Dysosmobacter welbionisは、食事誘発性肥満とマウスの代謝障害を予防する、新しく分離されたヒト常在菌である

オリジナル研究
Dysosmobacter welbionisは、食事誘発性肥満とマウスの代謝障害を予防する、新しく分離されたヒト常在菌である
http://orcid.org/0000-0002-0874-1490Tiphaine Le Roy1、Emilie Moens de Hase1、Matthias Van Hul1、Adrien Paquot2、Rudy Pelicaen1、Marion Régnier1、Clara Depommier1、Céline Druart1、Amandine Everard1、Dominique Maiter3,4, http://orcid. org/0000-0002-8271-3893Nathalie M Delzenne5, Laure B Bindels5, Marie de Barsy3,4, Audrey Loumaye3,4, Michel P Hermans3,4, Jean-Paul Thissen3,4, Sara Vieira-Silva6,7, Gwen Falony6,7, Jeroen Raes6,7, http://orcid.org/0000-0002-1600-9259Giulio・Muccioli2, http://orcid.org/0000-0003-2040-2448Patrice D Cani1
Patrice D Cani 教授（ルーバン医薬品研究所、WELBIO、代謝・栄養学、UCLouvain、Université catholique de Louvain、Avenue E. Mounier, 73 B1.73.11 B-1200、Brussels, Belgium; patrice.cani@uclouvain.be までご連絡ください。
要旨
目的 ヒト腸管から分離された新規酪酸産生菌Dysosmobacter welbionis J115Tの一般集団およびメタボリックシンドローム該当者における存在量および有病率を調査する。この細菌が宿主の代謝に及ぼす影響を、食事誘発性肥満マウスおよび糖尿病マウスを用いて検討する。

デザイン 4つのヒトコホート（すなわち、Human Microbiome Project, American Gut Project, Flemish Gut Flora Project, Microbes4U）を用いて、11 984人の被験者におけるこの細菌の存在と存在量を分析した。次に、肥満・糖尿病マウスを用い、D. welbionis J115Tを毎日経口投与した場合の代謝、肥満・糖尿病のいくつかの特徴、炎症、脂質代謝への影響を検証した。

結果 この新しく同定された細菌は、健常者の62.7%〜69.8%で検出された。メタボリックシンドロームを有する肥満のヒトでは、Dysosmobacter属の多さは、肥満度、空腹時グルコースおよび糖化ヘモグロビンと負の相関があることが顕著に示された。マウスでは、低温殺菌菌ではなく、生きたD. welbionis J115Tを補充することで、食事誘発性の肥満発症、脂肪量増加、インスリン抵抗性、白色脂肪組織の肥大および炎症が一部抑制されました。さらに、D. welbionis J115T を生きたまま投与すると、ミトコンドリア数の増加および非戦慄性熱発生に関連して、褐色脂肪組織の炎症からマウスを保護した。これらの効果は、マウスの腸内細菌叢の構成にほとんど影響を与えずに生じた。

結論 これらの結果は、D. welbionis J115Tが宿主の代謝に直接かつ有益な影響を与えることを示唆しており、肥満や関連する代謝性疾患を標的とした次世代有益菌の開発の有力な候補となるものである。

データ公開について
データは、公開されたオープンアクセスリポジトリで利用可能です。合理的な要求があれば、データを入手することができます。研究に関連するすべてのデータは、論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされています。本研究で作成・解析したすべてのデータセットと生データは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。マウス研究の16S rRNA遺伝子シーケンス生配列は、Sequence Read ArchiveデータベースでアクセッションコードPRJNA606762でアクセス可能である。FGFPコホートの16S生データは、European Genome-Phenome Archive (https://ega-archive.org/) のaccession no.で入手可能である。EGAS00001004420, Microbes4U cohortについてはaccession no. EGA00001003585 で公開されています。HMPについては、健康なヒト被験者のコホートは、ヒトマイクロバイオームプロジェクトデータポータル(https://portal.hmpdacc.org/)からダウンロードした。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
本論文は、Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0) ライセンスに従って配布されるオープンアクセス論文であり、原著作物が適切に引用され、適切なクレジットが与えられ、変更があればそれが示され、使用が非商業的であるという条件で、他の者がこの作品を非商業的に配布、リミックス、翻案、構築し、その派生物を異なる条件で許諾することができるものである。参照： http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323778

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この研究の意義
このテーマについて、すでに知られていることは何でしょうか？
ヒトの腸内細菌は、まだ数多く同定されていません。

配列決定法によって検出された細菌の大部分は、培養されたことがない。

いくつかの細菌が代謝の健康にプラスまたはマイナスに関連することが示されているが、前臨床試験で検証され、その後ヒト試験で妥当性が確認されたものはほとんどない。

新しい知見とは？
Dysosmobacter welbionisは、一般人の70％に見られる常在菌で、新たに単離されたものです。

D. welbionisは、メタボリックシンドロームを有する過体重および肥満の被験者の肥満度（BMI）、血糖値および糖化ヘモグロビンと逆相関を示しました。

D. welbionis J115T を投与したマウスは、食事誘発性肥満と脂肪量増加から部分的に保護され、耐糖能が改善され、インスリン抵抗性が低下することが確認されました。

D. welbionis J115T は、白色脂肪組織の肥大と炎症を抑制し、褐色脂肪組織のミトコンドリア数を増加させ、非戦慄性熱発生を抑制した。

D. welbionis J115T の低温殺菌は、その有益な効果を消失させる。

今後、臨床にどのような影響を与える可能性があるか？
これらの知見は、D. welbionis J115Tが肥満や糖尿病以外の臨床パラダイムで研究されるべき次世代の有益な細菌であることを示唆しています。この菌が宿主の代謝にどのような影響を与えるか、ヒトで試験する必要がある。

はじめに
腸内細菌叢の組成および機能の変動は、代謝、免疫、加齢および行動に影響を与えることにより、宿主の生理機能に影響を与える。これらの観察研究は、腸内細菌叢の組成や機能性と宿主の病態生理との関連性を示す最初の証拠となるものです。ヒト腸内細菌叢のうち、これまで培養されていなかった原核生物のメンバーを培養する大規模な取り組みが行われているにもかかわらず、最近の推定では、少なくとも4664種から構成されており、そのうち培養された代表種はわずか1332種に過ぎません7。さらに、肥満および関連代謝障害の発生に対する特定の種の影響は、ほんの一握りの種についてしか実証されていません。例えば、Enterobacter cloacaeの菌株を無菌マウスにコロニー形成させると、高脂肪食（HFD）により肥満とインスリン抵抗性が悪化することが示されている11。また、Bilophila wadsworthiaを通常飼育マウスに補充すると、体重に影響を与えずにHFDにより耐糖能異常と肝脂肪症を悪化させることが明らかにされている12。逆に、他の細菌の有益な影響が観察されている：遺伝的肥満/糖尿病マウスにAnaerobutyricum soehngenii（旧名Eubacterium hallii strain L2-7）を投与すると、エネルギー消費が増加して脂肪率が減少する13 ヒトでは、A. soehngenii投与は末梢インスリン感受性向上と関連している14 Christensella minutaで修正した低レベルの肥満ヒト微生物相を無菌マウスにコロネーションすると、受容マウスの脂肪率が低下する15。2013年、私たちは、アッカーマンシア・ムチニフィラが、ネズミの食事誘発性肥満と、耐糖能異常、インスリン抵抗性、肝脂肪症などの関連疾患に対抗することを示しました16。その後、低温殺菌したアッカーマンシア・ムチニフィラが生きた細菌と同等の効果を示したことから、健康促進特性の維持に細菌の生存率が必要ないことを実証しました17。注目すべきは、A. muciniphilaが過体重や肥満のヒトに投与された場合にも有益であることを示したことである18。前述の例は、ヒト集団19における特定の細菌の存在量と臨床変数との相関関係が、動物モデルにおける有益または有害効果にうまく変換されることを示すものである。しかしながら、相関関係から因果関係への移行が必要である。実際、我々は多くのヒトのコホートにおいて、Subdoligranulum sppがA. muciniphilaやメタボリックヘルスと強い相関があること、あるいは食物繊維介入やメトホルミン投与で増加することを見出した20。しかし、Subdoligranulum variabileでマウスを処理しても食事誘発性の代謝異常は改善しなかった20ことから、相関的観測値の真の生理的関連性を直接確かめることが急務になっている。

我々は最近、Ruminococcaceae の新種を単離し、記載した。この細菌は、痩せ型体質と一貫して関連する未培養の種と密接な関係があります。本研究では、D. welbionis が宿主の代謝の健全性に影響を与えるかどうかを明らかにすることを目的とした。まず、いくつかのコホート（すなわち、human microbiome project (HMP), American Gut Project (AGP), Flemish Gut Flora Project (FGFP) and Microbes4U）を用いて、一般集団の糞便微生物叢におけるD. welbionisの相対存在量と有病率を測定しました18 23-26。その結果、D. welbionis存在量は肥満指数および空腹時糖化と負の相関があることが判明しました。そして、D. welbionis J115T 株を HFD 飼育マウスに投与したところ、体重および脂肪体重の増加が抑制されることを示しました。このことは、褐色脂肪組織（BAT）のミトコンドリア数の増加と相まって、グルコースホメオスタシスの改善と非戦慄性熱発生の増加と関連していた。

結果
ヒト微生物叢におけるD. welbionisの有病率と存在量
我々は最近、ヒトの便からRuminococcaceaeに属する新種を分離し、D. welbionisと命名した21。新しい属・種の記載による分類学的興味に加えて、D. welbionisが低体重と関連するいくつかの分類群と密接に関連していることが明らかになった。実際、D. welbionisは、糞便微生物相の解析に基づくヒトの研究において、痩せ型と繰り返し関連してきた未培養種O. guillermondiiと16S rRNA遺伝子の配列類似度が92％である22。さらに、同じRuminococcaceaeに属するAnaerotruncus属も豚やヒトの体重と負の相関がある27 28。D. welbionisがこれらの分類群に近いことを考慮し、我々は腸内細菌叢におけるDysosmobacterの存在量と宿主の健康との関連性を解読することを目指した。

まず、D. welbionisが一般集団に存在するかどうかを調査した。D. welbionis J115Tの16S rRNA遺伝子配列によると、この配列変異はHMPコホート（n=161）において有病率62.7％、相対存在率0〜3.9％の範囲であった。AGPコホート（n=9511）では、有病率は69.8％で、相対的存在比の範囲は0％-9.2％であった。最後に、横断的FGFP（n=2259）では、65.9％の人にこの配列変異が検出され、相対的存在比は0％から0.9％の間であった。

さらに、非糖尿病、インスリン抵抗性、過体重または肥満の53人のコホート（Microbes4Uコホート）18を用いて、この細菌が肥満被験者のBMIや特定の代謝マーカーと相関しているかどうかを調査した。Dysosmobacter属は全個体の便から検出され、微生物叢全体の0.00035%から2.7%、平均0.75%で、便1gあたり1.7×105から2.0×109、平均5.9×108個に相当した(図1)。

図1
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図1
Dysosmobacter spp は、ヒトの BMI と負の相関を示す。(A) Microbes4Uコホートにおける糞便微生物叢中のDysosmobacter spp存在量と臨床変数とのピアソンの相関行列。*P<0.05. (B）過体重および肥満のヒトのコホートの糞便微生物叢におけるDysosmobacter sppの相対的存在量。(C）過体重および肥満のヒトのコホートの便サンプル中のディスオズモバクター属菌の濃度。(D) Dysosmobacter sppの相対的存在量とBMIのピアソンの相関。(E）Dysosmobacter属菌の絶対量とBMIのピアソンの相関。(F）Dysosmobacter属菌濃度と空腹時血糖値とのピアソン相関。(G）Dysosmobacter属菌と糖化ヘモグロビンのピアソン相関。結果は、図の部分B,Cの中央値を用いた点描画で表している。BMI, body mass index; HbA1c, glycated haemoglobin（糖化ヘモグロビン）。

興味深いことに、Microbes4Uコホートでは、Dysosmobacter属の相対量および絶対量はBMIと負の相関があり、Dysosmobacter属の絶対量は空腹時グルコースおよび糖化ヘモグロビン（HbA1c）と負の相関があった（図1A、D-G、オンライン補足表S1）。このことから、Dysosmobacter属は肥満および肥満に伴う糖代謝の変化から保護する可能性があることが示唆された。

補足資料
[gutjnl-2020-323778supp001.pdf]
D. welbionis J115T はマウスの食事誘発性肥満を予防する
最初の実験では、高脂肪食（HFD）投与マウスに、毎日、新鮮なD. welbionis J115T (1.0×109 cultivable, live bacteria per day and per mouse) を6週間投与すると（HFD J115-fresh group）、HFDによる体重増加が29%（すなわち1.5グラム）減少した（図2A）。次に、D. welbionis J115Tの生存率が抗肥満効果に影響を与えるかどうかを検討した。D. welbionis J115Tを低温殺菌（70℃で30分）すると、体重および脂肪量増加に対する有益な効果が完全に消失した（図2B,C）。次に、生きたD. welbionis J115Tをより長期間（すなわち13週間）マウスに投与することで、その有益な効果を維持できるかどうかを検証した。その結果、生きたD. welbionis J115Tはトレハロースで凍結しても活性を維持し（1日、1マウスあたり1.0×109個の培養可能な生菌）、13週間の投与後にHFDによる体重増加および脂肪量増加をHFD給餌マウスよりも深く減少させた（図2、E）。これは、腸間膜、皮下（鼠径部）および副睾丸脂肪沈着の重量の有意な減少に対応した（図2F）。マウスのいくつかの筋肉の重量に対する影響は観察されなかった（オンライン補足図S1）。1.0×109個の生菌（すなわち108個）より低い用量でマウスを処理しても、有益な効果がなかったことは注目に値する（オンライン補足図S2）。

補足資料
[gutjnl-2020-323778supp002.pdf]

図2
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図2
Dysosmobacter welbionis J115Tは、糞便中の微生物相に大きな変化を与えることなく、マウスの食事誘発性肥満を抑制することがわかった。(a) 高脂肪食を与え、1.0×109 コロニー形成単位（cfus）の新鮮なD. welbionis J115T (HFD J115-fresh) を6週間毎日経口摂取させたマウスと、対照食または高脂肪食（HFD）を与え、ビークルを毎日経口摂取させたマウスの体重増加量。(B,C)トレハロースで凍結したD. welbionis J115T（1.0×109培養可能生菌/日、1匹）を10週間毎日経口投与し、HFD（HFD Live J115）または低温殺菌したD. welbionis J115T (HFD pasteurised J115) (1.0×109 heat-killed bacteria per day and per mouse) とHFDを与え、ビヒクルを毎日経口投与したマウスを比較した。(D,E)トレハロースで凍結したD. welbionis J115T (1.0×109培養生菌/日、1匹)とHFD (HFD Live J115) と対照食またはHFDを与え、ビヒクルを毎日経口投与して13週間処置したマウスの体重および脂肪量。(F）13週間終了時の腸間膜、皮下（鼠径）および精巣上体脂肪パッド重量。(G)実験2の微生物叢組成の主座標分析。マウスの微生物相をクラスタリングし、各グループの重心を計算した。(H）HFDまたは生きたD. welbionis J115T処理によって有意に変化した細菌属の相対存在量。(I）マウスの微生物相を表すクラドグラムで、白いクレードマーカーはHFDマウスよりも対照マウスで有意に豊富な細菌群を強調し、黒いクレードマーカーは対照マウスよりもHFDマウスで有意により豊富な細菌群を強調し、水色のクレードマーカーは生きたD. welbionis J115Tによって有意に増加（丸）または減少（四角）する細菌群を強調する。welbionis J115Tの投与により、HFD飼育マウスで有意に増加（○）または減少（△）した細菌群を図部分Hで評価。1群あたりのマウス数。10-12. データは、図部分A、F、Jについては一元配置分散分析（ANOVA）後にTukeyのポストホックテストを、図部分B〜Eについては二元配置反復測定ANOVAを用いて分析した。H-Iについては、Kruskal-Wallis検定とDunnのペアワイズ多重比較法によりデータを分析した。*q<0.05; **q<0.01; **q<0.001. 結果は、図部分A、FおよびJについては平均±SEMによる点描画および棒グラフとして、図部分Hについては箱ひげ図（第1四分位、中央値および第3四分位）として表した。 図部分B-Eでは、HFD対HFDライブJ115の比較についてq＜0.05；**q＜0.01；**q＜0.001、対照対HFD比較について¤q＜0.001とした。図の部分Cでは、#p=0.06。HFD, high-fat diet.

D. welbionis J115Tの補給は、マウス腸内細菌叢組成にほとんど影響を与えない。
HFD誘発体重増加に対する保護が、D. welbionis J115Tの直接的効果であるか、あるいは腸内細菌叢生態系のリモデリングに起因するかを調べるために、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンサーによってマウス腸内細菌叢組成を分析した。一般化UniFrac非類似度行列に基づく主座標分析により、HFDが生態系の全体的な構成に深く影響していることが示された。HFDマウスと生きたD. welbionisを投与されたHFDマウスの微生物相は非常に似ていた（図2G）。豊かさ、シンプソンの多様性指数およびシャノンのアルファ多様性指数は、3つのグループ間で類似していた（オンライン補足図S3）。また、31の操作的分類単位（OTU）が、2つ以上のマウスグループ間で相対的な存在量が有意に異なることがわかった（図2H,I）。

Bacteroidaceaeファミリー、Alistipes、Ruminoclostridium、Tyzerellaおよび未同定のLachnospiraceae属はHFDによって増加し、Erysipelotrichaceaeファミリー、Rikenellaceae RC9腸グループおよびMuribaculum属はHFDによってコントロールグループと比較して減少した (図2I). 2つのOTUの相対量は、HFDによって増加し、D. welbionis J115T処理によって対照食マウスのレベルに回復した。Ruminoclostridium属とAlistipes属にそれぞれ属するOTU 11と16。Bacteroides属およびRuminoclostridium属に属するOTU 54および71は、D. welbionis J115Tの生処理によりそれぞれ増加および減少したが、飼料による影響は受けなかった。定量的PCR（qPCR）により、D. welbionisは未処理マウスには存在せず、生きたD. welbionis J115Tを強制給餌したマウスでは糞便内容物1g当たり2.3×108個（微生物相の0.76%に相当）に達したことが示された（図2J）。D. welbionis J115Tは、3日間のウォッシュアウト期間後、どのマウスの糞便にも検出されなかったため、マウス腸管に持続的にコロニー形成しなかった（オンライン補足図S3）。

D. welbionis J115Tは、吸収機能に影響を与えずに腸の形態にわずかな影響を与える
特定の病原体を持たないマウスの腸内細菌叢にはDysosmobacter sppが検出されないため、生きたD. welbionis J115Tの投与がマウスによく耐えられることを確認することを試みた。生きたD. welbionis J115Tを投与したマウスの空腸には、組織学的に炎症の徴候は認められなかった（図3A）。このことは、腸の異なるセグメントにおける炎症性マーカーの相対的発現の測定（オンライン補足図S3）および腸バリアマーカー（例えば、抗菌ペプチド、粘液生成およびタイトジャンクションタンパク質）に対する劇症的影響がないこと（図3B）からも支持された。D. welbionis J115Tの生投与により、空腸の絨毛の高さがわずかに減少したが（542.7 vs 482.3 μm、q=0.024）、クリプトの深さは影響を受けなかった（図3C）。絨毛の高さの減少は、トランジットタイムの加速と同様に、吸収面の減少をもたらし、エネルギー吸収に影響を与える可能性がある。しかし、通過時間および食事からのカロリー吸収率を測定・計算した結果、いずれのパラメータも生きたD. welbionis J115Tの投与に影響されないことが示された（図3D-E）。この結果から、生きたD. welbionis J115Tはマウスによく耐性があり、腸の生理機能を変化させないことが示された。

図3
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図3
生きたDysosmobacter welbionis J115Tは、腸の生理機能を中程度に変化させる。(A)空腸の代表的なH&E染色写真。スケールバー＝100μm。(B) 空腸における腸管バリアー機能関連遺伝子の相対的発現量。(C) 空腸の平均陰窩と絨毛の高さ。(D)通過時間。(E)、食物から吸収されたカロリーのパーセンテージ。1群あたりのマウス数。10-12. データは一元配置分散分析で分析し、図の部分BについてはTukeyのポストホックテストを行った。結果は、図B-Dについては平均±SEMの棒グラフで、図C-Eについては平均±SEMの点描画および棒グラフで表した。HFD, 高脂肪食。

D. welbionis J115T は、HFD での脂肪組織の膨張を抑制し、グルコースコントロールを改善する。
D. welbionis J115Tの生投与で観察された低い脂肪率は、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）中のより良いグルコース耐性と関連しており、ブドウ糖投与後15分の最初の血糖値ピーク後のベースラインのグルコースレベルへの復帰が早かった（図4A,B）。これは、有意に低い空腹時インスリンレベルおよび低いインスリン抵抗性指数と関連していた（図4C,D）。さらに、生きたD. welbionis J115Tを補充したマウスは、未処置のHFD給餌マウスよりもレプチンおよびレジスチンの血漿レベルが有意に低かった（図4E,F）。同様の傾向は、血漿グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（GIP）およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1（PAI-1）レベルでも観察された（図4G,H）。逆に、血漿脂質は本治療によって変化しなかった（オンライン補足図S1）。

図4
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図4
Dysosmobacter welbionis J115Tは、高脂肪食（HFD）摂取による脂肪組織の膨張と炎症を抑制し、代謝プロファイルの変化を改善することがわかった。(A）経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）中に測定した血漿グルコースプロファイルおよび（B）平均曲線下面積。 C）OGTT中のブドウ糖投与の30分前および15分後に測定した血漿インスリン。(D)インスリン抵抗性指数。(E）6時間絶食後のレプチン、（F）レジスチン、（G）グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（GIP）、（H）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1（PAI-1）血漿中濃度。(I) 皮下脂肪組織と腸間膜脂肪組織（それぞれSATとMAT）のH&E染色による代表的な写真。スケールバー＝100μm。(J）SATにおける脂肪細胞の直径（μm）分布。(K)MATにおける脂肪細胞の直径(µm)の分布。(L）SATにおける脂質代謝関連遺伝子の相対的発現量。(M）SATにおける炎症・免疫系関連遺伝子の相対的発現量。1群あたりのマウス数。9-12. 結果は、図B-Hについては平均±SEMの点描画と棒グラフで、図LとMについては平均±SEMの棒グラフで表した。データは、図B-H、L、Mについては一元配置分散分析にTukeyのポストホック検定を、図A、J、Kについては二元配置反復測定分散分析を用いて解析した。HFD対HFD Live J115の比較では*q<0.05; **q<0.01; ***q<0.001 、コントロール対HFDの比較では¤q<0.01、¤¤q<0.001とした。HFD、高脂肪食。

D. welbionis J115Tの補給は、脂肪細胞の直径の減少および脂肪組織の炎症の低下と関連している
肥満は、脂肪細胞の肥大、脂肪分解の障害、炎症性表現型と関連しており、これらは有害なアディポカイン分泌、インスリン抵抗性および異所性脂肪沈着に寄与する。そこで、皮下脂肪組織（SAT）および腸間膜脂肪組織（MAT）における脂肪細胞径を組織学および画像解析により測定しました（図4I）。D. welbionis J115T処理により、SATでは小型脂肪細胞（直径≦50μm）の割合が有意に増加し、大型脂肪細胞（直径≧70μm）の割合が減少した（図4J）。この効果は、MATでさらに顕著であった（図4K）。

D. welbionis J115T は、白色脂肪組織における炎症マーカーの発現変化に関連して、脂肪分解マーカーの発現を増加させる。
D. welbionis J115Tを投与した生きたマウスでは、脂肪細胞のサイズが小さく、全体的に脂肪が蓄積しにくい脂質代謝になっていることがわかった。実際、血流からの脂肪酸の取り込みに関与する脂肪酸輸送タンパク質4（Fatp4）は、処理マウスのSATで2倍発現が低下していた（図4L）。逆に、脂肪トリグリセリドリパーゼ（Atgl）やホルモン感受性リパーゼ（Hsl）などの脂肪分解や脂肪酸の動員に関与する遺伝子は、HFDマウスよりも処理マウスのSATでより多く発現していた。さらに、炎症性サイトカインTnfαおよびCd68、Cd163、Cd11b、Lbpなどのマクロファージ浸潤マーカーの相対発現は、HFDによって増加し、D. welbionis J115Tの生補給によって減少したが、他のいくつかのマーカーには影響がなかった (図4M).

D. welbionis J115Tは、HFDによる変化を抑制し、BATのミトコンドリア数を増加させた。
D. welbionis J115T を添加した HFD 飼料マウスの肩甲骨間 BAT の重量は、HFD 飼料マウスのそれよりも有意に低く、対照食供給マウスのそれよりもさらにわずかに低かった（図 5A）。組織学的解析の結果、HFDによって誘導されたBATの膨張は、脂肪滴サイズの増大と脂肪細胞の単眼性、白色様の外観に関連していた（図5B）。スライス中の脂質滴が占める表面は、HFDによって有意に増加した（図5C）。HFDで飼育したマウスに生きたD. welbionis J115Tを補充すると、褐色脂肪細胞の形態が回復し、脂質量が減少した。次に、生きたD. welbionis J115Tを投与したまたは投与していないHFD食マウスのBATから抽出したRNAのプールに対してRNA-seq分析を行った（図5D）。2つのプール間の違いの中で、特に、炎症反応プロセスおよび細胞外マトリックス遺伝子オントロジー（GO：0006955およびGO：0030020）に属する転写物が、HFDマウスのBATにおいて、HFD生きたD. welbionis J115T処理マウスのそれよりも発現が多かったように見えた（図5D、オンラインの補足図S4、オンライン補足表S2）。すべてのマウスに対して行った炎症およびマクロファージ浸潤のいくつかのマーカーに関する定量的PCRは、HFDが対照食を与えたマウスと比較して炎症を増加させ、HFD上のBATの炎症が生きたD. welbionis J115T補給によって完全に防止されることを確認した（図5E）。さらに、コラーゲンおよびマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子などのプロフィブロティック因子の発現は、HFDによって上昇し、生きたD. welbionis J115Tによって正常化した（図5F）、BATのHFD誘発リモデリングおよび／または線維化からの保護を示唆した。

補足資料
[gutjnl-2020-323778supp003.pdf]

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図5
生きたDysosmobacter welbionis J115Tは高脂肪食（HFD）誘発の褐色脂肪組織（BAT）機能不全を軽減し、ミトコンドリア数を増加させることがわかった。(A) トレハロースで凍結した生きたD. welbionis J115Tを毎日経口投与し、HFDを与えたマウス（HFD Live J115）、または対照食またはHFDを与え、等量のビヒクルを毎日経口投与したマウスの肩甲骨間BAT重量。(B) BATの代表的なH&E染色写真。スケールバー＝100μm。(C) BATにおける脂質滴に相当するスライス上の白色領域の割合。(D) HFDマウスのBATからのRNAプールとHFD J115マウスのBATからのRNAプールのRNA-seq発現データ間の散布図である。(E）BATにおける炎症および免疫系に関連する遺伝子の相対的発現量。(F）BATにおける細胞外マトリックスおよび線維化に関連する遺伝子の相対的発現量。(G）BATにおけるミトコンドリア数および機能に関連する遺伝子の相対的発現。(H)BAT1mgあたりのクエン酸合成酵素活性。(I)褐色脂肪パッドあたりのクエン酸合成酵素活性。(J）D.ウェルビオニスJ115Tの生体を毎日経口投与し、高脂肪食を与えたマウス（HFD Live J115）、または高脂肪食（HFD）を与え、ビヒクルを毎日3週間投与したマウスの体温（実験4、方法参照）。1群あたりのマウス数。図中A,C,E-Iの10-12匹）。1群あたりのマウス数：図部分A、C、E-Iでは10-12匹。結果は、図A、C、H-Jについては平均±SEMの点描画および棒グラフで、図E-Gについては平均±SEMの棒グラフで表した。

炎症と褐色から白色への変換は、BATのミトコンドリア機能障害および熱発生の障害と関連している。BAT特異的脱共役タンパク質Ucp1、特異的BATマーカー（Prdm16およびDio2）およびミトコンドリア生合成マーカーPgc1αの発現（図5G）は、D. welbionis J115T補給により増加したが、統計的有意性はPrdm16についてのみ到達した。BATの活性化の可能性とミトコンドリア数の増加を確認するために、ミトコンドリア呼吸鎖のいくつかの遺伝子（Mt-Co1、Cox7a1およびCox8b）の発現を測定した。それらの発現はHFDによって有意に上昇し、生きたD. welbionis J115Tによってさらに上昇した（図5G）。

mRNAを調査した際に観察された遺伝的シグネチャーが、代謝レベルでの特定の変化と関連し得るかどうかをさらに調査するために、クエン酸合成酵素活性を測定した。ミトコンドリア含量の代理指標であるこの活性（組織1mg当たりで表示）は、HFDライブJ115マウスのBATでは、HFDマウスのそれよりも70％高かった（図5H）。BATサイズが縮小したにもかかわらず、HFD生J115マウス脂肪パッドの総クエン酸合成酵素活性は、HFDのみで飼育したマウスの脂肪パッドの活性よりも25.7％高いままであり（図5I）、D. welbionis J115T生肉補充はBATのミトコンドリア量と活性を増加させることが示唆された。BATは非戦慄性熱産生により熱を産生することから、D. welbionis J115Tの生補給が体温を上昇させるか否かを検討した。マウスを3週間、HFDまたはHFDと生きたD. welbionis J115Tの補給に供した別の実験セット（実験4、材料および方法に詳述）において（オンライン補足図S5）、生きたD. welbionis J115Tを補給したマウスはHFDマウスよりも直腸温度が平均0.25℃高くなったことが確認された（図5J）。

材料および方法
オンラインの補足資料と方法を参照。

補足資料
[gutjnl-2020-323778supp004.pdf]
考察
本研究では、まず、新たに分離したD. welbionis J115Tという細菌が一般集団に高率に存在すること、この細菌がメタボリックシンドロームの肥満ヒトのBMI、空腹時血糖値、HbA1cに逆相関することを明らかにした。さらに、D. welbionis J115T を摂取することで、BAT の代謝と活性が回復し、HFD による代謝異常や低レベルの炎症からマウスを部分的に保護することを明らかにしました。

これまで、多くの細菌が肥満や代謝異常と関連することが示されてきましたが、その大半は培養されたことがなく7、有害または有益な表現型との因果関係を証明することが困難でした。本研究では、単純な相関関係から、新たに同定されたD. welbionis J115Tという細菌が有望な候補であることを証明した。重要なのは、この細菌をヒトに使用するのに適した明確に定義された培地で培養していることです。このため、A. muciniphilaの研究では、ヒトへの投与に適さない動物由来の化合物を含む培地を用いて、マウスでの初期データをすべて取得するという困難に直面していたが、これを回避することが可能である17。

興味深いことに、D. welbionisは当初、健康な被験者1人の腸から分離されましたが21、この菌の存在は一般集団に広く浸透しています。実際、HMP、AGP、FGFPなどの複数のコホート（すなわち、合計11 984人の被験者）を用いて、少なくとも一般人口の3分の2がこの新しく発見された細菌を腸内に保有していることを発見した。

この細菌は、メタボリックシンドロームに罹患した肥満のヒトの代謝パラメータおよびBMIと負の相関があることから、この細菌がHFD給餌により宿主の代謝に影響を与えるかどうかを検証した。そのために、毎日新鮮なD. welbionis J115T（1.0×109培養可能な生菌数/日、1匹あたり）、または生菌であるがトレハロースで冷凍した菌（1.0×109培養可能な生菌数/日、1匹あたり）または低温殺菌したD. welbionis J115T（すなわち加熱殺菌菌）でマウスを処理した。その結果、新鮮な培養物から得た生菌、あるいは凍結保護剤で凍結した生菌のいずれの処理でも、HFD処理マウスの体重および脂肪量増加を減少させることがわかった。しかし、低温殺菌によって細菌を死滅させると、その有益な効果は完全に消失した。我々は、マウスをより長期間（すなわち13週間）処理することがより強い効果と関連し、さらに脂肪量増加を減少させ、耐糖能の改善とインスリン抵抗性の減少をもたらすことを見いだした。それにもかかわらず、低用量のD. welbionis J115T（すなわち、＜1.0×109培養可能かつ生細胞）で処理した場合、マウスは菌の有益な効果に反応しなかった（オンライン補足図S2）。

プロバイオティクスと有益な細菌の生存率は、しばしばその健康促進特性の前提条件として考えられてきた。例えば、A. soehngeniiの有益な効果は腸内で複製する能力と関連しているなど、特定の種に当てはまることが知られているが14、加熱殺菌したA. muciniphilaやいくつかのLactobacillusおよびBifidobacterium種は、生きた形態と同じくらい強力であることも示されている17 29本研究では、低温殺菌D. welbionis J115Tは非効率であることを明らかにした。また、生きた菌はマウスの消化管に永久的に定着しないこともわかった。実際、72時間の洗浄後、D. welbionis J115Tの糞便中の含有量はqPCR検出限界以下であった（オンライン補足図S3）。D. welbionis J115T の有益な効果が、新鮮な調製品と冷凍調製品の両方に存在する構成成分または代謝物によってもたらされ、腸内で生成される代謝物によってもたらされないかどうかは、さらなる調査が必要である。本研究は、肥満のヒトで観察された相関関係が、D. welbionis J115T の有益な効果を示すマウス実験によって完全に裏付けられているという概念実証を提供するものである。

さらに、生きたD. welbionis J115Tが代謝パラメーターを改善するメカニズムを探るため、マウスの腸内細菌叢を配列決定し、HFDが腸内細菌叢の構成を変えることを確認した30 31。しかし、処理群と未処理群の間で腸内細菌叢構成は微妙なシフトしか観察されず、このことから、腸内生態系全体の調節を介してではなく、宿主代謝に対する細菌の直接効果があることが示唆された。そこで、D. welbionis J115T を投与した際に観察された体重および脂肪量の増加が、急性炎症またはエネルギー吸収の減少の結果である可能性を検討した。その結果、D. welbionis J115T の慢性投与は、腸の炎症、通過時間、エネルギー吸収に影響を与えないことから、菌の投与は忍容性が高く、代謝改善はエネルギー吸収の低下によるものではないことが示唆された。我々は、生きたD. welbionis J115Tが内臓脂肪細胞の形態を完全に正常化し、インスリン抵抗性と耐糖能異常の発症に寄与することが知られているいくつかの炎症マーカーも正常化することを発見した。これらのデータは、レジスチンやPAI-1の循環レベルの低さによっても裏付けられている。両者ともインスリン抵抗性の発症に関与していることが示されている32 33。

白色脂肪のほかに、褐色脂肪組織（BAT）は、エネルギーおよびグルコース代謝の制御に最も重要である。高脂肪食は、脂肪細胞の形態および機能を褐色から白色に変化させ、褐色脂肪組織の白色化と呼ばれるプロセスを引き起こし、最終的にBATの熱発生およびエネルギー消費の低下につながることが多く報告されている34。我々は、生きた D. welbionis J115T が、白色脂肪細胞の重量および量の減少によって特徴づけられる高脂肪食誘発の褐色脂肪組織の白色化を完全に防ぐことを明らかにし た。さらに、RNAseqおよびqPCR解析により、生きたD. welbionis J115Tの投与は、マクロファージ浸潤、いくつかの炎症マーカーの発現レベルおよびプロフィブロティックマーカーを減少させ、後者は、脂肪組織の機能障害および基質酸化によるエネルギー生産の障害に関連することが示された35。ミトコンドリア数の増加を示唆するトランスクリプトームデータは、ミトコンドリアマトリックスの専用マーカーであるクエン酸合成酵素の高い活性によって立証された36。このミトコンドリア数の増加は、D. welbionisによって引き起こされ、HFD投与マウスと比較して、生きたD. welbionis J115T処理マウスの優れたエネルギー代謝および高いエネルギー消費に関連して、高い体温につながる。我々の実験は、生きた D. welbionis J115T のエネルギー代謝に対する重要な効果を強く示唆しているが、生きた D. welbionis J115T が熱中性にさらされたときに代謝にさらに強い効果を誘発するかどうかをさらに調査することは興味深い37。

しかし、その作用機序の正確な解明には至っていない。しかし、血漿中および糞便中の酪酸レベルの増加は認められなかった（online supplemental figure 6）。

以上より、ヒト腸管常在菌 D. welbionis J115T は、肥満食に対する宿主の代謝調節に寄与する細菌であることが強く示唆された。さらに、D. welbionis J115T は、宿主のエネルギー代謝を調節する細菌であり、脂肪量の増加やBAT代謝を調節している可能性があることを、異なる相補的なin vivoアプローチで明らかにしました。他の次世代善玉菌と同様に、菌が宿主とどのように対話するのか、その最終的なメカニズムはさらなる探求が必要である41 42。本研究では、菌が酪酸生産者であることがわかったが、他の特定の分泌因子が関与する可能性も否定できない。最後に、D. welbionis J115T を 1.0×109 個の培養可能な生細胞の用量で、遺伝的に重度の肥満の ob/ob マウスに 6 週間投与しても、体重および脂肪量の増加は有意に減少しないことがわかった（オンライン補 足図 S7）。以上より、我々のデータは、食事誘発性肥満および糖尿病に対する生きたD. welbionis J115Tの有益な効果を強く支持するものであった。しかしながら、ob/obのような特定のモデル（過食モデルとしても知られている）において有益な効果を観察するために、より高用量の生きたD. welbionis J115Tおよび／またはより長い投与期間が必要かどうかは、さらなる調査が必要である。さらに、D. welbionis J115Tの投与が、これらのマウスの脂肪率の変化とは無関係に、インスリン抵抗性に有益な効果をもたらすことを排除してはならない。実際、宿主の微生物叢への曝露時間は、インスリン感受性の変化に寄与する重要な因子であることが示されている43。したがって、糖尿病対過体重および肥満の抑制を目的とした細菌標的戦略においては、曝露時間が重要な関心事である。

結論として、D. welbionis J115T は新たに分離されたヒト細菌であり、一般人口に非常に多く、メタボリックシンドロームに悩む過体重または肥満の被験者の BMI、空腹時血糖値および HbA1c に逆相関していることがわかった。D. welbionis J115T をマウスに6週間以上13週間まで毎日投与すると、腸内細菌叢の特定の変化とは無関係に、むしろ白色および褐色脂肪組織の代謝に作用して、高脂肪食による代謝異常を抑制することがわかった。

補足資料
[gutjnl-2020-323778supp005.pdf]
データ利用可能性に関する声明
データは公開されたオープンアクセスリポジトリで利用可能である。データは、合理的な要求があれば入手可能である。研究に関連するすべてのデータは、論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされています。本研究で作成・解析したすべてのデータセットおよび生データは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。マウス研究の16S rRNA遺伝子シーケンス生配列は、Sequence Read ArchiveデータベースでアクセッションコードPRJNA606762でアクセス可能である。FGFPコホートの16S生データは、European Genome-Phenome Archive (https://ega-archive.org/) のaccession no.で入手可能である。EGAS00001004420, Microbes4U cohortについてはaccession no. EGA00001003585 で公開されています。HMPについては、健康なヒト被験者のコホートは、ヒトマイクロバイオームプロジェクトデータポータル(https://portal.hmpdacc.org/)からダウンロードされた。

倫理に関する記述
論文発表のための患者同意書
不要

倫理的承認
マウス実験は、特定の契約番号2017/UCL/MD/005の下、Université catholique de LouvainのHealth Sectorの動物ケアに関するローカル倫理委員会の承認を受け、そのガイドラインに従って実施された。動物の飼育条件は、実験動物の保護に関する2013年5月29日のベルギー法（協定番号LA 1230314）で規定されている通りであった。FGFPの手順は、医療倫理委員会UZ Brussels-VUB（BUN143201215505）およびCommissie Medische Ethiek, UZ/KU Leuven（S58125）により承認された。Microbes4U のコホートは https://clinicaltrials.gov の試験番号 NCT02637115 として登録された。参加者全員からインフォームドコンセントを取得し、試験プロトコルはUniversité catholique de LouvainのCommission d'Ethique Biomédicale Hospitalo-facultaire によって承認された。

謝辞
Alexandre Barrois, Anthony Puel, Rose-Marie Goebbels, Henri Danthinne, Isabelle Blaveの技術協力に感謝します。また、Hubert Plovier氏には、有益な技術的議論をいただいた。また、Leica SCN400スライドスキャナーを使用していただいたIREC（Institut de Recherche Expérimentale et Clinique）イメージプラットフォーム（2IP）に感謝いたします。

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補足資料
補足データ
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データ補足1
データ補足2
データ補足3
データ補足4
データ補足5
脚注
TLRとEMdHは共同筆頭著者である。

ツイッター @matthias_vanhul, @Laure_Bindels, @MicrObesity

貢献者 PDC、TLR、EMdHはプロジェクトの構想を練った。PDCは前臨床と臨床のすべてを監督した。PDC、AE、CDr、CDe、MdB、JPT、AL、DM、MPHは臨床試験Microbes4Uに貢献した。SV、GF、JRはFGFPコホートにおける菌の解析に貢献した。RPは、ヒトマイクロバイオームプロジェクトとアメリカンガットプロジェクトコホートの解析を行った。APとGGMは短鎖脂肪酸の測定を行いました。TLR、EMdH、MVH、PDCは実験を行い、すべての結果を解釈した。TLR と EMdH は図と表を作成した。NMD、LBB、MR、JRは科学的議論に貢献した。PDC、TLR、EMdH、MVHは原稿を執筆した。すべての著者が結果について議論し、原稿を承認した。

資金提供 この研究は、助成金WELBIO-CR-2017C-02、WELBIO-CR-2019C-02RおよびProjet de Recherche PDR大会の下でFRFS-WELBIOを介してFonds de la Recherche Scientifique - FNRS-FNRS によって支援されました。FNRS T.0030.21. PDCはFunds Baillet Latour (Grant for Medical Research 2015)の受給者である。この研究は、Fonds Wetenschappelijk Onderzoek - Vlaanderen（FWO）およびFonds de la Recherche Scientifique - FNRSによるEOSプロジェクト番号（EOSプログラム番号30770923）により支援されました。NIH Human Microbiome Project - Core Microbiome Sampling Protocol A（HMP-A）開発のための資金援助は、NIH Roadmap for Medical Researchから提供された。本試験の臨床データは、ベイラー医科大学とワシントン大学医学部が共同で作成したものです。配列データは Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Centre、The Broad Institute、The Genome Centre at Washington University および J. Craig Ventor Institute により作成された。これらのデータは、HMPの臨床データ収集サイトとして機能しているEMMES Corporationから提出されたものである。

競合関係 PDCは、A-Mansia biotechの共同設立者である。TLRとPDCは、肥満および関連疾患の治療におけるバクテリアの使用に関する特許出願の発明者である。

証明と査読 委託ではなく、外部査読を受けている。

補足資料 本内容は、著者により提供されたものです。BMJ Publishing Group Limited (BMJ)による審査を受けておらず、査読を受けていない可能性があります。本コンテンツは、BMJ Publishing Group Limited (BMJ)の審査を受けておらず、査読を受けていない場合があります。BMJは、コンテンツに依存することから生じるすべての責任および義務を負いません。コンテンツに翻訳物が含まれる場合、BMJは翻訳の正確性と信頼性を保証せず（現地の規制、臨床ガイドライン、用語、薬剤名、薬剤投与量を含むがこれに限らない）、翻訳および翻案から生じるいかなる誤りおよび不作為に対しても責任を負わない。

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提供元
英国消化器病学会
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オンライン ISSN 1468-3288印刷する。ISSN 0017-5749
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