超好発腸内細菌Blastocystisにおける細胞の還元性と嫌気性の進化的解析

2023年7月16日 23:57

論文|第33巻第12号、p2449-2464.e8、2023年6月19日発行
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超好発腸内細菌Blastocystisにおける細胞の還元性と嫌気性の進化的解析

https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(23)00620-6?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0960982223006206%3Fshowall%3Dtrue

クリスチーナ・ザホノバ 17
ロス・S・ロー 17
クリストファー・J・ウォーレン 17
アンドリュー・P・ジャクソン
ジョエル・B・ダックス 18
アナスタシオス・D・ツァウシス 19, 20, 21
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オープンアクセス公開日:2023年06月01日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cub.2023.05.025
PlumXメトリクス
ハイライト

Proteromonasの高品質ゲノムを作成し、Blastocystisと比較した。

これまでで最も高度に還元されたペルオキシソームが報告された

ブラストシスチスにおける特殊化代謝への移行を詳述

ミトコンドリアとペルオキシソームのダイナミクスの共進化メカニズムが提案されている
まとめ
ブラストシスチスはヒトや動物の腸内に最も広く生息する真核微生物であるが、その常在菌としての役割や寄生虫としての役割についてはまだ議論の余地がある。ブラストシスチスは明らかに腸内環境への進化的適応を遂げており、最小限の細胞コンパートメント、減少した嫌気性ミトコンドリア、鞭毛を持たず、ペルオキシソームも報告されていない。このよく理解されていない進化の変遷に対処するため、われわれは学際的なアプローチで、ブラストシスチスに最も近い正統的ストラメノパイル近縁種であるProteromonas lacertaeの特徴を明らかにした。ゲノム解析の結果、P. lacertaeにはユニークな遺伝子が多数存在することが明らかになったが、同時にブラストシスチスのゲノム相補体の還元的進化も明らかになった。比較ゲノム解析により、鞭毛の進化が明らかになり、ストラメノパイルの形態学的特徴であるマスティゴネームに関与する37の新たな候補成分が見つかった。P.lacertaeの膜輸送システム（MTS）相補体は、Blastocystisのそれよりもわずかに正統的であるが、注目すべきは、両生物とも謎めいたエンドサイトーシスTSET複合体を完全にコードしていることである。また、P. lacertaeとBlastocystisの両方におけるミトコンドリアの組成と代謝の調節についても詳しく調べた。予想外なことに、我々はP. lacertaeにおいて、これまでに報告されている中で最も還元されたペルオキシソーム由来のオルガネラを同定した。このことは、嫌気性生物への道筋におけるペルオキシソーム-ミトコンドリオン還元進化のダイナミクスを導く制約のメカニズムについて推測することにつながる。全体として、これらの解析はオルガネラの進化を調査するための出発点となり、ブラストシスチスが典型的な鞭毛原生生物から、動物やヒトの腸内微生物へと超異端的かつ超有用な進化を遂げた道筋を詳細に明らかにするものである。

グラフィカル抄録
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キーワード
ペルオキシソーム
比較ゲノム学
鞭毛
ミトコンドリア関連オルガネラ
顕微鏡検査
寄生虫
原生生物
はじめに
1912年にエミール・ブリュンプトによってヒトで初めて報告された、
1
ブラストシスチスはおそらくヒトの腸に寄生する真核生物の中で最も一般的なものであろう。集団によっては最大100％の個体で見られる、
2
世界中のヒトの少なくとも6人に1人がこの菌を持っていると推定されている3。
3
動物群によってはもっと多い可能性もある。
4
ブラストシスチスは偏性共生生物であり、病原体である可能性が長い間疑われてきたが、その証拠は矛盾している5。
5
実際、最近になってブラストシスチスはヒトの健康な腸のマーカーになる可能性が示唆されている。
6
ブラストシスチスは他の多くの動物宿主にも存在し、人獣共通感染症の可能性を高めている。ブラストシスチスの病原性と人獣共通感染症の重要性の両方が不確かである一因は、その遺伝的多様性である。ヒトは形態学的同一性を共有しているにもかかわらず、サブタイプ（ST）として知られる少なくとも12の異なる変異体を保有していることが証明されている。
5
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8
,
9
これらのSTは互いに大きく異なっており、オルソログタンパク質は平均して60％しかアミノ酸が一致せず、ゲノムを比較すると遺伝子数に大きな違いがあることが明らかになった。
10
記載された当時、ブラストシスチスの分類学的親和性は不明であり、80年以上そのままであった。この間、酵母、胞子虫（アピコンプレキサンの古い分類学用語）、鞭毛虫性シストなど、さまざまな表現がなされた。ブラストシスチスは直径5〜10μmの球状で、シャボン玉やカエルの産卵に似ている。そのため、通常、分類学的スキームではIncertae sedisとされていた。他の生物との決定的なつながりができるようになったのは、DNA配列が利用できるようになってからである。最終的にブラストシスチスの近縁種が特定されたとき、それはまったく予想外のものであった：ブラストシスチスはストラメノピラの仲間なのだ、
11
ブラストシスチスは、珪藻類、大型の多細胞性昆虫類、比較的小型の従属栄養性鞭毛藻類を含む系統であるストラメノピラ11のメンバーである。ブラストシスチスはストラメノピラの仲間である。
12
ブラストシスチスが小さな二鞭毛虫の祖先から、今日のような非鞭毛虫の腸内共生生物へと進化し、それに伴って形態が単純化され、代謝が適応してきたことを理解するためには、適切なアウトグループ生物が必要である。ブラストシスチスは、オパリン科とプロテロモナド科からなる様々な宿主の腸内共生生物のグループであるスローパリニダ（Slopalinida）に特異的に関連していることが、ストラメノパイルとして最初に分子同定されて以来明らかになっている。SlopalinidaとBlastocystisは一緒になってOpalinataを構成している。
13
,
14
プロテロモナス属は、両生類や爬虫類の下部大腸に多く、時にはげっ歯類にも見られる小さな二鞭毛藻である。
14
最もよく研究されている種はProteromonas lacertaeで、典型的なstramenopileの外観をしている。体長は15〜20μmで、錐体状の細胞体、2本の鞭毛（ただし特徴的なマスティゴネームはない）を持つ。
15
)を持つが、細胞の後半分にソマトネーム(毛のような構造)を持つ。
14
,
16
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17
外観がブラストシスチスと似ていないだけでなく、細胞内部の構造も大きく異なっている。P. lacertaeは単一の核を持ち、単一の大きなミトコンドリアと密着している。鞭毛の根状体（rhizoplast）はゴルジ装置と核の溝を通り、ミトコンドリア上で終わる。
14
,
16
この結果、これらのオルガネラはすべて、鞭毛の根元近く、細胞の先端近くに位置することになる。どちらの生物も管状のクリステーを持つミトコンドリアを持ち、単一の核を持つ嚢を形成する。しかし、ブラストシスチスの栄養型は、複数の核と多くのミトコンドリア関連小器官（MRO）を持ち、ゴルジ体を含む他の小器官とともに細胞周辺に分布している。
18
プロテロモナスはブラストシスチスの姉妹系に属し、構造的にはより典型的な線虫であり、しかも無酸素状態の動物腸内細菌叢のメンバーでもあることから、我々はブラストシスチスが今日のヒトや動物の腸内細菌叢におけるプロティスタン群集の高度に分岐した、しかし支配的なメンバーへと変化するのに伴う還元的進化とゲノムの特異性をよりよく理解するために、P. lacertaeのゲノムと細胞生物学を研究した。
研究結果
P.lacertaeの顕微鏡的研究
BrugerolleとBardele以来、
17
BrugerolleとBardele, 17）以来、現代の顕微鏡技術を用いたプロテロモナスの包括的な研究は行われていない。そこで、ブラストシスチスと比較するP. lacertaeの細胞構造をよりよく理解するために、蛍光顕微鏡、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡を組み合わせた顕微鏡分析から始めた。ブラストシスティスとは異なり（図1A）、P. lacertaeは細長い細胞形状をしており、走査型電子顕微鏡で確認した（図1B）。その結果、2つの典型的なヘテロコント型の鞭毛（ただしマスティゴネームを欠く）、細胞体の皮質隆起、細胞下端のソマトネームが明らかになり、過去の報告と一致した。
17
逸話によると、より円形の形態も観察され（図1Cii）、これはエンシステーションのプロセスを経た細胞ではないかと推測される。透過型電子顕微鏡により、P. lacertaeには、核を取り囲む単一のミトコンドリアネットワークを含む、様々な典型的な真核小器官（核、小胞体、ゴルジ装置）が存在することが確認された（図1Bvおよび1Ci）。これはMitoTracker標識でさらに確認され、蛍光顕微鏡で撮影された（図1Bi）。ブラストシスチスの細胞構造が、P. lacertaeの比較的定型的なストラメノパイル型と比較して非常に多様であることから、我々はこれら2つの生物の細胞進化を理解するために、「オミックス」調査を行うことにした。
図1BlastocystisとP. lacertae細胞の顕微鏡観察結果。
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P.lacertaeのゲノムはBlastocystisのものよりかなり大きい。
P. lacertae LAゲノムは、最大コンティグ長864,525 bp、N50値92,586 bpの1,449コンティグからなる52.3 Mbの配列にアセンブルされた（表1）。ゲノムアノテーションには35,706の遺伝子モデルが含まれ、そのうち28,067はトランスクリプトームデータによって支持された。この遺伝子セットのBUSCOスコアは85.6%で、最もよくアノテーションされたブラストシスチスゲノムと同等であった
10
,
19
,
20
(表1）。また、海産ストラメノパイルCafeteria burkhardae（旧名roenbergensis）のトランスクリプトームも作成した。
21
)のトランスクリプトームも作成した。C. burkhardaeのトランスクリプトームで相互にベストマッチする遺伝子があれば、その遺伝子がBlastocystisでは欠失し、P. lacertaeでは存在する場合に、Blastocystisの欠失を確認する手段となる。C. burkhardaeの最終的な転写産物セットは、除染後28,952の転写産物からなり、BUSCOスコアは70.4%であった。P. lacertaeゲノム配列はBlastocystisと比較して遺伝子密度が高く（684遺伝子/Mb）、そのため平均遺伝子間長（534.9bp）が短い。ブラストシスチスゲノムの特徴である、広範囲に及ぶセグメント重複の証拠は見つからなかった。
10
同様に、P. lacertae転写産物のポリアデニル化に伴って、ブラストシスチスで観察されるような早発停止コドンの挿入は観察されなかった。
22
全体として、P. lacertaeゲノムはBlastocystisゲノムの約3倍から5倍大きく、約6倍の遺伝子を含んでいる。
表1P. lacertae LA、Blastocystis ST1、Blastocystis ST4、Blastocystis ST7のアセンブリとゲノム統計量
Proteromonas lacertae LABlastocystis ST1Blastocystis ST4Blastocystis ST7スキャフォールド1,4495801,30154コンティグ1,4491,0921,355155N5092,58636,65929,524296,810ゲノムサイズ（Mb）52.2516.4012.9218.82遺伝子数35,7066,5445,7076,020GC（%）27. 153.039.745.2平均カバレッジ54.380.0300.012.4BUSCO(%)85.5585.0881.8178.79全遺伝子長(Mb)33.111.67.97.8全遺伝子長(%)63706141遺伝子密度(遺伝子/Mb)684399442320遺伝子間長(Mb)19.14.8511
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ブラストシスチス（Blastocystis）ゲノムは、他の刺胞動物に比べて遺伝子数と多様性が減少している。
コード化内容における観察された分岐は、P. lacertaeにおける遺伝子の増加、Blastocystisにおける遺伝子の損失、またはそれらの組み合わせによるものである可能性がある。このことを調べるために、OrthoMCLを用いて、Blastocystis ST4とST7、P. lacertae、C. burkhardae、および他のstramenopilesの予測プロテオームをクラスター化した。貧弱な遺伝子モデルがクラスタリング解析に影響するのを防ぐため、P. lacertaeで転写支持のある遺伝子のみを含めた。これにより遺伝子数は28,067に減少し、BUSCOスコアは75.1%となった。このアプローチにより、遺伝子クラスターの系統学的分布が確立され、種特異的なもの（すなわち、遺伝子の増加）と、特定の種に存在しない広く保存された遺伝子（すなわち、遺伝子の減少）とが区別された。OrthoMCLは、10のゲノムまたはトランスクリプトームから122,818の予測タンパク質配列を24,945のオルソグループに割り当て、さらに52,806の配列はクラスター化しなかった（表S1参照）。
これらのクラスターのうち、13,585配列を含む2,363配列がP. lacertaeにユニークであった。さらに、6,932のP. lacertae配列はクラスター化せず、今回のサンプリングに基づくと、種特異的でもあると考えられた。この解析から、トランスクリプトームで支持されている高信頼性のP. lacertae遺伝子セットの73%までが種特異的であり、したがってゲノムサイズの不一致の多くはP. lacertaeのユニークな遺伝子に由来することが示唆された。
それにもかかわらず、これらの利益以外に、遺伝子の損失もまたBlastocystisとP. lacertaeの分岐に寄与している。図2Aは、Blastocystis ST7とP. lacertaeにおける全クラスタータイプの割合を比較したものである。各生物について、他方のゲノムから相対的に失われた遺伝子（「姉妹系統損失」と表現され、表S1のシートD-FにBlastocystisについて、シートG-IにP. lacertaeについて記載されている）は、祖先に対する遺伝子損失の規模を反映するために、現在の遺伝子数の割合として表現されている。種特異的な増加を除くと、3,161個のP. lacertae遺伝子がBlastocystis ST7ゲノムから欠損していることがわかった（すなわち、表S1D-S1Fのエントリーを合わせたもので、図2Aでは藍色のセグメントで示されている）。これはBlastocystisの全遺伝子数（n = 6,020）の52.5%、または保存されたBlastocystis遺伝子（n = 3,372）の93.7%に相当する。逆に、P. lacertaeから欠損している保存遺伝子はわずか545個であり、これはここで用いている高信頼性遺伝子セット（n = 28,067）の1.9%、あるいは保存されているP. lacertae遺伝子（n = 14,482）の3.8%である。このように、祖先を共有して以来、ブラストシスチスはP. lacertaeよりも多くの保存遺伝子を失ったが、新たに獲得した遺伝子ははるかに少なく、その結果、祖先の状態に比べてはるかに大きく減少した。
図2オルソグループとべん毛タンパク質の比較ゲノム解析
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これらの異なる進化史の機能的帰結を探るために、遺伝子の欠損に関連する機能用語を調べ、全ゲノムにおける頻度に対して有意に過剰または過小に発現しているKEGGオントロジー（KO）および遺伝子オントロジー（GO）用語を同定した（表S2）。図2Aは、比較のために保存遺伝子と並べて遺伝子欠損の有意なKO用語を示している。保存遺伝子セットは、"ribosome"（KO03011）や "transcription"（KO03021）のような中核的な細胞機能に関連する用語に当然富んでいるが、このような用語はBlastocystis遺伝子欠損の中で過小に表現されている（p < 0.01）。逆に、"染色体および関連タンパク質"(KO03036)および "細胞骨格タンパク質"(KO04812)に関連する配列は、Blastocystis遺伝子の欠損では過剰に発現しているが(p < 0.0001)、P. lacertaeの欠損では発現していない。KO04812は鞭毛内輸送タンパク質、ダイニン、キネシンを含む13の遺伝子欠損と関連している。この遺伝子欠損と運動性細胞骨格との関連は、過剰発現したGO用語の中にも反映されており、その中で最も重要なものは「繊毛」（GO: 0044441; p < 0.0001）と「ATP依存性微小管モーター活性」（GO: 1990939; p < 0.0001）である（表S2B）。
その結果、ゲノムサイズにおける明らかな格差は、主にP. lacertaeの遺伝子がかなり増加したことによるものであるが、遺伝子の損失においては種間で明らかな非対称性がある。これは、ブラストシスチスにおいて保存された遺伝子の機能が大幅に失われていることを反映しており、より単純化された形態と嫌気性／腸内環境への生化学的適応と一致している可能性がある。
鞭毛タンパク質データセットの大規模解析により、マスティゴネームの候補タンパク質が同定され、マスティゴネームとソマトネームの相同性が支持された。
細胞骨格に関連するGO用語が、Blastocystis遺伝子の欠損の中で濃縮されていることから、運動性に関連する進化的変化が示唆される。形態学的変異とゲノム的変異の両方が存在するが、鞭毛とそれに関連する分子機構はストラメノパイル間で保存されている。
23
,
24
走査型電子顕微鏡で観察したところ、P. lacertae（図1Bvi）にはよく発達した鞭毛が見られたが、Blastocystis（図1Avi）には鞭毛が見られなかった。実際、ブラストシスチスのさまざまな形態が、確信度の差こそあれ報告されているが、鞭毛を持つステージはこれまで報告されておらず、この系統では鞭毛運動も失われていることが示唆される。以前発見された16のタンパク質を解析したところ
25
鞭毛をもつ生物では一定であるが、鞭毛をもたないすべての生物では存在しない16のタンパク質を解析したところ、ブラストシスチスでは信頼できる候補は見つからなかったが、P. lacertaeでは13/16が存在した（図S1AとS2；表S3A）。これらのデータから、ブラストシスチスには本当に鞭毛がなく、腸内での生活に特化した結果、また糞便-経口感染メカニズムによるものと推測される。重要なことは、ブラストシスチスは前鞭毛の進化を下流で解析するための事実上のネガティブコントロールとして使えるという結論である。
ストラメノパイルは、後部鞭毛に三又の毛またはマスティゴネーム（すなわち棘突起）を持つことで定義される。
26
このような特徴があるにもかかわらず、グループ内にはさまざまな鞭毛の状態がある。鞭毛の消失は少なくとも2度起こっており、1度はブラストシスチスで、もう1度はペンネート珪藻で起こった。
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さらに、鞭毛を持つが棘突起を持たない分類群もいくつかある。鞭毛のタンパク質組成はよく分かっておらず、3つのタンパク質しか局在していない。
28
,
29
マスティゴネームのタンパク質組成はよくわかっておらず、3つのタンパク質しか局在していない。注目すべきことに、P. lacertaeは棘状鞭毛を持たないが、その体節は相同であると提唱されている。
26
したがって、P. lacertaeゲノムは、マスティゴネームの候補タンパク質を同定し、この相同性論を評価するまたとない機会を提供してくれる。
我々は、鞭毛とマスティゴネームに関連するタンパク質のコアセットを同定するために、一連の比較ゲノム解析を行った（図2B；表S4A-S4F）。以前、鞭毛の進化を調べるために使われた592個のタンパク質セットから、
30
鞭毛以外の機能を持つタンパク質を除去するために、まずブラストシスチス（Blastocystis）をネガティブフィルターとして用いて、236個のタンパク質の縮小セットを同定した。次に、このセットを、正統的な鞭毛形成状態（11分類群）、非鞭毛形成状態（Incisomonas marina
31
およびHalocafeteria seosinensis
32
)、非鞭毛化状態(BlastocystisとPhaeodactylum tricornutum)、または体細胞性状態(P. lacertae)を表す。鞭毛を持つ分類群の大部分では116個のタンパク質が見つかったが、BlastocystisとP. tricornutumでは見られなかった。これらのタンパク質のうち、37個は広く存在するが、I. marinaとH. seosinensisでは欠損していた、
32
したがって、分子生物学的な調査が必要な鞭毛関連タンパク質の候補である。注目すべきは、30/37がP. lacertaeに存在することで、体細胞膜とマスティゴネームの相同性と一致する。
BlastocystisとP. lacertaeは共に保存された膜輸送システムを持つ
IFT27、Rab23、Rab28、RABL2など、RabファミリーのいくつかのGTPaseは鞭毛に関連した機能を持つ。
33
P.lacertae、Blastocystis、およびストラメノパイルゲノムの一部におけるRabコンプリメントの包括的な分子進化解析が行われた。その結果、P. lacertaeから40のRab配列が同定され、これらが特定のRabサブファミリーに割り当てられた（図S1B; データS1）。これにより、最後のストラメノパイル共通祖先（LSCA）におけるRab相補体の推定が可能になり、ブラストシスチスにおける構成要素の有無の背景が明らかになった。LSCAは、最後の真核生物共通祖先（LECA）に存在した5つのRabタンパク質を持たなかったと推測される
34
: Rab4、Rab14、Rab20、Rab24、Rab34である（図S1B）。しかし、P. lacertaeや他のストラメノパイルは、鞭毛に関連するRAB、すなわちRab23、Rab28、RABL2、IFT27をコードしているが、これらはブラストシスチスには見られない。
10
BlastocystisとP. lacertaeのRab相補体の違いから、膜輸送系（MTS）における他の機構の保存について疑問が生じた。膜輸送系は真核生物の基本的な細胞機能にとって重要であり、多様な原生寄生虫の病原メカニズムにとっても重要である。
35
(特に）。
比較ゲノム学と系統遺伝学を用いて、P. lacertaeの膜輸送機構を同定し、分類した。全体として、P. lacertaeゲノムは比較的完全なMTSをコードしており、自由生物である真核生物と同様であった（図S3; 表S3B）。特筆すべきことに、P. lacertaeは完全なTSET複合体をコードしており、P. lacertaeタンパク質をクエリーとして用いると、ブラストシスチスにおけるオルソログを見つけることができた（データS2）。これはストラメノパイルにおける完全なTSET複合体の最初の例であり、LSCAに存在する可能性が高いことを示唆している。また、これまでの報告とは対照的に、この複合体がブラストシスチスにおいて膜輸送の役割を果たしうることを意味している。
10
植物におけるクラスリンを介したエンドサイトーシスの主要な調節因子としての役割を考えると
36
この複合体の存在は、ブラストシスチスにおける宿主からの物質取り込みの細胞生物学を理解する上で重要な意味を持つ可能性がある。
さらに、多サブユニットのテザリング複合体補体を調べると、P. lacertaeではDsl1複合体の4つのタンパク質のうち3つが同定されたが、ブラストシスチスのSTの大部分では単一のDsl1複合体サブユニットのみが同定された（図S3; 表S3B）。酵母では、Dsl1は小胞体で小胞の繋留だけでなく、ペルオキシソームのアセンブリーにも機能している。
37
注目すべきことに、Dsl1複合体構成成分の少なさは、ペルオキシソームの消失または修飾と相関している38。
38
このことと一致して、ペルオキシソームはブラストシスチスでは可視化されておらず、ペルオキシソームの増殖と集合に関与するペルオキシンタンパク質（Pex）もブラストシスチスゲノムで同定されていない。
10
P. lacertaeにおけるDsl1機構の同定は、この生物にペルオキシソーム小器官が存在する可能性を提起している。
P. lacertaeはこれまでに報告された中で最も初歩的なペルオキシソームを持っている
この可能性を検証するため、P. lacertaeゲノム中のPexオルソログを検索したところ、ペルオキシソーム膜E3ユビキチンリガーゼPex10とペルオキシソーム膜タンパク質（PMP）のファルネシル化レセプターPex19、さらにユビキチン結合タンパク質Pex4のホモログが同定された（図3A；表S3C）。注目すべきは、Pex10と19がペルオキシソームの明白な情報マーカーであると考えられていることである、
39
他のPexタンパク質は同定されなかった。ペルオキシソーム標的化シグナル1（PTS1）および2（PTS2）認識機構を構成するPexタンパク質がP. lacertaeに存在しないことと一致し（図3A；表S3C）、これらの標的化シグナルを持つタンパク質を検索しても、通常これらの方法が標的とする既知のペルオキシソームマトリックスタンパク質は同定できなかった。PTS1とPTS2モチーフを持つタンパク質は、それぞれ126個と2個同定されたが（表S5）、これらはデータベースでヒットした既知のタンパク質がないか（PTS1が90個、PTS2が2個）、あるいは他の様々な細胞機能に起因するものであり、P. lacertaeペルオキシソームはそのマトリックス中のタンパク質を介して機能しないと予想される。これとは対照的に、他の様々なストラメノパイルを調べたところ、ペルオキシンが比較的揃っていることがわかった。偽菌類は調べたタンパク質のほぼすべてをコードしているが、単独で補体を退化させたと思われるビギラ菌類とアウレオコッカス・アノファージフェレンス菌類以外の分類群を考慮しても、調べた17種類のタンパク質のうち平均14.8種類がコードされていることがわかり、LSCAがペルオキシンのフルセットを保有していることが示唆され、これまでのデータと一致した（図3AとS4；表S4G）。しかしながら、我々はBigyraの中で、P. lacertaeとBlastocystisの上流でいくつかのペルオキシンが失われていることを突き止めた。Pex22はどのビギラン分類群にも見られず、一方、調べたオパロゾアン分類群内では、徐々に小さな補完が見られた（図S4；表S4G）。
図3P. lacertaeにおける最小ペルオキシソームのバイオインフォマティックおよび分子細胞生物学的証拠
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最も注目すべきは、モデル系（酵母や哺乳類など）では、Pex3（Pex16）とPex19が、Pex10のようなPMPのペルオキシソーム膜への取り込みのために一緒に機能していることである。Pex10とPex19はP. lacertaeとC. burkhardaeで確実に報告されているが、Pex3の欠損はStramenopila内のOpalozoaの底にマッピングされた（図S4）。ただし、Pex3の保存度は低く、バイオインフォマティクスツールを用いた同定には問題がある可能性がある。
40
それにもかかわらず、Pex19の確立されたPex3およびPex10結合領域の一次配列保存性を調べたところ（表S6AおよびS6B）、Pex3を持つ生物のオルソログ（14.8％）に比べて、Pex19のPex3結合領域は、P. lacertaeおよびC. burkhardaeのPex3結合領域は保存性が低いことがわかった（平均同一性はそれぞれ9.5％および12.2％）。対照的に、P. lacertaeとC. burkhardaeのPex19のPex10結合領域は、Pex3を持つ分類群（22.5%）と比較して、わずかに保存状態が良い（平均同一性はそれぞれ26.2%と29.7%）。このことは、Pex3を失ったPex19保有生物において、Pex3結合領域は退化しているが、Pex10結合領域は保存されていることと一致する。全体として、P. lacertaeのPex相補体は最小限であるが、ペルオキシソーム由来のオルガネラの存在を示唆している。
インシリコ解析の結果、最小限のペルオキシソーム小器官が存在する可能性が示唆されたため、多面的なアプローチを用いた。つの異種抗Pex19抗体を用いたウェスタンブロッティング
41
を用いたウェスタンブロッティングの結果、P. lacertaeタンパク質抽出物中に約68kDaの交差反応バンドが見いだされた（図3B）。これはP. lacertae Pex19の予測サイズに対応する。
Pex3-Pex19結合は、Pex19膜結合の最も確立されたメカニズムである。しかしながら、Pex19がC末端のファルネシル化によって膜に標的化されるという別のメカニズムも提案されている42。
42
,
43
GPS-Lipidプログラムを使用、
44
Pex19のファルネシル化モチーフ（CAAX）を同定したが、これはPex19のオーソログの大部分において保存されており（表S6C）、Pex19がPMPと相互作用する能力を保持していることを意味している。
42
そこで、共焦点顕微鏡を用いてP. lacertae細胞内の抗Pex19（Abcam）の結合位置を局在化したところ、細胞内に点状に局在し、核との共局在は見られなかった（図3C）。この局在の解像度を上げるために、同じ抗体を用いた免疫電子顕微鏡法を採用した。この結果、金粒子は主に単膜結合体の周辺部に局在し、ペルオキシソーム局在と一致した（図3D）。これらの観察を確認するため、予測されるタンパク質の特異的ペプチドに対するPex10抗体を作製した。ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光顕微鏡観察により、この抗体の特異性（59kDaの明瞭なバンド）、点状局在、Pex19との共局在が示され、このタンパク質が同じオルガネラに存在することが一致した（図3Bと3C；Video S1, 0:00-0:50 min）。これらのデータは、P. lacertaeにペルオキシソーム小器官が存在することを示唆しているが、その機能に関してさらなる疑問も投げかけている。
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ビデオ S1. Pex10とPex19の共局在（0:00-0:50分）、Pex10とPXMP2の共局在（0:51-1:40分）。
ペルオキシソームの2つの特徴的な活動は、脂肪酸（FA）のβ酸化と活性酸素種（ROS）の代謝である。
45
そこで、P. lacertaeの予測プロテオームとゲノムからこれらの酵素を検索し、C. burkhardaeとBlastocystisの同じ経路を比較した。その結果、P. lacertaeにはPTSを認識するペルオキシンが存在せず、ブラストシスチスにはペルオキシソームが存在することがわかった、
10
のペルオキシソームにはPTSを認識するペルオキシンが存在せず、ブラストシスチスにはペルオキシソームが存在しないことと一致して、これら2種ではペルオキシソームが標的とするFA β酸化酵素は同定されなかった（図4A）。一方、C. burkhardaeでは全経路を再構築した。驚くべきことに、P. lacertaeとBlastocystisではFAのミトコンドリアβ酸化も不完全であり、前者では3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-ケトアシル-CoAチオラーゼ、3機能性タンパク質が欠損しており、後者では3-ケトアシル-CoAチオラーゼと3機能性タンパク質が欠損していたが、C. burkhardaeではミトコンドリアβ酸化がまだ機能していた（図4A）。
図4P. lacertaeの最小ペルオキシソームにおける潜在的機能のバイオインフォマティックおよび分子細胞生物学的証拠
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異なる細胞区画からは、いくつかの活性酸素代謝酵素が知られている。最もよく知られているペルオキシソームの活性酸素代謝酵素はカタラーゼである。しかし、カタラーゼはブラストシスチスゲノムに欠損していることが示された、
10
,
19
さらに、P. lacertaeやC. burkhardaeではこのタンパク質を同定できなかった。スーパーオキシドジスムターゼはP. lacertaeとC. burkhardaeで同定されたが、どちらもミトコンドリアに局在すると予測された。H2O2を還元する追加酵素であるペルオキシレドキシンも同様に、C. burkhardaeのミトコンドリアでのみ働くと予測された（表S6D）。PXMP2とPXMP4（図4A）は、活性酸素代謝に関与する2つのペルオキシソームタンパク質で、膜貫通型であるため、Pex19システムを介してペルオキシソームに標的化される。両者ともC. burkhardaeにコードされており、特にブラストシスチスではホモログを同定できなかったが、P. lacertaeではPXMP2のホモログを同定した。P. lacertaeのPXMP2タンパク質に対して有効な抗体を作製し（図4Bと4C）、免疫蛍光顕微鏡でPex10と共局在を示した（図4D；ビデオS1、0:51-1:40分）。これらを総合すると、P. lacertaeではペルオキシソーム由来のオルガネラが高度に減少しており、その中に局在する既知の酵素は活性酸素代謝に関与すると推測されるPXMP2だけである、という証拠と一致する。
一般に、嫌気性と寄生性の系統はペルオキシソームが減少していると考えられてきた。最近、アルカメーバ（Entamoeba histolytica、Mastigamoeba balamuthi、Pelomyxa schiedti）に嫌気性ペルオキシソームが存在することが報告されたが、これは顕著な反例であり、酸素を嫌う生物におけるペルオキシソームの代替代謝機能の可能性を提起するものである。
46
,
47
,
48
それにもかかわらず、トリコモナスやジアルジアのような微好気性生物は、明らかにブラストシスチスと同様に、このオルガネラを完全に失っているようである。我々の知る限り、P. lacertaeに存在するペルオキシソーム小器官は、現在報告されているペルオキシソーム小器官の中で最も機能が低下しているが、おそらくは機能しているものであり、嫌気性系統におけるペルオキシソーム小器官の進化の後期中間段階を研究する絶好の機会である。P.lacertaeゲノムにはPexタンパク質がほとんどコードされていないが、ペルオキシソーム由来のオルガネラと思われるものが存在すること、また、最近、EntamoebaやToxoplasmaにペルオキシソームが存在する例があることを考えると、P、
47
,
49
ではペルオキシソームは存在しないとされていたが、ペルオキシソームが失われたと推定されている他の生物についても再検討する価値があるかもしれない。
ブラストシスチスはP. lacertaeに匹敵する代謝を達成しているが、冗長性は減少している。
この最小限のペルオキシソームの補完と、このオルガネラがミトコンドリアと一体的につながっているという性質を踏まえて、我々は次に、この2つの異常なコンパートメントによって調節される代謝経路に特に焦点を当てて調べた。比較の結果、ブラストシスチスのSTはP. lacertaeとC. burkhardaeの両方とほぼ同様の代謝能力を保持しており、291のパスウェイがすべてのブラストシスチスのST、P. lacertae、C. burkhardaeの間で共有されていることが示された（表S3DとS6D）。最も大きな相違は、各ゲノムからマップされた遺伝子の総数から生じた。Blastocystis ST1とP. lacertaeの間には347遺伝子の差があり、これはアスパラギン酸生合成経路に顕著な違いがあるものの、冗長なKO語で構成されているようである。ブラストシスチスはこれらの経路の中で最も少ない遺伝子をコードしており、これはブラストシスチスのSTが能力を損なうことなく、保存された代謝経路から複雑さを失ったことを示唆しているのかもしれない。Blastocystis STとP. lacertaeの間には、ゲノムの大きさやKEGGにマッピングされた配列の数に違いがあるにもかかわらず、驚くほど類似した経路のレパートリーを含んでいる。両者に根本的な違いがあるとすれば、それは各経路に関与する遺伝子の数、すなわち代謝の「遺伝子の豊富さ」である。ブラストシスチスはP. lacertaeとほぼ同等の代謝能力を達成しているように見えるが、遺伝子数はかなり少ない（図5A）。
図5ゲノム予測に基づくP. lacertaeミトコンドリオン関連オルガネラ（MRO）の代謝マップと機能の提案
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代謝比較の最も顕著な点は、解糖系経路に見られた。ストラメノパイルは解糖の後半をミトコンドリアで分割することが以前に示された。
50
そこで、P. lacertaeの解糖をコードする酵素についてゲノムを調べ、ミトコンドリア標的酵素の可能性の有無を評価した。ブラストシスチスと同様である、
50
と同様に、P. lacertaeはATPを利用する酵素の一部をピロリン酸を利用する酵素に置き換えているようである。P. lacertaeは10種類の解糖系酵素をすべてコードしている。他の研究されたストラメノパイルと同様である、
50
解糖は分岐しており、解糖の後半（C3部分）の酵素は細胞質とミトコンドリアの両方に存在する。しかしブラストシスティスは細胞質枝を失い、もっぱらミトコンドリアのC3枝に依存している。
50
ピルビン酸キナーゼはブラストシスチスではミトコンドリア標的シグナルを持たないが、ブラストシスチスはピルビン酸キナーゼの代替酵素であるホスホエノールピルビン酸合成酵素（ピルビン酸ジキナーゼ）を利用している。P.lacertaeもホスホエノールピルビン酸合成酵素を使っているようであるが、この酵素には認識可能なミトコンドリア標的化シグナルはないようである（図5B）。MROへのターゲティングは非正規的であることが示されている。
51
P.lacertaeにおいて、ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への最後のステップがどのように進行するかは、今のところ不明である。Blastocystisとは異なり、しかし他のストラメノパイルと同様に、P. lacertaeは推定上のミトコンドリアピルビン酸キャリア（MPC）を含んでいる。
P. lacertaeとBlastocystisは同等のMROと関連した好気性代謝を持つ。
ブラストシスチスはそのMROで注目されており、古典的なミトコンドリアとミトコンドリア残骸の中間段階の例として研究されてきた。
52
,
53
好気性（正統的）ミトコンドリアの機能は非常によく知られているが、嫌気性ミトコンドリア、MRO、ヒドロゲノソーム、ミトソームの機能や区別はまだ曖昧である。
54
我々のインシリコ予測によると、P. lacertaeのミトコンドリアタンパク質組成は、ブラストシスチスST1と類似しており、それぞれ314個と292個のタンパク質が予測された（図5A）。2つのオルガネラの間には形態的な違いがあるにもかかわらず（図1）、どちらのMROも同様の機能を持っているようである。注目すべきことに、2つのオルガネラの大きな違いは、ミトコンドリアタンパク質輸入機構のタンパク質組成と、オルガネラの転写および翻訳に関与するタンパク質に関係している（図5A；表S3D）。P. lacertaeはBlastocystisに比べてミトコンドリアタンパク質輸入機構が減少しており、オルガネラの外膜に局在すると予測されるタンパク質（例えばTom40、Tom70）を欠いている。対照的に、P. lacertaeはBlastocystisと比較して、ミトコンドリアの転写と翻訳に関与するタンパク質をほぼ2倍コードしている（図5A; 表S3D）。BlastocystisとP. lacertaeのミトコンドリアゲノムのコンプリメントは、タンパク質をコードする遺伝子の数は同じであるが、P. lacertaeのものはより多くのtRNAをコードしており、特筆すべきことに、ゲノムの構造が明らかに異なっている（円形と直鎖）。
55
P.lacertaeにおける転写／翻訳機構の相補性の増加が、ミトコンドリアゲノムの直線的な構成に起因する要件を反映しているかどうかは、今後の分子生物学的特性解析の課題である。
生化学的には、嫌気性エネルギー代謝がP. lacertaeとBlastocystis MROの最も顕著な違いである。P.lacertaeゲノムは、ブラストシスチスのオルガネラに存在し局在することが示された[FeFe]-ヒドロゲナーゼとそのマチュラーゼ（HydE）をコードしていない53。
53
これらの遺伝子はC. burkhardaeにも存在しないので、遺伝子の獲得はブラストシスチスの系統で起こったと推定される。注目すべきことに、ブラストシスチスにおいてこのタンパク質の活性を示す試みは失敗に終わっているが、これはおそらく酵素の成熟のための機構が不完全なためであろう（HydGとHydFを欠いている
10
). 加えて、in silico予測により、ブラストシスチスST1ゲノムはピルビン酸をアセチル-CoAとCO2に脱炭酸するための複数の経路をコードしていることが明らかになった、
10
,
53
好気性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（PDC）、嫌気性ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（PFOR）、ピルビン酸：NADP+酸化還元酵素（PNO）などである。
10
FeFe]-ヒドロゲナーゼが存在しないにもかかわらず、P. lacertaeは嫌気性脱炭酸酵素（PFORとPNO）をコードしており、どちらもミトコンドリア標的シグナルが予測されている（表S3D）。In vitroでは、P. lacertaeはBlastocystisの軸培養とは対照的に、あらかじめ還元した培地に接種する必要がなく（STAR Methods）、P. lacertaeがより酸素耐性であることを示唆している。ピルビン酸脱炭酸の嫌気的手段を維持しながら、PDCが存在しないことは不可解であり、さらなる調査が必要である。
ブラストシスチスのMROと同様に、P. lacertaeのミトコンドリアには、電子輸送連鎖の複合体Iと複合体IIの構成要素と、ロドキノン生合成酵素RQUAを含む（嫌気的な）キノン代謝に関与するタンパク質が存在する56。
56
および代替オキシダーゼ（AOX）を含む、（嫌気性）キノン代謝に関与するタンパク質も含まれている。
57
(図5B）。これらのオルガネラはまた、アミノ酸代謝、補酵素／ビタミン代謝（葉酸、B5、B12、ステロイド、リポ酸）、FA生合成、不完全なトリカルボン酸サイクルのための経路、およびミトコンドリアゲノムの維持も含んでいる（図5）。ブラストシスチスと同様に、P. lacertaeはISCのアセンブリーとエクスポートのタンパク質（例えば、ATM1）をコードし、細胞質でのFe-Sのアセンブリー（CIA機構）をサポートしている（図5）。この機構の構成要素に加えて、P. lacertaeは融合型硫黄動員タンパク質（SufCB）をコードしており、このタンパク質はブラストシスチスにおいてFe-Sクラスター（例えば、[4Fe-4S]）に結合することが示され、酸素ストレス下で発現し、細胞質に局在していた。
58
まとめると、P. lacertaeのMROは、Blastocystisの小器官と比較すると、嫌気性代謝はパッチ的に保存されているようであるが、機能は同等かそれ以上に低下している。ペルオキシソームのデータと合わせると、P. lacertaeはより好気性に傾いた代謝を持っているようであり、したがって微好気性段階とブラストシスチスで見られるより高度な嫌気性代謝の中間段階を表している可能性がある。
考察
P. lacertaeは形態学的に典型的なストラメノパイルであり、そのゲノムはこれまでのストラメノパイルゲノムと比較して、ブラストシスチス由来の状態とよく比較できる。現在までに解読されたストラメノパイルの中で最もブラストシスチスに近縁であり、腸内での生活にも適応している。祖先の状態をある程度示すことで、ブラストシスチスのゲノムがストラメノパイルの基準からすると、いかに純粋に小さいかがわかる。
10
サイズが小さくなったのは、運動性やペルオキシソームなどの特定の細胞機能が失われたことと、プロテロモナスとの最後の共通祖先からの分岐以来、ブラストシスチスの系統で保持されていた遺伝子と同数の遺伝子が失われたことによるゲノム全体の大幅なスリム化の両方によるものである。ブラストシスチスゲノムにおけるゲノムの減少は、細胞生理学のほとんどすべての側面に影響を与えたが、ほとんどの場合、代謝機能の完全な喪失ではなく、単純化につながった。
我々のデータはまた、ミトコンドリア代謝遺伝子の比較的複雑で保存された相補体と、ペルオキシソームにおける共有経路がほとんど完全に減少していることを対比している。嫌気性生物への移行におけるこれら2つのオルガネラの共進化的変性は、複数の真核生物の系統に共通して見られるが、このダイナミックを導く規則があるとすれば、まだ不明である。ペルオキシソームタンパク質（Pex22やPex3など）の損失は、オパール動物では嫌気性生物に移行する以前からあったと推測されるため、今回の結果は、ペルオキシソームの早期変性が、ミトコンドリアにおける経路損失のブレーキとして働いた可能性があるという興味深い可能性を提起している。他の系統では、MROはより退化しているが、ペルオキシソーム経路はより完全である（例えば、M. balamuthi
46
やE. histolytica
47
のように）、ペルオキシソームとミトコンドリアについて、先に退化を始めたオルガネラが、もう一方のオルガネラの経路喪失に負の選択圧をかけるという、より一般的な進化メカニズムが推測される（図6）。嫌気性生物への完全な適応が達成されると、両方のオルガネラの退化が進む。これがこの嫌気性系統における単なる偶発的な問題なのか、それとも嫌気性生物への移行における進化的制約を明らかにするものなのかは、もっと多くの系統がサンプルされるようになってから、調査される必要がある。
図6ペルオキシソームとミトコンドリア小器官縮小の進化的ダイナミクスの指針
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全体として、ブラストシスチスゲノムの進化は、鞭毛やペルオキシソームのような細胞小器官に関連するシステムの喪失によって中断され、冗長性の一般的な喪失を伴う、漸進的ではあるが広範なゲノム全体の合理化によって特徴づけられてきた。この結果、ゲノムの多様性が欠落し、現代のブラストシスチスで見られる発生学的・生態学的な均一性を反映している。この合理化プロセスは、宿主腸内の限られたニッチへの適応と一致している。
STAR★方法
主要リソース表
REAGENT or RESOURCEIDENTIFIRAntibodiesPXMP2 anti-rabbit antibodythis paperN/APex10 anti-rat antibodythis paperN/APex19 anti-rabbit antibodyAbcamCatalog number: ab137072MitoTracker Red CMXRosInvitrogenCatalog number： M7512Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Invitrogenカタログ番号： A-11008Goat anti-Rat IgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488InvitrogenCatalog number： A-11006Goat anti-Rat IgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 594InvitrogenCatalog number： A-11007VECTASHIELD Antifade Mounting Medium2ScientificCatalog number: H-1000-10化学物質、ペプチド、組み換えタンパク質DNeasy mini kitQiagenCatalog number: 69504RNeasy kitQiagenCatalog number: 74104glutaradehydeSigma-AldrichCatalog number： G5882カコジル酸ナトリウムSigma-Aldrichカタログ番号： CO250低融点アガロースMilliporeカタログ番号：2070-OPアルカインブルー0.1 %酢酸色素Sigma-Aldrichカタログ番号：05500四酸化オスミウム（OsO4）Sigma-Aldrichカタログ番号：201030プロピレンオキシドSigma-Aldrichカタログ番号：110205低粘度樹脂Sigma-Aldrichカタログ番号：900149VH1ハードナーガーサイエンティフィックカタログ番号： AGR1375VH2硬化剤科学的なカタログ番号： AGR1376LVアクセラレーター理化学研究所カタログ番号： AGR1381酢酸ウラニル科学的なカタログ番号： AFR1000水酸化カリウムSigma-Aldrichカタログ番号: 4.80864リン酸緩衝生理食塩水Sigma-Aldrichカタログ番号： P4417LR白レジナガーScientificカタログ番号： AGR1281ゼラチンアガーScientificカタログ番号： AGG29209ウシ血清アルブミンSigma-Aldrichカタログ番号： A8654Tween 20Sigma-Aldrichカタログ番号： P1379クエン酸レイノルド鉛既報の通りhttps://marclab.org/tools/protocols/reynolds-lead-citrate-stain-for-grids/adult ウシ血清Gibcoカタログ番号：16170078MgCl2Sigma-Aldrichカタログ番号：M8266TrisCl2Sigma-Aldrichカタログ番号：M8266TrisCl2Sigma-Aldrichカタログ番号：M8266 M8266Tris-HClSigma-AldrichCatalog number： PHG0002EDTA遊離プロテアーゼ阻害剤Sigma-Aldrichカタログ番号: 11873580001Laemmli Protein Sample BufferBioradカタログ番号: 1610737NaClSigma-Aldrichカタログ番号： S9888TrizmaSigma-Aldrichカタログ番号： T8524ECL試薬既報の通り
59
N/AD寄託データProteromonas lacertaeゲノムGenbank： BioProject PRJNA386230; Biosample SAMN06926116RawリードとアセンブリはNCBIで入手可能: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA386230Proteromonas lacertae transcriptomeGenbank： BioProject PRJEB60805; Biosample SAMEA112818123Raw reads available at NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJEB60805Cafeteria burkhardae transcriptomeGenbank： BioProject PRJEB54677;バイオサンプルSAMEA110341195Raw reads and assembly available at NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJEB54677Software and algorithmsAUGUSTUS v2.4Stanke et al.
60
rrid: scr_008417; http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/SNAPKorf
61
RRID: SCR_007936; http://snap.genomics.org.cnBLASTAltschul et al.
62
RRID: SCR_004870; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiInterProScan v5.21-60.0Zdobnov and Apweiler
63
RRID: SCR_005829; http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/TMHMM v2.0cKrogh
64
RRID: SCR_014935; https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/SignalP v4.1Bendtsen et al.
65
RRID: SCR_015644; https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/ModPredPejaver et al.
66
http://montana.informatics.indiana.edu/ModPred/RfamScan v1.1.1Griffiths-Jones
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RRID: SCR_015027; http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler/LTRfinder v1.0.5Xu and Wang
69
https://github.com/xzhub/LTR_FinderBLAST2GO v4.1Conesa et al.
70
RRID: SCR_005828; http://www.blast2go.com/b2ghomeTopHat v2.1.1Trapnell et al.
71
RRID: SCR_013035; http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtmlTrinity v2.1.1Haas et al.
72
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73
RRID: SCR_015008; https://busco.ezlab.org/OrthoMCL v2.0.9Li et al.
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RRID: SCR_007839; http://www.orthomcl.org/cgi-bin/OrthoMclWeb.cgiPhyMLGuindon et al.
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RRID: SCR_014629; http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/AMOEBAEBarlow et al.
76
https://github.com/laelbarlow/amoebaeMAFFT v7.458Katoh and Standley
77
RRID: SCR_011811; https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/trimAl v1.4Capella-Gutiérrez et al.
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RRID: SCR_017334; http://trimal.cgenomics.org/IQ-TREE v1.6.12Nguyen et al.
79
RRID: SCR_017254HMMER v3.1b1Eddy
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81
RRID: SCR_011812; http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/Mesquite v3.03マディソンとマディソン
82
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83
RRID: SCR_014628; http://darwin.uvigo.es/software/prottest_server.htmlPhyloBayes v3.3Lartillot and Philippe
84
,
85
およびLartillot et al.
86
RRID: SCR_006402; https://github.com/bayesiancook/pbmpiMrBayes v3.2.2Ronquist and Huelsenbeck
87
および Huelsenbeck et al.
88
RRID: SCR_012067; https://nbisweden.github.io/MrBayes/RAxML v8.1.3Stamatakis
89
RRID: SCR_006086; https://github.com/stamatak/standard-RAxMLTargetP-2.0Almagro Armenteros et al.
90
RRID: SCR_019022; https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP-2.0/NommPredKume et al.
91
https://gitlab.com/kkei/NommPred
新しいタブで表を開く
リソースの有無
代表連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、主担当者であるAnastasios D. Tsaousis (A.Tsaousis@kent.ac.uk)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本研究では2種類のユニークな抗体を作製した。抗体はご要望に応じてご提供いたしますが、商業的応用の可能性がある場合には、代金のお支払いおよび／または材料譲渡契約書のご記入をお願いすることがあります。
実験モデルと被験者の詳細
P. lacertaeおよびC. burkhardaeの培養条件
Proteromonas lacertae LA培養物
92
LYI-S-2 で軸生培養した。
93
LYI-S-2、15% 成牛血清（Sigma Aldrich）を添加した滅菌ホウケイ酸ガラス管中、22 ℃で軸生育させ、2-3 週間ごとに継代した。Cafeteria burkhardae ATCC 50561は、遮光T-25培養フラスコ中、4℃または室温の原生動物用人工海水（ASWP）で維持した。
方法の詳細
オミックス配列決定、アセンブリー、初期解析
P. lacertaeおよびC. burkhardae核酸抽出
P. lacertaeゲノムDNAは、DNeasy mini kit（Qiagen）を用いて、製造元のプロトコールに従って抽出した。20μgの高分子DNAをリバプール大学ゲノム研究センター（University of Liverpool's Centre for Genomic Research）に提出し、塩基配列を決定した。ライブラリーはDNAを約10kbの断片に剪断して調製した。塩基配列決定は主にSMRT細胞1個で行われた。
P. lacertaeおよびC. burkhardaeの全RNAは、RNeasyキット（Qiagen）を用いて、製造元のプロトコールに従って抽出した。RNAサンプルはプールし、リバプール大学ゲノム研究センター（University of Liverpool's Centre for Genomic Research）で、メーカーのプロトコールに従ってpolyA selectionを用いて処理した。
P. lacertaeゲノムおよびトランスクリプトーム配列決定とアセンブリー
ゲノム配列決定はPacBio RSIIシークエンサーを用い、9個のSMRTセルを用いて行い、SMRT Portalソフトウェア（HGAP 3）を用いてアセンブルした。RNAサンプルは、鎖特異的ScriptSeqキットを用いて濃縮RNAから3つのイルミナRNASeqライブラリーを作製するために用いた。ペアエンドシーケンス（2x125 bp）は、Illumina HiSeqプラットフォームを用いて1レーンで行った。
アセンブリーパラメーターは、ゲノムサイズを35 Mbに設定した以外はデフォルトとした、
94
および最小シードリード長を10,000 bpに増やした。
遺伝子コールは、AUGUSTUS v2.4
60
およびSNAP
61
188遺伝子のトレーニングセットを用いた。最終的な遺伝子セットは手動でキュレーションした。遺伝子アノテーションは、相同性（BLASTx
62
)、InterProScan v5.21-60.0に基づいて割り当てられた、
63
TMHMM v2.0c、
64
SignalP v4.1、
65
ModPred、
66
RfamScan v1.1.1、
67
RepeatModeler v1.0.4、
68
LTRfinder v1.0.5、
69
およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)
95
GhostKoala を用いてタンパク質配列にアノテーションを付与した。
96
およびBLAST2GO v4.1
70
また、KEGG Mapper - Reconstruct Pathwayを用いてKEGGパスウェイにマッピングした。アノテーションを補助するため、トランスクリプトームはTopHat v2.1.1を用いてコンティグにマッピングした。
71
C. burkhardaeのトランスクリプトーム配列決定とアセンブリー
ライブラリーの調製とシーケンシングはP. lacertaeと同様に行った。リードはTrinity v2.1.1を用いてアセンブルした。
72
細菌のコンタミネーションは、既知の細菌配列と98%以上の配列同一性を持つ配列をフィルターするために、kmer頻度のPCAを用いて除去した。
最初のトランスクリプトームには40,858のユニークな転写産物が含まれていた。polyAで選択されたとはいえ、異種細胞培養からの細菌性転写産物はアセンブリー中に頻繁に混入していた。原核生物転写物を除去するために、カフェテリア特異的シグネチャーを同定するためにkmer頻度を調べた。陽性転写産物セットには、ストラメノパイルにBLASTでトップヒットした配列が含まれ、配列同一性は40%以上であった。陰性転写産物セットには、細菌配列に対して95%以上の配列同一性を持つ転写産物が含まれた。Kmer頻度をこれらと他の全ての転写産物について計算し、主成分分析（PCA）を用いて分析した。その結果、陽性対照群と陰性対照群を明確に区別することができ、それに応じて残りの転写産物をすべて真核生物または原核生物に割り当てることができた（図S5）。陰性対照グループとクラスター化した11,633の転写産物は、BLAST親和性を手作業でチェックした後、取り除かれた。最終的なトランスクリプトームには28,952の転写産物が含まれ、BUSCOスコアは70.40%であった。
各データセットについて、完全性はBUSCO v1.1.1から計算された。
73
eukaryota_obd9 データセットを使用。
ゲノム解析
P.lacertaeとBlastocystisの遺伝子セットの比較解析はOrthoMCLを用いて行われ、遺伝子をオルソログクラスターに配列し、進化の保存と消失を調べた。各ゲノムにおいて遺伝子が獲得されたか、失われたか、あるいは保存されたかを確定するために、今回作成したC. burhardaeのトランスクリプトームを含む様々なstramenopileアウトグループとクラスター化した。スキャフォールド数とコンティグ数が少なく、N50値が高く、BUSCOスコアが高いゲノムアセンブリーを完全性の対象としている：また、Blastocystis sp. ST4 WR1、Blastocystis sp. ST7 Singapore isolate B、Pythium ultimum DAOM BR144、Phytophthora sojae P6497株、Saprolegnia diclina VS20、Ectocarpus siliculosus Ec32株、Thalassiosira pseudonana CCMP1335、Schizochytrium sp.トランスクリプトーム。すべてのゲノムとトランスクリプトームはNCBI Genomeからダウンロードした。OrthoMCL v2.0.9
74
all-v-allのBLASTでE-value閾値1e-5で相同遺伝子のクラスターを生成した。RBHや高スループット法を使用する場合、偽陽性や偽陰性の可能性があることは認識している。しかし、データセットのサイズを考えると、すべてのタンパク質の系統解析は不可能であった。特定の細胞システム解析の場合には、以下に述べるように系統解析を行った。
クラスターは、P. lacertae由来の配列が少なくとも1つ、Blastocystis亜型が少なくとも1つ、アウトグループ（C. burkhardaeを含む）が少なくとも1つ含まれていれば「保存されている」とみなされた。クラスターは、単一のゲノムからの配列のみを含む場合、「種特異的」であった（両方の亜型からの代表的な配列を含む可能性のあるBlastocystisを除く）。クラスターは、すべてのBlastocystisゲノムには存在しないが、P. lacertaeと少なくとも1つの他のstramenopileの両方に存在する場合、Blastocystisゲノムからの損失を表すと考えられた。
P. lacertaeの種特異的クラスターを確認し、コンタミネーションを除外するために、いくつかのポイントを考慮した。P. lacertae特異的と推定される遺伝子の18,425個（89.8%）は、保存されたstramenopile遺伝子と連続している。さらに、保存遺伝子座に物理的に連結していない残りの推定種特異的遺伝子は、コドン使用法や予測アミノ酸組成が保存遺伝子と有意に異ならないことから（t検定、p>0.3）、本物のコード配列であることが示された。その代わりに、78.8%はBLASTpを用いて既知のタンパク質と相同性を示さず、相同性を示す遺伝子の中でも平均配列同一性は低く（30.1%）、87%を超えない。したがって、P. lacertae特異的遺伝子の割合が高いのは、これまでのストラメノパイルのゲノムサンプリングが不十分であったことを反映していると考えられる。
このようにして遺伝子クラスターを分離した後、KEGGmapperツールを用いてKEGGオルソロジー（KO）用語を遺伝子に関連付けた。P.lacertaeまたはBlastocystisの保存遺伝子および遺伝子欠損のそれぞれにおいて観察された各KO項の発現率を、全ゲノムにおける頻度から予想される発現率と比較し、ボンフェローニ補正を用いた超幾何学的検定を適用して、有意な過少または過剰発現を示すKO項を同定した。有意に濃縮されたジーンオントロジー（GO）用語を同定するために、BLASTpを用いてP. lacertaeまたはBlastocystis遺伝子のヒト相同遺伝子をconservedおよびlossカテゴリーで同定し、GOnetを用いてFishers exact検定とBenjamini補正を用いてバックグラウンドのヒトジーンオントロジーと比較した。
細胞システムの情報解析
鞭毛補体
Judelson et al.
25
は以前、多様な真核生物における1,000を超える運動関連タンパク質の分布を調査した。その結果、すべての鞭毛真核生物間で保存されている16のタンパク質が同定された。これらのタンパク質のヒト相同体（トリパノソーマには存在しないことが判明した膜貫通型O-メチルトランスフェラーゼLRTOMTを除く）を、ブラストシスチスや他の生物に対するBLASTp検索のクエリーとして用いた： BBS4（Bardet-Biedl syndrome 4 protein; NP_149017.2）; BBS5（Bardet-Biedl syndrome 5 protein; NP_689597.1）; TTC8（Tetratricopeptide repeat domain 8; NP_938051.1）; CFAP20（Cilia- and flagella-associated protein 20; NP_037374. 1); DAW1 (Dynein assembly factor with WDR repeat domains 1; NP_849143.1); DYNC1I2 (Cytoplasmic dynein 1 intermediate chain 2; NP_0012587.1); DRC3 (Dynein regulatory complex subunit 3; NP_001123563.1); CLUAP1 (Clusterin-associated protein 1; NP_0013173. 1); AGBL3 (Cytosolic carboxypeptidase 3; XP_0168676.1); KIF3C (Kinesin-like protein KIF3C; NP_002245.4); IFT22 (Intraflagellar transport protein 22; NP_073614.1); IFT52 (Intraflagellar transport protein 52; NP_057088. 2); IFT57 (Intraflagellar transport protein 57; NP_060480.1); IFT88 (Intraflagellar transport protein 88; NP_001340501.1); SPAG6 (Sperm-associated antigen 6; NP_036575.1); and RIBC2 (RIB43A-like with coiled-coils protein 2; NP_056468.1)。
遺伝子セットは、様々な親和性を持つ5つの鞭毛虫生物[Homo sapiens (GRCh38)、Trypanosoma brucei strain TREU927 (TryBru_Apr2005_chr11)、Tetrahymena thermophila (JCVI-TTA1-2.2)、Chlamydomonas reinhardtii (v5.5)、Naegleria gruberi strain NEG-M (v1. 0)]から得られた。 0））、3種の鞭毛化しない生物（Schizosaccharomyces pombe（ASM294v2）、Ostreococcus lucimarinus（ASM9206v1）、Hyaloperonospora arabidopsidis（HyaAraEmoy2_2. 0）］、さらに本研究で作製したP. lacertaeゲノムとC. burkhardaeトランスクリプトーム、最後にBlastocystis hominis strain Singapore B (sub-type 7)ゲノム（ASM15166v1）。
ヒトゲノムクエリーと非ヒトゲノム中の対象タンパク質のBLASTpによる相互ベストマッチは、後者にオルソログが「存在する」ことを確認するために必要であった。逆比較でベストマッチしなかった相同配列は非オルトログとみなされ、クエリータンパク質は「存在しない」と記録された。KIF3Cはキネシン様タンパク質であり、ヒトゲノムなどでは複数コピー見つかっている（図S1A）が、鞭毛以外の3つの生物では見つかっており、微小管ベースの前向転移因子で、おそらく運動性とは無関係な複数の機能を持つ。他の鞭毛タンパク質とのBLASTpマッチがBlastocystisで見つかった（例えば、細胞質ダイニンDYNC1I2、ダイニン調節複合体サブユニット3、DRC3、鞭毛内輸送タンパク質22、IFT22）。例えば、ブラストシスチス（Blastocystis）タンパク質はDRC3と相同であったが、鞭毛藻類における真のオルソログの典型的な500アミノ酸以上ではなく、72アミノ酸スパンのみであった。したがって、これらの部分的なヒットは、そうでなければ関連性のないタンパク質が共有する相同ドメインによるものであると結論した。
同定されたP. lacertaeの13タンパク質とC. burkhardaeの9タンパク質について、系統解析（図S2）を行った結果、P. lacertaeまたはC. burkhardaeのホモログに対する遺伝的距離は、他の鞭毛虫種のオルソログと一致することが示された。P.lacertaeまたはC.burkhardaeタンパク質と他の鞭毛藻類からのマッチングのオーソロジーを可視化するために、各クエリータンパク質のアライメントから最尤系統樹を推定した。系統樹はPhyML
75
を用いて推定した。ツリーサーチのデフォルト設定を採用し、ノードの頑健性を評価するために100のノンパラメトリックブートストラップレプリケートを適用した。ブラストシスチス遺伝子セットの最初のスクリーニングにヒトタンパク質配列を用いたこと、ブラストシスチスとヒトは大きな系統学的距離で隔てられていることを考慮すると、ブラストシスチスに保存されたべん毛タンパク質遺伝子がないことは、代わりにProteromonas/Cafeteriaのオルソログを検索クエリーとして用いても変わらないことに注意されたい。表S1（黄色の網掛け）で遺伝子名を照合すると、OrthoMCLではブラストシスチスのオルソログは同定されなかったが、KIF3Cのパラログは存在した。
我々は、以前に作成された鞭毛関連タンパク質の大規模データセット
30
を用いた（表S4A-S4F）。このデータセットには、鞭毛での作用が示唆されているが、必ずしもこのオルガネラに限定されるわけではない592個のタンパク質が含まれていたため、目的の構造で限定的に作用する有力な候補を同定することを目的として、一連のバイオインフォマティックフィルターを行った。データセットはまず、陰性対照としてブラストシスチスゲノムに対して検索された。ブラストシスチスに存在するタンパク質は、他の細胞プロセスで作用している可能性が高いとして取り除かれた。得られた236個のタンパク質データセットを、ストラメノパイルゲノムとトランスクリプトームのキュレーションされたデータセットに対して検索した。全236個のタンパク質はAMOEBAEバイオインフォマティックワークフローで検索された。
76
このワークフローは、予測されたタンパク質とヌクレオチドコンティグに対する BLAST 解析、および HMMer 解析を組み込んだもので、相互ベストヒット e-value カットオフを適用している。
鞭毛にのみ作用すると思われるタンパク質の選択性を高めるために、ゲノムやトランスクリプトームに含まれる偽陰性の可能性を考慮し、棘状鞭毛を持つ11種の生物のうち7種に存在するが、鞭毛を持たないP. tricornutumには存在しないタンパク質を同定するために、得られたデータセットをフィルタリングした。その結果、鞭毛に関連するタンパク質として既にアノテーションされている37種類（ダイニン、キネシン、IFT、ラジアルスポーク、鞭毛）と、保存されている未知のタンパク質54種類を含む116種類の候補が得られた。マスティゴネームの候補タンパク質を同定するため、これらの116個のタンパク質にフィルターをかけ、Halocafeteria seosinensisのトランスクリプトームとゲノムを合わせたデータセットに欠損しているタンパク質を同定した。このような37のタンパク質のうち、棘状鞭毛を持たない3つの生物（P. lacertae、H. seosinensis）すべてで欠損していたのは7つだけであった、
32
およびIncisomonas marina
31
)、残りの大部分はP. lacertaeでは存在するが、他の2つでは欠損していた。
鞭毛と鞭毛虫の候補タンパク質のリストは、冗長な細胞機能や局在を持つ可能性のあるタンパク質を除外しているため、意図的に網羅的ではないことを再確認する価値がある。例えば、以前に報告された592個のべん毛関連タンパク質のうち、わずか236個しかない、
30
が保持された。鞭毛を失った分類群におけるこれらのタンパク質の存在は、鞭毛機能の乱れや冗長性を強く示唆するからである。同様に、3つの既知のマスティゴネーム関連タンパク質は、H. seosinensisに存在するため、我々のフィルターで拒絶された。このことはともかく、我々の解析によって、37の候補タンパク質リストができあがった。さらに、このような候補タンパク質の30/37がP. lacteraeには存在するが、他の2つの非チン角類には存在しないという事実は、体細胞膜とマスティゴネームの間の相同性という仮説と一致する。
膜輸送タンパク質
以前にPhytophthora sojaeで同定されたRabs
34
で同定されたRabsは、それぞれPytophthora sojaeの予測タンパク質およびトランスクリプトームに対するBLASTpおよびtBLASTn検索のクエリーとなった。E-valueの閾値1e-04を超えるヒットはすべて、自作のGTPaseデータベースとNCBI nonredundant databaseとの逆BLASTにかけられた。少なくとも1つのデータベースの逆引き検索でRabが最良のブラストヒットとなったもの（図S1B）のみを、以前の解析からデータセットに加えた。
34
RabsはMAFFT v7.458を用いてアラインメントした。
77
L-INS-I戦略で最大1,000回繰り返し、アライメント不良の位置はtrimAl v1.4で除去した。
78
gt 0.5 オプションを用いて除去した。LG+C20+F+Gモデル、事後平均部位頻度法を用いて最尤樹（Data S1）を推定した、
97
IQ-TREE v1.6.12のLG+F+Gガイドツリーを用いた。
79
1,000ブートストラップレプリケートによる "徹底的な "最尤探索による迅速なブートストラップ戦略が採用された。
相同性検索は、P. lacertae の膜輸送遺伝子（図 S3）とペルオキシソーム生合成遺伝子を同定するために用いられた。ヒトおよび酵母の機能的に特徴付けられた遺伝子をBLASTp検索のクエリー配列として使用し、E値が0.05未満で検索された配列をクエリー生物のゲノム検索に使用した。クエリー配列または明確なオルソログがE値0.05未満のトップヒットとして同定されなければ、その候補は真の相同遺伝子とみなされない。BLASTpでホモログが同定できなかった場合は、tBLASTnを用いてゲノムを検索した。さらに、P. lacertaeではなく、Blastocystis sp.や他の近縁種でホモログが同定されたことがある場合は、その配列をBLASTpまたはtBLASTnクエリーとして使用した。HMMER v3.1b1
80
検索は、先にリストした配列を用いて、分岐の激しいTSETホモログを同定するために行った。
98
高度にパラロガスなタンパク質ファミリーについては、系統学によってオーソロジーを確認した（Data S2）。配列はMUSCLE v3.8.31を用いてアライメントした、
81
Mesquite v3.03を用いて可視化した、
82
配列はMUSCLE v3.8.31を用いてアラインメントされ、Mesquite v3.03を用いて可視化された。マスクされたアラインメントはリクエストに応じて入手可能。ProtTest v3.4
83
は配列進化のベストフィットモデルを決定するために使用された。PhyloBayes v3.3
84
,
85
,
86
および MrBayes v3.2.2
87
,
88
は系統のベイズ推定に、RAxML v8.1.3
89
を使用した。PhyloBayesは、すべての二分割で観察される最大の不一致が0.11未満になり、少なくとも100サンプリングポイントが達成されるまで実行され、MrBayesは、2つの独立した実行（それぞれ2連鎖）の分割頻度の平均標準偏差が0.01未満になるまで、1,000世代ごとにサンプリングしながら、最低100万MCMC世代の木空間を探索するために使用された。コンセンサスツリーは、それぞれのケースで尤度プラトーを大きく上回る25%のバーンイン値を用いて生成された。RAxMLは100偽複製で実行した。
ペルオキシソームタンパク質
KEGGパスウェイ(04146)のThalassiosira pseudonanaおよびPhytophthora sojae由来のペルオキシンは、C. burkhardaeのトランスクリプトームアセンブリに対するtBLASTn検索のクエリーとなった。C.burkhardaeの配列は、P. lacertaeおよびBlastocystisの予測タンパク質および/またはゲノムを検索するためのクエリーとなった。見つかったタンパク質のドメインはInterProScanで同定した。
63
Geneious Prime v2020.2.5に実装されている。
99
ホモサピエンスおよびPhytophthora ramorumのPex配列（NCBIタンパク質データベースからダウンロード；最終アクセスは16.8.2022）は、AMOEBAEワークフローによるストラメノパイルズゲノムおよびトランスクリプトームの選択検索におけるクエリーとして使用した。
76
ペルオキシソーム標的シグナル1（PTS1）と2（PTS2）は、[SAC]-[KRHQ]-[LM]$と定義した。
100
and ˆx{2,22}-[R]-[LIVQ]-xx-[LIVQH]-[LSGA]-x-[HQ]-[LA],
101
をそれぞれ示す。PTS1またはPTS2を持つタンパク質は、社内のPythonスクリプト(https://github.com/kikinocka/ngs/blob/master/py_scripts/pts_search.py)とNCBI nonredundantデータベースに対するBLASTp検索によってP. lacertaeで同定された。ミトコンドリア予測はTargetP-2.0で評価した。
90
およびNommPred
91
により評価した。
Geneious Prime v2020.2.5の組み込みアライナーを用いて、選択した真核生物のPex19配列をアライメントした。Pichia pastorisのPex3およびPex10結合ドメインに対応する領域
102
のPex3およびPex10結合ドメインに対応する領域をアライメントから抽出し、同一性の割合を同一残基の割合として直接同定した。
ミトコンドリアと代謝の予測
P. lacertaeのミトコンドリア補体および代謝酵素は、相互BLAST検索を用いてアノテーションした。簡単に説明すると、H. sapiens、Mus musculus、Arabidopsis thaliana、Saccharomyces cerevisiae、Trypanosoma brucei、Giardia lambliaおよびBlastocystis ST1のミトコンドリアプロテオームを、P. lacertaeプロテオームに対するBLAST検索のクエリーとして使用した。次に、推定されるオルソログ候補を、それぞれの生物のプロテオーム全体に対する相互BLAST検索のクエリーとして使用した。比較スクリプトを使用して、真のヒットについて2つの出力を比較した。それぞれの正合致をまとめ、コンセンサスアノテーションを割り当てた。
アノテーションが正しいことを確認するために、BLASTとアラインメントツールを用いて、目的の遺伝子をさらに検証した。このアプローチにより、1,100の遺伝子がミトコンドリアの可能性があると同定された。微生物の嫌気性真核生物に由来する既知の嫌気性酵素のリストが個別にキュレーションされ（Pfamドメインの長さと位置）、予測される代謝経路の構築に使用された。
顕微鏡観察
抗体作製
Pex10 (PIPex10_16-30-2111130-KHL-MBS; H-CNN KIS RKR KHV DDD M)とPXMP2 (Plac_PXMP2-2010476-KLH-MBS; C+KLIERNKSFDKRRSF)のペプチドは、予測されたタンパク質に基づいてEurogentec (ベルギー)によりデザインされ、それぞれ2匹のラットと1匹のウサギについてMini Speedy Program (28日間)を用いて抗体を作製した。
培地と最終ブリードをElisaを用いて検査した（1動物/プレート、2Ag/プレート）。1匹の動物から得たPXMP2抗血清も精製した。
Pex19の実験には2種類の異種抗体を用いた：
1.
H. sapiens抗Pex19ウサギポリクローナル抗体（ProteinTech Europe; 14713-1-AP）。
2.
A. thaliana 抗Pex19ウサギポリクローナル抗体
41
Bonnie Bartel 教授の好意により提供された。
透過型および免疫電子顕微鏡観察
P. lacertae培養（継代後4～10日目）3チューブを800 x gで10分間、室温でペレット化した。上清を捨て、各ペレットを100 mMカコジル酸ナトリウム（Sigma Aldrich）緩衝液pH7.2中2.5 %グルタルアルデヒド（Sigma Aldrich）2 mlに懸濁し、室温で2時間放置して固定した。固定後、サンプルを1,900 x gで2分間ペレット化し、カコジル酸緩衝液で10分間2回洗浄して固定液を除去した。ペレット化後、緩衝液を捨て、ペレットを500μlの同じ緩衝液に懸濁し、その後50μlを別のチューブに移し、55℃の湯浴で5分間温めた。50μlの3％低融点アガロースを細胞に加え、ガラスピペットを使って、混合物をあらかじめ作っておいたガスケット（ゲルが薄い層を形成するように、プラスチックを切って2枚のスライドガラスで挟み、クランプで固定したもの）に素早く移し、ゲルが固まるまで4℃で5～10分間保存した。冷蔵庫から取り出したゲルを非常に薄く切り、0.1%酢酸染料Alcain blueの滴に移し、曲げた爪楊枝を使って染料から静かに取り除き、余分な染料を取り除くために3mlの緩衝液に入れた。ガラスピペットを用いて緩衝液を除去し、ゲルの断片を除去しないように注意した。1-1.5mlのOsO4（1mlの4％OsO4、1mlのミリQ水、2mlの200mMカコジル酸緩衝液から調製）を加え、サンプルを室温で1時間放置した。この後、OsO4を捨て、試料を50％エタノールで10分間洗浄した後、70％エタノール中で4℃、一晩放置した。
翌日、サンプルを90％エタノールで1回洗浄し、100％エタノールで3回洗浄した。この洗浄工程の後、エタノールを捨て、断片を3mlのプロピレンオキシドで2回洗浄した。これを除去し、50％プロピレンオキシド／50％低粘度（LV）樹脂（LV樹脂12g、VH1硬化剤4g、VH2硬化剤9g、LV促進剤0.63g）を加え、室温で30分間放置した。50/50ミックスを除去し、100%LV樹脂混合物を加え、90分間放置した。この後、10-12個の断片を新鮮なLVに移し、さらに90分間放置した。パスツールピペットを用いて、6mlのLV樹脂を小さな型に入れ、断片を型の端から少し離れたところに置き、曲げたつまようじを使って静かに底に押し込んだ。その後、60℃のオーブンに20～24時間入れ、切片作製に備えた。切片化するには、細胞が最も集中しているところで型を切り（光学顕微鏡検査に従う）、ヤスリで削ったブランクの樹脂カプセルに重ね合わせ、ガラスナイフでカプセルの縁を切り取って型を浮き上がらせたままにした。ナイフの背面にはボートがあり、ミリQ水で満たされていた。自動ナイフは、ブロックから非常に薄い（厚さ数ミクロン）スライスを切り出すのに使われた。それを膨張させるために、クロロホルムの蒸気にさらした。十分な枚数が集まると、およそ7枚のスライスがプラスチックでコーティングされた溝に取り付けられた。
染色するために、ラベルを貼った長方形のデンタルワックスをミリQ水で覆い、パラフィルムで密封した。それぞれのカラムの上部に4.5％の酢酸ウラニルを一滴、その下にミリQ水を一滴、さらにその下にもう一滴滴下した。スロットグリッドを酢酸ウラニルの上に置き、45分間染色した後、ミリQで静かに洗浄し、ミリQの滴の上に置き、これを繰り返した。ろ紙で乾燥させた。パラフィルムで包んだワックスの別のグリッドに、酢酸鉛1滴の下にミリQを2滴置いた（この容器では、空間は水酸化カリウムで満たされていた）。スロットグリッドを鉛の中に7分間置き、1滴目、2滴目のミリQに移し、ろ紙の上で乾燥させた後、ライトの下でしばらく放置した（鉗子で空中に保ったまま）。
免疫電子顕微鏡（IEM）のために、吸引したP. lacertaeの培養液を、4％ホルムアルデヒドを含む新しく調製したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で1時間固定し、その後PBSで数回洗浄した。IEMサンプルをLR白色樹脂（Agar Scientific）に懸濁した。樹脂の浸透は、サンプルを真空中に2分間置くことで助けた。その後、樹脂を吸引して新鮮な樹脂と交換し、試料をゼラチン（Agar Scientific社製）カプセルに移し、あらかじめ温めた60℃のオーブンで15時間固めた。固まったブロックは研磨され、その後ウルトラミクロトームで70μmの厚さで切片化され、金のEMグリッド上に1グリッドあたり約5切片で置かれた。IEMグリッドの免疫染色は加湿室で行った。サンプルのブロッキングは、0.05% Tween 20を加えたPBS中2%ウシ血清アルブミンで1時間インキュベートすることで行った。一次抗体の結合は、Pex19抗体を3倍希釈（1:10、1:20、1:50）し、8℃で15時間インキュベートすることで行った。その後、IEMグリッドを対応する金標識二次抗体とともに室温で30分間インキュベートした。PBS中4.5%酢酸ウラニルで15分間インキュベートし、クエン酸レイノルド鉛で2分間インキュベートすることにより、カウンター染色を行った。
TEMとIEMのグリッドはいずれも、80 kVで作動するJeol 1230透過電子顕微鏡で撮像し、画像はGatan One viewデジタルカメラで撮影した。
走査型電子顕微鏡（SEM）
BlastocystisおよびP. lacertaeの標本は、培養物から走査型電子顕微鏡（SEM）用に調製した（Blastocystis：Betts et al.
103
P.lacertae：LYI-S-2培地＋成体ウシ血清でのaxenic培養）。検体は、ピペットで培養チューブから手作りのバスケット［1,000μlのピペットチップの上端を5μmのポリカーボネート製メンブレンフィルター（ミリポア社製）にシリコンで固定］に移し、PBSで満たした12ウェル培養プレートに入れた。Whatman No.1ろ紙をウェルプレートの蓋に取り付け、4%(w/v)のOsO4で飽和させた。ウェルプレートの蓋を閉め、暗所で30分間OsO4蒸気によって標本を固定した。4%(w/v)のOsO4 5滴をバスケットに直接加え、さらに30分間固定した。フィルターを水で洗浄し、段階的にエタノールを加えて脱水した。フィルターをCO2で臨界点乾燥し、支柱に取り付け、5 nmの白金でスパッタコーティングし、走査型電子顕微鏡Hitachi S-4300 (Hitachi, Tokyo, Japan)で観察した。
免疫蛍光顕微鏡観察
P. lacertaeの培養液を15 mlチューブに移し、800 x gで8分間ペレット化した。培地を捨て、細胞を2nMのMitoTracker Red CMXRos（Invitrogen；任意）と20分間インキュベートした後、2%ホルムアルデヒドで20分間固定し、次いで1×PBS中0.1% Triton-Xで10分間透過処理した。その後、細胞をポリ-L-リジン（Sigma-Aldrich）コットスライドに分注し、2時間放置した。1×PBS中5％脱脂乳で1時間ブロッキングした後、ウサギ抗Pex19（1:200）および／またはウサギ抗PXMP2（1:400）抗血清、および／またはラット抗Pex10（1:200）またはラット抗BhSufCB（1:100）でプローブした。
104
). 二次抗体のAlexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG（H-L）、Alexa Fluor 488標識ニワトリ抗ラットIgG、およびAlexa Fluor 594標識ロバ抗ラットIgG（Molecular Probes）を1:1,000の希釈で使用した。細胞をDAPI含有抗フェードマウント試薬（Vectashield）でマウントし、レーザー走査型Zeiss LSM 880共焦点顕微鏡のAiryscanイメージングモードを用いて観察した。画像は共焦点顕微鏡用のZeiss Zen Blackソフトウェアを用いて収集し、ImageJで処理した。3D画像処理にはZen Blueソフトウェアを使用した。
タンパク質抽出とウェスタンブロッティング
完全に生育したP. lacertae培養物2個を15mlチューブに入れ、1,000 x gで10分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを合わせて8mlのPBSに懸濁し、1mlのDNAase/RNAase mix（50mM MgCl2、0.5M Tris-HCl pH7.0）と10μlのEDTAフリーのプロテアーゼインヒビターを加えた。混合物を再度1,000 x gで10分間ペレット化した。上清を捨て、ペレットを500μlのPBS/10% DNAase/RNAase mixに懸濁し、10μlのプロテアーゼ阻害剤を加えた。サンプルを1.5 mlチューブに移し、4,500 x gで2分間遠心した。上清を捨て、ペレットを400μlの4×Laemmli Protein Sample Buffer (Biorad)に懸濁し、細いシリンジに通した。サンプルを95℃で5分間煮沸した。沸騰後、サンプルを12,000 x gで3分間ペレット化し、使用するまで-20℃で保存した。
4×Laemmli Protein Sample Buffer（Biorad）に懸濁したP. lacertaeの全タンパク質抽出物を95℃で5分間加熱し、15μlを12％SDS-PAGEゲルにロードしてタンパク質を分離した。免疫ブロッティングのために、タンパク質を0.2 μm PVDF膜に電気泳動した。膜はブロッキングバッファー（1×TBS-Tバッファー［8.76g NaCl、6.06g Tris、0.1%(v/v) Tween 20、pH 7.6］中の5%(w/v) 脱脂乳）で室温で1時間ブロッキングした。抗Pex10および抗PXMP2血清（1:200および1:500）、ならびに抗Pex19および抗PXMP2精製抗体（1:200）の希釈液をブロッキングバッファーで調製し、4℃で一晩メンブレンとインキュベートした。膜を1×TBS-Tバッファーで3回洗浄した後、適切なHRP標識二次抗体（PXMP2とPex19は抗ウサギ、Pex10は抗ラット）を1:10,000希釈で加えた。1×TBS-Tでもう1回洗浄した後、メンブレンを既述のECL試薬を用いて現像した。
59
定量と統計解析
Pex19のPex3およびPex10結合ドメインの平均同一性は、Microsoft ExcelのAVERAGE関数で計算した。P. lacertaeとC. burkhardaeについては、他の生物との同一性％のみを考慮し、お互いを除外した。残りの生物については、生物間の%同一性を考慮した。
IEMについては、ImageJ（v1.51）ソフトウェアを用いて、生成された各画像をグリッドに分割し、その後、μm2あたりの金粒子を手動で定量した。プロットはMicrosoft Excel for Mac（v16.72）を用いて作成した。各プロットは、コンパートメントごとのμm2あたりの金粒子の平均を表し、エラーバーは計算された標準偏差（SD）を示す。
データとコード

生リードとアセンブリーはNCBIに寄託されており、公開日現在入手可能。アクセッション番号はkey resources tableに記載。本論文ではオリジナルコードは報告していない。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要請があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
著者らは、Andrew Roger（ダルハウジー大学）、Marek Eliáš（オストラヴァ大学）、Alastair Simpson（ダルハウジー大学）、Ida van der Klei（フローニンゲン大学）の有益な議論と長期にわたる協力に感謝したい。本研究は、Vanier Canada Graduate Scholarship（E.K.H.へ）、Gordon and Betty Moore Foundation（S.R.へGBMF9327）、Norwegian Research Council（M.v.d.G.へ301170）、Leverhulme Trust Project（M.v.d.G.へ301170）の支援を受けた。 )、Leverhulme Trust Project Grant (RPG-2014-005 to A.P.J.)、Interreg-2-seas H4DC grant (to A.D.T.)、Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RES0043758 and RES0046091 to J.B.D.)。本研究はさらに、英国王立協会国際交流助成金（2015/R1-IE150049、A.D.T.とJ.B.D.に共同）からも助成を受けた。計算資源は、チェコ共和国教育・青年・スポーツ省の支援を受けたe-INFRA CZプロジェクト（ID: 90140）から提供された。透過型電子顕微鏡から得られた画像を用いて、プロテロモナス細胞の3次元（3D）モデルの再構築を手伝ってくれたオックスフォード・ブルックス大学のSue VaughanとTimm Mohrに感謝する。
著者貢献
概念化、M.v.d.G.、C.G.C.、A.P.J.、J.B.D.、A.D.T.、データキュレーション、A.P.J.、J.B.D.、A.D.T.、形式解析、調査、結果解釈、K.Z、 R.S.L.、C.J.W.、D.C.、E.K.H.、L.Y.、C.A.R.、Y.P.、I.R.B.、S.R.、N.L.B.、J.T.、E.L.B.、M.v.d.G.、A.P.J.、J.B.D.、A.D.T.、資金獲得、M.v.d.G、 C.G.C.、A.P.J.、プロジェクト管理、A.P.J.、J.B.D.、A.D.T.、監督、S.R.、E.G.、A.P.J.、J.B.D.、A.D.T.、可視化、K.Z、視覚化、K.Z.、D.C.、S.R.、A.D.T.、役割・執筆-原案、K.Z.、R.S.L.、A.P.J.、J.B.D.、A.D.T.、執筆-校閲・編集、全著者。執筆-校閲・編集、全著者。全著者が最終版原稿を見て承認した。
利害関係
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
補足情報
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ドキュメントS1. 図S1-S5
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表S1. 図2AおよびSTAR Methodsに関連するオルソグループ
P. lacertae (P)由来の高信頼性遺伝子は、Blastocystis ST4およびST7 (B)、Cafeteria (C)および6つのstramenopileアウトグループゲノムまたはトランスクリプトーム (OG)由来の遺伝子セットとクラスター化されている。OrthoMCL解析により、遺伝子は系統学的分布を示す様々なカテゴリーに分類された。
(A) P. lacertaeとBlastocystisの遺伝子のうち、保存されているもの（オレンジ）、ストラメノパイルの祖先と比較して失われたもの（それぞれ緑／紫）、あるいは種特異的なもの（灰色）の総数。
(BとC）保存されたオルソグループ。
(D-F）ブラストシスチスで失われたオルソグループ。
(G-I) P. lacertaeで失われたオルソグループ。
(J）P.lacertaeおよびBlastocystisに特異的なオルソグループ。
(K) P. lacertaeとBlastocystisの両方で失われたオルソグループ。
(L-O) 種特異的オルソグループ。
(P）様々なアウトグループで保存されているオルソグループ。
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表S2. 図2Aに関連するKO用語とGO用語
(AおよびB) (A)KO用語および(B)GO用語。
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表S3. 図3-5およびSTAR Methodsに関連する比較ゲノム1
(A-D) (A)べん毛タンパク質、(B)膜輸送タンパク質、(C)ペルオキシソームタンパク質、(D)代謝レパートリーの比較ゲノム。
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表S4. 図2B、3、4およびSTAR Methodsに関連する比較ゲノム2
鞭毛虫（A-F）とペルオキシソーム（G）のストラメノパイル間の比較ゲノム解析。
(A) Blastocystisにおける592の推定べん毛タンパク質のAMOEBAE検索の結果。
(B)Blastocystisでは同定されなかった236の推定鞭毛タンパク質について、ストラメノパイルのゲノムまたはトランスクリプトームを選択してAMOEBAE検索した結果。
(C) 腺胞における(B)の236個のタンパク質の有無。鞭毛タンパク質の数はN列に示す。
(D) (C)の116個のタンパク質の有無。鞭毛を持つストラメノパイルの大部分には見られるが、ブラストシスチスとP. tricornutumには見られない。
(E)37個のマスティゴネム／ソマトネム関連候補の有無。
(F）マスティゴネムのみの候補の有無。
(G）ペルオキシンのストラメノパイルゲノムまたはトランスクリプトームの選択におけるAMOEBAE検索の結果。
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表S5. 図3-5に関連するP. lacertaeのペルオキシソーム標的シグナル（PTS）が同定されたタンパク質
PTSが同定されたタンパク質は、NCBI nonredundant databaseに対する最良のBLASTヒット（BBH）とともにまとめられている。
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表S6. 図3-5に関連するペルオキシソームタンパク質とミトコンドリアタンパク質の一次配列解析
(AおよびB）Pex19のPex3（A）およびPex10（B）バイディング領域の配列保存、（B）様々な生物由来のPex19タンパク質の転写後修飾、（C）ペルオキシソームまたはミトコンドリアタンパク質の局在の情報学的予測。
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データS1. 図S1BとSTAR Methodsに関連するP. lacertaeに存在するRabsの進化的関係
(A-D) (A)最尤系統樹はLG+C20+F+Γモデルのもと、超高速ブートストラップで推定した。支持率は75％以上の場合に示されている。鞭毛に関連するRabsは淡青色のボックスでハイライトされている。いくつかのP. lacertaeとBlastocystis配列はこの系統樹で同定できなかった（灰色の斜線ボックス）ので、より小さなRabクレードの系統樹（B-D）も示している。アスタリスクは、明確に割り当てられなかったRabを示す。
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データS2. 図S3およびSTAR Methodsに関連するヘテロ4量体アダプターコート複合体サブユニットの系統解析
(A-E)(A)大ベータ、(B)大EGADZ、(C)中、(D)小、(E)βプロペラ-αソレノイド。すべての図において、MrBayesトポロジーが示され、その上にPhyloBayesとRAxML解析による支持値がオーバーレイされている。サポート値はクリティカルノードについて示し、それ以外は挿入図として置き換えている。
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論文で見る
スコープス (140)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
レ・T.
Žárský V.
Nývltová E.
ラダ P.
ハラント K.
ヴァンコヴァ M.
ヴェルナー Z.
フルディ I.
Tachezy J.
Mastigamoeba balamuthiの嫌気性ペルオキシソーム。
Proc. Natl. Sci. USA. 2020; 117: 2065-2075
論文で見る
スコープス (12)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヴァーナー Z.
ŽárskýV。
ルT.
ナラヤナサミーR.K.
ラダ P.
ロズベスキー D.
マッキ A.
ベリショバ D.
Hrdý I.
Vancová M.
ほか
Entamoeba histolyticaの嫌気性ペルオキシソームはミオイノシトールを代謝する。
PLoS Pathog. 2021; 17e1010041
論文で見る
麹菌
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ザホノヴァー K．
トレイトリS.C.
Le T.
シュコドヴァー・スヴェラーコヴァー I.
ハヌスコヴァー P.
チェピチュカ I.
タチェジ J.
ハンプル V.
単細胞ゲノム解析から明らかになった、自由生活アメーバPelomyxa schiedtiにおけるミトコンドリアとペルオキシソームの嫌気性誘導体。
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論文で見る
スコパス (4)
PubMed
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グーグル奨学生
ムーグD.
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アピコンプレキサンの寄生虫Toxoplasma gondiiおよび他のコクシジウムにおけるペルオキシソームの存在に関するゲノムおよびプロテオミクス的証拠。
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論文で見る
スコープス (13)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リオ・バルトゥロスC.R.
ロジャースM.B.
ウィリアムズT.A.
ゲンテカキ E.
ブリンクマン H.
セルフ R.
リオー M.F.
ヘール A.B.
ヤレット N.R.
グルーバーA.
他
真核生物の主要系統におけるミトコンドリアの解糖系。
Genome Biol. Evol. 2018; 10: 2310-2325
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スコープス (30)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ガルグ S.
シュテルティングJ.
ジモルスキーV.
ラダP.
タチェジーJ.
マーティン W.F.
グールド S.B.
ミトコンドリアおよびヒドロゲノソームマトリックスへのトランジットペプチド非依存性タンパク質輸入の保存。
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論文で見る
スコープス (38)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ペレス-ブロカルV.
クラーク C.G.
腸内寄生虫Blastocystisのミトコンドリオン様オルガネラの2つのゲノムの解析：完全配列、遺伝子含有量、ゲノム構成。
Mol. Biol. Evol. 2008; 25: 2475-2482
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筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シュテヒマンA.
ハンブリン K.
ペレス-ブロカルV.
ガストン D.
リッチモンド G.S.S.
ファン・デル・ギーゼン M.
クラーク C.G.
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ミトコンドリアとヒドロゲノソームの区別を曖昧にするブラストシスチスのオルガネラ。
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論文で見る
(133)を参照。
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
リチャードソン E.
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進化細胞生物学：「最も美しい無限の形」からの機能的洞察。
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論文で見る
スコープス (13)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ペレス-ブロカルV.
シャハール・ゴラン
クラーク C.G.
2つの大きな逆反復を持つ直鎖分子：線虫Proteromonas lacertaeのミトコンドリアゲノム。
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論文で見る
(22件)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ステアーズ C.W.
エメL.
ムニョス-ゴメスS.A.
コーエン A.
デレール G.
シェパード J.N.
フォーセット J.P.
ロジャー A.J.
真核微生物がロドキノン生合成に関与する遺伝子の水平獲得により低酸素環境に適応した。
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論文で見る
スコープス (33)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ツァウシスA.D.
ハンブリンK.A.
エリオットC.R.
ヤング L.
ロセル・イダルゴ A.
ゴーレイ C.W.
ムーア A.L.
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ヒト腸内常在菌Blastocystisは、複合体IIと代替オキシダーゼを用いて呼吸を行い、腸内の一時的な酸素変動を緩衝している。
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論文で見る
スコープス (18)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ツァウシスA.D.
オラニエ・ド・シュウデンスS.O.
ゲンテカキE.
ロング S.
ガストン D.
ステヒマン A．
ヴィネラ D．
パイ B.
フォンテカーブ M.
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他
嫌気性寄生虫BlastocystisにおけるFe/Sクラスター生合成の進化。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109: 10426-10431
論文で見る
スコープス (57)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ムルクD.D.
Cheng C.Y.
ルーチン免疫ブロッティングのための増強化学発光（ECL）：市販キットに代わる安価な方法。
Spermatogenesis. 2011; 1: 121-122
論文で見る
PubMed
クロス
グーグル奨学生
シュタンケ M.
シュタインカンプR.
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Augustus：真核生物の遺伝子検索用ウェブサーバー。
核酸研究 2004; 32: W309-W312
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筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Korf I.
新規ゲノムにおける遺伝子発見
BMC Bioinformatics. 2004; 5: 59
論文で見る
遺伝子発現
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
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ギッシュW.
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マイヤーズ E.W.
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基本的なローカルアライメント検索ツール。
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論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ズドブノフ E.M.
Apweiler R.
InterProScan - InterProのシグネチャー認識手法の統合プラットフォーム。
Bioinformatics. 2001; 17: 847-848
論文で見る
論文リスト(2187)
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
クローグ A.
ラーションB.
フォン・ヘインG.
ソンハマー E.L.
隠れマルコフモデルによる膜貫通タンパク質トポロジーの予測：完全ゲノムへの応用。
J. Mol. Biol.
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ベントセン・J.D.
ニールセン H.
フォン・ヘインG.
Brunak S.
シグナルペプチドの予測精度向上： SignalP 3.0.
J. Mol. Biol.
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ペジャバーV.
シューW.L.
シン F.
ダンカー A.K.
ユバースキー V.N.
Radivojac P.
翻訳後修飾の複数のイベントを受けるタンパク質の構造的および機能的シグネチャー。
タンパク質科学 2014; 23: 1077-1093
論文で見る
スコープス (255)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
グリフィス-ジョーンズ S.
Rfamを用いたノンコーディングRNAのアノテーション
Curr. Protoc. Bioinform. 2005; 33: 12.5.1-12.5.12
論文で見る
グーグル・スカラー
スミット A.
Hubley R.
RepeatModeler Open-1.0.
2010
http://www.repeatmasker.org
記事で見る
グーグル・スカラー
Xu Z.
Wang H.
LTR-FINDER：全長LTRレトロトランスポゾンの効率的予測ツール。
Nucleic Acids Res. 2007; 35: W265-W268
論文で見る
遺伝子発現
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
コネサ A.
ゲッツ S.
ガルシア-ゴメスJ.M.
テロール J.
タロン M.
Robles M.
Blast2GO：機能ゲノミクス研究におけるアノテーション、可視化、解析のための汎用ツール。
Bioinformatics. 2005; 21: 3674-3676
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
トラプネルC.
パクターL.
Salzberg S.L.
TopHat: RNA-seqによるスプライスジャンクションの発見。
Bioinformatics. 2009; 25: 1105-1111
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ハースB.J.
パパニコロウA.
ヤスールM.
グラバーM.
ブラッドP.D.
ボウデン J．
クーガー M.B.
エクルス D．
リー B．
リーバーM.
他。
Trinityプラットフォームを用いたRNA-seqからのde novo転写産物配列再構築によるリファレンス作成と解析。
Nat. Protoc. 2013; 8: 1494-1512
論文で見る
筑波大学
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
シマン F.A.
ウォーターハウスR.M.
イオアニディスP.
クリベンツェワ E.V.
ズドブノフ E.M.
BUSCO: シングルコピーオルソログによるゲノムアセンブリとアノテーションの完全性の評価。
Bioinformatics. 2015; 31: 3210-3212
論文で見る
スコープス (5810)
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
Li L.
ストッケルト C.J.
Roos D.S.
OrthoMCL：真核生物ゲノムのオルソロググループの同定。
ゲノム研究 2003; 13: 2178-2189
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ギンドン S.
デルサック F.
デュファヤールJ.F.
Gascuel O.
PhyMLによる最尤系統樹の推定。
Methods Mol. Biol.
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
バーロウL.D.
マチヨウスキーW.
モアK.
テリーK.
ヴァルゴヴァー R.
ザホノバ K.
ダックス J.B.
AMOEBAEを用いた進化細胞生物学のための比較ゲノム科学：ゴルジ体とその先の理解。
in： Wang Y. Lupashin V.V. Graham T.R. Golgi： Methods and Protocols. Springer, 2023: 431-452
論文で見る
Scopus (1)
クロスレフ
グーグル奨学生
加藤和彦
スタンドリーD.M.
MAFFTマルチプル配列アライメントソフトウェアバージョン7：パフォーマンスとユーザビリティの向上。
Mol. Biol. Evol. 2013; 30: 772-780
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
カペラ-グティエレス S．
シジャ＝マルティネスJ.M.
Gabaldón T.
大規模系統解析における自動アライメントトリミングツール。
Bioinformatics. 2009; 25: 1972-1973
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
グエン L.T.
シュミットH.A.
フォン・ヘーセラーA.
ミン B.Q.
IQ-TREE：最尤系統推定のための高速かつ効果的な確率的アルゴリズム。
Mol. Biol. Evol. 2015; 32: 268-274
論文で見る
スコープス (10967)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Eddy S.R.
プロファイルHMM検索の高速化。
PLoS Comput. Biol.
論文で見る
スコープス (3302)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
エドガー R.C.
MUSCLE：高精度・高スループットの多重配列アライメント
核酸研究 2004; 32: 1792-1797
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
マディソン W.P.
マディソン D.R.
Mesquite：進化解析のためのモジュラーシステム。
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https://www.mesquiteproject.org/
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グーグル・スカラー
ダリバ D.
タボアダ G.L.
ドアロ R.
Posada D.
ProtTest 3: タンパク質進化のベストフィットモデルの高速選択。
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論文で見る
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PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ラルティヨN.
フィリップH.
熱力学的積分を用いたベイズ因子の計算。
Syst. 2006; 55: 195-207
論文で見る
(448)スコープス(Scopus)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラルティヨN.
フィリップ H.
アミノ酸置換過程における部位間の不均一性に関するベイズ混合モデル。
Mol. Biol. Evol. 2004; 21: 1095-1109
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラルティヨN.
ブリンクマンH.
フィリップ H.
サイトヘテロジニアスモデルを用いた動物系統におけるロングブランチアトラクションアーティファクトの抑制。
BMC Evol. Biol.
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ロンキストF.
Huelsenbeck J.P.
MrBayes3：混合モデルによるベイズ系統推定。
Bioinformatics. 2003; 19: 1572-1574
論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ヘルゼンベックJ.P.
ロンキストF.
ニールセンR.
ボルバックJ.P.
系統のベイズ推定と進化生物学への影響。
Science. 2001; 294: 2310-2314
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Stamatakis A.
RAxMLバージョン8：系統解析と大規模系統のポスト解析のためのツール。
Bioinformatics. 2014; 30: 1312-1313
論文で見る
日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
アルマグロ・アルメンテロス J.J.
サルバトーレ M.
エマヌエルソンO.
ウィンターO.
フォン・ヘイネ G.
エロフソン A.
ニールセン H.
ディープラーニングを用いたターゲティングペプチドの配列シグナルの検出。
Life Sci. Alliance. 2019; 2e201900429
論文で見る
スコープス (331)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
久米健一
天笠剛
橋本哲也
北川博之
NommPred：非モデル生物のミトコンドリアおよびミトコンドリオン関連オルガネラタンパク質の予測。
Evol. Bioinform. Online. 2018; 14 (1176934318819835)
論文で見る
スコープ (10)
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グーグル奨学生
Kulda J.
Proteromonas lacertae-viridis (Grassi, 1879)の軸培養。
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論文で見る
スコープス (346)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リウ・B．
Shi Y.
Yuan J.
Hu X.
Zhang H.
Li N.
Li Z.
チェン Y.
Mu D.
Fan W.
de-novoゲノムプロジェクトにおけるk-mer頻度の解析によるゲノム特性の推定。
arXivでのプレプリント。2013;https://doi.org/10.48550/arXiv.1308.2012
論文で見る
クロスフィルム
グーグル奨学生
金久正明
後藤慎一郎
佐藤康志
古道正明
田辺真一
大規模分子データセットの統合と解釈のためのKEGG.
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論文で見る
筑波大学
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
金久正明
佐藤康博
森島和彦
BlastKOALAおよびGhostKOALA：ゲノムおよびメタゲノム配列の機能解析のためのKEGGツール.
J. Mol. Biol.
論文で見る
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
Wang H.-C.
ミン B.Q.
ススコ E.
ロジャー A.J.
部位頻度の事後平均プロファイルを用いた部位の不均一性のモデル化により、正確な系統推定が加速される。
Syst. Biol. 2018; 67: 216-235
論文で見る
スコープス (178)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハースト J.
シュラハトA.
ノルコットJ.P.
トレイナーD.
ブルームフィールド G.
アントロバス R．
ケイ・R・R
ダックス J.B.
ロビンソン M.S.
古くから広く存在する膜輸送複合体TSETの特性評価
eLife. 2014; 3e02866
論文で見る
PubMed
クロス
グーグル奨学生
カース M.
モアR.
ウィルソンA.
ストーンズ-ハヴァスS.
チャン・M.
スターロック S.
バクストン S.
クーパー A.
マーコウィッツ S．
デュランC.
et al.
Geneious Basic: 配列データの整理と解析のための統合的で拡張可能なデスクトップ・ソフトウェア・プラットフォーム。
Bioinformatics. 2012; 28: 1647-1649
論文で見る
論文リスト
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ラメッチワントナーG.
ブロカードC.
フランセンM.
ヴァン・フェルドホーフェンP.
ベルガー J.
Hartig A.
ペルオキシソーム標的シグナル1としての末端トリペプチドの認識における酵母とヒトの違いは、その受容体Pex5pの同定シグナルおよびそれに隣接する残基に対する親和性の違いに起因する。
J. Biol. Chem. 1998; 273: 33635-33643
論文で見る
スコープス (169)
パブコメ
概要
全文
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グーグル奨学生
ペトリフ O.I.
タン L.
チトレンコ V.I.
ラクビンスキー R.A.
ペルオキシソーム標的シグナルタイプ2のコンセンサス配列の新しい定義。
J. Mol. 生物学 2004; 341: 119-134
論文で見る
スコープス (102)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スナイダー W.B.
フェイバー K.N.
ヴェンツェルT.J.
コラー A.
ルアーズG.H.
ランゲルL.
ケラーG.A.
スブラマニ S.
Pex19pはPex3pおよびPex10pと相互作用し、Pichia pastorisのペルオキシソーム生合成に必須である。
Mol. Biol. Cell. 1999; 10: 1745-1761
論文で見る
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ベッツ E.L.
ゲンテカキE.
トーマスA.
ブレイケル V.
カーペンター A.I.
ツァウシスA.D.
霊長類以外の動物におけるブラストシスチスの遺伝的多様性。
Parasitology. 2018; 145: 1228-1234
論文で見る
スコープス (47)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ツァウシス A.D.
ゲンテカキE.
エメL.
ガストン D.
ロジャー A.J.
ブラストシスチス種および他の微生物真核生物における細胞質鉄硫黄クラスター形成機構の進化。
Eukaryot. Cell. 2014; 13: 143-153
論文で見る
スコープス (38)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2023年6月1日
受理受理：2023年5月11日
改訂版受理 2023年3月22日
受理：2023年3月22日 2022年8月16日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cub.2023.05.025
著作権
© 2023 The Author(s). 発行：エルゼビア社
ライセンス
クリエイティブ・コモンズ表示 (CC BY 4.0)
再利用方法
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図表
要旨
図1Blastocystis細胞とP. lacertae細胞の顕微鏡観察結果（Asorted microscopic observations of Blastocystis and P. lacertae cells
図2オルソグループとべん毛タンパク質の比較ゲノム解析
図3P. lacertaeの最小ペルオキシソームに関するバイオインフォマティックおよび分子細胞生物学的証拠
図4P. lacertaeにおける最小ペルオキシソームの潜在的機能を示すバイオインフォマティックおよび分子細胞生物学的証拠
図5ゲノム予測に基づくP. lacertaeミトコンドリオン関連オルガネラ（MRO）の代謝マップと機能の提案
図6ペルオキシソームとミトコンドリア小器官縮小の進化的ダイナミクスの指針
表
表1P. lacertae LA、Blastocystis ST1、Blastocystis ST4、Blastocystis ST7のアセンブリとゲノム統計量
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