウスの腹腔洗浄液では、これまで特徴づけられていなかったB-1細胞が、WTマウスの腹腔洗浄液よりも有意に少なかったが、WTマウスのSLOよりも、腸および非腸関連C57BL6-cd40l-/-マウスのSLO内でより豊富であったことである。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、B-1細胞が自然抗体を産生するために、マウスの体中の免疫エフェクター部位に移動していることを示している（Hardy and Hayakawa, 2005）。B-1細胞とその抗体は、マウスの肺炎球菌感染症（肺炎球菌によって引き起こされる）に対する防御に重要な役割を果たすことが示されており、B-1細胞を欠損した動物は肺炎球菌感染症に耐えることができなかった。これは、天然のIgMとIgAが産生されないためであり、特に肺炎球菌の細胞壁に存在する非タンパク質抗原である莢膜多糖体血清型3（PPS）-3に対するIgMとIgAが産生されないためと考えられる（Dasu et al、 2009; Rodriguez-Zhurbenko et al., 2019）。また、ヒトB-1細胞集団は、S. pneumoniaeの莢膜多糖およびSalmonella typhi（腸チフスの原因菌）の多糖Viに対する抗体を産生することから、動物およびヒトの粘膜免疫応答におけるB-1集団の重要な役割が示唆される（Suzukiら、2010b；Marshallら、2012；Rodriguez-Zhurbenkoら、2019）。
TGFβスーパーファミリーのメンバーは、B細胞の成熟、分化に寄与し、特にB細胞からIgA産生形質細胞への分化を誘導することによってIgA産生を促進する（Liら、2006；Tamayoら、2018；Takeuchi and Ohno、2021）。両マウス系統の脾臓B細胞におけるTGFβ受容体1（TGFβR1）の存在を評価した結果、この受容体の発現は類似していることが観察された。一方、腸管関連SLOであるMLNのB細胞におけるTGFβR1の発現は、WTマウスのMLN B細胞と比較して、C57BL6-cd40l-/-マウスで有意に高かった。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、MLNにおけるIgA陽性細胞数およびB-1細胞数がWTマウスに比べて有意に多かったという事実とともに、これらの観察結果は、MLNの微小環境が、C57BL6-cd40l-/-マウスにおいて、腸管IgA抗体を産生するIgA形質細胞の誘導を促進していることを示唆している。
この結果は、GC非存在下でC57BL6-cd40l-/-マウスの糞便中のIgA抗体の濃度が高いという我々の最初の観察結果を説明するものであろう。さらに、C57BL6-cd40l-/-マウスの腸管関連SLOでは、IgA陽性細胞、IgA陽性形質細胞、B-1細胞、およびB細胞TGFβR1が、WTマウスのSLOよりも豊富であることが報告された。C57BL6-cd40l-/-マウスでは、（TGFβR1の過剰発現により）腸関連SLOおよび微小環境で同定されたB細胞集団が、腸内の総IgA抗体産生の増加に寄与している。高濃度の腸管IgAは、マウスおよびHIGM患者において、腸内微生物病原体の付着、増殖、排除、および／またはクリアランスのバリアとなっている。
結論
HIGM患者の大部分（95％）はcd40l遺伝子に変異を有し、患者の血清中IgM濃度は高く、IgG、IgA濃度は低く、SLOではGCを認めないことが特徴である。C57BL6-cd40l-/-マウスは、血清免疫グロブリン濃度がHIGM患者で観察されるレベルと同等であり、SLOにGCを欠くことから、HIGM患者の特徴を模倣した動物モデルである。我々のグループは、C57BL6-cd40l-/-マウスがWTマウスよりもIgGが低く、IgAが高い糞便抗体を持ち、C. rodentiumに対する特異的血清抗体（IgMおよびIg2b）を持ち、これらの細菌に対して補体を介した殺菌作用を持つことを報告している。無免疫条件下でC57BL6-cd40l-/-マウスモデルを用い、試験したすべてのSLO（Slpleen、ILN、MLN、PP）はGCを欠き、B-1細胞の数が多く、すべての腸関連SLOはWTマウスよりもIgA陽性形質細胞の数が多く、一方、両マウス系統とも小腸固有層におけるIgA陽性細胞の発現は同程度であることが明らかになった。IgA陽性形質細胞とB-1細胞は、腸におけるIgA抗体の産生に直接関与している。最近得られた知見は、HIGM患者の腸内で有害な病原体を排除するための特異的治療法の開発に役立つであろう。例えば、病原体抗原で腸をプライミングすることにより、特異的な腸管IgA、IgM、IgG2b、IgG3抗体の産生を誘導するようなものである。
データ利用声明
本研究で発表された原著論文は、論文／補足資料に含まれている。その他のお問い合わせは、対応する著者までお願いいたします。
倫理声明
動物実験は、CINVESTAV倫理委員会（# 254994）の審査・承認を得た。
著者貢献
LF-R、TE-G、FH-Cが実験を考案した。FH-C、RM-A、CL-Sが実験を行った。JY-P、JM-B、SE-Pは指導、リソース、意見を提供した。FH-CとTE-Gが原稿を執筆し、著者全員の査読と承認を得た。FH-CとTE-Gが原稿を執筆し、全著者が査読・承認した。
資金提供
CONACYT-Mexicoの奨学金780260はFH-Cに授与された。TE-GとLF-Rは、それぞれCONACYT助成金254994と21102を受けた。
謝辞
著者らはMSc. VictorRosales、Yolanda Sánchez-Chávez、Grecia Sánchez Palomero、Margarita Alonso Floresに感謝する。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1172021/full#supplementary-material。
補足図1｜定常状態におけるWTおよびC57-cd40l-/-の脾臓および鼠径リンパ節（ILN）におけるIgDおよび胚中心（GC）の存在のin situ分布。WTマウス（左パネル）とC57-cd40l-/-マウス（右パネル）の脾臓とILNのナイーブB細胞（赤色染色）。細胞はDAPI（青）で染色され、赤い部分はB細胞ゾーン（BZ）を示し、濾胞外ゾーンは青で染色されている。WTマウスとC57-cd40l-/マウスではGCは見られなかった。白棒は200µmに等しい。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン、EZは濾胞外ゾーン。6回の独立した実験から得られた代表画像。
補足図2｜WT C57-cd40l-/-マウスの脾臓および鼠径リンパ節（ILN）におけるIgDおよびIgAのin situ分布。WTマウス（左パネル）およびC57-cd40l-/-マウス（右パネル）の脾臓および鼠径リンパ節を、IgD陽性細胞（赤）、IgA陽性細胞（緑）およびDAPI（青）で染色した。WTおよびC57-cd40l-/-マウスの脾臓およびILNには、ごく少数のIgA陽性細胞が存在した。白棒は200µmに等しい。BZはB細胞ゾーン、TZはT細胞ゾーン。6回の独立した実験から得られた代表画像。
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キーワード C57-CD40L欠損マウス、腸関連二次リンパ球臓器、B細胞集団、IgA産生、未免疫化
引用 Hernandez-Cazares F, Maqueda-Alfaro RA, Lopez-Saucedo C, Martinez-Barnetche J, Yam-Puc JC, Estrada-Parra S, Flores-Romo L and Estrada-Garcia T (2023) 腸管関連二次リンパ臓器に由来する高IgM症候群の未免疫マウスモデルでは、胚中心が存在しない場合でも腸管IgAレベルが上昇している。Front. Cell. Infect. Microbiol. 13:1172021.
受理：2023年2月22日 2023年2月22日；受理された： 受理：2023年2月22日；
発行：2023年6月29日
編集者
アドリアナ・フローレス・ランガリカ（バーミンガム大学、英国
査読者
Eric Brown, テキサス大学ヒューストン健康科学センター, 米国
Sabiha Anis、インダス病院、パキスタン
Copyright © 2023 Hernandez-Cazares, Maqueda-Alfaro, Lopez-Saucedo, Martinez-Barnetche, Yam-Puc, Estrada-Parra, Flores-Romo and Estrada-Garcia. 本記事は、Creative Commons Attribution License（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責 Teresa Estrada-Garcia, testrada@cinvestav.mx
故人
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
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