長期マクロライド曝露が腸内細菌叢に及ぼす影響と代謝制御への示唆

宿主と微生物の相互作用
研究論文
2023年6月22日
長期マクロライド曝露が腸内細菌叢に及ぼす影響と代謝制御への示唆

https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/spectrum.00831-23

著者 Jocelyn M. Choo https://orcid.org/0000-0001-9500-8360, Alyce M. Martin, Steven L. Taylor, Emily Sun, Fredrick M. Mobegi, Tokuwa Kanno, Alyson Richard, Show All (13 AUTHORS), Geraint B. Rogers geraint.rogers@sahmri.comAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/spectrum.00831-23
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ABSTRACT
マクロライドの抗菌作用は腸内細菌叢にも影響を及ぼす可能性がある。我々は、このような治療が腸内常在細菌学に変化を与えるかどうか、またそのような変化が全身の免疫および代謝調節に影響を与えるかどうかを調べた。健康な成人に、臨床で使用されているような低用量のエリスロマイシンまたはアジスロマイシンを4週間投与したところ、腸内細菌叢の構成に一貫した変化が認められ、炭水化物代謝と短鎖脂肪酸の生合成に関連する微生物の能力が低下した。これらの変化は、免疫（インターロイキン5[IL-5]、IL-10、単球走化性タンパク質1[MCP-1]）および代謝（セロトニン[5-HT]、C-ペプチド）の恒常性に関連する全身バイオマーカーの変化を伴っていた。エリスロマイシンに曝露したマウス微生物叢を無菌マウスに移植したところ、マクロライド投与による腸内細菌叢の変化から、全身的な免疫調節ではなく、代謝恒常性と消化管運動性の変化が生じることが示された。この知見は、長期にわたる低用量マクロライド療法が、腸内細菌叢の変化を介して宿主の生理機能に影響を及ぼす可能性を強調するものである。
重要性 長期マクロライド療法は慢性呼吸器疾患に広く用いられているが、その抗菌活性は宿主生理の重要な調節因子である腸内細菌叢にも影響を及ぼす可能性がある。腸内細菌叢に関するマクロライド関連の研究は、短期間の抗生物質投与に限られており、宿主の免疫および代謝調節への影響については検討されていない。本研究により、長期にわたるマクロライドの投与が、マクロライド活性によって直接的に、あるいは腸内細菌叢の変化によって間接的に媒介されながら、基幹細菌を枯渇させ、宿主の制御に影響を与えることが明らかになった。このようなマクロライド関連機序の解明は、長期曝露のリスクの特定に貢献し、腸内細菌叢の維持のための標的治療の重要性を浮き彫りにするものである。
はじめに
長期的な低用量マクロライド療法とは、急性感染症の治療に通常用いられる量よりも少ない投与量と、それを超える投与期間を伴うものと定義される(1)。このような治療は、慢性肺疾患の増悪を効果的に予防することが示されている(2-6)。マクロライド療法は、継続的な利益をもたらし、忍容性が高く、比較的リスクが少ないと考えられており、現在では喘息、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、閉塞性細気管支炎、慢性鼻副鼻腔炎、嚢胞性線維症、組織化肺炎、びまん性汎細気管支炎の治療に広く用いられている(1, 7)。しかし、マクロライド系抗菌薬には多面的な作用があることが知られており、場合によっては数十年にも及ぶ長期連続投与がもたらす潜在的な影響については十分に理解されていない。
アジスロマイシンやエリスロマイシンなどのマクロライド系薬剤の長期投与は、局所的・全身的な免疫調節を含む宿主の生理機能の多くの側面に直接影響を与える能力を持つ(8)。炎症性メディエーターの細胞内発現を低下させる作用は、in vitroや動物モデルを用いて証明されている(9)。さらに、細胞内マイトジェン活性化プロテインキナーゼとNF-κB経路の調節を通じて、これらの作用は複数の免疫細胞タイプにわたって起こる(8, 10)。マクロライドを投与された患者を対象とした研究でも同様に、マクロライドが慢性呼吸器疾患における好中球性炎症の軽減を通じて炎症性気道反応を抑制し（11、12）、循環サイトカインレベルに影響を及ぼすことが示されている（13-15）。
免疫調節への影響に加えて、マクロライド系抗生物質は多くのグラム陽性菌やグラム陰性菌に対して抗菌活性を有する(8)。抗生物質への曝露による腸内細菌叢の破壊は、宿主の生理機能に大きな影響を及ぼす可能性があり、心血管疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、2型糖尿病、肥満などの心代謝系疾患のリスク上昇に関連している(16)。腸内細菌叢とその代謝産物は、腸管細胞を活性化し、セロトニン（5-HT）やグルカゴン様ペプチド1（GLP-1）などの腸管由来ペプチドの放出を促進することにより、宿主の代謝調節を調節することができる（17）。これらの分子は、腸神経系（ENS）にシグナルを送り、運動や栄養吸収などの消化管生理機能に影響を与えることに関与しており、エネルギーとグルコースの恒常性の維持に重要な役割を果たしている（17）。したがって、慢性肺疾患に用いられるマクロライドの長期投与が、腸内細菌叢の変化を介して直接的または間接的に、さまざまな健康転帰に影響を及ぼす可能性がある。
腸内細菌学と微生物-宿主相互作用の変化は、抗菌薬投与量の抗生物質に短期間曝露された結果としてよく認識されている(18-20)。しかし、長期にわたる低用量マクロライド療法が、腸内細菌叢をどの程度変化させるのか、あるいは宿主の生理学的側面にどの程度影響を及ぼすのかはわかっていない。このような知識のギャップに対処することは、マクロライド療法の潜在的な影響を理解する上で不可欠であるが、それにはかなりの困難が伴う。慢性肺疾患患者は、一般的にマクロライド系以外の抗生物質への曝露が多く、基礎疾患に関連した慢性全身性炎症のマーカーを示し、場合によっては腸管病態生理の変化も認められる(21)。このような曝露をコントロールするために、我々は健康な成人を対象に、エリスロマイシンエチルコハク酸塩400mgを1日2回、またはアジスロマイシン125mgを1日2回投与する単盲検無作為並行4週間試験を行った。このアプローチにより、低用量のマクロライドに曝露した後の腸内細菌叢の変化、宿主の免疫・代謝恒常性の変化を、潜在的な交絡因子がない状態で調べることができた。次に、エリスロマイシンの長期曝露の前臨床モデルを用いて、被験者に観察された腸内細菌学と宿主生理学におけるマクロライドに関連した変化を調べ、無菌マウスへの微生物叢移植によってこれらの関係の因果性を証明した。
本論文では、健常成人における長期低用量マクロライド療法がレシピエントの生理機能に及ぼす影響について、初めて詳細に検討した結果を報告する。我々は、長期的な疾患リスクや健康転帰に影響を及ぼす可能性のある、宿主の代謝調節に対する直接的な影響と微生物叢を介した影響を明らかにした。
結果
低用量長期マクロライド曝露は、全身性免疫マーカーおよび代謝マーカーの変化と関連している。
健康成人に低用量のエリスロマイシン（ERY）またはアジスロマイシン（AZM）を4週間投与し（各抗生物質群n = 10）、全身性免疫マーカーおよび代謝マーカーへの影響を評価した。マクロライドの免疫調節作用は認められているため、最初の解析では、空腹時血清中のサイトカイン、ケモカイン、成長因子を含む広範な免疫マーカーパネルにおけるマクロライドに関連した変化の確認評価に焦点を当てた。アジスロマイシンへの曝露は、ケモカインである単球走化性タンパク質1（MCP-1）、サイトカインであるインターロイキン5（IL-5；偽発見率[FDR]P < 0.05）およびIL-10（P < 0.05）を含む血清炎症マーカーの有意な減少と関連していた（図1A、補足資料の図S1）。同様の効果はエリスロマイシンでも観察されたが、統計学的有意差には至らなかった（図1A、図S1）。腫瘍壊死因子α（TNF-α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、およびIL-17Aは、いずれかのマクロライドへの曝露後に減少傾向を示したが、これらは統計学的有意差には至らなかった。リポポリサッカライド（LPS）、線維芽細胞増殖因子2（FGF-2）、およびサイトカインである肝細胞増殖因子（HGF）、IL-1β、IL-9のレベルは、いずれのグループでも60％未満のサンプルで検出されたため、それ以上の分析は行わなかった。
図1
図1 ヒトのエリスロマイシン（ERY）群とアジスロマイシン（AZM）群における（A）全身性免疫マーカーおよび（B）グルコース調節、脂質代謝および胆汁酸調節に関連する代謝バイオマーカーの血清レベルの変化。各血清バイオマーカーのベースライン値は、全参加者（n＝20）のベースライン時の平均値と標準偏差に基づく。値は、5-HT（ng/mL）、グルコース（mmol/L）、アディポネクチン（μg/mL）、レプチン（ng/mL）、C反応性蛋白（CRP、ng/mL）を除き、すべてpg/mL単位である。血清バイオマーカーは、方法のセクションに記載したように、市販のシングルおよびマルチプレックスイムノアッセイパネルを用いて測定した。棒グラフおよびエラーバーは、それぞれのベースライン値と比較した抗生物質投与終了時のバイオマーカー値の平均倍率変化（log2）および標準偏差を表す。一対比較は線形混合モデル（Rのlme4 v1.1-23およびlmerTest v3.1-1パッケージ）を用いて行った。偽発見率（FDR）法による多重検定の補正後の統計的有意性（P < 0.05）は、アスタリスク（*）で示した。
マクロライドへの曝露がヒトの代謝恒常性に影響を及ぼす可能性については、グルコース調節（胃抑制性ポリペプチド[GIP]、5-HT、C-ペプチド、インスリン、GLP-1、グルカゴン、グルコース、ペプチドYY[PYY]）、脂質代謝（アディポネクチン、レプチン）、胆汁酸調節（FGF-19）の血清マーカーに対するマクロライドに関連した変化を評価することによっても検討した（図1B、図S2）。ベースライン値はすべての参加者で正常範囲内であったが、PYYはいずれの群でも60％未満の検体で検出された。エリスロマイシンとアジスロマイシンはともにC-ペプチドレベルの有意な上昇と関連していたが、5-HTの血清レベルの有意な上昇はエリスロマイシン単独で観察された（FDR P < 0.05）（図1B、図S2）。マクロライド投与後のインスリンレベルの変化は、C-ペプチドの変化と正の相関があり（r = 0.523、P = 0.018）、インスリン分泌の安定したバイオマーカーとしてのC-ペプチドの機能と一致していた。GIP、インスリン、GLP-1、グルカゴン、グルコース、アディポネクチン、レプチンのレベルの変化は上昇傾向にあったが、FGF-19については有意ではない下降傾向が観察された。
マクロライドへの暴露は腸内細菌叢組成の変化と関連している。
腸内細菌叢の変化が宿主の生理機能に影響を及ぼす可能性を考慮し、低用量マクロライド曝露が腸内細菌叢に及ぼす影響を検討した。マクロライド投与は糞便細菌量の有意な減少とは関連しなかった（ERYとAZMの両方でP > 0.05）（表S1）。しかし、腸内細菌叢のα多様性の変化は、両方の抗生物質で観察された。具体的には、ベースラインと比較して、投与は検出された細菌分類群の数（ERY、P = 0.006、AZM、P = 0.006、複合、P < 0.0001）およびその多様性（ERY、P = 0.010、AZM、P = 0.004、複合、P < 0.0001）の大幅な減少に関連したが、細菌の均等性（Pielouの均等性；P > 0.05）には関連しなかった（それぞれ図S3A～C）。マクロライド投与後、糞便微生物叢組成の有意な変化も観察された（ERY：P＝0.002、t＝2.16；AZM：P＝0.004、t＝1.99；複合： P = 0.0002、擬似F = 7.82）（図2A、表S2）。注目すべきことに、マクロライド曝露後に変化した微生物叢の組成は、エリスロマイシン群とアジスロマイシン群の間で有意差はなかった（P = 0.826、t = 0.88）。エリスロマイシンとアジスロマイシンの影響は参加者コホート全体で一貫しており、ベースラインと比較してグループ内分散（分散）の有意な増加はみられなかった（ERY、P = 0.70；AZM、P = 0.46；複合、P = 0.44）。
図2
図2（A）エリスロマイシンまたはアジスロマイシン治療（ABX）前（ベースライン、BL）および4週間後の糞便微生物叢に基づく非計量的多次元プロット。各群の楕円は80％信頼限界の標準偏差を表す（点線と実線はそれぞれベースライン群と治療群を表す）。(B～D）ヒトにおけるエリスロマイシンとアジスロマイシンの両治療によって有意に変化した微生物種と、（C）エリスロマイシンまたは（D）アジスロマイシンのいずれかによって変化した微生物種。ヒートマップは各グループ内のサンプルの平方根相対存在量を表し、棒グラフはベースラインと4週間のマクロライド治療終了時の特定の分類群の相対存在量の（log2）倍変化を表す。棒グラフとエラーバーは中央値と四分位範囲を表す。有意性は、エリスロマイシンとアジスロマイシンの両群を含む比較ではFDR P＜0.05、薬剤別の比較ではP＜0.05のウィルコクソン検定に基づいて決定した。
アジスロマイシンとエリスロマイシンの両方が、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、アッケマンシア・ムチニフィラ、ビロフィラ・ワズワルティア（FDR P < 0.05）を含む特定の細菌分類群の減少と関連していた（図2B）。逆に、Actinomyces johnsonii、Eggerthella lenta、Ruminococcus gnavus、Coprococcus comesの相対量は両群で有意に増加した（FDR P < 0.05）。細菌分類群の相対存在量における薬剤特異的な変化も観察された。例えば、エリスロマイシン単独投与では、Ruminococcus bicirculans、Roseburia inulinivorans、Actinomyces sp. ICM47が有意に減少し、Blautia obeum、Flavonifractor plautii、Anaeromassibacillus sp.の相対量が増加した（P < 0.05）（図2C）。対照的に、アジスロマイシン単独投与は、ファーミキューテス属細菌CAG110、Colinsella stercoris、Odoribacter splanchnicusの減少、およびActinomyces sp. oral taxon 180とEubacterium ramulusの相対存在量の増加と関連していた（P < 0.05）（図2D）。
マクロライド曝露は糞便微生物叢の機能的能力の変化と関連している。
分類学的組成の変化と一致して、マクロライド曝露は糞便微生物叢の機能的能力の有意な変化とも関連していた（ERY: P = 0.014, t = 2.31; AZM: P = 0.003, t = 2.42;図3A、表S3）。注目すべきは、炭水化物の生合成と分解および解糖に関与する経路の減少が両群で観察されたが、アジスロマイシン投与群でより顕著であったことである（FDR P < 0.05）（図3B）。短鎖脂肪酸（SCFA）前駆体の酢酸および／または乳酸の生成に関連する混合酸発酵およびホモ乳酸発酵経路、ならびに発酵経路の中間体（アセチルコエンザイムA、オキサロ酢酸、クエン酸など）を利用するクエン酸（TCA）サイクルに関与する経路の減少も両群で観察された（P＜0.05）（図3B）。
図3
図3（A）アジスロマイシンまたはエリスロマイシンによる4週間の治療後のヒトにおける細菌機能経路存在量の非計量的多次元尺度法による順序プロット。各群の楕円は80％信頼限界の標準偏差を表す（点線と実線はそれぞれベースライン群と治療群を表す）。(B）ベースラインとエリスロマイシン（ERY）およびアジスロマイシン（AZM）治療終了時の一対比較をWilcoxon検定を用いて行い、P値はFDR法を用いて多重比較補正した。エリスロマイシン群またはアジスロマイシン群で、それぞれのベースライン存在量と比較して1.5倍変化（log2平均fold change > |0.58|、FDR P < 0.05）し、有意に変化したパスウェイのみを示す。棒グラフとエラーバーは中央値と四分位範囲を表す。エリスロマイシンまたはアジスロマイシンのいずれかによって有意に変化した細菌種に基づくパスウェイの層別化を、ヒートマップを用いて示す。分類学的に層別化したパスウェイはいずれも、治療によって有意に変化しなかった。パスウェイの存在量（counts per million、CPM）は、Human Microbiome Project Unified Metabolic Analysis Network（HUMAnN3）ツールを用いて決定し、Metacyc Metabolic Pathwayデータベースに基づいてアノテーションした。
マクロライド処理後に相対存在量の変化を示した菌種のうち、B. longumの減少が、同定された多くの機能的変化の主な原因であった可能性がある（図3B）。これらの変化には、糖質代謝に関連する経路（例えば、UDP-N-アセチル-d-グルコサミン生合成I、グリコーゲン分解I、トレハロース分解V、スクロース分解IV）や、免疫機能と栄養代謝に関与する必須分子であるグルタチオンの生合成と分解に関連するγ-グルタミル・サイクルが含まれていた。また、B. adolescentis、B. wadsworthia、R. bicirculansを含む他の種のシフトも、炭水化物代謝能力の変化に寄与した（図3B）。マイクロバイオームの機能的能力は変化したが、糞便pHは処理によって変化しなかった（ERY, P = 0.131; AZM, P = 0.193）（表S1）。
宿主の生理機能の変化は、マイクロバイオームの機能的能力の変化と相関している。
次に、マクロライドに関連した腸内細菌学の変化が、宿主の全身性免疫および代謝調節の変化と関連しているかどうかを調べた。特にグルコース調節に関連する宿主マーカーで有意な関係が確認された（図S4）。特に、5-HTとC-ペプチドの増加は、ビフィズス菌の枯渇、グルコースの利用および合成に関与する経路（糖新生、解糖、糖の分解を含む）、ならびに乳酸、酢酸、コハク酸などのSCFA前駆体の合成に関与する発酵経路（混合酸発酵およびホモ乳酸発酵）（P < 0.05）と関連していた。マイクロバイオームの形質とインスリン値との関連は、ほとんど有意ではなかったが（P > 0.05）、C-ペプチドで観察されたものと同様の傾向をたどった（図S4）。
腸内細菌叢の特性と宿主免疫マーカーとの間の有意な関連は、MCP-1とGM-CSFにほぼ限定されたが（図S4）、これらのマーカー間で重複する有意な関連は観察されなかった。IL-5またはIL-10の変化は、IL-10とイノシン-5′-リン酸生合成経路（ヌクレオチド生合成に関連）との有意な関連を除いては、微生物叢とは関連していなかった。探索的ではあるが、これらの知見は、マクロライド曝露によって生じる腸内細菌叢の変化が、宿主の代謝恒常性を変化させ、免疫調節の側面にも影響を及ぼす可能性のあるメカニズムを示唆している。
エリスロマイシンに関連した変化は、マウスの糞便中マイクロバイオームにおいて明らかである。
長期低用量エリスロマイシン投与マウスモデルを用いて、マクロライドに関連した腸内細菌学的変化と宿主代謝との関係をさらに検討した。我々はまず、エリスロマイシン投与（ERY）後の従来型マウスの糞便微生物群集構造の変化が、ヒトで観察されたものとほぼ一致していることを立証した。具体的には、総糞便細菌量に有意な変化は認められなかったが（P = 0.451）（表S4）、エリスロマイシンは観察された種の減少（P ≤ 0.0001）およびシャノン多様性指数（P ≤ 0.001）と関連していた（図S5）。これらの変化は90日目の対照マウスと比較して有意であった（P≦0.05）。
90日目のエリスロマイシン処置マウスの糞便微生物叢組成はベースラインと有意に異なっていた（PERMANOVA［permutational multivariate analysis of variance］： P = 0.0001、t = 9.28）、対照マウスとは有意に異なっていた（P = 0.0001、t = 8.72）。この組成の差は、エリスロマイシン投与マウスにおける嫌気性分類群、特にSCFA生合成に関与する分類群（Lactobacillus属、Faecalibaculum属、Clostridium sensu stricto 1属、RuminococcaceaeおよびLachnospiraceaeファミリーのメンバー）および炭水化物利用（Bacteroidales 24-7グループ）の相対的存在量のコントロールと比較した有意な減少と関連していた（FDR P < 0. 05, fold change > |1.5|）（図4A）。注目すべきは、マクロライド曝露後にヒトで観察された枯渇とは対照的に、投与によってアッカーマンシアの相対存在量が有意に増加したことである。さらに、Bacteroidales目の1つの分類群では、エリスロマイシン処理マウスで有意に減少した（FDR P < 0.05）が、ヒトでは対応する変化は観察されなかった（FDR P = 0.915）（表S2）。
図4
図4（A）90日目に対照マウスと比較してエリスロマイシン投与マウスの糞便サンプルで有意に変化した細菌分類群および（B）代謝産物。各バーは、対照マウスと比較してエリスロマイシン投与マウスで有意に増加（赤色）または有意に減少（灰色）した細菌分類群（または代謝物）のlog2平均倍変化を示す。(C)エリスロマイシン投与マウス（赤色記号）と対照マウス（灰色記号）の糞便サンプルを、Procrustes解析を用いて、微生物相組成（閉じた円）と代謝産物組成（開いた円）に基づいて序列化した。閉じた円と開いた円を結ぶ線は、それぞれのマウスの微生物叢サンプルと代謝物サンプル間の距離を表す。グループ間の細菌分類群および代謝産物量の統計的比較は、それぞれMann-Whitney検定およびunpaired t検定を用いて行った。FDR調整P＜0.01かつ1.5倍変化で有意に変化した細菌分類群、および有意に変化した代謝物（FDR P＜0.05）を示す。
次に、マクロライドに関連した腸内細菌学の変化が、宿主-マイクロバイオーム相互作用の潜在的メディエーターの産生に及ぼす影響を、糞便メタボロミクスを用いて評価した。90日目に群間で同定された代謝物のうち半数以上（検出された46代謝物中26代謝物）が、エリスロマイシン投与後に減少していることが判明し（FDR P < 0.05）（図4B）、ヒトで観察された微生物機能能力の低下と一致した。注目すべきは、SCFA（酢酸、プロピオン酸、酪酸）およびその前駆体化合物である乳酸とクエン酸のレベルが、対照群と比較してエリスロマイシン投与マウスで減少していたことである。必須アミノ酸（リジン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンを含む）および非必須アミノ酸（チロシン、アラニン、およびアスパラギン酸を含む）を含む宿主代謝に関与する代謝物、ならびにトリメチルアミンおよびヒスタミンなどの心代謝疾患および免疫応答に関与する代謝物のレベルも、エリスロマイシン処理後に減少した（図4B）。エリスロマイシンに関連した糞便代謝産物への影響は、糞便微生物叢組成で観察された変化と強く関連していた（距離共分散[dcov]=0.649、P < 0.0001）（図4C）。ここでもヒトでの観察と同様に、エリスロマイシンは、糞便微生物叢と代謝物の変化にもかかわらず、糞便pHの変化とは関連していなかった（中央値［四分位範囲］：コントロール＝6.9［6.6～7.0］、ERY＝6.6［6.3～6.9］；P＝0.071）。
代謝ホメオスタシスに対するエリスロマイシン関連の効果にはマイクロバイオームが必要である。
次に、従来型および無菌マウスモデルを用いて、治療に関連した腸内細菌叢の変化と宿主バイオマーカーとの関連が因果関係にあるかどうかを検討した。従来型および無菌マウスモデルにおけるグルコースホメオスタシスは、腹腔内糖負荷試験によって評価した。従来のマウスに低用量のエリスロマイシンを90日間投与したところ、対照マウスと比較してグルコースの曲線下面積（AUC、0～120）が有意に減少した（P = 0.004）（図5A）。対照的に、無菌マウスに低用量のエリスロマイシンを90日間投与すると、無処置マウスと比較してグルコースホメオスタシスは変化しなかった（P = 0.836）（図5B）。最後に、エリスロマイシンを投与したマウスの腸内細菌叢を無菌レシピエントに移植すると、対照の微生物叢を移植したマウスと比較してグルコースのAUCが減少する傾向が見られた（エリスロマイシンを投与した従来のマウスと同様の方向）が、統計学的有意性には至らなかった（P = 0.209）（図5C）。
図5
図5（A）エリスロマイシン（20 mg/kg）または水を投与されたマウス（ERYはn＝22、対照はn＝24、 それぞれ）、（B）エリスロマイシン（20 mg/kg）または水を投与した無菌マウス（各群n = 7）、および（C）エリスロマイシン関連微生物叢または対照微生物叢を移植した無菌マウス（各群n = 9）。データは平均値で示し、エラーバーは標準偏差を表す。群間の統計的比較はMann-Whitney検定を用いて行い、有意差はP < 0.05とした。
代謝ホメオスタシスに対するエリスロマイシンの影響は、平均呼吸商（基礎代謝活動の指標）と総体重（ここでは包括的な代謝指標として使用）に基づいても評価した。エリスロマイシンは、日中および夜間の両サイクルにおいて、対照群と比較して呼吸商を有意に増加させ（P < 0.0001）、栄養利用への影響を示唆した（図S6C）。この変化は主に、活動的な夜間サイクル中の呼気CO2量の有意な増加（P = 0.038）によって引き起こされ、食物や水分の摂取量、および総エネルギー消費量とは無関係であった（P > 0.05）（図S6C）。しかし、従来のマウスでは、体重はエリスロマイシン処理によって有意に変化しなかった（P = 0.654）（図S6A）。エリスロマイシンを投与した無菌マウスおよびエリスロマイシン改変腸内細菌叢を移植した無菌マウスの体重は、それぞれのコントロールと比較して変化しなかった（P > 0.05）（それぞれ図S7AおよびB）。
エリスロマイシンは腸内細菌叢の変化を通して宿主の代謝に影響を及ぼす。
グルコースホメオスタシスの変化にもかかわらず、代謝バイオマーカーである5-HTおよびC-ペプチドの血清レベルは、従来のマウスではエリスロマイシン投与に反応して有意な変化はなかった（図6A）。しかし、無菌モデルマウスを用いた研究では、5-HTレベルは、直接的には曝露によって（P < 0.001）、間接的には微生物叢依存的な経路（P = 0.002）を介して（それぞれ図6BとC）、有意に調節されることが示された（それぞれ図6BとC）。これらの所見は、5-HTの調節がグルコースホメオスタシスの変化を媒介する主要なドライバーではないことを示唆している。C-ペプチドでは、有意な直接的効果も微生物叢を介した効果も観察されなかった（それぞれP = 0.316および0.107）。
図6
図6 (A)エリスロマイシン投与マウスおよび対照マウス（両群ともn = 9）、(B)無菌マウスおよびエリスロマイシン投与を受けた無菌マウス（各群n = 7）、および(C)エリスロマイシン関連または対照微生物叢でコロニー形成された無菌マウス（各群n = 9）の代謝マーカーC-ペプチドおよび5-HT、ならびに免疫マーカーIL-5、IL-10、およびMCP-1の血清レベル。血清バイオマーカーは90日間の試験終了時に評価した。統計学的比較は対応のないt検定を用いて行い、有意性はP＜0.05とした。
腸管運動は、栄養吸収への影響を通じてグルコースおよびエネルギー代謝の重要な調節因子であり、腸内細菌学およびエリスロマイシンなどの運動促進剤の両方によって影響を受ける。無菌マウスにエリスロマイシンを直接投与しても（腸管通過時間に基づく）腸管運動性は有意に変化しなかったが（P = 0.209）（図7A）、エリスロマイシン関連微生物叢を無菌レシピエントに移植すると、対照微生物叢のレシピエントに比べて腸管通過時間が有意に延長した（P = 0.0003）（図7D）。盲腸重量は腸運動性と同様の傾向を示し、エリスロマイシンに直接曝露した無菌マウスでは変化しなかったが（P = 0.710）、エリスロマイシン関連微生物叢のレシピエントでは対照微生物叢のレシピエントと比較して有意に増加した（それぞれP < 0.0001）（図7BおよびE）。注目すべきことに、移植された微生物叢のレシピエントでは盲腸重量が消化管運動性と強い相関を示した（r = 0.89、P < 0.0001）が、この関係は非コロニー化無菌マウスでは見られなかった（r = -0.08、P = 0.777）（図7FおよびC、それぞれ）。これらの結果から、エリスロマイシンに関連した消化管生理の変化は、主として腸内細菌群集の変化を通して生じることが示唆される。
図7
図7 宿主の生理機能に対するエリスロマイシン曝露およびエリスロマイシンに関連した腸内細菌叢の直接的影響の評価。A）エリスロマイシン処理または水を投与された無菌マウス、および（B）エリスロマイシン関連または対照微生物叢でコロニー形成された無菌マウスにおいて、90日間の試験における体重を評価した。盲腸重量（CおよびE）および腸通過時間（DおよびF）も、90日間の試験終了時にそれぞれの群について測定した。(G)エリスロマイシン処理または水を投与された無菌マウス、および(H)コントロールまたはエリスロマイシン関連ドナーの微生物叢でコロニー形成されたレシピエントにおける総腸通過時間と盲腸重量との関連は、線形回帰モデルを用いて決定した。棒グラフとエラーバーはそれぞれ中央値と四分位範囲を表す。群間比較はMann-Whitney検定を用いて統計学的に解析した。
免疫マーカーに対するエリスロマイシンの直接的影響の証拠。
グルコースホメオスタシスに対するエリスロマイシンのマイクロバイオームを介した影響に加えて、マクロライドに関連したマイクロバイオームの変化とは独立した、宿主の免疫調節に対するエリスロマイシンの直接的な影響の証拠が同定された。例えば、エリスロマイシンを投与した無菌マウスでは、IL-5の有意な減少（P = 0.008）が観察された（図6C）が、エリスロマイシンを投与した無菌レシピエントと対照微生物叢を投与した無菌レシピエントとの間でIL-5レベルの差は確認されなかった（図6B）。最後に、免疫マーカーであるIL-10とMCP-1は、エリスロマイシンを投与した従来型モデルでも無菌モデルでも変化しなかった（図6）。
考察
慢性肺疾患の増悪を予防するマクロライド長期投与の有効性から、その臨床的使用が増加している（22, 23）。マクロライドはQTc間隔延長やトルサード・ド・ポアンツのリスクを伴い(24)、肝チトクロームP450酵素を阻害することによりスタチンなどの薬剤と併用すると毒性が増加する可能性がある(25)。しかし、適切なスクリーニングを行えば、マクロライド療法は最小限のリスクで済むと考えられている。にもかかわらず、マクロライド系薬剤の肺外作用についてはほとんど知られていない。マクロライド系薬剤は、直接的に、あるいは腸内細菌叢への影響によって、多面的な影響を及ぼす可能性がある。
我々は、健康な成人と前臨床モデルを用いた研究により、慢性呼吸器疾患の管理に用いられるマクロライド系抗生物質の低用量投与が、全身のホメオスタシスのマーカーの変化と関連しているかどうかを調べた。特に、宿主とマイクロバイオームの相互作用の変化によって影響を受けることが知られている生理学的側面、すなわち代謝制御に注目した。ヒトでは、マクロライド曝露と宿主の代謝マーカーの変化との間に関連が認められ、その変化は腸内細菌叢の組成および機能の変化と相関していた。この知見から、長期にわたる低用量マクロライド療法は、レシピエントの全身の代謝制御に影響を及ぼし、心代謝性疾患のリスクに影響を及ぼす可能性があることが示唆された。
マクロライドへの曝露と、免疫および代謝恒常性の宿主マーカーの変化との関連は、広範に確認された。マクロライド曝露後、血清免疫マーカーIL-5、IL-10、MCP-1が緩やかではあるが有意に低下し、その効果はアジスロマイシンでより顕著であった。マクロライドの免疫調節作用はよく知られている。例えば、アジスロマイシンを投与された喘息患者は、末梢血単核球から分離されたCD4+細胞においてIL-5の発現が低下している(26)。われわれの研究で顕著な抗炎症作用がみられなかったのは、おそらく健康な参加者に全身性の炎症がなかったことを反映しているのであろう。
対照的に、マクロライドへの暴露は、代謝調節の宿主マーカーの増加と関連していた。特に、エリスロマイシンはグルコース調節を反映する5-HTとC-ペプチドの血清レベルを有意に上昇させた。有胞子性腸内細菌叢は、大腸腸クロムマフィン細胞による5-HT生合成を促進することが知られている(27)。5-HTは、膵β細胞のホルモン産生に影響を与え、肝細胞の脂質代謝を調節することにより、グルコースホメオスタシスに影響を与える可能性がある(28)。エリスロマイシンは運動促進薬であるため、消化管運動と栄養吸収を亢進させることにより、グルコースホメオスタシスに影響を及ぼす可能性がある。エリスロマイシンは腸内細菌叢の調節を介して宿主の生理機能に影響を及ぼす可能性が示唆される。
エリスロマイシンおよびアジスロマイシンと宿主の生理学的側面との関連と並んで、両薬剤は腸内細菌叢の組成および機能的能力の変化と関連していた。総細菌量は変化しなかったが、両マクロライドは細菌の豊富さと多様性の有意な減少と関連していた。これらの所見は、抗生物質曝露の一般的な影響（20）と類似しているが、本研究で使用されたマクロライドの用量は、抗生物質目的で処方された用量よりも低かった。治療により、ビフィドバクテリウム属（B. longumおよびB. adolescentis）を含む多くの重要な通性嫌気性菌が減少し、一方、Ruminococcus gnavus（29）のような炎症に関連する種はマクロライド暴露後に増加した。これらの観察結果は、急性アジスロマイシン療法（30-32）またはエリスロマイシン療法（33）後に報告されたものと一致しており、抗菌剤投与時のマクロライドの広域スペクトル活性（30, 32）と一致している。
機能的能力に関連して、解糖、炭水化物の生合成と分解、TCAサイクル、発酵などのエネルギー代謝に関連する微生物経路の存在量は、被験者のマクロライド暴露後に有意に減少した。マウスを用いた並行研究では、糖質代謝経路（UDP-N-アセチル-d-グルコサミン生合成Iとビフィドバクテリウム・シャント）と発酵経路（糖の酢酸と乳酸への発酵）におけるマクロライドに関連した変化が明らかになった。マウスの糞便代謝物を直接調べたところ、予測された機能的変化がさらに立証され、SCFAの存在量が減少していることが示された。これらの変化は、酢酸や乳酸を酪酸に変換するRuminococcaceaeやLachnospiraceaeの仲間を含むSCFA産生分類群に対するエリスロマイシンの影響と一致している(34)。
ヒトで観察された関連性がどの程度因果関係があるのかを含め、マイクロバイオームとマクロライドに関連した宿主生理の変化との潜在的な関係をさらに調べるために、無菌マウスとマクロライドに曝露した微生物叢を移植したマウスを用いた。これらの解析から、マクロライド曝露が腸内細菌叢への影響を介して宿主の代謝生理に影響を及ぼす可能性があることが示された。特に、グルコース負荷試験とメタボリックケージシステムを用いた従来のマウスでの解析から、マクロライド曝露と代謝恒常性との関係が示された。グルコースAUCの減少に反映されるように、マクロライド曝露マウスにおけるグルコース調節の変化は、安静状態および活動状態の両方において呼吸商の増加と同時に観察された；これらの効果はエネルギー恒常性の変化と一致する(35-37)。エリスロマイシンで処理した微生物叢を移植した無菌マウスでは、グルコースAUC値が低下するという同様の、しかし緩やかな傾向が観察されたが、エリスロマイシンで直接処理した無菌マウスでは観察されなかった。これらの所見は、エリスロマイシン曝露とグルコースホメオスタシスの間に観察された関係の微生物群介在を支持するものである。対照的に、炎症性サイトカインであるIL-5のレベルの低下は、エリスロマイシンの直接的な活性と関連しており、腸内細菌叢の組成の操作には影響されなかった。このことは、エリスロマイシン（38）とアジスロマイシン（26）の両方の確立された抗炎症特性と一致して、免疫調節に対するマクロライドの直接的な媒介作用を示唆している。
無菌モデルの解析から、微生物に依存した作用が腸の運動性を変化させる主な媒介因子であることも示された。グルコースのホメオスタシスに重要な役割を果たす腸管運動は、腸神経系による消化管の収縮活動を通じて制御されている。LPSなどの微生物成分や炭水化物発酵産物などの微生物代謝産物は、ENSのシグナル伝達に関与している(17, 39)。さらに、5-HTを含む腸内ホルモンもENSのシグナル伝達に関与していることが知られている（17）。我々の無菌マウス研究では、5-HTはマイクロバイオームおよびエリスロマイシン曝露によって有意に調節されることが示されたが、宿主の消化管通過は腸内細菌叢によって有意に調節された。これらの知見を総合すると、エリスロマイシンが宿主に及ぼす直接的な影響よりも、むしろマイクロバイオームに及ぼす影響の方が、消化管生理のより強い調節因子であり、代謝のホメオスタシスに寄与している可能性が示唆される。
低用量のマクロライド長期投与で観察された腸内細菌学的変化とそれに伴う宿主生理学的側面の変化は、意図しない治療効果の潜在的な原因である。われわれの知見は、慢性呼吸器疾患に対する継続的なマクロライド療法が、全身性免疫と微生物が介在する代謝ホメオスタシスの変化に重大な直接的影響を及ぼす可能性を示唆している。これらの影響は、長期的な代謝の健康転帰に大きな影響を及ぼす可能性があるが、長い期間と多様な罹患との関連においてのみ明らかになる可能性があるため、マッチさせたプラセボ対照を含む大規模コホートの縦断的評価が必要である。
我々の研究には考慮すべき限界があった。健康な被験者を用いたことで、肺疾患や関連する治療法などの疾患の潜在的な交絡因子がない状態でマクロライドの影響を評価することができた。しかし、マクロライドが全身の生理学に及ぼす影響は、ホメオスタシスが疾患関連因子によってすでに破壊されている場合には異なる可能性がある。われわれは慢性肺疾患の治療によく用いられる2種類のマクロライドの効果を検討したが、これらの効果は他のマクロライドの効果とは異なる可能性がある。身体活動、食事、ストレスなどの外的要因は、腸内細菌叢、宿主の代謝、炎症マーカーに影響を与える可能性がある(40)。われわれの縦断的研究により、被験者内でのペア評価が可能となり、個人間で大きく変動する可能性のあるこのような曝露に関連した変動を最小限に抑えることができた。しかし、プラセボ対照群が含まれていないため、評価マーカーの経時的な自然変動、宿主の生理学的マーカーに対するプラセボ効果、あるいは試験参加による行動変化（ホーソン効果）が、マクロライド関連効果のマスキングに寄与しているかどうかは判断できない。さらに、宿主生理学に対するマクロライドの直接的な影響の評価は、網羅的なものではなかった。例えば、マクロライドに関連した自食作用の障害（41）や他の薬剤との相互作用（42）が宿主生理に影響を与える可能性がある。ここでは、腸内細菌学、生理学的プロセス、薬物代謝の基礎に違いがあるヒトとマウスの両方を調査した。実際、ヒトもマウスもマクロライドに反応して宿主のホメオスタシスと腸内細菌叢の機能的能力に変化を示すことがわかったが、一致しない特定の分類群やマーカーがあった。例えば、A. muciniphilaはマウスではエリスロマイシン投与後に増加したが、ヒトでは減少した。これらの影響は先行研究と一致しており、それぞれのモデルに対するAkkermansiaの特異的な反応を反映している可能性がある（18, 31）。最後に、我々のマウス研究ではメスマウスのみを用いたため、性差の影響によって生じる腸内細菌叢と宿主の代謝・免疫関係の違いを捉えることができなかった可能性がある（43, 44）。
材料と方法
ヒトを対象とした研究における被験者の募集とサンプル採取。
健康な成人に、エリスロマイシンエチルコハク酸塩400mgを1日2回経口投与、またはアジスロマイシン125mgを1日2回経口投与する4週間のコースを実施した（各抗生物質群につきn＝10）（表1）（45）。各用量は、低用量の長期マクロライド療法を処方された患者が受ける用量と同等である。参加者はパラレルデザインで無作為に割り付けられ、投与された抗生物質については盲検化された。すべての参加者は、書面による完全なインフォームドコンセントを行った。本試験は、施設の倫理委員会（HREC/15/MHS/41）により承認され、Australian and New Zealand Clinical Trials Registry（ANZCTR12617000278336）に登録された。新鮮な糞便サンプルを抗生物質治療開始直前（ベースライン）と4週間の抗生物質治療終了時に採取し、-80℃で保存した。空腹時（6時間以上）の血清は、対応する時点で採取した血液サンプルから得た。参加者は試験期間中、習慣的な食事を維持するよう指示された。参加者は、過去3ヵ月間に抗生物質の投与を受けておらず、過去12ヵ月間にマクロライド系薬剤の投与を受けていなかった。全参加資格基準は補足資料に記載されている。参加者のベースライン人口統計は表1に詳述されている。
表1
表1 参加者の属性a
特徴エリスロマイシン（n=10）アジスロマイシン（n=10）年齢（歳）36±1240±150.113性別（女性）、n（％）9（90％）6（60％）0.303BMI（kg/m2）27.7±5.928.5±5.10.727QTc（ms）、中央値（IQR）425（421-431）411（392-430）0. 147心拍数（拍/分）76±1372±120.575他の薬物、投与法プロクロルペラジン25mg/日、経口、3日間（n = 1）--メトクロプラミド10mg/日、経口、1日間（n = 1）--。
a
BMIは体格指数、IQRは四分位範囲。特に断りのない限り、データは平均値±標準偏差で表した。P値は、データの特徴に応じて、t検定（年齢、BMI、心拍数）、Mann-Whitney検定（QTc）、またはFisherの正確検定（性別）を用いて算出した。
マウスにおける抗生物質の曝露
アジスロマイシンは飲料水に不溶性であるため、エリスロマイシンのみをマウスモデルで検討した。C57BL/6雌マウス（7～8週齢）を、飲料水中のエリスロマイシンエチルコハク酸塩20 mg/kgを投与する群と、普通の水を投与する群に無作為に割り付け（1群あたりn＝24、1ケージあたり3～5匹、6ケージに割り付けた）、90日間投与した。エリスロマイシンエチルコハク酸塩の投与量の計算は補足資料に詳述されている。抗生物質投与前と90日目に新鮮な糞便を採取した（補足情報）。マウスは水と餌（Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Envigo, Huntington, United Kingdom）を自由に摂取でき、South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI) Bioresources animal facility（南オーストラリア州、オーストラリア）で飼育・管理された。マウスの研究および処置は、SAHMRI動物倫理委員会（SAM133、SAM269、SAM378）の承認を得た。
無菌マウスにおける抗生物質曝露と微生物叢移植。
無菌C57BL/6雌性マウス（6～7週齢）を、IsoPケージ（Techniplast社、イタリア）に無作為に3匹ずつ入れ、4群に分けた（1群あたりn＝7～9匹）。無菌マウスには90日間、普通の飲料水かエリスロマイシンエチルコハク酸塩（20 mg/kg相当）を含む飲料水を与えた。無菌マウスにドナーのコントロールまたはエリスロマイシンによって破壊された微生物叢を移植することは、それぞれの群から3匹のドナーマウスから調製したプール盲腸材料を用いて、以前に記載されたように行った(46, 47)。すべてのマウスは水とオートクレーブ処理した餌（Teklad Global 18% Protein Rodent Diet）を自由に摂取できた。
宿主生理の測定。
ヒト糞便サンプル(48)およびマウス糞便ペレット(46)の糞便pHは、FE20 FiveEasy pH meter (Mettler-Toledo AG, Schwerzenbach, Switzerland)を用いて測定した。マウスの消化管通過時間は、カルミンレッド色素（0.5%メチルセルロース中の3%[wt/vol]溶液）（Sigma-Aldrich, St. マウスの盲腸重量は試験終了時に記録した（補足資料）。
糞便DNA抽出および微生物プロファイリング。
ヒト糞便サンプルおよびマウス糞便ペレットからの細菌DNAは、DNeasy PowerLyzer PowerSoilキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて、メーカーの説明書に従って抽出した(50)。総細菌量の定量（16S rRNA遺伝子をターゲットとする）は、SYBR Greenをベースとするアッセイを用い、前述と同様に行った（51）。
ショットガンメタゲノムシーケンスライブラリーは、TruSeq Nano DNA Library Prepキットを用いて抽出したすべてのヒト糞便DNAに対して行い、NovaSeq 6000システム（Illumina、サンディエゴ、米国）でペアエンドシーケンス（150 bp）を行った。シーケンスリードの出力およびクオリティフィルタリングパラメーターは補足資料に記載されている。以前のパラメーター（52）に従ってダウンストリーム解析に使用したサンプルは、少なくとも138塩基、Q30スコア≧20の2230±290万リードの品質フィルター付きリードであった。種レベルの微生物プロファイリングはMetaPhlAn3を用いて行い、遺伝子ファミリーと代謝経路量の機能プロファイリングはbioBakeryワークフロー内のツールであるHUMAnN3を用いて行った(53)。
マウスの糞便ペレットから抽出したDNAは、V4超可変領域の16S rRNAアンプリコン配列決定に使用した(50)。アデレード（オーストラリア）のSouth Australian Genomics Centre（SAGC）で、Illumina MiSeqプラットフォームを使用し、MiSeq v3キット（2×300 bp）を用いてアンプリコンライブラリーのインデックス付けとペアエンドシーケンスを行った。シーケンスデータは、ダウンストリーム解析の前に4,459リードにサブサンプリングした。α多様性（観察された種、Pielou均等性、Shannon多様性H′）、β多様性（加重UniFrac距離）、および細菌の相対存在量を測定するためのペアエンドリードの計算解析は、前述（46）のようにQIIME2プラットフォーム（54）を用いて実施した。
血清タンパク質の定量。
サイトカインおよびケモカイン（TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、MCP-1、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A）、成長因子（HGF、FGF-2）、炎症マーカー（C反応性タンパク質[CRP]）、およびリポ多糖（LPS）を含む免疫関連バイオマーカーの血清濃度； ならびに、宿主のグルコース代謝（GIP、5-HT、C-ペプチド、インスリン、GLP-1、グルコース、グルカゴン、PYY）、脂質代謝（アディポネクチン、レプチン）、および胆汁酸恒常性（FGF-19）に関連するホルモンおよび分子を含む代謝マーカーは、市販の多重免疫測定パネル（Milliplex）と酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を組み合わせて定量した。アッセイは、製造元の説明書に修正を加えて実施した（補足資料）。
糞便メタボローム解析
マウスの糞便メタボローム特性は、以前に記載されたように、プロトン核磁気共鳴（1H NMR）によって決定した（55）。糞便メタボローム解析は、NMR スペクトル強度を確率的商正規化およびパレートスケーリング (56) して行った。
糖負荷試験
マウスは給餌トレイを取り除き、絶食トレイのある新鮮な寝床に12～14時間絶食させた。すべてのマウスは、絶食期間中、普通の飲料水またはエリスロマイシンエチルコハク酸塩（20 mg/kg相当）を含む飲料水を自由に飲むことができた。グルコース（2 g/kg体重、滅菌0.9%塩化ナトリウムに溶解）を腹腔内注射し、グルコメーター（Abbott Freestyle Freedom Lite、オーストラリア）を用いて尾の先端から血糖を測定した。血糖測定は、グルコース投与後0分（基礎値）、15分、30分、60分、120分に行った。
マウスの代謝および行動モニタリング
マウスはPromethion Metabolicケージシステム（Sable Systems International, NV, USA）に個別に収容した（各群n = 3）。24時間の順化期間後、代謝および行動情報を昼夜2サイクル連続で記録した。
統計分析。
データ分布の正規性はShapiro-Wilk検定を用いて決定した。対の標本間の比較はt検定（パラメトリックデータ）またはWilcoxon検定（ノンパラメトリックデータ）を用いて行った。対になっていないサンプルは、対になっていないt検定（パラメトリックデータ）またはMann-Whitney検定（ノンパラメトリックデータ）を用いて分析した。試験結果に対する食事に関連した影響を最小化するために、抗生物質投与前後のヒト糞便サンプルの一対比較を行った。PRIMER7（PRIMER-E、Plymouth）を用いて、Bray Curtis距離（ショットガンメタゲノミクスデータ）および属レベルの相対存在量（16S rRNAアンプリコン配列データ）に対する重み付けUniFrac距離に基づいて距離行列を作成し、微生物叢組成の群間差をPERMANOVA（57）により評価した。ネズミの微生物多様性解析は、ケージをランダム因子とした混合モデルを用いて行った。マウス腸内細菌叢の距離行列とメタボロームデータの相関は、Rパッケージdcov（v0.1.1）を用いて距離の共分散を検定することで評価した。血清バイオマーカー解析では、エリスロマイシン群またはアジスロマイシン群全体でサンプルの60％以上で検出閾値以上に達したもののみを解析した。血清バイオマーカー値の一対比較は、Rの線形混合モデル（lme4 v1.1-23およびlmerTest v3.1-1）を用いて行った。マイクロバイオームの特性と宿主バイオマーカー間の相関分析は、反復測定相関のRパッケージrmcorr（v0.5.4）を用いて行った。マクロライドに反応したマイクロバイオームの変化、および宿主の免疫・代謝マーカーの評価は、偽発見率法を用いて多重検定を補正したが、変化間の探索的相関分析は補正しなかった。
データの入手可能性
本研究で作成および／または解析したデータセットは、NCBI Sequence Read Archiveのaccession no. PRJNA851177（ショットガンメタゲノム配列データ）、またはPRJNA851193およびPRJNA592263（16S rRNAアンプリコン配列データ）。
謝辞
プロメチオン・メタボリックケージの研究に協力してくれたAmanda Page、無菌マウスの研究に協力してくれたSamay TrecとMariah Turelliに感謝する。本論文に記載されたNMR実験は、キングス・カレッジ・ロンドンの生体分子分光学センターで、ウェルカム財団のMulti-User Equipment Grantと英国心臓財団のInfrastructure Grantを利用して取得した装置を用いて実施した。NMR実験を手伝ってくれたAndrew Atkinsonに感謝する。
J.M.C.、L.D.B.、G.B.R.は本研究の構想を練り、S.L.とM.M.はヒト研究のサンプルとデータの取得に貢献し、J.M.C.とA.R.はマウス研究のサンプルとデータの取得に貢献した、 J.M.C.、A.M.、E.S.、F.M.M.、T.K.はデータの正式な解析と解釈を行い、J.M.C.、S.L.T.、L.D.B.、D.J.K.、A.J.M.、G.B.R.は原稿の準備と改訂に貢献した。すべての著者が最終原稿を確認し、承認した。
競合する利害関係はないことを宣言する。
補足資料
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