アモキシシリンとチアンフェニコール処理は、ニワトリの腸内細菌叢における耐性遺伝子の共選択に影響を与える可能性がある
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公開日：2022年11月27日
アモキシシリンとチアンフェニコール処理は、ニワトリの腸内細菌叢における耐性遺伝子の共選択に影響を与える可能性がある
Andrea Laconi, Roberta Tolosi, ...Alessandra Piccirillo 著者を表示する。
Scientific Reports 12巻 記事番号: 20413 (2022) この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
本研究の目的は、アモキシシリンおよびチアンフェニコール処理後の鶏腸内の微生物群集および抗菌薬耐性遺伝子（ARG）の動態と、ARGの潜在的な共選択性を評価することであった。この目的のために、16S rRNA NGSを用いた微生物群集の構成と、qPCRを用いたβ-ラクタム系およびフェニコール系に対する耐性を付与するARGの存在比を測定した。その結果、投与された抗菌薬は腸内細菌叢の多様性を大きく減少させることはなかったが、その組成は変化し、投与後にガリバクテリウムやメガモナスなどの分類群が濃縮し、他の細菌（StreptococcusやBifidobacteriumなど）に取って代わられることが明らかとなった。ARG（cmlA、blaCMY-2、blaSHVなど）と特定分類群（Lactobacillus、Subdoligranulumなど）の相対存在量には正の相関が見られた。アモキシシリンとチアンフェニコールによる選択圧は、β-ラクタム系抗生物質（blaTEM-1、blaSHV、blaCTX-M1様）とフェノール系抗生物質（floR、cmlA）に対する耐性ARGを増加させることに繋がった。これらの知見は、2種類の抗菌薬に対する耐性遺伝子（例：BlaTEM-1とcmlA）の共起と合わせて、複数の耐性決定因子を持つ移動性遺伝要素（MGE）の存在により、耐性出現に抗菌薬間の相互作用が起こっている可能性を示唆している。
はじめに
従来の畜産業における抗菌薬使用（AMU）が細菌集団における抗菌薬耐性（AMR）の出現と蔓延に寄与し、動物およびヒトの健康に重大な脅威を与えていることを示す証拠が増えている1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。また、飼料や飲料水を介して一度に大量の動物に抗菌薬を投与する大量薬剤投与は、一部の抗菌薬の治療効果の低下や多剤耐性菌の発生に寄与していると考えられています4。ニワトリは、ヒトの病原体を含め、いくつかの抗菌薬に耐性を持つ細菌を保有しており5,6、その一部は世界保健機関（WHO）の重要抗菌薬に指定されている7。 βラクタム系のアモキシシリンはヒト8およびブロイラー9で最もよく使用されている抗菌薬の1つである。これまでの研究で、β-ラクタム系抗菌薬の使用は、ヒトの多剤耐性菌感染症を治療するための数少ない選択肢である第三世代セファロスポリン（3GC）に対する耐性菌の出現を助長することが明らかにされています10。チアンフェニコールは、クロラムフェニコールのアナログで、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に有効な広域静菌性抗菌薬です11。AMRに対抗する新薬の不足により、クロラムフェニコールなど動物での使用が禁止されていた抗菌薬が、ヒト医療において多剤耐性菌の治療に再び有用性を発揮するようになった12。しかし、チアンフェニコールによる選択圧がクロラムフェニコール耐性菌の出現につながらないかという疑問が残る。β-ラクタム薬やフェニコールに対するARGは、プラスミドなどの移動性遺伝要素（MGE）に保持されることがあり、種内および種間（例えば、腸内細菌科とクロストリジウム科間）の水平遺伝子移動（HGT）は、微生物群における耐性の出現と拡散に寄与する一般的な事象である13。
本研究では、アモキシシリンとチアンフェニコールの予防投与がニワトリの腸内細菌叢組成に影響を与え、微生物の多様性と特定の分類群の存在量が増減するかどうか、また、3GC、カルバペネム、クロラムフェニコールなどの重要な抗菌薬に対する耐性を付与するARGの存在量に影響を与えるかどうかを検討した。さらに、特定の分類群の存在量とARGの出現量に相関があるかどうか、アモキシシリンとチアンフェニコールの投与により、もう一方の抗菌薬クラスに対する耐性を付与するARGが共選択されるかどうかを検討した。
研究成果
配列の一般的な説明
品質フィルタリング、キメラフラグメントの除去、リードのマージを行った結果、3007種類の特徴を持つ3,378,323リードが得られ、1サンプルあたりの平均配列数は27,244であった。品質フィルタリングの結果、どのサンプルも微生物群集の解析から除外されなかった。
アモキシシリンとチアンフェニコール処理は、微生物の多様性と特定の分類群の存在量に影響を与える
16S rRNA NGSを使用して、各グループのヒナの腸内細菌群集組成を異なる時点で特徴付けました。動物門レベルでは、微生物群組成は処理よりもむしろ年齢によって変化した（補足図S1）。生後1日目ではプロテオバクテリアが最も多く、それ以降はファーミキューテスが優勢となり、46日目に採取した盲腸サンプルではバクテロイダスが非常に多く見られた。腸内細菌科とクロストリジウム科は1日目に多く、乳酸菌科、ラクリスチーマー科、ルミノコックス科は8日目に開花するようである。また、46 d.o.a.に採取した盲腸試料では、リケネル科が優勢であった（図1；補図S2）。
図1
図1
ファミリーレベルでの微生物群集組成を表すヒートマップ。ヒートマップは、R (version 4.2.1) (https://www.r-project.org/) でパッケージ pheatmap (version 1.0.12) を使って作成した。
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前期高齢者行政
いずれのα-多様性指標（図2A,B）でも、すべての群で初期から後期にかけて多様性が増加する傾向が見られた。しかし、有意差があったのは、投与後21日目（p.t.）のアモキシシリン（AMX1）投与群と他の群、およびAMX1群内で21日目p.t.と他の時点の間だけであった。PERMANOVAにより、微生物群集は、1日目のp.t. (p < 0.001) と12日目のp.t. (p = 0.048) でチアンフェニコールで処理した群 (THP1) と他の2群（すなわちAMX1とコントロール）の間で有意な差があり、最終時点では差がないことが示された。これらの知見はNMDSプロット（図2C-E）により支持され、最初の2つの時点においてTHP1と残りのグループの間で明確な空間的分離が観察された。
図2
図2
シャノン指数（A）およびシンプソン指数（B）を用いた、異なる時点における早期治療を受けたグループ内のα-多様性。箱ひげ図は25〜75パーセンタイル、ひげ図は四分位範囲（IQR）の最大値×1.5を示し、文字の違いはα-多様性指標内の有意差を示す（p < 0.05）。1日目p.t.（C）、12日目p.t.（D）、21日目p.t.（E）における治療群間のβ-多様性。サンプルはBray Curtis距離に従ってクラスタリングされている。
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各時点で属レベルで行ったLEfSe解析では、チアンフェニコール投与後にcc_115属が増加し（LDA = 4.40）、対照群では1日目のp.tでHelicobacter（LDA = 4.40） と Candidatus Arthomitus（LDA = 4.49）の減少が見られた（補図3A）。続く12日目のp.t.では、AMX1群でBacteroides（LDA = 4.79）が減少し、対照群ではStreptococcus属が濃縮された（補足図3B）。21日目のp.t.（補足図3C）では、AMX1群でSphingomonas（LDA = 4.11）、Megamonas（LDA = 4.69）、Bacteroides（LDA = 4.31）など6種の分類群が濃縮された。 31）、THP1群では1個、すなわちGallibacterium（LDA = 4.35）、対照群では2個、すなわちStreptococcus（LDA = 4.65）およびBifidobacterium（LDA = 4.13）であった。
中年期投与
アモキシシリンとチアンフェニコールの中年期投与は、シャノンの指標とシンプソンの指標で示されるように、腸内細菌叢のα多様性に影響を与えなかった（図3A,B）。逆に、PERMANOVAとNMDSプロット（Fig. 3C,D）では、チアンフェニコール投与群（THP2）と他の2群（すなわち、アモキシシリン投与群（AMX2）とコントロール）の間で微生物群集組成（β-diversity）に差があったが、1日目のp.t.にのみ差が見られた（p＜0.001）。
図3
図3
シャノン（A）およびシンプソン（B）指数を用いた、異なる時点における中年期治療群内のα-多様性。箱ひげ図は25～75パーセンタイル、ひげ図は四分位範囲（IQR）の最大値×1.5を示す。 β-1日目午後（C）と9日目午後（D）の処理群間の多様性。サンプルは、Bray Curtis距離に従ってクラスタリングされている。
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1日目のp.t.では、AMX2グループでMegamonas (LDA = 4.63)、THP2グループでRuminococcus (LDA = 4.61) とcc_115 (LDA = 4.38) が、対照ではHelicobacter (LDA = 4.69) とPeptoniphilus (LDA = 4.52) がより豊富に見られた（補図4A）。9日目のp.t.では、チアンフェニコール処理群ではGallibacteriumが多く、コントロール群ではPeptoniphilusが少なかった（補足図4B）。
アモキシシリンとチアンフェニコールはβ-ラクタム系およびフェニコール系耐性遺伝子の存在量に影響を及ぼす
blaNDMを除き、調査した他のすべてのARGは少なくとも1つのサンプルで検出された。また、検出されたARGは、blaVIM-2とblaOXA-1を除き、すべて対照群でも同定された。β-ラクタム系抗生物質（すなわち、blaTEM-1、blaSHV、blaOXA-1およびblaOXA-48）またはフェニコール（すなわち、catA1、catB3、floRおよびcmlA）に対する耐性を付与する遺伝子が1日齢のヒナで検出された（補足図 S5）。屠殺場で採取した盲腸試料では、14種類のARGのうち7種類（すなわち、blaTEM-1、blaCMY-2、catA1、catA2、catB3、floR、およびcmlA）が同定された。すべての検体で少なくとも1つのARGが検出され（最小値＝1，最大値＝7，平均値＝3.83），89.84％の検体が両方の抗菌薬クラスに対する耐性を示した。全体として，β-ラクタム系およびフェノール系に対する耐性を付与するARGの相対量は処理後に有意に増加したが，β-ラクタム系およびフェノール系に対する耐性を付与する遺伝子は群によって異なる時間的変動を示した。
早期処理
フェニコールに対する耐性を付与するARGの相対量は、AMX1群、THP1群ともにコントロールと比較して有意に増加した（図4A、B）。しかし、THP1群ではすべての時点で存在量が有意に高かったが、AMX1群では21日目の午後から減少していた。対照群と比較して、β-ラクタム薬に対するARGは、THP1群では1日目のp.t.のみ存在量が多く、AMX1では12日目のp.t.から相対的に存在量が多くなっていることがわかった。
図4
図4
アモキシシリンおよびチアンフェニコール早期投与後の各時点における群ごとの16S rRNAコピー数に対するβ-ラクタム薬耐性付与遺伝子（A）およびフェニコール耐性付与遺伝子（B）の全量の相対値。遺伝子floR (C), cmlA (D), blaTEM-1 (E), blaSHV (F), blaCTX-M1-LIKE (G) の16S rRNAコピー数に対する相対的存在量。表現しやすいように、同じ時点のグループ間で有意差を示すARGのみを報告した。
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個々のARGを考慮すると、floRは1日目のp.t.に限りAMX1群とTHP1群の両方で対照群よりも多く存在し（図4C）、cmlAは12日目のp.t.までAMX1群とTHP1群の両方で高い存在度を示した（図4D）。フェニコールに対する耐性を付与する残りの4つのARGのいずれも、どの時点でもアモキシシリンまたはチアンフェニコール投与後に濃縮されなかった。日目のp．blaSHVは1日目のp.t.でAMX1群に濃縮され（図4F）、blaCTX-M1様群は12日目のp.t.で他の2群に比べTHP1群に有意に濃縮された（図4G）。残りのβ-ラクタム薬に耐性を付与するARGのうち、両抗菌薬投与後に濃縮されたものはなかった。
中年期投与
1日目の投与群ではβ-ラクタム系およびフェニコール系ARGの相対量が有意に増加したが、9日目の投与では投与した抗菌薬のクラスに対する耐性を付与する遺伝子のみが濃縮された（Fig.5A,B）。floRとcmlAは両AMD投与後により多く存在したが、cmlAは両処理後1日目に濃縮されたのに対し、floRはAMX2群では1日目の午後、THP2群では9日目の午後に濃縮された（図5A,B）。興味深いことに、フェニコールに対する耐性を付与するcatA1はアモキシシリン（1 d.p.t.）投与後にのみ濃縮され、β-ラクタムに対する耐性を付与するBlaCMY-2はAMX2（1および9 d.p.t）群および THP2（9日 p.t）群で濃縮されていた（図5E,F）。残りのARGは、いずれの時点でも、いずれの処理後にも有意に濃縮されていなかった。
図5
図5
アモキシシリンおよびチアンフェニコール中年投与後の時間点ごとの群ごとの16S rRNAコピー数に対するβ-ラクタム薬（A）およびフェニコール（B）に対する耐性を付与するすべての遺伝子の相対的存在量。遺伝子catA1 (C), floR (D), cmlA (E), blaCMY-2 (F)の相対的存在量と、各時点における群ごとの16S rRNAコピー数との関係。表現しやすいように、同じ時点のグループ間で有意差を示すARGのみを報告する。
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盲腸サンプルのマイクロバイオームとARGsの組成
α-、β-多様性に有意差が検出されなかったことから、投与したAMDsの種類や投与期間は、屠殺場で採取した盲腸サンプルの微生物相の多様性に影響を与えていないようだった（図6A〜C）。同様に、ARGの存在量についても、処理群と対照群との間に有意差は認められなかった（Fig. 6D,E）。
図6
図6
Shannon（A）およびSimpson（B）インデックスを用いた盲腸サンプル内のα-多様性。箱ひげ図は25～75パーセンタイル、ひげ図は四分位範囲（IQR）の最大値×1.5を表す。 β-グループ間の多様性（C）。サンプルはBray Curtis距離に従ってクラスタリングされている。グループごとの16S rRNAコピー数に対する、β-ラクタム薬（D）およびフェニコール（E）に対する耐性を付与するすべての遺伝子の相対的存在量。
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微生物群集とARGの関連性、ARGの共起性
ARGの出現と特定の分類群（属レベル）との関連をTable 1にまとめました。17の分類群が少なくとも1つのARGと有意に関連し、Lactobacillusが最も関連数が多く（n = 3）、cmlAとblaCMY-2は特定の分類群との関連数が最も多いことが示された。blaCMY-2はSubdoligranulumやButyricoccusなど5属と正の相関、Streptococcus、Lactobacillus、Enterococcusと負の相関を示し、blaSHVはLactobacillusやFaecalibacteriumなど5属と正の相関を示した。cmlAはLactobacillus属、Bacteroides属、Subdolingranum属と正の相関を示し、Escherichia/Shigella属、Alistipes属を含む8種の分類群と負の相関を示した。また、floRはEscherichia/Shigella属やEnterococcus属と正の相関が確認された。catA1およびcatB3はいずれもRuminococcus torquesの増加量と相関があり、後者はClostridiaとも相関があった。
表1 微生物分類群と抗菌剤耐性遺伝子との有意な関連性。Z値およびp値を報告する。
フルサイズの表
同じ抗菌薬クラスに対する耐性を付与する遺伝子間、およびβ-ラクタム系とフェニコール系に対する耐性を付与する遺伝子間で正の相関が認められた。具体的には、BlaCMY-2とcatA2（Spearman r = 0.2561, p = 0.003）、BlaTEM-1とfloR（Spearman r = 0.3662, p < 0.001）cmlA（Spearman r = 0.4133, p < 0.001）、BlaCTX-M1-LIKEと cmlA（Spearman r = 0.2286, p = 0.009）間には正の相関が確認された。ARGの共起に関するデータを表2に報告する。
表2 抗菌薬耐性遺伝子の共起性。Spearmanのrとp値を報告する。
原寸表
考察
本研究では、アモキシシリンおよびチアンフェニコールの投与がニワトリの腸内細菌叢および関連するARGに及ぼす選択圧を縦断的に検討した。微生物群集は年齢依存性の強い動態を示し、これまでの観察14,15と同様に、1日目の時点では腸内細菌科が優勢であり、それ以降の時点では乳酸菌科、ラクリス菌科および反すう菌科が微生物群集を支配していた。これまでの観察によると、46 d.o.a.で採取した糞便サンプルにはRikenellaceaeが非常に多く含まれていた16。先行研究では、鶏の腸内微生物の多様性（α-diversity）に対するAMUの対照的な影響が報告されている。Le Royらは、AMUがニワトリの腸内細菌の多様性と豊かさを有意に減少させると記述しているが17、他の研究では、微生物の多様性が増加する傾向はないとしても、有意な変化は認められなかった14,18。実際、アモキシシリンとチアンフェニコールの投与は、アモキシシリンの早期投与後21日目に鶏の腸内で分類学的多様性の有意な増加が観察された点で、微生物の多様性と富を減少させないようである。しかし、細菌群集間の比較（β-多様性）により、チアンフェニコール投与群のニワトリの腸内細菌叢は他の群とは有意に異なり、早期投与は微生物群集組成のシフトをより長く引き起こす（すなわち、早期投与群では12 d.p.tまで、中期投与群は1 d.p.t. のみ）ことが明らかとなった。これらの結果から、アモキシシリンおよびチアンフェニコールの選択圧力のもとで耐性菌が開花し、非耐性菌の損失を補う可能性があること、および早期年齢でのAMD投与は腸内細菌叢のより持続的な摂動を引き起こす可能性が示唆されるように思われる。耐性菌集団が選択されるリスクに加えて、腸内細菌叢の遺伝的多様性が高いと一般にニワトリの健康に有益と考えられているとしても、通常は存在量の少ない細菌の増殖によって微生物群集構造が変化し、代謝機能障害を引き起こし、日和見病原体への感受性が高まる可能性がある14,17。
アモキシシリンまたはチアンフェニコールのいずれかを投与すると、β-ラクタム系およびフェニコール系に耐性を付与するARGの相対量が対照群に比べ増加することが確認された。このことは、アモキシシリンとチアンフェニコールに対する耐性が共選択された可能性を示唆しており、フロフェニコールとアモキシシリンに暴露した後にβ-ラクタム系とフェノール系に対する耐性がそれぞれ増加したという過去の報告と一致している9,19。近年、クロラムフェニコールはヒトの多剤耐性菌の治療に使用されており、特に代替治療薬がほとんどない低所得国においては、アモキシシリンに曝露した後のフェノール類に対する耐性遺伝子（cmlAやfloRなど）の共選択と残存は、公衆衛生上の懸念となる可能性がある12。BlaTEM-1、cmlA、floRは正の相関を示し、鶏の腸内で同様の動態を示した（すなわち、両処理後に存在量が増加した）ことから、観察された耐性の共選択は、以前に報告されたように、同じ遺伝子要素にβ-ラクタム系とフェノール系に対する耐性決定因子が存在することによるのかもしれない20, 21. フェニコールとβ-ラクタム薬に対する耐性の共選択は、第三世代セファロスポリン（3GC）に対する耐性をもたらすAmpCおよび拡張スペクトルβラクタマーゼ（ESBL）コード化遺伝子も関与しているようである。実際、チアンフェニコールによる処理は、AmpCとESBLをそれぞれコードするBlaCMY-2とBlaCTX-M1-likeに選択的圧力をかけているようである。注目すべきは、BlaCMY-2とBlaCTX-M1-likeの両方が、フェノール類に対する耐性を付与する遺伝子（それぞれcmlAとcatA2）と共起していることである。さらに、cmlAはLactobacillus属およびSubdoligranulum属と正の相関を示し、これらは3GCに対する耐性遺伝子（それぞれblaCMY-2およびblaSHV）と正の相関を示し、耐性遺伝子共選択仮説の裏付けとなった。乳酸菌とサブドリジャーヌは鶏の腸の健康に有益であるが、cmlA、BlaCMY-2、BlaSHV遺伝子は複数の耐性決定基を持つ移動遺伝要素（MGEs）上にあることが以前に報告されており、そのため、ヒトや動物の病原菌を含む多剤耐性菌の出現に寄与し、獣医や公衆衛生に対する懸念が表明された。ARGの分子検出は全DNAに対して行われたため、統計解析によって推測される関連性は必ずしも特定の耐性遺伝子を保有する分類群を意味しないが、cmlAとBla遺伝子は乳酸菌23,24とファーミキューテス25において過去に報告されている。また、フェニコール耐性遺伝子（catA1、catB3）とRuminococcus属、Firmicutes門との間に正の相関があることも報告されている26。アモキシシリンの投与は、blaSHVやblaCMY-2にも選択圧を与えるようである。一過性とはいえ、これらの3GC耐性遺伝子は、農業の常識である家畜糞尿による施肥を通じて土壌に移行し、環境中に拡散・残留する可能性があり、公衆衛生上の別の懸念材料となっている27, 28。クロラムフェニコールがヒトの感染症治療において重要性を取り戻したことを考えると、これらの属に属する細菌はヒトに重篤な感染症を引き起こし、MEGsに多剤耐性決定基を保有し、他の細菌種に移行する可能性があるので、floR と Escherichia/Shigella および Enterococcus との正の関連はヒトの健康に対する脅威である5、29、30、31。
屠殺場で採取した盲腸サンプルは、処理群と無処理群の間で、ARGの存在量および微生物群集組成に有意な差は見られなかった。全群の鳥に呼吸器症状および腸症状が見られたため、33 日目以降、連続 5 日間のドキシサイクリンによる治療を行った。この処置は、アモキシシリンおよびチアンフェニコールの投与が鶏の腸内細菌叢および関連するAMRに及ぼす長期的影響を調査する妨げとなり、結果を平坦化する原因となった可能性がある。
結論として、本研究で得られたデータは、アモキシシリンおよびチアンフェニコール投与が、鶏の腸内でβ-ラクタム系抗生物質（3GCを含む）およびフェニコールに対する耐性菌およびARGの共選択と持続に寄与し、健康を脅かす可能性を示唆するものであった。実際、土壌肥料のために使用される従来の養鶏の堆肥は、環境中のAMRの拡散と普及を促進し、水路への拡散や食物連鎖への侵入により、他の動物や人間への感染を引き起こす可能性がある28,32。したがって、養鶏における細菌感染症の治療にこれらの抗菌薬を使用することは、その使用を減らすことでワンヘルスの観点から間接的に AMR の影響を減らすことに貢献できるため、再考されるべきです。
材料と方法
動物および試料採取
トリノ大学獣医学科の動物施設において、単一の孵化場から生後1日の健康なロス308ヒナ100羽を5つのペンにランダムに割り振り、動物実験として生後46日まで飼育した。この試験は、トリノ大学（イタリア）獣医学科の倫理・動物福祉委員会（プロトコル番号：2796/2020）の承認を得たものである。ブロイラーはすべて孵化場でマレック病および伝染性滑液包病に対するワクチンを接種した。さらに、生後1日のヒナにはコクシジウム症（粗めのスプレー）、ニューカッスル病および感染性気管支炎病（細かいスプレー）に対するワクチン接種を行った。各ペンはバケツ型給餌器と水飲み器を備え、リターとして木くずを使用した。環境条件（照明、温度、相対湿度、換気）は、ロス・ブロイラー管理ガイドラインに従って制御された。鳥は標準的な栄養要求量を満たすために以下の給餌プログラムを受けた：0日目から12日目まで（スターター期）は市販のスターター飼料（230 g/kg of CP）、13日目から46日目までは市販の育成用飼料（185 g/kg of CP）（フィニッシャー期）。2つのグループ（AMX1およびAMX2）には、1日あたり生体重1kgあたり20mgのアモキシシリンを朝と夕方に1回ずつ、12時間の間隔をおいて3日間連続で投与し、2つのグループ（THP1およびTHP2）には1日あたり生体重1kgあたり57mgのチアンフェニコールを3日間連続して投与した。AMX1群およびTHP1群のヒナには5日目以降、AMX2群およびTHP2群のヒナには21日目以降に処理された。対照群には抗菌剤を投与しなかった。生後30日目に全群の鳥に呼吸器症状および腸症状が現れ始めたため、農場の獣医師がドキシサイクリン20mg/kgを1日に生体重で33日目から5日間連続で処方・投与した。投与はすべて飲料水から行った。各グループから6羽を無作為に選び、1日目（T0）に咽頭拭い液を採取した。AMX1群、THP1群および対照群の鳥は、1日目（T1）、12日目（T2）および21日目（T3）に綿棒で採取された。AMX2、THP2および対照群からは、1日目のd.p.t.（T1）および9日目のd.p.t.（T2）に咽頭ぬぐい液を採取した。合計120個の咽頭拭い液が採取された。採取後1時間以内に、DNA抽出まで-80℃に静置した。飼育サイクル終了時（46日齢）、定期休薬期間および症状の完全寛解後、鳥を定期的に屠殺し、盲腸内容物を無菌的に採取し、直ちに液体窒素で凍結した。
DNA抽出
市販のキット（QIAamp UCP Pathogen Mini Kit, Qiagen, Germany）を用いて綿棒から微生物DNAを抽出し、それぞれの綿棒から、下流の分析に使用する2つのアリコートを調製した。一方、DNeasy PowerSoil DNA Isolation Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて、250 mgの糞便内容物から、製造者の推奨に従ってDNAを抽出した。DNA の品質と量は Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) を用いて評価した。
16S rRNA 遺伝子配列決定とデータ解析
NGS ベースの 16S rRNA は、各サンプルに存在する細菌の同定と比較のために実施された。簡単に説明すると、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を、オーバーハングスアダプター配列33を持つプライマー341F/R806で増幅し、第2段階のPCRを行ってイルミナネクステラDNA UDインデックス（IDT）を追加した。すべてのPCRは、2720サーマルサイクラー（Applied Biosystems, Waltham, MA）でKAPA HiFi HotStart ReadyMix（Roche）を用い、増幅プロトコル95℃3分（min）、95℃30秒（s）、55℃30秒、72℃30秒を25または8サイクル、第1段階と第2段階のPCRにそれぞれ適用して実施された。両方のPCRステージの後、アンプリコンをSPRIselect purification kit (Beckman Coulter, Brea, CA)を用いて精製した。ライブラリーはQubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) を用いて定量し、プールしてIllumina MiSeqシーケンスプラットフォーム（米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて2×300 bpペアエンドアプローチで配列決定した。Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2 version 2019.4) ソフトウェア内で、DADA2 パッケージを 16S rRNA データ解析に使用した34,35。分類群の割り当てはSILVA-Naive Bayes sklearn学習済みデータベース36を用いて行い、微生物群集の統計解析にはオンラインソフトウェアCalypso (http://cgenome.net/wiki/index.php/Calypso) およびGalaxy (https://galaxyproject.org/) 37を使用した。微生物群集の構成はヒートマップを用いて探索し、各グループ内の微生物多様性（α-diversity）はシャノン指数とシンプソン指数を用いて表現した。グループ間の微生物組成の違い（β-diversity）は、Adonis関数を用いたBray-Curtis非類似尺度に基づく並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて評価し、非計量多次元尺度法（NMDS）で可視化した。線形判別分析（LDA）効果量法（LEfSe）を用いて、同時点での群間差を説明する可能性が最も高い分類群を同定した。
ARGの定量的PCR（qPCR）解析
抽出したDNAをqPCRでスクリーニングし、β-ラクタム系抗生物質（blaTEM-1、blaSHV、blaCTX-M-1like、blaCMY-2、blaOXA-1、blaOXA-48、blaVIM-2、blaNDM）およびフェニコールの14種類の耐性ARGを検出・定量した（すなわち、catA1, catA2, catA3, catB Group3, floRおよびcmlA）。プライマーの配列、最適濃度、アニーリング温度、溶融温度、および使用した陽性対照を補足表1に報告する。すべてのサンプルは、PowerUp™ SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) を用いて、LightCycler480 Roche (Roche, Basel, Switzerland) リアルタイムプラットフォームで各プライマーの最適濃度で3重に遺伝子検査を行い、平均値（それぞれのARGのコピー数）を推定した。ただし、あるサンプル中のARGの絶対量は、サンプル中に存在する全DNAに比例するため、有意な値ではないので、ARGのコピー数を16S rRNA遺伝子コピー数に正規化することにより、ARG相対量を算出し、統計解析に使用した。
統計解析
同一時点（例：T0-T3）におけるグループ間（例：AMX1、THP1、コントロール）のα多様性またはARG存在量の差は、対数リンクとガウス誤差分布（対数変換したシャノン指数値）またはガンマ誤差分布（ARG存在量）を用いた一般化線形モデル（GLM）を使用して有意性を検定した。全サンプルで10%以上の有病率を持つARGのみを解析に含めた。階層的クラスタリングにより、各ARGの有無とグループおよび時点の関連を評価した。3 群間の微生物分類群の相対存在度の差は、複数の従属変数（すなわち、微生物分類群の対数変換相対存在度）を用いた多変量回帰分析を用いて有意性を検定した。同じ方法で、異なる分類群の相対現存量とARG現存量との関連も評価した。また、これらの分析では、サンプル全体における有病率10%の検出確信レベルで存在する分類群およびARGのみを対象とした。さらに、スピアマンの順位相関を用いて、β-ラクタムとフェニコールに対する耐性を付与するARGの共起を評価した。すべてのモデルには、同じ雛に由来するサンプルの時間的なクラスタリングを考慮し、クラスタロバスト（Sandwich）分散推定量を含めた。統計的有意性は p < 0.05 とした。統計解析とデータの可視化は、Statsパッケージ（バージョン4.1.2）、Stata 16（StataCorp、米国）およびGraphPad Prismバージョン9.2.0（https://www.graphpad.com）を用いてR（バージョン4.2.1）（https://www.r-project.org/）で実施された。
倫理的声明
動物実験については、トリノ大学（イタリア）の獣医学科倫理・動物福祉委員会（プロトコル n. 2796/2020）の承認を得ている。(https://www.veterinaria.unito.it/do/organi.pl/Show?_id=twsn）。動物の世話と使用に関するすべての国際的、国内的、および／または組織的ガイドラインに従った。著者らは、本研究の動物実験結果がARRIVEガイドライン（https://arriveguidelines.org）に従って報告されていることを宣言する。
データの利用可能性
本研究で作成および/または解析したデータセットは、NCBIリポジトリ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA872901, BioProject ID PRJNA872901）で入手可能である。
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謝辞
サンプリング計画の立案と糞便サンプルからのDNA抽出にご協力いただいたGiuditta Tilli博士とLisa Carraro博士 [Department of Comparative Biomedicine and Food Science, University of Padua, Legnaro (PD), Italy] に感謝いたします。また，動物実験実施中に技術的支援を提供してくれた Giovanni Perona 博士および Stefano Nurisso 博士（トリノ大学獣医学科，Grugliasco (TO), イタリア），Dr. Elena Pagani 博士（モンジュ大学獣医学科，Monge (PD)）に感謝する．Elena Pagani [Monge & C, Monasterolo di Savigliano (CN), Italy] にはサンプリング手順の技術サポートを、Sara Divari, Paola Pregel, Frine Eleonora Scaglione and Alessandra Sereno [Department of Veterinary Science, University of Turin, Grugliasco (TO), Italy] にはこの研究のサポートをお願いしました。
著者情報
著者および所属
パドヴァ大学比較生物医学・食品科学科，35020, Legnaro, PD, Italy
Andrea Laconi, Roberta Tolosi & Alessandra Piccirillo（アンドレア・ラコーニ、ロベルタ・トロシ、アレッサンドラ・ピッチリーロ
リスク評価科学研究所（IRAS）、獣医学部、ユトレヒト大学、ユトレヒト、オランダ
ラポ・ムギーニ-・グラス
オランダ国立公衆衛生・環境研究所（RIVM）感染症管理センター（オランダ・ビルトホーン
Lapo Mughini-Gras（ラポ・ムギーニ・グラス
トリノ大学獣医学科（イタリア・トリノ
Matteo Cuccato & Francesca Tiziana Cannizzo（マッテオ・クッカート＆フランチェスカ・ティツィアーナ・カンニッツォ
寄稿
A.L., A.P. and F.T.C. designed and conceived the study; A.L. and R.T. acquire and curated the data; A.L. and L.M.G. analysed the data; M.C. managed the animal and collected the samples; A.L., L.M.G. and A.P. wrote the manuscript. 最終原稿は全著者が承認した。
対応する著者
Andrea LaconiまたはAlessandra Piccirilloに連絡すること。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権や所属機関について中立的な立場をとっています。
補足情報
補足図S1.
補足図S2.
補足図S3.
補足図S4.
補足図S5.
補足表1.
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスのもとで許諾されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製が許可されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
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この記事の引用
Laconi, A., Tolosi, R., Mughini-Gras, L. et al. Amoxicillin and thiamphenicol treatment may influence the co-selection of resistance genes in the chicken gut microbiota. Sci Rep 12, 20413 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-24927-7。
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受付終了
2022年8月23日
受理済
2022年11月22日
公開
2022年11月27日発行