超好熱菌Thermotoga maritimaにおけるd-リジン生合成経路の解明

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The FEBS JournalVolume 286, Issue 3 p. 601-614

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超好熱菌Thermotoga maritimaにおけるd-リジン生合成経路の解明

https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/febs.14720

宮本哲也、片根真澄、齊藤泰明、関根正江、本間浩

First published: 07 December 2018

https://doi.org/10.1111/febs.14720

引用文献： 15

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Sections

Abstract

様々なd-アミノ酸が細菌のペプチドグリカンやバイオフィルム代謝に関与しており、これらの化合物が環境変化への適応を成功させるために必要であることが示唆されている。超好熱菌Thermotoga maritimaのペプチドグリカンには、従来のd-アラニン（d-Ala）とd-グルタミン酸に加えて、l-リジン（l-Lys）とd-Lysが含まれているが、メソ-ジアミノピメレート（meso-Dpm）は含まれていない。d-Lysはペプチドグリカンの構成成分としては珍しく、その生合成経路は不明である。本研究では、T. maritimaのd-Lys生合成経路に関連する新規なLysラセマーゼ（TM1597）とDpmエピメラーゼ（TM1522）を同定し、その特徴を明らかにした。Lysラセマーゼはピリドキサール5′-リン酸を補酵素として含む二量体構造を有していた。アミノ酸の中ではd-およびl-Lysに対して最も高いラセマーゼ活性を示し、オルニチンとAlaのd-およびl-エナンチオマーに対しても比較的高い活性を示した。Dpmエピメラーゼはll-およびmeso-Dpmに対して最も高いエピメラーゼ活性を示し、Lysを含む特定のアミノ酸に対しても測定可能なラセミ化を行った。これらの結果から、Lysラセマーゼはペプチドグリカン構成成分として使用されるd-Lysとd-Alaの生産に寄与し、Dpmエピメラーゼはll-Dpmをl-Lys生合成経路の前駆体であるmeso-Dpmに変換することが示唆された。

略号

Aba

アミノ酪酸

AOAA

アミノキシ酢酸

BN-PAGE

ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動

Boc-l-Cys

N-tert-ブトキシカルボニル-l-システイン

CAPS

N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸

CHES

N- シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸

Cit

citrulline

Dpm

diaminopimelate

DTT

dithiothreitol

Hse

homoserine

NAC

N-acetyl-l-cysteine

OPA

o-phthalaldehyde

Orn

ornithine

PIPES

piperazine-1、 4-bis(2-ethanesulfonic acid)

PLP

pyridoxal 5′-phosphate

はじめに

細菌中のd-アミノ酸は、ペプチド性抗生物質や細胞壁のペプチドグリカン層の構成成分として利用されている[1-3]。高分子であるペプチドグリカンは、細胞の形状を維持し、浸透圧に耐えるという、いくつかの重要な機能を果たしている。ペプチドグリカンは、短いペプチドによって架橋されたN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）とN-アセチルムラミン酸（MurNAc）から構成されている。ほとんどのグラム陰性およびグラム陽性細菌において、ペプチド鎖は、典型的には、l-アラニン（l-Ala）、d-グルタミン酸（d-Glu）、メソ-ジアミノピメレート（meso-Dpm）またはl-リジン（l-Lys）、およびd-Ala（例えば、l-Ala-d-Glu-meso-Dpm-d-Ala-d-Ala）を含む。さらに、Enterococcus gallinarumなどのバンコマイシン耐性菌では、d-セリン（d-Ser）がペプチド鎖に組み込まれ [4]、Enterococcus faeciumなどの乳酸菌はd-アスパラギン酸（d-Asp）を使用する [5]。さらに、他のd-アミノ酸（非カノニカルd-アミノ酸）もペプチドグリカンの幹ペプチドに組み込まれている [6-8]。これらの分子は、黄色ブドウ球菌や緑膿菌などの複数の細菌種において、ペプチドグリカン代謝やバイオフィルム代謝（阻害と破壊）に関与している［6, 9-19］。このように、ペプチドグリカン幹ペプチドに含まれるd-アミノ酸は、細菌が様々な環境に適応し生存するために不可欠である。

サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）は、地熱で温められた海底から分離された超好熱性細菌（至適生育温度80℃）である [20]。厳密に嫌気性で、桿状、グラム陰性、特徴的な鞘状の構造に包まれている。興味深いことに、そのペプチドグリカンにはd-Alaとd-Gluに加えてl-Lysとd-Lysの両方が含まれているが、meso-Dpmは含まれていない[20]。d-Lysはペプチドグリカンの構成成分としては非常に珍しく、T. maritima以外ではButyribacterium rettgeriでしか報告されていない[21]。T. maritima由来のMurE（UDP-N-acetylmuramoyl-l-alanyl-d-glutamate: meso-diaminopimelateリガーゼ）は、in vitroでl-およびd-LysをUDP-MurNAc-l-Ala-d-Gluに結合させ [22] 、l-およびd-Lysを含むペプチドステム（例えば、 MurNAc-l-Ala-d-Glu-l-Lys-d-AlaおよびMurNAc-l-Ala-d-Glu-d-Lys）を含むペプチドステムがペプチドグリカンの微細構造に存在する [23]。しかしながら、T. maritimaにおけるd-Lysの生合成経路は不明なままである。バクテリアにおけるd-アミノ酸の生合成経路が明らかになれば、バクテリアの環境適応のメカニズムについてより深い洞察が得られるであろう。

ペプチドグリカンのd-アミノ酸成分は一般に、Ala（EC 5.1.1.1）、Glu（EC 5.1.1.3）、Ser（EC 5.1.1.18）、Asp（EC 5.1.1.13）などのラセマーゼによって、対応するl-アミノ酸から生産される[2, 24-27]。ある種の細菌では、d-Lys、d-アルギニン（d-Arg）、d-プロリン（d-Pro）も、それぞれ対応するラセマーゼ、Lys（EC 5.1.1.5）[28-30]、Arg（EC 5.1.1.9）[31、32]、Pro（EC 5.1.1.4）[33、34]によって産生されるが、これらのd-アミノ酸の生理的役割は不明なままである。さらに、Vibrio choleraやPseudomonas putidaなどの細菌では、幅広い基質特異性を持つアミノ酸ラセマーゼが同定されている[35-37]。これらの非正規d-アミノ酸（すなわち、d-Alaとd-Glu以外の非従来型d-アミノ酸）は、ペプチドグリカンの構造と強度に影響を及ぼす[6]。我々は以前、ピリドキサール5′-リン酸（PLP）非依存性のアミノ酸ラセマーゼYgeAとRacXを、それぞれ大腸菌と枯草菌で同定した[38]。YgeAはホモセリン（Hse）のラセミ化を優先的に触媒し、RacXはLys、Arg、オルニチン（Orn）などの塩基性アミノ酸のラセミ化を触媒する。さらに、大腸菌由来の2つのシスタチオニンβ-リアーゼ（MetCとMalY；EC 4.4.1.8）は、複数の非共役d-アミノ酸を生成できる多機能酵素であることも見いだした[39]。また、Lactobacillus sakei由来のシスタチオニンβ-リアーゼ（MalY）も幅広い基質特異性を持つラセマーゼ活性を持つ[40]。

本研究では、3つの候補遺伝子（TM1597、TM1522、TM1731）がラセマーゼ活性を持つタンパク質をコードしているかどうかを調べることで、T. maritimaのd-Lys生合成経路を探索した。この目的のため、これらの遺伝子を大腸菌で発現させ、組換えタンパク質を精製した。TM1597とTM1731はAlaラセマーゼに相同なPLP依存性酵素であると以前に注釈されていたが、TM1522はDpmエピメラーゼ（EC 5.1.1.7）、すなわちll-Dpmとmeso-Dpmのエピマーゼ化を触媒する酵素であると注釈されていた。生化学的実験の結果、TM1597とTM1522は強いラセマーゼ活性とエピメラーゼ活性を持つが、TM1731はラセマーゼ活性を持たないことが明らかになった。酵素学的性質を詳細に検討した結果、TM1597とTM1522はそれぞれT. maritimaのLysラセマーゼとDpmエピメラーゼとして生理的に機能していることが明らかになった。

結果

T. maritima における Lys ラセマーゼおよび Dpm エピメラーゼの精製と同定

ヒスチジン（His）タグ付き組換えタンパク質（TM1597、TM1522、TM1731）を Ni アフィニティーカラムで精製した。TM1597とTM1731のタンパク質溶液は黄色であったが、TM1522のそれは無色であった。TM1597（図1A）では〜425 nmに、TM1731（図1B）では〜420 nmに吸収ピークが観察されたが、TM1522（図1C）ではピークは検出されなかった。これらのピークは、PLPとタンパク質の間のシッフ塩基結合によるもので、PLP依存性酵素の特徴である。PLP依存性酵素の阻害剤であるアミノキシ酢酸（AOAA）を添加すると、これらのピークはほとんど消失した（図1A,B）。(図1A,B）。これらのことから、TM1597とTM1731はアミノ酸配列から予想されるように、PLP依存性酵素であることが示唆された。

詳細は画像に続くキャプションに記載

図1

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次に、TM1597とTM1522の4次構造をBN-PAGEで調べた。TM1731に対応するタンパク質バンドはこの方法では検出できなかった（すなわち、分子量30 kDa未満のバンドは正確に同定できなかった）。TM1597とTM1522に対応するバンドは、66～97kDaの間に観察された（図2A,B）。したがって、TM1597とTM1522の4次構造は、Hisタグをつけた単量体の推定分子量（TM1597, 41 kDa; TM1522, 30 kDa）から、それぞれ2量体と3量体である可能性が高い。

詳細は画像に続くキャプションにある

Figure 2

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TM1597とTM1522はl-Lysに対してラセマーゼ活性を示したが、TM1731は示さなかった。予想通り、TM1522はDpmのエピマーゼ化を優先的に触媒した。さらに、TM1731はd-Lys、d-およびl-Ala、d-およびl-Ser、l-Asp、l-Gluに対してラセマーゼ活性を示さなかった。従って、TM1597とTM1522はそれぞれLysラセマーゼとDpmエピメラーゼであり、TM1731はアミノ酸ラセマーゼではないようである。

TM1597とTM1522の基質特異性

4種類の非タンパク質性アミノ酸とジアミノ酸を含む22種類のアミノ酸を基質として、TM1597とTM1522のラセマーゼ活性とエピメラーゼ活性の特異性を調べた： Ala、Ser、スレオニン（Thr）、Glu、グルタミン（Gln）、Asp、アスパラギン（Asn）、メチオニン（Met）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、Lys、 Arg、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、His、Orn、シトルリン（Cit）、アミノ酪酸（Aba）、Hse、およびDpmであった（表1および2）。TM1597は10種のアミノ酸のラセミ化を触媒し、l-Lysに対する活性が最も高かった（表1）；d-Lysに対するラセマーゼ活性は1.5倍低かった。l-Ornに対する活性も高く、l-Lysに対しては1.4倍低く、d-Ornに対しては1.3倍高かった。この酵素は別の塩基性アミノ酸であるl-Argのラセミ化も触媒するが、その活性はLysやOrnに対する活性より100-190倍低かった。d-およびl-Alaに対する活性は低かったが検出可能であった。d-AlaはT. maritimaを含むバクテリアのペプチドグリカンの主要成分である。一方、l-Alaに対する活性はl-Lysに対する活性の28倍低かった。非タンパク質生成アミノ酸（AbaとHse）およびその他のアミノ酸（Ser、Asn、Phe、Met）に対する活性は非常に低かったが、検出可能であった。興味深いことに、TM1597はll-Dpmとmeso-Dpm間のエピマー化を触媒したが、これらの活性はラセミ化活性より有意に低かった。これらの結果から、TM1597はLysとOrnに対して最も高い活性を持つ新規なLysラセマーゼであることが示唆された。

表1. TM1597ラセマーゼ活性の基質特異性

基質特異活性 (μmol-min-1-mg-1) 相対活性 (%)

l-Lys 979.384 ± 37.504 100.000

l-Orn 689. 053 ± 10.320 70.356

d-Lys 646.102 ± 1.135 65.970

d-Orn 514.887 ± 12.375 52.573

l-Ala 34.562 ± 1.118 3.529

d-Ala 27.418 ± 0.981 2.799

l-Arg 5.115 ± 0.187 0. 522

l-Aba 2.640 ± 0.092 0.270

ll-Dpm 2.622 ± 0.052 0.268

l-Ser 2.513 ± 0.066 0.257

l-Hse 0.928 ± 0.031 0.095

meso-Dpm 0.898 ± 0.076 0.092

l-Asn 0.247 ± 0.007 0. 025

l-Phe 0.083 ± 0.005 0.008

l-Met 0.067 ± 0.002 0.007

l-Asp ND

l-Glu ND

l-Gln ND

l-His ND

l-Thr ND

l-Val ND

l-Leu ND

l-Ile ND

l-Trp ND

l-Tyr ND

l-Cit ND

ND, not detected. 値は3連実験の平均値と標準偏差。

表2. TM1522エピメラーゼの基質特異性とラセマーゼ活性

基質特異的活性（μmol-min-1-mg-1） 相対活性（%）

meso-Dpm 216.5556 ± 5. 9930 100.0000

ll-Dpm 197.3620 ± 0.6639 91.1369

d-Lys 0.1377 ± 0.0039 0.0636

l-Lys 0.1330 ± 0.0004 0.0614

l-Orn 0.0196 ± 0.0003 0.0091

d-Orn 0.0190 ± 0.0004 0. 0088

l-Gln 0.0127 ± 0.0006 0.0059

l-Met 0.0077 ± 0.0005 0.0035

l-Cit 0.0065 ± 0.0010 0.0030

l-Ala 0.0028 ± 0.0002 0.0013

l-Ser 0.0019 ± 0.0003 0.0009

l-Hse < 0. 001

l-Leu < 0.001

l-Aba < 0.001

l-Phe < 0.001

l-Arg < 0.001

l-Asn < 0.001

l-Asp ND

l-Glu ND

l-His ND

l-Thr ND

l-Val ND

l-Ile ND

l-Trp ND

l-Tyr ND

ND, not detected. 値は三重実験からの平均値と標準偏差である。

TM1522はDpmのエピマー化を優先的に触媒した。ll-Dpmとmeso-Dpmに対する特異的活性は同等であり、他のアミノ酸に対する活性よりも著しく高かった（表2）。TM1522はd-およびl-Lysに対してもラセマーゼ活性を示したが、その活性はエピメラーゼ活性の約1500分の1であった。6つのl-アミノ酸（Orn、Gln、Met、Cit、Ala、Ser）に対する活性は、l-Lysに対する活性より6-70倍低かったが、検出可能であった。さらに、他の6つのl-アミノ酸（Hse、Leu、Aba、Phe、Arg、Asn）に対する活性はさらに低かったが、それでも検出可能であった。従って、TM1522はLysを含む特定のアミノ酸のラセミ化も触媒するDpmエピメラーゼであると思われる。

TM1597とTM1522のラセマーゼ活性に対するpHの影響

TM1597のl-Lysに対するラセマーゼ活性を、90℃で様々なpH値（5.0-11.0）で調べた（図3A）。ラセマーゼ活性はpH 5.0では認められず、pH 6.0からpH 10.0まで徐々に増加した。pH9.0での活性はCHES-NaOHバッファーで、pH10.0での活性はCAPS-NaOHバッファーで観察された。ラセマーゼ活性はpH10.0からpH11.0にかけて低下した。

詳細は画像に続くキャプションに記載されている

。 Figure 3

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また、85 °Cの様々なpH値（5.0～10.0）において、TM1522のl-Lysに対するラセマーゼ活性を調べた（図3B）。活性はpH5.0からpH7.5まで上昇し、Tris-HClのpH7.5-8.0で最も高い活性を示したが、pH7.0または8.5の活性は1.2-1.4倍低かった。活性はpH8.5からpH10.0にかけて低下し、TM1522はpH10.0ではほとんど不活性であった。

TM1597とTM1522のラセマーゼ活性に対する温度の影響

次に、TM1597とTM1522のl-Lysに対するラセマーゼ活性を様々な温度（50-95 °C；図4A,B）で調べた。TM1597の活性は50℃から85℃まで上昇し、85℃から95℃まではほぼ一定であった。同様に、TM1522の活性は50 °Cから90 °Cまで上昇し、90 °Cでピークに達し、95 °Cでやや低下した。このように、各酵素のラセマーゼ活性の温度プロファイルと至適温度は非常に類似していた。

詳細は画像に続くキャプションに記載されている

。 Figure 4

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TM1597とTM1522のラセマーゼ活性とエピメラーゼ活性の速度論的解析

l-またはd-Lys、l-またはd-Orn、l-またはd-Alaを基質として、Hanes-Woolfプロットを用いてTM1597のラセマーゼ活性の速度論的パラメーターを決定した（表3）。Lysの場合、TM1597のVmax値はl-Lysで16.9±2.1μmol・s-1・mg-1、d-Lysで16.3±0.9μmol・s-1・mg-1であった。Km値はl-Lysの方がd-Lysより1.2倍高く、kcat値はほぼ同じであった。したがって、kcat/Km値はd-Lysの方がl-Lysよりもわずかに高かった。Ornの場合、Vmax値はl-Ornで13.1±0.4μmol-s-1-mg-1、d-Ornで10.9±1.1μmol-s-1-mg-1であった。Lysの場合と同様に、Kmとkcatの値はd-Ornよりもl-Ornの方が高かった。Alaの場合、Vmax値はl-Alaで23.5±2.0μmol-s-1-mg-1、d-Alaで17.7±2.2μmol-s-1-mg-1であった。Kmとkcatはl-Alaの方がd-Alaよりも1.3倍高く、LysとOrnの値よりもはるかに高かった。注目すべきは、kcat/Km値によると、TM1597はLysよりもむしろOrnに対して最も高いラセマーゼ活性を示したことである。Keq値（l-アミノ酸とd-アミノ酸のkcat/Kmの比）が約1.0であったことから、TM1597はアミノ酸ラセマーゼとして機能すると結論づけられた。

表3. 基質 Km (mm) kcat (s-1) kcat/Km (s-1 mm -1) K eq

l-Lys 2.14 ± 0.33 693 ± 85 325 ± 14 0.86

d-Lys 1.77 ± 0.15 669 ± 38 380 ± 23

l-Orn 1.13 ± 0. 10 537 ± 15 478 ± 30 1.07

d-Orn 1.01 ± 0.16 447 ± 47 446 ± 21

l-Ala 375 ± 32 965 ± 83 2.576 ± 0.032 1.00

d-Ala 282 ± 36 725 ± 90 2.575 ± 0.005

数値は3回の独立実験の平均値と標準偏差である。

TM1522エピメラーゼ活性およびラセマーゼ活性の速度論的パラメータも、基質としてll-Dpmまたはmeso-Dpmおよびl-またはd-Lysを用いて調べた。Vmax値はll-Dpmで1.87±0.04μmol-s-1-mg-1、meso-Dpmで2.63±0.19μmol-s-1-mg-1であった。Km値はll-Dpmよりもmeso-Dpmの方が3.1倍高く、kcat値もll-Dpmよりもmeso-Dpmの方が高かった。その結果、TM1522はmeso-Dpmよりもll-Dpmに対して2.2倍高いkcat/Km値を示した。一方、LysのVmax値はl-Lysで0.34±0.02μmol-s-1-mg-1、d-Lysで0.37±0.01μmol-s-1-mg-1であった。したがって、l-Lysとd-LysのKm値とkcat値はほとんど同じであった。しかし、Km値はDpmよりもLysの方がはるかに高かった（2000倍以上）。LysのKeq値は、TM1597の場合と同様に〜1.0であった。これらの結果を総合すると、TM1522のDpmに対するエピメラーゼ活性は、Lysに対するラセマーゼ活性よりもはるかに高いことが示唆された。

考察

TM1731はアミノ酸ラセマーゼ活性を持たない

T. maritimaのd-Lys生合成酵素を同定するために、組換えTM1597、TM1522、TM1731を精製し、様々なアミノ酸に対するラセマーゼ活性を調べた。TM1731はSaccharomyces cerevisiae由来のYBL036Cに類似しており、細菌のAlaラセマーゼや真核生物のOrn脱炭酸酵素のN末端ドメインと構造的に類似していることから、PLP依存性酵素であることが提唱されている。YBL036C（PDBID：1CT5および1B54）[41]と大腸菌オルソログYggS（PDB ID：1W8G）の立体構造が報告されている。どちらもPLPがLys残基に共有結合している単量体タンパク質である。実際、TM1731の紫外線吸収スペクトルは、PLP依存性酵素に特徴的なピーク（～420 nm）を示し、AOAA添加によりこのピークの強度が減少した（図1B）。しかし、BN-PAGE法では分子量30 kDaを超えるバンドが正確に検出できなかったため、ネイティブ型のTM1731の特性解析は行わなかった（Hisタグ付き組換え型TM1731の単量体の推定分子量は27 741 Da）。YBL036Cはin vitroでl-Alaをd-Alaに変換することができる[41]。しかし、YBL036Cおよびそのオルソログである枯草菌由来YggS、YlmE、ホモサピエンス由来PROSCは、20種類のタンパク質生成l-アミノ酸および対応するd-アミノ酸に対するラセマーゼ活性を持たない。本研究では、TM1731が少なくともd-およびl-Lys、d-およびl-Ala、d-およびl-Ser、l-Asp、l-Gluに対してラセマーゼ活性を持たないことを確認した。したがって、TM1731は（他のオルソログと同様に）アミノ酸ラセマーゼとしては働かない。YggSファミリーは、2-ケト酪酸レベルとCoAの利用可能性を制御し[42]、フタル酸（γ-l-グルタミル-l-2-アミノブチリルグリシン）の産生を制御することによって、l-Ileとl-Valの代謝に寄与している可能性がある[43]。

LysラセマーゼとしてのTM1597の特性

TM1597は当初、細菌のAlaラセマーゼに類似した未特定のPLP依存性酵素としてアノテーションされていた。我々は、TM1597がPLP依存性酵素であることを、PLP特異的阻害剤であるAOAAの添加によって特徴的なピーク（〜425 nm）が減少することを示すことによって確認した（図1A）。細菌のAlaラセマーゼは通常ホモ二量体であり、α-プロトンの脱離と基質の再トン化の触媒反応は二量体の反対側で起こる。我々のBN-PAGE分析では、TM1597の4量体構造がホモ2量体であることが確認された（図2A）。さらに、TM1597は立体構造が決定されているAlaやLysのラセミ体と20％程度の配列同一性を持っているため、配列解析を用いて触媒残基を推定することはできなかった。したがって、TM1597の触媒残基を同定するためには、その立体構造を決定する必要があり、現在その研究計画が進行中である。

興味深いことに、TM1597は10種類のアミノ酸のラセミ化を触媒した（表1）。l-Lysに対する活性が最も高く、d-Lysに対する活性よりもわずかに高かった。TM1597はd-およびl-Ornに対しても高い活性を示したが、l-Argに対する活性は100倍以上低かった。塩基性アミノ酸に優先的に作用するアミノ酸ラセマーゼは、以前にも報告されている[28-32]。例えば、Oenococcus oeni由来のLysラセマーゼのl-Argとl-Ornに対する活性は、l-Lysに対する活性のそれぞれ25%と14%であり[29]、Pseudomonas taetrolens由来のArgラセマーゼのl-Argとl-Ornに対する活性は、l-Lysに対する活性のそれぞれ103%と42%である[31]。d-Lysは珍しいアミノ酸で、T. maritimaやB. rettgeriではペプチドグリカンの成分であり[20, 21, 23]、P. putidaでは異化できる[44, 45]が、それ以外では細菌では報告されていない。l-Ornはl-Argとポリアミンの代謝中間体であり、好熱菌Thermus thermophilusのペプチドグリカンの構成成分である（例えば、l-Ala-d-Glu-l-Orn-d-Ala-d-Ala）[47]。d-OrnはB. rettgeriのペプチドグリカンの構成成分であるが、その生理学的役割についてはほとんど知られていない[21]。TM1597は、他の細菌と同様にT. maritimaでもペプチドグリカンの構成成分として利用されるd-およびl-Alaに対して高い活性を示した。さらに、TM1597はl-Aba、l-Hse、l-Serおよび他のアミノ酸のラセミ化を触媒した。d-Abaとd-Hseの生理学的役割は今のところ不明であるが、l-Abaはl-Valとl-Ileの代謝に関与し、また眼酸の産生にも関与する[42, 43]。d-Serは、バンコマイシン耐性菌ではペプチドグリカンに組み込まれるが [4]、ほとんどの細菌では、タンパク質合成を阻害し [48]、SOS応答を誘導し、III型分泌系をダウンレギュレートするため有毒である [49]。これらの菌種では、d-Serはd-Serデヒドラターゼ（DsdA；EC 4.3.1.18）[50]やMetC[39]によってピルビン酸に分解されるか、アミノ酸ラセマーゼ[35, 36, 39, 51]によってl-エナンチオマーに変換される。さらに、TM1597はll-Dpmとmeso-Dpmのエピマー化を触媒することができたが、これはおそらくLysとDpmの構造が似ているためであろう。これらの結果を総合すると、T. maritimaのTM1597ラセマーゼは、LysとOrnのd-およびl-エナンチオマーに対して高い活性を示し、TM1597は様々な非カノニカルd-アミノ酸を生成できることが明らかになった。この意味で、TM1597は大腸菌のYgeA、MetC、MalYや枯草菌のRacXと類似している。

TM1597ラセマーゼの至適pHはCHES-NaOH中でpH9.0、CAPS-NaOH中で10.0であり、少なくともpH6.0までは活性が維持されていた（図3A）。このように、ラセマーゼ反応はT. maritimaの生理的pH範囲内で起こり、T. maritimaはpH5.5～9の間で増殖し、至適pHは6.5付近である[20]。一方、至適温度は85℃であり、85℃から95℃の範囲で活性はほぼ一定であった（図4A）。T. maritimaは55 °Cから90 °Cまで増殖可能で、至適温度は80 °Cである[20]。従って、TM1597は生理的温度でT. maritimaのアミノ酸ラセマーゼとして機能することができる。

Km値が示すように（表3）、TM1597はd-およびl-Lys、d-およびl-Ornに対して高い親和性を持つ。Ornに対するKmとkcatの値はLysに対する値よりわずかに低く、kcat/KmはLysよりOrnの方が高かった。一方、d-およびl-AlaのKm値はLysおよびOrnよりも100倍以上高く、d-およびl-Alaのkcat値は3種類のアミノ酸の中で最も高かった（表3）。TM1597のd-およびl-Lysに対するKm値（l-Lysに対するKm＝2.14 mm; d-Lysに対するKm＝1.77 mm）は、O. oeni由来のLysラセマーゼ（l-Lysに対するKm＝11 mm; d-Lysに対するKm＝9.8 mm）[29] およびP. taetrolens由来のArgラセマーゼ（l-Lysに対するKm＝2.4 mm; d-Lysに対するKm＝2.4 mm）[52] よりも低かった。逆に、d-およびl-Lysに対するTM1597のkcat値（l-Lysに対するkcat = 693 s-1; d-Lysに対するkcat = 669 s-1）は、O. oeni由来のLysラセマーゼ（l-Lysに対するkcat = 210 min-1; d-Lysに対するkcat = 170 min-1）[29]およびP. taetrolens由来のArgラセマーゼ（l-Lysに対するkcat = 109 s-1; d-Lysに対するkcat = 104 s-1）[52]よりも有意に高かった。言い換えれば、TM1597は他の細菌のラセマーゼよりも有意に高い活性を有していた。さらに、d-およびl-Alaに対するTM1597のKm値（l-AlaのKm = 375 mm; d-AlaのKm = 282 mm）は、P. taetrolens由来のArgラセマーゼのKm値（l-AlaのKm = 15.7 mm; d-AlaのKm = 15.0 mm）よりもはるかに高く[52]、O. oeni由来のLysラセマーゼはAlaに対してラセマーゼ活性を全く持たない。しかし、TM1597のd-またはl-Alaに対するkcat値(l-Alaに対するkcat = 965 s-1; d-Alaに対するkcat = 725 s-1)は、P. taetrolens由来のArgラセマーゼ(l-Alaに対するkcat = 2.4 s-1; d-Alaに対するkcat = 2.6 s-1)よりもはるかに高い[52]。T. maritima由来のシスタチオニンβ-リアーゼ（TM1270）はAlaラセマーゼ活性を有し、大腸菌alrおよびdadX欠失株のd-Ala従属栄養表現型をレスキューすることが報告されている[53]。この研究は、TM1270が生理学的にAlaラセマーゼとして働くことを示唆している。TM1597のl-Alaに対するkcat値はTM1270のそれ（2.4×10-3 s-1）よりもはるかに高く、一方TM1597のKm値はTM1270のそれ（0.38 mm）よりもはるかに高かった[53]。その結果、TM1597 の l-Ala に対する kcat/Km 値は TM1270 のそれよりも 400 倍ほど高かった。さらに、10 mm l-Ala に対する TM1597 の比活性（34.56 ± 1.12 μmol-min-1-mg-1）は、TM1270 の比活性（0.19 ± 0.007 μmol-min-1-mg-1）よりも有意に高かった。これらの知見を総合すると、TM1597はd-Lys合成だけでなく、in vivoでのd-Ala産生にも関与している可能性が高い。

DpmエピメラーゼとしてのTM1522の特徴

TM1522はDpmエピメラーゼ、すなわちll-Dpmとmeso-Dpmの相互変換を触媒する酵素として分類され、l-Lys生合成の最終段階に関与している。Dpmエピメラーゼは補酵素を必要とせず、GluやAspラセマーゼを含むPLP非依存性アミノ酸ラセマーゼファミリーに属する。このファミリーのメンバーは、ラセミ化を触媒する一対のシス残基を持つ。実際、TM1522は、特徴的なDpmエピメラーゼと比較的高い配列同一性（〜30％）を示し、2つの触媒残基（Cys64とCys186）を持っており、これらは明らかに脱プロトン化またはプロトン化を介してエピメラーゼ化に関与している（図5）。予想外なことに、TM1522の四次構造は三量体である可能性が示された（図2B）。大腸菌（PDB ID: 4IJZ）[54]、炭疽菌（PDB ID: 2OTN）、コリネバクテリウム・グルタミカム（PDB ID: 5H2G、5H2Y、5M47）のDpmエピメラーゼは二量体であり[55]、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（PDB ID: 1BWZ）のオーソロジーは単量体である[56]。

詳細は画像に続くキャプションに記載されている。

Figure 5

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TM1522はDpmのエピマー化だけでなく、Lysを含む特定のアミノ酸のラセミ化も触媒したが、比活性はDpmに対して他のアミノ酸よりも著しく高かった（1500倍以上）（表2）。我々の知る限り、これはアミノ酸ラセマーゼ活性を持つ細菌のDpmエピメラーゼの最初の例である。しかし、最近の研究で、クラミジア・トラコマティス由来のDpmエピメラーゼは、PLPを補酵素として依存するGluラセマーゼ活性を持ち、生体内で十分なd-Gluを産生できることが示された[57]。TM1522の至適pHはTris-HCl中でpH7.5-8.0であり（図3B）、至適温度は90℃であった（図4B）。T. maritimaの生育条件を考慮すると、TM1522はTM1597の場合と同様に、生理的条件下でDpmエピメラーゼとして機能している可能性が高い。

TM1522のll-Dpmとmeso-Dpmに対する基質特異性は、我々の速度論的解析で示されたように、かなり厳しい（表4）。ll-またはmeso-Dpmに対するTM1522のKm値（ll-Dpmに対するKm = 0.082 mm; meso-Dpmに対するKm = 0.258 mm）は、ll-Dpmに対する大腸菌Dpmエピメラーゼ（0.129 mm）[58]およびmeso-Dpmに対する結核菌Dpmエピメラーゼ（0.166 mm）[59]と同程度であった。ll-Dpmに対するTM1522のkcat値（56.2 s-1）は、大腸菌Dpmエピメラーゼのkcat値（120 s-1）[58]よりも2倍程度低く、meso-Dpmに対するkcat値（79.1 s-1）は、結核菌Dpmエピメラーゼのkcat値（0.147 s-1）[59]よりもはるかに高かった。一方、TM1522のl-およびd-Lysに対する親和性は、Dpmに対してよりもはるかに低かった（表4）。これらの観察結果を総合すると、TM1522は生体内ではd-Lysの生合成ではなく、ll-Dpmとmeso-Dpmの相互変換に関与している可能性が高い。

表4. TM1522エピメラーゼおよびラセマーゼ活性の速度論的パラメーター

基質 Km（mm） kcat（s-1） kcat/Km（s-1 mm -1） K eq

ll-Dpm 0.082 ± 0.002 56.2 ± 1.3 687 ± 20 2.22

meso-Dpm 0.258 ± 0.037 79.1 ± 5.8 309 ± 24

l-Lys 594 ± 33 10.1 ± 0.7 0.0170 ± 0.0002 0.94

d-Lys 619 ± 51 11.2 ± 0. 3 0.0181 ± 0.0013

数値は3つの独立した実験の平均値と標準偏差である。

T. maritimaにおけるd-Lys生合成経路

本報告に記載された結果に基づき、T. maritimaにおけるd-Lysは、新規のLysラセミ化酵素であるTM1597によるl-Lysのラセミ化によって生成されると考えられる（図6）。l-Lysの生合成経路は、l-Aspから始まる多段階プロセスである。7つのステップを経て、l-Aspはll-Dpmに変換され、次にTM1522によってmeso-Dpmにエピマー化される。次にmeso-DpmはDpm脱炭酸酵素（TM1517）によってl-Lysに変換される。最後に、l-LysはTM1597によってd-Lysにラセミ化される。さらに、TM1597はl-Alaをd-Alaにラセミ化することができ、d-Alaはシスタチオニンβ-リアーゼ（TM1270）によってl-Alaから生成される。T. maritimaペプチドグリカンのもう一つの必須成分はd-Gluである。TM1597とTM1522はl-Gluに対するラセマーゼ活性を持たないが（表1と表2）、TM1270はAlaとGluの両方のラセマーゼ活性を持つ[53]。したがって、TM1270はin vivoでのd-Glu産生に関与している可能性がある。

詳細は画像に続くキャプションにある

Figure 6

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グラム陰性菌では、ペプチドグリカンのペプチドステムの3位のアミノ酸残基は多くの場合meso-Dpmであるが、T. maritimaではこの残基はd-またはl-Lysである。以前、d-LysはB. rettgeriにおいてのみペプチド架橋に存在することが報告されており［21］、ペプチドグリカンの稀な構成要素であることを示唆している。さらに、T. maritimaのペプチドグリカンでは、架橋の程度が他のグラム陰性菌よりも低く、平均鎖長が長い［23］。これらの特性が細胞の耐熱性に寄与しているかどうかはまだ不明であり、この問題は今後の研究で調査されるべきである。さらに、ほとんどの細菌はバイオフィルムとして知られる細菌群集を形成し、様々な環境への適応や抗生物質への耐性を助けている [60, 61]。様々なd-アミノ酸を取り込むとペプチドグリカンの構造が変化するため、バイオフィルムやその形成が阻害される可能性がある[9]。従って、様々な細菌におけるd-アミノ酸の生合成経路を解明することは、生存戦略としての環境変化に対する細菌の適応に関する知見を提供することになる。

実験手順

タンパク質生成l-アミノ酸および対応するd-アミノ酸は、富士フイルム和光純薬（日本、大阪）、ナカライテスク（日本、京都）またはシグマアルドリッチ（米国、ミズーリ州セントルイス）から購入した。l-Ornはペプチド研究所（大阪、日本）から購入した。l-Aba、d-Aba、d-Orn、l-Cit、l-Hse、PLP、o-フタルアルデヒド（OPA）、N-アセチル-l-システイン（NAC）は富士フイルム和光純薬から購入した。N-tert-ブトキシカルボニル-L-システイン（Boc-L-Cys）はNovabiochem社（スイス、Läufelfingen）から購入した。その他の化学物質はすべて、市販の最高グレードのものを使用した。

T. maritima由来のTM1597、TM1522およびTM1731のクローニング

TM1597、TM1522およびTM1731遺伝子は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE；東京、日本）から入手したT. maritima MSB8の染色体DNAから、以下のプライマーを用いて増幅した： TM1597、5′-GCCCATATGGTGTATCCCAGGCTTCTG-3′（フォワード）および5′-GCCCTCGAGGATTGAGGGTTCATACCT-3′（リバース）； TM1522、5′-GCCCATATGTGCTATTCGGGCCAATGGG-3′（フォワード）および5′-GCCCTCGAGCTCCTCTGAACATCTTTTCACATCC-3′（リバース）； TM1731、5′-GCCCATATGGATTGAAAGAAAACCTCG-3′（フォワード）および5′-GCCCTCGAGCTTCCCTCCTTCGAATATG-3′（リバース）。フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれNdeIおよびXhoI制限部位を含んでいた（下線）。TM1597およびTM1731の増幅断片を発現ベクターpET41aにクローニングし、TM1522断片をpET28b（Novagen, Madison, WI, USA）にクローニングした。C末端Hisタグ化TM1597、N末端およびC末端Hisタグ化TM1522、およびC末端Hisタグ化TM1731は、以下に記載するように大腸菌で発現させた。

組換えタンパク質の発現および精製

TM1597およびTM1522を保有する発現ベクターで大腸菌BL21（DE3）pLysS細胞を形質転換し、TM1731を保有する発現ベクターでRosetta 2（DE3）pLysS細胞を形質転換した。各形質転換体は、20μg-mL-1カナマイシンを含むLuria-Bertani培地中、37℃で培養した；Rosetta 2細胞の場合、30μg-mL-1クロラムフェニコールを添加した。形質転換体は600 nmの吸光度（A600）が0.6-0.8になるまで増殖させ、その時点で0.5 mm（TM1597）または1.0 mm（TM1522およびTM1731）のイソプロピルβ-d-チオガラクトピラノシド（IPTG）を培地に添加し、さらに37℃（TM1597およびTM1731）または30℃（TM1522）で6時間培養を続けた。その後、10,000 g、5分間、4 °Cで遠心して細胞を回収した。回収した細胞を500 mm NaClを含む20 mmリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）に再懸濁し、Sonifier 250（Branson, Danbury, CT, USA）を用いて懸濁液を超音波処理した。得られた溶解物を85℃で30分間インキュベートし、20,000 g、4℃で5分間遠心分離し、上清を回収し、100 mm（TM1597）または50 mm（TM1522およびTM1731）のイミダゾールと混合した。

組換えタンパク質をHis SpinTrapカラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）を用いて精製した。上清は、500 mm NaClと100 mm（TM1597）または50 mm（TM1522およびTM1731）イミダゾールを含む20 mmリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で平衡化した後、カラムに適用した。同じバッファーで洗浄後、組換えタンパク質を、500 mm NaClおよび500 mmイミダゾールを含む20 mmリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）で溶出した。溶出したタンパク質画分を、Amicon Ultra-0.5遠心フィルター10K装置(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)を用いて、10%グリセロールを含む50 mm Tris-HCl (pH 8.0)にバッファー交換した。精製した酵素は-80℃で保存した。タンパク質濃度は、Bio-Rad Protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準として測定した。酵素の純度は、12％または13％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS/PAGE）によって確認した。

吸光スペクトル分析

精製酵素の吸光スペクトルを PowerWave XS (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) で測定した。精製したTM1597（2μg-μL-1）、TM1522（4μg-μL-1）、またはTM1731（2μg-μL-1）を、10％グリセロールを含む50 mm Tris-HCl（pH8.0）中のプレートにアプライし、室温で250-550 nmでスキャンを行った。最終濃度1 mmのAOAAを加えた後、混合物を室温で15分（TM1597）または1時間（TM1731）インキュベートした。

4次構造解析

10%分離ゲルと2.5%積層ゲルを用いて、Wittigら[62]の方法に従って、TM1597とTM1522の4次構造を調べるためにBN-PAGEを行った。簡単に説明すると、BN-PAGEは、50 mmトリシン、7.5 mmイミダゾール、0.02%クマシーブリリアントブルー（CBB）G-250からなるカソードバッファーと、25 mmイミダゾールからなるアノードバッファー（pH 7.0）で行った。レーンあたり4マイクログラムの精製酵素をロードした。電気泳動は4℃で100-150Vで行った。バッファーの青色走向フロントが分離ゲルの長さの約3分の1移動した後、カソードバッファーを低濃度のCBB G-250（0.002%）を含む同じバッファーに交換し、電気泳動を再開した。

酵素アッセイ

アミノ酸ラセマーゼ活性およびDpmエピメラーゼ活性は、既 に記載されているようにアッセイした[38]。TM1597の反応混合物（150 μL）は、50 mm CHES-NaOH（pH9.0）、10 mm アミノ酸、50 μm PLP、1 mm ジチオスレイトール（DTT）、および精製酵素（0.1または1 μg）から構成された。TM1522のアッセイでは、反応混合物（150μL）は、50 mm Tris-HCl（pH7.5）、10 mm アミノ酸、1 mm DTTおよび精製酵素（0.1、10または20μg）から構成された。これらの反応混合物を85℃または90℃で指示された時間インキュベートした。TM1731のアッセイでは、反応混合物(150μL)は、50 mm CHES-NaOH (pH 10.0); 10 mm Lys, Ala, Ser, l-Asp, またはl-Gluのd-およびl-エナンチオマー; 50 μm PLP; 1 mm DTT; および精製酵素(20μg)から構成された。これらの反応混合物を90℃で2時間インキュベートした後、600μLのメタノールを加えて反応を終了させた。その後、混合物を-80℃で1時間以上インキュベートし、4℃で20,000g、10分間遠心分離した。上清を0.45μmのMillex-LHフィルター（Merck Millipore）でろ過した。アリコート（10μL）を、メタノール中の400mmホウ酸緩衝液（pH9.0）30μLおよびOPA/Boc-l-Cys 20μL、またはメタノール中の200mmホウ酸緩衝液（pH10.2）30μLおよびOPA/NAC 20μLと混合した。混合物のアリコート（10 μL）をLC-2000PlusまたはLC-4000シリーズHPLCシステム（ジャスコ株式会社、東京、日本）に注入し、アミノ酸誘導体をMightysil RP-18GPカラム（150×4.6 mm i.d.、関東化学株式会社、東京、日本）で分離した。OPA/Boc-l-Cys誘導体の分析では、溶出溶媒Aを50 mm酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2-6.0）、溶出溶媒Bをアセトニトリルとした。溶出は1.0 mL-min-1の流速でグラジエントを用いて行った。例えば、Lysの分析では、10%から32%の溶媒Bへの直線グラジエントを10分間行い、その後32%の溶媒Bでさらに25分間行った。他のアミノ酸の分析のためのグラジエント条件は、以前に記載されたとおりであった[38]。蛍光検出の励起波長は344 nm、発光波長は443 nmとした。Dpm と His の分析には、OPA/NAC 誘導体化法を用いた。溶出溶媒Aは50 mmリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）、溶媒Bはアセトニトリルであった。Dpmの分析では、A：B＝86：14（v/v）、流速0.4 mL-min-1でアイソクラティック溶出を行い、Hisの分析では、A：B＝94：6（v/v）、流速1.0 mL-min-1でアイソクラティック溶出を行った。蛍光検出の励起波長は 350 nm、発光波長は 445 nm であった。

基質特異性

d-およびl-Ala、l-Ser、l-Thr、l-Glu、l-Gln、l-Asp、l-Asn、l-Met、l-Val、l-Leu、l-Ile、d-およびl-Lys、l-Arg、l-Phe、l-Trp、l-Tyr、l-His、d-およびl-Orn、l-Cit、l-Aba、l-Hseを基質として、TM1597およびTM1522のラセマーゼ活性の基質特異性を調べた。ll-Dpmとmeso-Dpmに対するエピメラーゼ活性も調べた。TM1597（0.1または1μg）のアッセイ混合物（150μL）には、50μm PLP、1mm DTT、10mmアミノ酸（l-Tyrの場合は5mm）、50mm CHES-NaOH（pH9.0）が含まれていた。反応混合物を90℃で3分間（Lys、Orn、Alaの場合）または15分間（他のすべてのアミノ酸の場合）インキュベートした。TM1522（0.1、10または20μg）のアッセイ混合物（150μL）は、10mmアミノ酸（l-Tyrの場合は5mm）および50mm Tris-HCl（pH7.5）を含んでいた。反応混合物を85℃で5分間（Dpmの場合）、15分間（Lysの場合）、30分間（Ornの場合）、または2時間（他のすべてのアミノ酸の場合）インキュベートした。

酵素活性に対するpHの影響

TM1597およびTM1522に対するpHの影響を、標準的なアッセイ条件下で10 mm l-Lysに対するラセマーゼ活性を測定することによって調べた。TM1597（0.1μg）を50mm緩衝液中、90℃で3分間、様々なpH値（5.0-11.0）でインキュベートした。TM1522(10μg)は、様々なpH値(5.0-10.0)の50mmバッファー中、85℃で15分間インキュベートした。このアッセイに使用したバッファー は以下の通り：酢酸ナトリウム（pH 5.0-6.0）、PIPES-NaOH（pH 6.0-7.0）、Tris-HCl（pH 7.0-9.0）、CHES-NaOH（pH 9.0-10.0）、CAPS-NaOH（pH 10.0-11.0）。

酵素活性に対する温度の影響

TM1597およびTM1522に対する温度の影響を、標準的なアッセイ条件下で10 mm l-Lysに対するラセマーゼ活性を測定することによって調べた。TM1597 (0.1 μg)を、50 mm CHES-NaOH (pH 9.0)中、様々な温度(50-95 °C)で3分間アッセイした。TM1522(10μg)を50 mm Tris-HCl (pH 7.5)中、様々な温度(50-95 °C)で15分間インキュベートした。

速度論的解析

TM1597 のラセマーゼ活性の速度論的パラメータは、精製酵素 (0.1 μg)、基質として l-Lys (0.4-4 mm)、d-Lys (0.4-4 mm)、l-Orn (0.4-4 mm)、d-Orn (0.4-4 mm)、l-Ala (50-400 mm)、および d-Ala (50-400 mm) を用いて決定した。反応は90℃で1分間（LysとOrn）または3分間（Ala）行った。TM1522のラセマーゼ活性の速度論的パラメーターも、精製酵素[0.1μg(Dpm)または10μg(Lys)]とll-Dpm(0.05-0.3 mm)、meso-Dpm(0.1-1 mm)、またはd-またはl-Lys(100-700 mm)を用いて決定し、反応は90℃で1分間(Dpm)または15分間(Lys)行った。酵素活性のVmaxおよびKm値は、Hanes-Woolfプロットを用いて決定した。kcat値は、Vmax値（これらの値は本文に記載）とHisタグ付き組換え酵素の分子量（TM1597は41 038 Da、TM1522は30 084 Da）から計算した。

謝辞

実験を手伝ってくれた丸山亮一、原田博之、三田敏明（北里大学薬学部）に感謝する。本研究の一部は、日本学術振興会科研費17K18082（TM）および北里大学若手研究グラント（TM）の助成を受けた。

利益相反

著者らは、本原稿に関して利益相反がないことを宣言する。

著者の貢献

TMとHHが研究を計画し、原稿を執筆した。TMは実験を行い、データを解析した。著者全員がデータの解釈に貢献した。

参考文献

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