RNAウイルスとウイロイド様要素のハイブリッドが真菌類で複製される
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発行：2023年5月5日
RNAウイルスとウイロイド様要素のハイブリッドが真菌類で複製される
https://www.nature.com/articles/s41467-023-38301-2
マルコ・フォルジア
ベアトリス・ナバロ
...
マルコス・デ・ラ・ペーニャ
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：2591（2023） この記事を引用する
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指標詳細
要旨
地球上の生命は自己複製するRNAとして誕生した可能性があり、RNAウイルスやウイロイド様要素はそのような細胞以前のRNA世界の名残であると論じられてきた。RNAウイルスはRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）をコードする直鎖RNAゲノムで定義され、ウイロイド様要素は小さな一本鎖の環状RNAゲノムで構成され、場合によっては対になった自己切断リボザイムをコードする。本研究では、地理的・生態的に多様なニッチに存在するウイロイド様要素の候補の数が、これまで考えられていたよりもはるかに多いことを明らかにした。これらの環状ゲノムのうち、真菌類のアンビウイルスがローリングサークル複製を行うウイロイド様要素であり、自身のウイルスRdRpをコードしていることを報告する。このように、アンビウィルスはウイロイド様RNAとウィルスのハイブリッドな特徴を持つ別個の感染性RNAであることがわかった。また、ミトコンドリア様真菌ウイルスに関連する、活性リボザイムを持ちRdRpをコードする同様の環状RNAを検出し、真菌がRNAウイルスやウイロイド様要素の進化的ハブであることが明らかになった。今回の発見は、RNAウイルスとウイルス様要素の深い共進化の歴史を示すものであり、原始感染体やRNA生命体の起源と進化に新たな視点を提供するものである。
はじめに
遺伝情報のコード化と生物学的触媒の2つの機能を持つRNAは、生命の起源においてDNAやタンパク質よりも先に存在した「RNAワールド」であると提唱されている1,2,3。さらに、現存するサブウイルスやウイルス性病原体は、地球最初の生命の分子生物学を解明するための「生きた化石」であることが示唆されている4,5。
RNAゲノムを持つウイルス（領域リボウイルス）は、RNAウイルスの場合はRdRp、レトロウイルスの場合はRTのいずれかの複製ポリメラーゼ（レプリカーゼ）をコードする直鎖RNAゲノムを持つ感染体である。これらのポリカーゼは、RdRpとRT6の保存された手のひらドメインのアラインメントに基づくと、リボウィリアは単系統であることが判明している。
ビロイドおよびビロイド様物質（ヒト衛星ウイルス、肝炎デルタウイルスなど）は、動植物の感染性サブウイルスRNA因子である（図1A）。これらのウイルスは、一本鎖の小さな環状RNA（circRNA）ゲノムを持ち、そのゲノムは、典型的には棒状または枝分かれした棒状の二次構造を形成していることが特徴である。その中には、各鎖の極性に1つずつ、対になった自己切断触媒RNAまたはリボザイムをコードするものがある。これらの自己触媒性リボザイムは、タンパク質が存在しない場合、circRNAゲノムの複製中に生成されるオリゴマーRNAの部位特異的なホスホジエステル切断をローリングサークル機構で行う構造RNA要素である4、5。これまで、感染性circRNAで報告されているリボザイムは、ハンマーヘッド（HHRz）7、ヘアピン（HPRz）8、肝炎デルタ（DVRz）リボザイム9、10です。RNAウイルスとは異なり、感染性circRNAは宿主（ウイロイドや肝炎デルタウイルス）やヘルパーウイルス（サテライトcircRNA）がトランスでコードするRNAポリメラーゼによって複製される。さらに、ウイロイドがノンコーディングRNAであるのに対し4、デルタウイルス様RNAは保存されたデルタ抗原タンパク質をコードし、リボジビリアという領域に割り当てられています11。全体として、感染性circRNAのシンプルなゲノムと小さなリボザイムは、これらの要素が前生物界の分子化石とみなされる理由である4。
図1: サブウイルスとアンビウイルスのcircRNAゲノム構成と、2つのアンビセンスリボザイムを持つcircRNAゲノムのサイズ分布。
A circRNAのゲノムを持つ代表的なサブウイルスおよびウイルス剤のゲノム構成：植物由来のノンコーディングウイロイドおよびウイロイド様サテライトRNA、動物由来の抗原タンパク質をコードするデルタウイルス様（リボジビリア）、真菌由来のRdRpをコードするアンビウイルス。B 90%塩基配列同一性で検出された20,364種の種様運用分類単位（sOTU）の塩基長に基づく分布グラフ。小型またはウイロイド/ゼータウイルス様14（200-800 nt、14,526種）、中型（800-1200 nt、3233種）、中型またはデルタウイルス様（1200-2200 nt、1951種）、大型またはミトウイルス様（3000 nt前後、147種）、非常に大型またはアンビリウイルス様（5000 nt前後、653種）の主要5グループ内の概数sOTUが示されている。
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アンビウイルスは、真菌類の一本鎖RNA感染症として最近特徴づけられ、広く知られるようになったグループであり、各極性鎖に1つずつ、2つの保存されたオープンリーディングフレーム（ORF）AおよびBをコードする5 kb程度のバイシストロン型のアンビセンスゲノムを持っている（図1A）。ORF-AはウイルスのRdRpsと類似しているため、これらの薬剤はRNAウイルスとして報告されている。しかし、ノーザンブロッティング、RT-PCR、de novo転写産物アセンブリでは、3'と5'末端が連続しており、典型的な線状RNAウイルスゲノムの想定とは矛盾していた12, 13。
このように、地理的・生態的に多様なニッチで発生する新しいウイロイド様circRNAの可能性は、これまで考えられていたよりもはるかに高いことが報告された。その中でも、最も魅力的な要素であるアンビウイルスを調査することにした。アンビウイルスは、circRNAゲノムを持ち、生体内で活性を持つ対の自己切断リボザイムをコードし、ローリングサークル機構による複製を可能にする、これまで報告されてきたウイロイド様RNAの典型的な特徴を持っていることを明らかにしました。しかし、我々はさらに、ORF-Aが古典的なRNAウイルスのような機能的なRdRpの典型的な特徴を持っていることを明らかにした。このように、アンビウイルスは、ウイロイド様ゲノム骨格とRNAウイルスの特徴的な遺伝子RdRpの遺伝子組み換えによって生まれた可能性が高く、感染性RNAの中間クラスであると考えられる。この発見は、ウイルスとウイロイドのRNAビロスフィアをつなぐものであり、その起源と（共）進化に関する深い問題を提起している。
研究成果
超高速スクリーニングによる新規サブウイルス剤の同定
リボザイムを持つ新規サブウイルス剤をスクリーニングするために、RNAウイルス探索に用いられてきたSerratusの超高速計算アーキテクチャ14を応用し、Sequence Read Archive15,16で自由に入手できる198,194個のメタゲノム/メタトランスクリプトームからINFERNALを用いてリボザイムを検索した。リボザイムにヒットした上位5000個のライブラリーを、これまでのRNAウイルスアセンブリとTranscriptome Shotgun Assembly（TSA）と組み合わせ、58,557個のライブラリーからなる「RNA Deep Virome Assemblage」（RDVA）を作成しました。125億個のアセンブルされたコンティグから、3400万個が円形分子と一致する5'-3'k-merのオーバーラップを含んでいました。さらに、プラスセンスのリボザイムとマイナスセンスのリボザイム（ペアリボザイム）の両方をコードする円形コンティグをフィルタリングした結果、リボザイムを持つ円形の可能性がある32,393個の発見セットが得られ、これらは90%の塩基配列同一性を持つ20,364ユニットにクラスター化されました。そのサイズから、クラスターの大部分は、小型ゲノム（70%が200-800 nt長）または中型ゲノム（25%が800-2 kb）の異なる集団に分類され（図1Bおよび補足図1）、それぞれウイロイドおよびデルタウイルス様ゲノムの特徴として、円形性、予測される安定二次構造（棒状または分岐）、2つのアンビセンス・リボザイム、多様なタンパク質コード能力などが挙げられる4．最近報告されたように14,17、これらのRNAのほとんどは、宿主の推定が困難な環境メタトランスクリプトミクスに出現する。しかし、Rhizoctonia solaniとTulasnella属の分離株のランを解析したところ、ウイロイドやデルタウイルスに似たゲノムが7例見つかり、これらはRNA種としてのみ存在することが確認され、新しい感染性のサブウイルスである可能性が高いことがわかった（補足図2）。しかし、興味深いことに、検出された全サーキュラーゲノムのかなりの割合（〜4％）は、サブウイルスが持つ典型的なcircRNAの長さとは異なり、非常に大きなサイズ（〜3〜5kb）を示している。
アンビウィルスはリボザイムを持つcircRNAゲノムを持つ
リボザイムを持つ大きなcircRNA（〜5 kb）の解析から、多様なアンビウイルスゲノムとの配列類似性が明らかになり、5' RACE解析から得られたその珍しい特徴は、円形ゲノムに起因する可能性が示唆された（補注1および補図3）。さらに、公表されているアンビウイルスゲノムをINFERNAL18で構造化RNA共役モデルとの配列相同性を解析しました。その結果、ほとんどのGenBank配列で、サブウイルスcircRNAを彷彿とさせる、頭から尻尾まで向いたアンビセンスHHRzまたはHPRzモチーフが発見された（補足表1）。
当初報告されたアンビウイルスORF-AとRdRpの類似性は、その深い分岐のため、統計的に有意ではなかった12,13。しかし、RDVAや他の公開データベースでアンビウイルスのRdRpを検索したところ（Methods参照）、最大で974種類のRdRpをコードするアンビウイルスが見つかり、これらは90%の掌紋アミノ酸同一性を持つ439のsOTUに分類された19。また、これらのゲノムは、多様な環境データセットに広く存在していることがわかった（補足図4）。このようにアンビウイルスRdRpの配列数が多いことから、配列のみからタンパク質の深い相同性を評価する能力を拡張したインシリコ構造予測をさらに活用する機会が得られた20。ORF-AのColabFold-AlphaFold2予測では、これらのタンパク質が古典的な右手手のひらドメイン構造をとり、ネガルナウイルスRdRps（インフルエンザA、Zスコア>19、RDSM 3.8 A）と最も構造類似性が高いことが支持されました（補足図5）。また、ポリメラーゼの触媒モチーフであるA, B, C, D, E, F19の配列が保存されていることがわかった（図2A、補足図6）。さらに、すべてのアンビウイルス潜在性円形ゲノムについて、自由エネルギーが最小となる二次構造を予測した結果、これらのRNAの大部分（90％）は、ほとんどの植物ウイロイドやデルタ様ウイルスに似た、非常に高い安定性を持つロッドまたは準ロッド様構造を採用していることがわかった。しかし、アンビウイルスゲノムの約10%は高度に分岐したRNA構造をとっており（図2B）、アンビウイルス間で広範なゲノム塩基対構造制約が保存されていることが示唆された。
図2: アンビウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼの系統樹。
代表的なArmillaria borealis ambivirus 2 (Accession MW423810.1) ORF-AのColabFold-AlphaFold2予測構造では、古典的なポリメラーゼ掌型構造が示されている。モチーフA、B、Cの触媒残基の保存は、本研究で同定され、データベースに存在するすべてのアンビウイルスで見られる。B 代表的な2つのアンビウイルスの予測されるRNA二次構造を円形にプロットしたもの。左は、ほとんどのアンビウイルスで予測される特徴的な棒状構造の例。右側は、いくつかのアンビウイルスRNAゲノムで予測される高度に分岐した構造の例で、通常HHRz/HPRzモチーフの混合ペアを持つ。C 439の異なる種のような運用分類単位（sOTUs）から得られたRNA依存性RNAポリメラーゼの掌紋の最尤系統樹です。より詳細な樹形は、補足図7で見ることができる。アンビウイルスには、多様なリボザイム使用法を示す最大6つの主要なクレードが存在する。60%までのSOTUは、イプシロンウイルス14,41や植物ウイロイド4のモチーフに非常によく似たペアHHRzを使用しているが、〜30%は2つのHPRzまたはHHRz/HPRzミックスを持ち、5%は動物デルタウイルスに特有のDVRz（ペアまたはHHRzとの混合）を持ち、3SOTUにはTWRz（P1アーキテクチャ）42とHHRzモチーフを混合していることが分かる。アンビウイルスに存在するツイスター（TWRz、オレンジ色）、ハンマーヘッド（HHRz、赤色、2種類の長さの変異体）、ヘアピン（HPRz、緑色）、デルタウイルス（DVRz、青色）のリボザイム構造（加重塩基保存基準70%）をコンセンサスとして示す。自己切断部位は矢印で示す。
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系統樹の再構築により、アンビウイルスのRdRpとそのリボザイムの複雑な自然史が示された。既知の9種類の自己切断型リボザイム21のうち4種類がアンビウイルスゲノムで見つかったことから、リボザイムの組み換えや水平移動が複数回起こった可能性が高いと考えられる（図2C、補足図7）。興味深いことに、1つのゲノム上に2つの異なるリボザイムが広範囲に混在していることもある。同様のリボザイム混合は、今回の発見セットの5%の小型ウイロイド様ゲノムでも観察され、ゲノム内に異なるリボザイムクラスが共存している可能性があることを裏付けている。
アンビウイルスゲノムの環状性と自己触媒作用の分子的検証
このインシリコによるアンビウイルスの拡張を検証するため、選択した真菌分離株において予測された配列から主要な特性を分子的に評価しました。アンビウイルスリボザイムの自己切断は、Cryphonectria parasitica ambivirus 1 (CpAV1) (2 HHRz)、Tulasnella ambivirus 4 (TuAmV4) (1 HHRz and 1 HPRz) および TuAmV1 (2 HHRz) のcDNAを in vitro転写で確認した。すべての試験配列において、転写物は自己切断を示し、得られた断片の末端は予測されるリボザイム切断部位と一致した（補足図8）。生体内でも切断が起こるかどうかを調べるために、感染したTulasnella spp.とCryphonectria parasiticaの抽出物から5' RACEを行ったところ、やはりin silico予測およびin vitro結果と完全に一致した（図3A、Bおよび補足図9）。
図3: アンビウィルスは機能的な+/-鎖リボザイムをコードし、circRNAゲノムを持つ。
TuAmV4ゲノムRNAの（A）正鎖と（B）負鎖の5'RACEとサンガー配列決定では、それぞれHHRzとHPRzモチーフの予測切断部位でin vivo自己切断（青矢印）が見られる。リボザイム二次構造はインレイとして描かれている。C, D 非変性（C）および変性（D）条件下で電気泳動により分離したRNA調製物を、（+）および（-）CpAV1 RNAに特異的なプローブでハイブリダイズしたノーザンブロットアッセイである； レーン3および4は、それぞれCpAV1感染および非感染Cryphonectria parasiticaからのRNA；RNAマーカーは、健康またはTBSV感染（それぞれCおよびDのライン1）およびTMV感染（CおよびDのライン2）した植物からのRNA。感染株において、非変性条件下でいずれかのプローブを用いて検出された単一のシグナルは、共移動すると予想される円形および直鎖のCpAV1ゲノムRNA（4663 nt）の両方に対応する（C）。変性条件下では（D）、アンビウイルスのcircRNAは、それぞれの線状体（下側のバンド）に対して遅延している。C, Dにおいて、左端の2枚はメチレンブルーで染色したtotal RNAである。同じ結果が3つの独立した実験から得られた。
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このような両極性の機能的な自己切断リボザイムは、多様なウイロイドやデルタウイルス様病原体にのみ存在することが知られている。これらの病原体はすべてcircRNAゲノムを持ち、DNAがない状態で、対称的なローリングサークル機構によって複製を行う。対称型ローリングサークル複製のもう一つの特徴は、両極性のcircRNAがin vivoで蓄積されることである22。アンビウイルスがcircRNAゲノムを持つかどうかを評価するために、CpAV1に対するノーザンブロッティングをネイティブおよび変性条件で行った（図3C、D）。ネイティブな条件下では、CpAV1ゲノムRNAは単量体RNA（予想される4623 nt付近）に対応する単一のバンドとして移動したが、変性条件下では、2つのバンドが分離された。遅延したバンドは円形の分子に対応すると考えられ、実際に上のバンドはRNase Rエキソヌクレアーゼ処理に対して優先的な耐性を示した（補足図10）。このことから、CpAV1、ひいてはアンビウイルスが、in vivoでは左右対称のローリングサークル機構で複製を行うことが明らかになった。
最後に、アンビウイルス感染に表現型を関連付けるため、アンビウイルス感染株とアンビウイルス非感染株の同系子実体を入手し、CpAV1がその真菌宿主に低ウイルス性をもたらすことを示した（補足図11）。この特徴は、この重要なクリ病に対するバイオコントロールに役立つ。これは、この新しい感染体グループに関連してバイオテクノロジーを利用できる特性を持つ最初の例である。
circRNAの自己切断型ゲノムを持つミトコンドリアウイルス
他の「RNAウイルス」がウイロイドのようなゲノム骨格を共有しているかどうかを調べるため、RDVAセットから二重極性のペアリボザイムを持つコンティグを検索し、多様なミトウイルスRdRpsと配列類似性を持つRdRp様ORF（補足表2、図4）をコードする約3kbの最大16の円形コンティグを確認した。このうち、Fusarium asiaticumミトウイルスに類似した7つの新規環状ゲノムを検出した。これらのゲノムはすべて、まれで複雑な自己切断モチーフであるVarkud Satelliteリボザイム（VSRz）の二極変異体を持っており、これまでのところNeurospora分離株のミトコンドリアVSプラスミドにのみ記載されていた23。ミトウイルスVSRzの自己切断活性は実験的に確認されたが、これらの薬剤の予測される二次構造は高度に分岐していることが判明した（図4）。これらの結果は、リボザイムを持つ円形ゲノムの存在を別のグループのRNAマイコウイルスに拡大し、ウイロイド様RNAとウイルスのハイブリッドな特徴を持つ薬剤の出現が、進化の歴史の中で何度も起こった可能性を示唆している。
図4：RdRpとリボザイムのハイブリッド分子のさらなるグループ。
A Grapevine-associated mitovirus 14 (Accession MW648461.1)の模式的ゲノム構成。寄託された配列は、ゲノムの両端にcircRNAを示す203ntの繰り返しを含む。RdRpに対応する予測されるORFは、プラス極性にツイスター（TWRz）、マイナス極性にハンマーヘッド（HHRz）リボザイムによってそれぞれ挟まれる。B ライブラリーSRR10849745（土壌メタゲノム）から検出された推定円形ゲノムを持つミトウイルスは、各極性にVarkud Satelliteリボザイムが存在することがわかる。異なるインキュベーション時間で得られた両リボザイム構築物のランオフ転写からのRNA生成物の変性PAGEは、一次および開裂RNA生成物の予想サイズを示している。自己切断部位は矢印で示し、各リボザイムの保存ヌクレオチドは赤で示した。
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考察
感染性circRNAは生物学的に奇異なものと考えられており、植物ウイロイドやヒトデルタウイルスのようなウイロイド類似種は50種以下であると認められている24。本研究では、2万種以上の潜在的なウイロイド様エレメントを報告し、それらがこれまで評価されてきたよりも広範囲に存在し、さらなる分子的特徴付けが必要であると提唱する。これらのウイロイド様要素は、小型のウイロイド様要素、中型のデルタ様要素、大型のウイルス様要素に及び、自己触媒リボザイムとウイルスRdRpをコードする円形ゲノムを持つハイブリッド感染性RNAであることが判明した。今回の発見は、従来、ウイルスとウイロイド様RNAの区別は、それぞれの線状ゲノムと円形ゲノムに基づき、独自のレプリカーゼをコードするかしないかで行われてきたが、これに新しい視点を提供するものである。アンビウイルスとミトウイルスは、リボザイムをコードするcircRNAの宿主を真菌類に拡大したほか、感染性リボザイムをコードするcircRNAのゲノムサイズをそれぞれ5kbと3kbまで拡大したハイブリッド感染体の2例である。ゲノムサイズの拡大は、小さなウイロイド様RNAのバックボーンに新しい遺伝情報を組み込むことで、その結果生じるゲノムのエネルギー的コストを克服する必要があるため、有利に作用した。
アンビウイルスとミトウイルスでそれぞれTWRzとVSRzが同定されたことは、感染性circRNAの複製に関与するリボザイムの種類が、これまで考えられていたHHRz、HPRz、DVRzに限られないことを示し、報告された数千の新しいウイロイド様circRNAの可能性に、他の既知またはまだ知らないタイプのリボザイムの複製に関与する可能性を示唆しています。また、同じ環状ゲノムの中で異なるリボザイムが組み合わされることは、異なるタイプのリボザイムが頻繁に共存することを示しており、ウイロイド様要素の間で遺伝情報の水平移動が起こる可能性を示唆している。これらの知見を総合すると、ハイブリッド感染体の起源に関する興味深い疑問が浮かび、各極性鎖の自己切断活性を持つRNAモジュールと必要なレプリカーゼ活性をコードする遺伝子との間の組換え現象が大きな役割を果たすことが支持される。
計算機の進歩により、これらの要素（RNAウイルスと同様）は飛躍的に発見されるであろうが14,25、この新しい感染性物質の宇宙を共同で分子的に特徴付けることに重点を置くべきである。一般に、これらの病原体は、ミトコンドリア（一部のミトウイルス）、真菌（アンビウイルス）、植物（ウイロイド）、動物（デルタ様ウイルス）の感染性病原体とされているが、これらの宿主分布がまだ限られているのは、あらゆる王国にわたる感染性circRNAの多様性を私たちが知らないことを表していると考えられる。
今回、菌類が感染性circRNAを保有することをin vivoで証明したことで、ウイロイド様分子の宿主は、植物や動物だけでなく、菌類も含まれることが実験的に確認されました。真菌類は、動植物の宿主と複数の共生関係を持つことから、今回紹介したような感染性要素の王国を超えた水平移動が起こる拠点となることが期待される26。また、CpVA1感染に伴う表現型は、これらのウイロイド様感染体がホロビオントの新しい構成要素であり、種内表現型の変動に寄与している可能性を示唆している。さらに、これらの病原体（特にアンビウイルス）は、RNAテンプレートからタンパク質発現を安定化するためのさらなるステップであるcircRNA発現ベクターに発展する可能性もある27。
ウイロイドの急速な変異率28、リボザイムを交換するウイロイド様要素の性質（ここに示すように）、および系統解析の限界を考えると、感染性circRNA間の深い進化的関係（アンビウイルスのゲノム起源など）は、おそらく不明である。さらに、HHRzのような構造的に単純なリボザイムは、比較的単純なヘッド・トゥ・ヘッド結紮RNAのように、進化の過程で自然に生じることがあり29、最も単純なクラスの感染性circRNAは、継続的にde novo進化しているかもしれないという考えを支持している。ウイロイドのようなcircRNAは、デルタ抗原やウイルスRdRpなどの遺伝子を獲得し、より複雑な存在を生み出すことができるため、宿主のRNAポリメラーゼは、地球の原初の「ウイルス」を生み出すために進化してきた可能性があると考えられる。おそらく最も興味深いのは、初期のRNA複製酵素リボザイムを獲得することで、RNAの世界で最も単純な複製者の設計図となり、生命の起源を決定する大きな一歩となることである4。
研究方法
Sequence Read Archiveのリボザイム検索
リボザイムは、100 nt以下の短い塩基配列で捕らえることができることから、大量の塩基配列データをスクリーニングして、リボザイムを含む可能性のあるライブラリを特定することが可能であると考えられた。この目的のために、私たちは、超高スループットのSerratusクラウドコンピューティングプラットフォーム14と、二次構造とヌクレオチド共分散モデリングを用いてRNA要素を特定するアルゴリズムであるINFERNAL18を適応させました。Serratus-INFERNAL（https://github.com/ababaian/serratus/tree/infernal-dev）を用いて、Sequence Read Archive（SRA）にある198,194個の公開メタゲノム/メタトランスクリプトームシーケンスライブラリーを対象に、デルタ、ヘアピン、ハンマーヘッド、ツイスター、Varkud satelliteリボザイム（ハチェット、ピストール、ツイスター姉妹、glmSリボザイムは過去の解析でヒットしなかったため廃棄）のスクリーニングを実施しました。SRAの検索クエリは、2022-01-13に "METAGENOME" OR "METATRANSCRIPTOME" OR "metatranscriptomic"[Filter] OR "metagenomic"[Filter] NOT amplicon [All Fields] AND "platform illumina"[Properties] AND cluster_public[prop]" のセットからランダムにサブサンプリングされました。その後、SRAのフォーカス配列アセンブリのために、ライブラリの品質と明確なリボザイムヒットの数、および配列の深さに基づき、ヒューリスティックにライブラリをランク付けしました。候補となるウイロイド様およびリボザイム配列は、以下の基準で同定され、そのすべてが満たされる必要がある： (1) 円形分子を示唆する5'-3'末端k-merオーバーラップの存在、(2) E値<1e-3の1つのリボザイムモデルに対する一対の相補的ヒット、(3) dust30、Tandem Repeat Finder31およびublast32によるセルフヒットの報告の組み合わせによる<25%反復配列、。90%同一性のある種のようなOperational Taxonomic Unitsへのクラスタリングは、circuclust (https://github.com/rcedgar/circuclust)を用いて行われました。
アンビウイルスRdRpsのバイオインフォマティクスによる検出と系統分類
GenBankに寄託された19のアンビウイルスゲノム（09-2021）、または公開メタトランスクリプトームデータセット（「メタトランスクリプトーム」または「メタトランスクリプトーム」［フィルター］）からINFERNALを用いて検出した169のアンビウイルス様配列（推定完全円またはゲノムフラグメント）由来のRdRps (ORF-A) はアンビウイルスモチーフA、B、Cに対する合意配列構築に使用されました。得られたアンビウイルスパームドメインのコンセンサス配列に基づき、アンビウイルスRdRp検出が可能なpalmscanソフトウェアの新バージョン(https://github.com/rcedgar/palmscan)を構築しました。RDVAの円形コンティグを対象にpalmscanによる検索を行ったところ、GenBankから得られたものと合わせて439個のambiviral RdRpが90%の配列同一性で得られた（https://github.com/ababaian/serratus/wiki/ambivirus_extended_data/)。クラスター化したRdRpの掌紋配列に対してMUSCLE33を用いて多重配列アライメントを行い、MEGA1134を用いてアライメントから最尤樹を推論した。アンビウイルスゲノムの自由エネルギーが最小となる2次RNA構造は、ViennaRNA Package35のRNAfoldプログラムを用いて計算した。得られた構造は、jupiterソフトウェア（https://github.com/rcedgar/jupiter）を用いて得られた円形プロットにより可視化した。
液体培地での真菌の増殖
分子解析用の真菌の菌糸を得るために、CpAV1を含まない3株とCpAV1に感染した3株を生物学的三重奏で液体培地に植え付けた（18サンプル）。培地は，24 g/L ポテトデキストロースブロス（PDB）（SIGMA）に，長さ8 cmのヨーロッパ栗（Castanea sativa）2本（長手方向に切断）を121 ℃で1時間オートクレーブしたものを加えたもので，50 mLを100 mLコニカルフラスコに移し，すべての検体とした．次に、液体培地12.5 mLを50 mLコニカルFalconTMチューブ（CorningTM Fisher Scientific）に集め、各レプリカートについて30個の菌糸体プラグを移した。Omni Tissue Homogenizer（Qiagen）を用いて組織を1分間破砕し、均質化したペースト3.5 mLを液体培地の入った各コニカルフラスコに接種した。培養液は、室温で120rpmで常に振とうしておいた。
接種後3日目に、菌糸を液体培地から分離するために、真空ポンプに接続された1層のMiracloth（Calbiochem）で覆われたBuchner漏斗でろ過することによって真菌培養物を収穫した；収穫した菌糸を-80℃で冷凍し、45時間凍結乾燥した（EDWARDS MODULYO freeze dryer）。各レプリケートの菌糸体乾燥重量は、トップパン天秤で測定した。
Tulasnella属の単離株は、液体培養で増殖させ、上記のように収穫して凍結乾燥した。
RNA抽出
RNA抽出は、Spectrum Plant Total RNAキット（SIGMA-Aldrich）を用いて、製造者のプロトコルに若干の修正を加えて行った：簡単に言えば、凍結乾燥した菌糸体（100mg）を、Oリング（Biosigma）付き1.5mL円錐形微量遠心管で、MP BiomedicalsTM製のFastPrep-24TMホモジナイザーを用いて10、4.5mm直径、セラミックビーズを使用して設定6で30秒間壊した。1:100容量希釈の溶解バッファーと2-メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）の1mL混合液をサンプルに加え、上記と同様にビーズビーターをもう1周して菌糸を抽出した。その後、サンプルを10,000×gで4分間遠心した。上清の700μLをキットに付属のフィルターカラムチューブに移し、同じスピードで30秒間遠心をした。カラムを廃棄し、フロースルーに結合液700μLを加えた。この混合物を、上記と同様にさらに遠心分離して、結合カラムに通した。カラムを回収し、新しい回収管に移し、洗浄バッファーIおよびIIで2回洗浄した（それぞれ600および700μL）。その後、RNAを40μLの溶出バッファーで溶出した。RNAの定量は、Nanodrop LITE Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)を用いて行われた。
アンビウイルスゲノムの末端配列のin vivoでの特性評価
C. parasitica株ACP3413由来のCpAV1、Tulasnella属（それぞれMUT4048株およびMUT4047株）12由来のTuAmV1およびTuAmV4について、Hirzmann法36を用いてRace (Rapid Amplification of cDNA Ends) 分析を実施しました。簡単に説明すると、アンビウイルスゲノムのポジティブセンスとネガティブセンスの5'末端のcDNAを、Thermo Scientific社のFirst Strand cDNA synthesis Kit #K1612を用いて 、メーカーのプロトコルに従って特定のプライマー（補足データ1）で合成し、Zymo clean and concentrator 5 kit（Zymo research, Irvine, CA, USA）で洗浄して、ターミナル・トランスフェラーゼ（NEB社 Ipswich, MA, USA）で処理してポリAまたはポリGテールを付加させた。Terminal Transferase反応後、DNA Clean & ConcentratorTM 25 (Zymo research, Irvine, CA. USA)を用いてcDNAを洗浄した、 USA）を用いて最終溶出量を10μLとし、得られたcDNAの1μLを鋳型として、Taqポリメラーゼ（Biorad社のOneTaqキット）を用いて、製造者のプロトコルに従い、特定のプライマーと付加したテールに相補的なアンカー型ポリTまたはポリCプライマーを用いて、51℃でのアニールステップを30秒、68℃での延長ステップを15秒、98℃での変性ステップを15秒間行うPCR反応を実行しました。得られたアンプリコンを1％アガロース1×TAEバッファーのゲル電気泳動で分画し、Zymo gel DNA recovery kit（Zymo research, Irvine, CA, USA）を用いて精製し、製造者の指示に従ってpGEM-T easy vector system（Promega, Madison, WI, United States）でクローニングした。ライゲーション産物は、調製したDH5アルファ大腸菌細胞で形質転換し、Mix&Goのプロトコルおよび材料に正確にしたがって形質転換させた！E. coli Transformation Kit (Zymo Research)のプロトコールと材料に正確に従った。得られたクローン（各コンストラクトについて、末端領域を含む少なくとも3つのクローン）のサンガー配列決定は、補足データ1に詳述されている特定のプライマーを用いてBiofab research（ローマ、イタリア）により行われた。
二本鎖RNAの配列決定に最適化されたLambdenら37から改変した方法により、CpAV1およびTuAmV1アンビウイルスゲノムのポジティブセンスおよびネガティブセンスの両方の3'末端を直接配列する試みを行ったが、すべて失敗に終わった。簡単に説明すると、5'-リン酸化、3'-アミノ結合したオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを、T4 RNAリガーゼを用いて抽出した全RNA（1μg total RNA）の3'末端に4℃で一晩ライゲートさせた。ライゲーションしたRNAをカラム（Spectrum Plant Total RNA kitの結合カラム、SIGMA）で洗浄し、ライゲーションしたアダプターに相補的なプライマーでcDNAを合成し（Superscript IV、サーモフィッシャー）、Zymo clean and concentration 25 kit（Zymo research, Irvine, CA, USA）で最終溶出量25μLで洗浄； 得られたcDNAの1μLを用い、特異的プライマーとcDNA合成に用いたプライマーを用いて、アニーリング温度を55℃とした以外は上記と同条件でPCR反応を行った。
in vitroにおけるRNAの自己開裂の解析
代表的なアンビウイルス（CpAV1、TuAmV1、TuAmV4）のHHRzおよびHPRZ、ならびにSRR10849745ライブラリーで検出したミト様ウイルスのVSRzの自己切断活性を、それぞれのリボザイムのcDNAを含む組み換えプラスミドを転写してin vitroでテストしました。リボザイムを含むウイルスRNA断片のcDNAは、補足データ1に記載された適切なプライマーを用いて増幅するか、gBlock Gene Fragments (Integrated DNA Technologies) として購入し、pBlueScript KSまたはpGEM-T easy Promega, (Madison, WI, United States) にサブクローン化して、配列を決定し、方向と望ましくない変異の不在を確認した。適切な制限酵素で線状化した組換えプラスミドを、T7 RNAポリメラーゼ（Thermo-Fisher Scientific）を用いて、メーカーから提供されたバッファーを用いて37℃で2時間インビトロで転写し、反応生成物を変性5% PAGE 8M尿素および1×TBE（89mMトリス、89mM硼酸、2.5mM EDTA、pH 8.3）によって分離し、エチジウムブロミドで染色し、紫外線可視化した。HHRzおよびHPRzモチーフの3'自己切断産物の5'末端ヌクレオチドは、5'RACE実験によって決定した。簡単に説明すると、インビトロ転写中の各試験リボザイムの自己開裂によって生成した3'RNA断片を、水飽和フェノールと緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.9、1：1）の混合液で粉砕してゲルから溶出した。 9、1mM EDTA、0.5% SDS)で粉砕し、エタノール沈殿により水相から核酸を回収した38その後、補足データ1に示したプライマーを用いて、上記のように5'RACEによりそれらの5'末端配列を決定した。
ノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイ
総RNAの変性条件下でのアガロース（1％）ゲル電気泳動は、HEPES EDTAバッファー中の6Mグリオキサールと50％v/v DMSOを用いて行い、RNAサンプルを55℃で20分間保持してからロードし、以前に記述したプロトコルに従った12。非変性条件下でのRNA調製物のアガロースゲル電気泳動は、ロード前に変性させることなく1×TAEで実施した。
電気泳動後、RNAをImmobilon-Ny+膜（Merck, Darmstadt, Germany）上にブロットし、Biorad gs gene linker UV chamber（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）で架橋を実施した。この膜を、Dig-RNA labeling mix（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ）を用いたin vitro転写により合成されたCpAV1の（＋）または（-）極性鎖に特異的なジゴキシゲニン（DIG）ラベル化リボプローブと、2798位から3088位のCpAV1 cDNA挿入体（ORFAに位置）および1628位から1998位（ORF Bに位置）をそれぞれ含む線形のプラスミドとハイブリッドした。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは、DIG easy Hyb（Roche Applied Science, Germany）バッファー中、65℃で実施した。ハイブリダイゼーション後、膜は2×SSC（0.3M NaCl, 0.03M sodium citrate, pH 7）、0.1% SDSで10分間室温で2回、0.1×SSC, 0.1% SDSで65℃、15分間2回洗浄しました。ハイブリダイゼーションシグナルは、抗DIGアルカリフォスファターゼコンジュゲートABフラグメントと化学発光基質CDP-star（Roche Applied Science、ドイツ）を用いて、製造者の説明書に従って明らかにし、Chemidoc Touch Imaging system（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）で可視化した。
切断されたゲノムの末端配列に関するqPCR
アンビウイルスRNAのゲノム鎖と抗原鎖の末端断片が完全に相補的であるかどうかを調べるために、TuAmV1 RNAの鎖特異的qPCR解析を行った。ゲノム鎖または抗原鎖上のいずれかに特異的にアニールし（補足データ1）、RACEによって見つかった末端推定配列上、または上流/下流領域のいずれかに設計したプライマーで同量のRNAからcDNAが合成された。プライマーのペアはORF Aに設計され、得られたqPCR生成物は末端配列の定量化のための内部参照として使用された。cDNAをカラム精製し（DNA Clean & ConcentratorTM 25 Zymo Research）、同じプライマーを用いて標準的なqPCRを実施した：簡単に言うと、qPCR反応はSYBR® Green Master Mix（Biorad）を用いて10μL最終容量で実施した。各10μLの反応ミックスには、5μLのミックス、4μLの滅菌水、0.2μLのフォワードおよびリバースプライマー（補足データ1）、および1μLのcDNAが含まれていました。増幅は96ウェルプレートでCFX Connect Real-Time PCR Detection System（Biorad）を用い、95℃で3分、95℃で20秒、60℃で30秒のサーモサイクル条件を40サイクル行った。定量は、内部参照に対する量として報告された。
RNAse R 消化
RNAse R (Lucigen) を使用して、CpAV1上のアンビウイルスゲノムの環状性を試験した。感染したC. parasitica ACP43からの2μgの全RNAを含むサンプルを、RNAse R 1X反応バッファ、1UのRNAse Rで37℃で5、15または30分インキュベートした。ネガティブコントロールは、2μgの全RNAをRNaseRを含まない反応バッファーと混合し、時間0と37℃でのインキュベーションの30分後にテストしたものである。反応の不活性化は、ノーザンブロット変性ミックス（上記のノーザンの説明を参照）を各サンプルに加え、65℃で20分間インキュベートして行った。変性したサンプルは、変性アガロースゲル電気泳動とノーザンブロッティングにより、上記の報告に従って分析した。
アンビウイルス感染株およびアンビウイルス非感染株の作製
分離株-ACP34-は、もともとアゼルバイジャンの明らかなキャンカーを持つ罹病樹（Castanea sativa）から採取されたものである13。C. parasiticaの分離株は、PDA培地で4℃に保たれていた。
単離株ACP34は、90 mmペトリ皿にPDAを接種し、12時間の明暗サイクルで2ヶ月と16日間培養した。ペトリ皿に滅菌水10 mlを2分間ピペッティングし、1分間隔で2回菌糸をこすり、培養から子実体を収穫した。胞子懸濁液のアリコートを集め、5mLチップに入れた綿で濾過した。採取した胞子懸濁液を連続希釈し、希釈した分生子300mLを150mmペトリ皿に連続希釈（1：10-1〜1：10-10）でプレーティングして、同系統の単胞分離株を取得した。5日後に単胞子株を移植し、単菌コロニーをqRT-PCRでアンビウイルスの有無について検査した。cDNAはHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Appliedbiosystems, by Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造者のプロトコルに沿って合成された。
分離株のCpAV1を診断するために、1700 fast SDS Real-Time PCR検出システム（Applied Biosystems）を用いてqRT-PCRを実施した。PCR反応は、I-Taq supermix（Biorad）およびTaqmanプローブを用いて10μLで行った。各10μLの反応ミックスには、5μLのスーパーミックス、0.15μLのプローブ、4μLの滅菌水、0.2μLのフォワードおよびリバースプライマー（補足データ1）、および1μLのcDNAを含んだ。増幅は96ウェルプレートでCFX Connect Real-Time PCR Detection System（Biorad）を用い、95℃で3分、95℃で20秒、60℃で30秒のサーモサイクルを40サイクル行う条件で実施した。
ポテトデキストロース寒天培地でのインビトロ培養
CpAV1フリーおよびCpAV1感染株の同系統を導き出した後、各条件（+1、+4、+8、-2、-7、-12）の3株のサブカルチャーの端から菌糸プラグを採取した。分離株を150 mmペトリ皿に接種し、ポテトデキストロース寒天（PDA）（Sigma-Aldrich）中で26℃、14日間インキュベートした。各単離株について、3つの生物学的複製を含み、菌糸径は、ペトリ皿の全径が覆われるまで、接種後3日間隔ですべての単離株について測定された。
生きたクリ茎とリンゴ果実上のウイルス感染株とウイルス非感染株のウイルス性特性評価
CpAV1フリーおよび感染単離株（1+、4+、8+、2-、7-、12-）を接種するために、30cmの生きた栗の茎を準備した。実験に使用する挿し木は、栗園（イタリア、サロ-BSのヨーロッパ栗、Castanea sativa）の栗の吸盤から得た。挿し木は、70％エタノールで消毒した後、17cmの距離でウイルス陽性菌糸と陰性菌糸のプラグで共同感染させた。実験は、CpAV1感染菌糸とCpAV1非感染菌糸を茎の上側と下側にランダムに配置した3つの生物学的複製で実施した。直径5mmのコルクボーラーを使用して、樹皮の一部を人為的にずらした。その後、除去した樹皮の下に菌糸体プラグを置き、傷口を閉じるためにしっかりとテープで固定した。また、菌糸体プラグを用いないが、同様の傷を持つネガティブコントロールも作成した。挿し木は、水で浸した1.5Lのバーミキュライトに21日間保存した。
リンゴ（cv Delicious）も病原性を確認するために使用した。各リンゴにCpAV1感染株とCpAV1非感染株を4点接種した（1個のリンゴに各2反復、対向配置）。接種したリンゴは14日間、室温で保存した。
統計解析
病原性アッセイ（リンゴおよびクリ挿し木）における病変またはキャンカーの大きさの測定に関連するデータの分析は、R統計プログラム39を用いた一元配置分散分析（ANOVA）を用いて行った。有意差は、Tukeyのポストホックテストで評価した（p < 0.05）。
真菌メタトランスクリプトームにおけるウイロイド様要素およびデルタ様要素のRNAオンリーの性質の検証
2つのバイオプロジェクトに存在するHTSリードライブラリーをスクリーニングした： PRJNA524447はRhizoctonia solaniの分離株のコレクション40、PRJNA629308はランとエリコイド菌根菌のコレクション12であり、上述と同じパイプラインを使用した。選択されたすべてのコンティグは、OneTaq® DNA Polymerase（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を用いた標準PCR反応において、補足データ1のプライマーを用いてコンティグ陽性サンプルを追跡するために、各生物サンプルでチェックされた。コントロール遺伝子は、阻害化合物の存在なしに全核酸サンプルからDNAを増幅できることを確認するために使用した。得られた短いPCR断片は、1×TAEバッファー中の2％アガロースゲルで分離した。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryをご覧ください。
データの利用可能性
Serratusの全データは、International Nucleotide Sequence Database Collaboration (16)に従い、直ちにパブリックドメインに公開され、https://github.com/ababaian/serratus/wiki/ambivirus_extended_data、自由に利用できる。また、本研究のアセンブルゲノムは、BioProject PRJNA951513としてGenBankで公開されている。ソースデータは本論文に添付されています。
材料の入手
生物学的材料は、入手可能な場合、MTAを締結することでリクエストに応じて入手可能である。Tulasnella isolate MUT4048およびMUT4047はMycotheca Universitatis Taurinensis（MUT）に寄託されており、ACP 34はCryphonectria parasitica isolateでコレクションに寄託されている（アクセッション番号： MUT 6705はACP34 sc1、MUT 6706 ACP34 sc4、MUT 6707 ACP34 sc8、MUT 6708 ACP34 sc9、MUT 6709 ACP34 sc7）、現在共著者のD.N.Aに依頼すれば入手可能です。ノーザンブロットおよびRACE実験に用いたアンビウイルス陽性株ACP43はMUT6704として、Mycoteca Universitatis Taurinensis（MUT）へ寄託された。
コードの入手
本研究で作成したソフトウェアは、オープンソースGPLv3ライセンスのもと、https://github.com/ababaian/serratus/tree/infernal-dev, https://github.com/rcedgar/circuclusthttps://github.com/rcedgar/palmscan, https://github.com/rcedgar/jupiter, https://github.com/rcedgar/ribozy で公開されています。
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謝辞
本研究は、ウイロイドとウイロイド様RNAの研究に大きく貢献したRicardo Flores教授の思い出に捧げます。M.T.は、栗の挿し木を提供してくれたDamiano Fontana氏に感謝する。M.d.l.P.は、IBMCP（UPV-CSIC）のBioinformatics Serviceの優れた技術支援に感謝しています。M.F.は、イタリア国立研究評議会のポスドクフェローシップ（Assegno di Ricerca IPSP 078 2021 TO）の支援を受けています。M.F.A.は、PlantHealthプロジェクトのもと、欧州委員会のErasmus + - KA1 Erasmus Mundus Joint Master's Degree Programmeによる移動滞在助成金の支援を受けた。A.B.は、カナダ保健研究院（CIHR）のバンティング博士研究員（#453974）の支援を受けた。M.d.l.P.は、スペインのMinisterio de Economía y CompetitividadとFEDER grant PID2020-116008GB-I00の支援を受けました。コンピューティングリソースは、ブリティッシュコロンビア大学コミュニティヘルス＆ウェルビーイングクラウドイノベーションセンター（powered by AWS）より提供されました（A.B.）。
著者情報
著者情報
メアリー・F・アキンユワ
現在の住所 オーバーン大学昆虫学・植物病理学教室、オーバーン、AL、USA
これらの著者は等しく貢献した： マルコ・フォルジア、ベアトリス・ナバロ
著者と所属
イタリア国立研究評議会持続可能な植物保護研究所、イタリア、トリノ
マルコ・フォルジア＆ステファニア・ダギノ（Marco Forgia & Stefania Daghino
イタリア国立研究評議会持続可能な植物保護研究所、イタリア、バーリ
ベアトリス・ナバロ＆フランチェスコ・ディ・セリオ
バレンシア政治大学・細胞生物学研究所（スペイン・バレンシア
アメリア・セルベラ＆マルコス・デ・ラ・ペーニャ
イタリア国立研究評議会バイオメディカルテクノロジー研究所（イタリア・バーリ
アンドレアス・ギゼル
国際熱帯農業研究所、ナイジェリア、イバダン
アンドレアス・ギゼル（Andreas Gisel
トリノ大学生命科学・システムバイオロジー学部（イタリア・トリノ
シルビア・ペロット
アゼルバイジャン共和国科学教育省植物学研究所、アゼルバイジャン、バクー
ディルザラ・N・アガエワ
バレンシア工科大学アグロフォレストリー生態系学部、バレンシア、スペイン
メアリー・F・アキンユワ
イタリア、パドバ、パドバ大学、土地・環境・農業・林業学部
メアリー・F・アキニュワ（Mary F. Akinyuwa
イタリア、ブレシア、ブレシア大学、分子・トランスレーショナル医学部
エマニュエラ・ゴッビ
スタンフォード大学生化学科（米国カリフォルニア州スタンフォード市
イワン・N・ゼルーデフ
独立研究員、米国カリフォルニア州コルテマデラ
ロバート C. エドガー
G5シーケンスバイオインフォマティクス、計算生物学部門、パスツール研究所、フランス、パリ
ラヤン・チキ
イタリア国立研究評議会持続可能な植物保護研究所、イタリア、ブレシア
マッシモ・トゥリーナ
トロント大学分子遺伝学教室（カナダ・オンタリオ州トロント市
アルテム・ババイアン
トロント大学テレンス・ドネリー細胞・生体分子研究センター（カナダ、オンタリオ州、トロント市
アルテム・ババイアン
貢献度
コンセプトの立案： A.B.、F.D.S.、I.N.Z.、M.d.l.P.、M.T., R.C.E. 方法論： A.B., A.G., B.N., F.D.S., M.d.l.P., M.F., M.F.A., M.T., R.C.E., S.D. ソフトウェア： A.B.、R.C.E. 形式的解析： 調査：A.B., M.d.l.P., R.C., R.C.E： A.B., A.C., A.G., B.N., F.D.S., M.d.l.P., M.F.A., M.T., R.C.E., M.F., S.D. リソース： D.N.A.、S.P.ビジュアライゼーション： B.N., M.d.l.P., M.F., S.D. 資金獲得： A.B.、F.D.S.、M.d.l.P.、M.T. 監修： A.B.、E.G.、F.D.S.、M.d.l.P.、M.T. 執筆・原案作成： A.B.、B.N.、F.D.S.、M.d.l.P.、M.F.、M.T.、S.D.
対応する著者
Massimo Turina、Artem Babaian、Francesco Di SerioまたはMarcos de la Peñaに対応する。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利益はないことを宣言している。
査読
査読情報
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Forgia, M., Navarro, B., Daghino, S. et al. RNAウイルスとウイロイド様要素のハイブリッドが真菌で複製される。Nat Commun 14, 2591 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38301-2
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2023年3月24日受領
2023年4月25日受理
2023年5月5日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-38301-2
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ネイチャーコミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン版）
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