シロイヌナズナにおけるCENH3クロマチンを介した求心的レトロトランスポゾンの統合
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公開されました： 2025/01/01
シロイヌナズナにおけるCENH3クロマチンを介した求心的レトロトランスポゾンの統合
塚原小百合, Alexandros Bousios, ... Tetsuji Kakutani著者を表示
Nature (2025)この記事を引用する
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要旨
脊椎動物から植物までの生物において、セントロメアの主要な構成要素は、タンデムリピート（TR）やトランスポーザブルエレメント（TE）などの急速に進化する繰り返し配列であり、これらの配列はセントロメア特異的ヒストンH3（CENH3）を保持している1,2。ヒトとシロイヌナズナで最近決定された完全なセントロメア構造は、セントロメアのTR領域内にレトロトランスポゾンが頻繁に組み込まれ、パージされていることを示唆している3,4,5。親センター性」レトロトランスポゾンは、セントロメアの急速な進化というパラドックスに大きな影響を与えているにもかかわらず、どの生物においても、セントロメアのターゲティングに関与するメカニズムはまだよくわかっていない。ここでは、Ty3とTy1の両長末端繰り返しレトロトランスポゾンが、シロイヌナズナのセントロメアTR内で急速にターンオーバーすることを示す。我々は、Ty1/CopiaエレメントTal1（Transposon of Arabidopsis lyrata 1）が、シロイヌナズナのCENH3が占める領域にde novoで統合すること、そしてCENH3領域の異所性拡大がTal1統合領域の拡散をもたらすことを示した。キメラTEの統合スペクトルは、これらのTEの進化の過程で繰り返し変換された、セントロメアと遺伝子リッチ領域に対する対照的なクロマチン標的特異性の原因となる重要な構造変異を明らかにした。私たちの発見は、真核生物ゲノム全体に関連する、TEを介したセントロメアの急速な進化におけるセントロメアクロマチンの影響を示している。
記事 2023年5月17日
Nicotiana benthamianaの完全ゲノムアセンブリにより、セントロメアの
遺伝的およびエピジェネティックなランドスケープが明らかになった
記事 2024年11月14日
テロメアからテロメアへの綿花ゲノムアセンブリにより、セントロメアの進化と、胚発生を制御するMutatorトランスポゾンと関連したモジュールが明らかになった
記事 2024年8月15日
主要記事
染色体伝達に不可欠で保存されたセントロメアの機能にもかかわらず、セントロメアは多様な構造を持ち、進化している、 これは「セントロメアのパラドックス」と呼ばれている1,2,3,4,5,6,7。セントロメアの急速な進化は、タンデムリピート（TR）やトランスポーザブルエレメント（TE）が極めて頻繁に入れ替わることと関連している3,4,5,7,8。セントロメアTRの単一モノマーは通常100から200塩基対（bp）の長さで、1つのヌクレオソームにセントロメア特異的ヒストンH3（CENH3）（CENP-A（セントロメアタンパク質A）としても知られている）をロードすることができる9,10,11。セントロメアTEの特筆すべき特徴は、シトシンメチル化（mC）やヒストンH3リジン9のメチル化（H3K9me）11などのヘテロクロマートマークを含むことで、アクセス性が低下し、転写が抑制される領域が生じる。セントロメアTEとそれに関連する構成的ヘテロクロマチンは、セントロメアの機能と染色体の挙動に大きな影響を与える9,10,11,12,13。
セントロメアTEは、配列変異や進化のレベルで広く研究されてきた5,14,15,16,17,18。しかし、ほとんどのセントロメアTEでは可動コピーが単離されていないため、セントロメアTEの動態に関する理解は、メカニズムレベルではまだ限られている。ここでは、移動性セントロメアTEの挙動と進化の特徴を明らかにし、CENH3クロマチンが統合の誘導に与える影響を明らかにし、TEとセントロメアの動態と進化に示唆を与える。
シロイヌナズナのセントロメアにおけるLTRエレメント
モデル植物であるシロイヌナズナが主に近親交配種であるのに対し、姉妹種であるシロイヌナズナは外交配種であり、そのゲノムにはより多くの活性TEが存在すると予測されている5,19,20,21,22。これと同様に、シロイヌナズナの2つの自然交雑種の完全なセントロメア構造を解析したところ、シロイヌナズナのセントロメアTR領域には、ATHILAと呼ばれるTy3クラスのロングターミナルリピート（LTR）エレメントの統合体の割合が、シロイヌナズナのそれと比べて高いことが明らかになった5（図1a）。リラータゲノムのATHILAコピーは、タリアナゲノムよりも若い傾向があり（図1b）、これは、外交配したリラータゲノムはより活性の高いTEを含んでいるという考えと一致する。ATHILAに加えて、A. lyrataのcentromeric TR領域には、ALE23,24と呼ばれるTy1/CopiaクラスのLTRエレメントが数百挿入されていることがわかった（図1および拡張データ図1a）。ATHILA3,5の場合と同様に、ALEはTR領域に豊富に存在する（図1dおよびExtended Data Fig.） セントロメアTR領域には、A. thalianaよりもA. lyrataの方がATHILAとALEの密度が高く、そのコントラストはA. thalianaのTR領域には全く存在しないALEで最も顕著である（図1a）。求心的ALEは他の近縁属にも広く存在することから（補足的考察1および拡張データ図2）、祖先的なものであるか、あるいは繰り返し進化していることが示唆される。
図1：A. lyrataのセントロメアに存在するLTRエレメント。
図1
a、ATHILAとALEの密度は、セントロメアに関連するTRの内側（In）と外側（Out）1Mbあたりのインタクト挿入数で示す。各円は、セントロメアを含むA. thaliana（コロンビア系統）またはA. lyrata（2系統）ゲノムの1染色体（chr.）を表す3,5。 b, A. lyrataとA. thalianaにおけるATHILAエレメントのLTR配列同一性の分布。InコピーとOutコピーは別々に特徴付けられている。A.thalianaの66アクセッション5のデータを使用した（Methods）。 c, ALE枝のLTR配列の同一性の分布。bおよびcにおいて、中央の線は中央値を表し、ボックスの境界は第1および第3四分位数（四分位範囲）に対応し、ひげは1.5×四分位範囲を超えない範囲で最大値まで拡張し、外れ値は黒い点で示し、括弧内にエレメントの数を示す。 d, TRおよびその周辺領域におけるインタクトなTy1/Copia、ALE、Ty3およびATHILAの挿入の数。TRはその長さによって大きさの異なる20のビンに分割された。e, A. lyrataとA. thalianaのインテグラーゼ(PF00665)と逆転写酵素(PF07727)のコアドメインを連結したALEエレメントの系統樹（黄色のボックス）、Saccharomyces cerevisiaeのTy1エレメント(M18706.1)を根に持つ（下）。4つの主枝を示し、各要素（In/Out）とTRの関係を示した（番号は補足表1に示す）。主要なノードのブートストラップ・サポートと、Tal1とEVDの位置を示す。この図では、シベリア産NT1と北米産MN47のA. lyrataゲノムを用いた。Extended Data Fig. 1aのCircosプロットは、A. lyrata MN47染色体に沿ったTE分布を示す。
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系統解析により、A. lyrataゲノム内のALE要素は4つの主要な枝に分けられた（図1e）。これらの4つのALEクラスターは、セントロメアに関連するTR領域内に局在している点で異なっており（図1eおよび拡張データ図1a）、最も求心的な枝をALE4と呼んだ。ALE4エレメントのほとんど（279個中229個）はTR領域内に位置しているが、ALE1、ALE2、ALE3はほとんどTR領域外にしか局在していない（図1e、右、および拡張データ図1a）。ALE1-ALE3エレメントと比較して、TR領域内のALE4エレメントはエレメント内のLTR同一性が高く（図1c）、系統樹上の末端分岐が短い（図1e）ことから、最近統合されたことが示唆される。TR領域内に古いALE4が挿入されていないことは、セントロメアATHILAエレメント5について提唱されているように、エレメントが効率的に除去されたか、あるいはALE4クレードが最近拡大したことを示唆している。これらの2つのLTRレトロトランスポゾンは、ともにTR領域に頻繁に挿入され、そこから効率的に除去されることが示唆されている。
Tal1のセントロメアへのネオ挿入
A. lyrataのセントロメアALE4コピーの1つであるTal1は、A. thalianaのCOPIA93/EVADE（EVD）と近縁であり（図1e）、両者のコードアミノ酸配列の81.3%（1,442個中1,172個）の同一性を共有している25,26,27。EVDはA. thalianaゲノムの遺伝子リッチ領域に優先的に組み込まれることが示されている26,27,28。我々は以前、A. thalianaゲノム内でde novo Tal1の統合を誘導し、統合が178 bpのTR配列（CEN178）に隣接する領域に濃縮されることを観察した27。しかしながら、ゲノム上のどのような特徴が特異的な統合を決定するのかはまだ不明である。
最近決定されたCol-CEN参照ゲノム（https://github.com/schatzlab/Col-CEN）を用いて、Tal1のde novo統合をプロファイリングした。我々は、Transposable Element Display29の技術をハイスループットシークエンシング（TEd-seq）に応用し、1サンプルあたり10,000-100,000イベントのオーダーでTal1の体細胞新挿入を検出することができた。5本すべての染色体において、Tal1の統合はセントロメリアのTR領域に限られていた（図2a,bおよびExtended Data図3a）。注目すべきことに、Tal1統合領域はCENH3の濃縮と強く関連していた（図2a,bおよび拡張データ図3a）。A.thalianaでは、CENH3はTR領域に限局しているが、リピート配列全体を均一に占めているわけではない3（図2a）。それは4番染色体（CEN4）のセントロメアTR配列で最も明瞭に見られる。CEN4では、CENH3は主にTRクラスターの左半分（短腕側）を占め、Tal1はCENH3が占めた配列に優先的に組み込まれることが観察された（図2a）。5つのセントロメアすべてにおいて、CENH3シグナルはTR領域内で強度の勾配を示し、Tal1の統合頻度はCENH3シグナルと有意に相関していた（r = 0.67）（図2a,c）。これらの結果は、Tal1の統合がCENH3に富むクロマチンを標的にしていることと一致している。
図2：Tal1のde novo統合は、CENH3が占めるTR領域に限定される。
図2
a, 上、A. thalianaにTal1導入遺伝子を導入した後のTalの体細胞ネオ挿入の分布。下、順鎖（赤）または逆鎖（青）方向3についての10kbあたりのCENH3（ChIP/input）（灰色）とCEN178。これらの値はそれぞれ隣接する10kb間隔でカウントした。TR（オレンジ）、染色体周辺（PC、黄色）、染色体アーム（Arm、灰色）領域は下部の異なる色で示した。統合は10kb間隔でカウントし、サイズ9、ステップ1のスライディングウィンドウで示した。Tal1（野生型）、Tal1（ddm1）およびEVD（野生型）は、トランスジェニックA. thaliana株におけるそれぞれのTEのネオ挿入を示すが、EVD（ddm1）は、トランスジーンを持たないddm1変異株における内在性EVDのネオ挿入を示す27。2番染色体と4番染色体の結果を示し、5番染色体すべての結果をExtended Data Fig. c-f、野生型（WT）（c,e）またはddm1（d,f）バックグラウンドにおけるCENH3濃縮とTal1（c,d）またはEVD（e,f）統合頻度を比較した散布図。各ドットは10kb区間の値を表す。各パネルにピアソン相関係数（r）を示す。 g, 野生型およびddm1バックグラウンドにおけるEVDおよびTal1のTR領域、ペリセンタメリック領域、アーム領域への統合特異性のまとめ。これらの各領域における統合の割合を示す。追加行の結果は、Extended Data Fig.
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Tal1はATCOPIA93/EVDと構造的に類似しているため（参考文献25）、TEd-seq法を用いてEVDの体細胞新型挿入も調べた。その結果、EVDは遺伝子の多い染色体アーム領域に優先的に組み込まれたが、野生型でH3K9meなどのヘテロクロマチン標識が濃縮されている染色体周辺やセントロメア領域には組み込まれなかった（図2b,eおよび拡張データ図3a）。我々は、H3K9meやmCなどのヘテロクロマチン標識がセントロメア領域やペリセントロメア領域から消失しているddm1（DNAメチル化の減少）変異体バックグラウンドでのEVD転座を調べた30,31,32,33,34,35,36。ddm1変異体では、EVDが組み込まれたゲノム領域は、野生型と比較して、遠心体周辺領域まで拡大した（図2b,e-gおよびExtended Data図3a）。しかし、ddm1でも、EVDの中心核TRへの再転移は検出されなかった（図2b,e-gおよび拡張データ図3a,b）。EVDのこれらの統合の特徴は、以前の報告28と一致しており、セントロメアのコアに統合するTal1とは対照的である（図2および拡張データ図3）。
次に、ヘテロクロマティックマークの役割を調べるために、ddm1変異体バックグラウンドでTal1の統合を調べた。CENH3で覆われているTR領域は、隣接するセントロメア周囲のヘテロクロマチンと比べて、H3K9meや非CpGコンテキストのメチル-C（mCH、HはA、TまたはC）などのヘテロクロマチックマークが比較的少ない3。ddm1では、centromeric領域とpericentromeric領域でヘテロクロマティックマークが消失しているにもかかわらず、TEd-seqで測定したTal1インテグレーションの分布は、全体的に野生型バックグラウンドの分布と同様であった（図2b-d,gおよびExtended Data Fig.3）。また、PacBioロングリード技術を用いて全ゲノム配列決定を行い、de novoのTal1統合をマッピングしたところ、同様の統合スペクトルが得られた（図2bおよび拡張データ図3a）。これらの結果を総合すると、Tal1は、密接に関連するEVDエレメントとは対照的に、重要な求心的適応を持つということと一致する。
CENH3はTal1の統合領域を規定する
。Tal1の統合領域はCENH3が占める領域と密接に一致するので、CENH3の分布の変化がレトロトランスポジションに及ぼす影響を調べた。CENH3の分布を変化させるために、野生型Col-0バックグラウンドで、構成的に活性なプロモーターRPS5a（参考文献37）の下でこのタンパク質を過剰発現させた。CENH3を過剰発現させた株（以下、CENH3-OXと呼ぶ）では、クロマチンに結合したCENH3の量が増加し（図3aおよび拡張データ図4a）、5本の染色体すべてでTRのCENH3占有部分が著しく拡大した（図3b,cおよび拡張データ図4b）。非トランスジェニック（NT）Col-0ではCENH3はTR領域の一部しか覆っていなかったが、CENH3-OX株ではCENH3はTR領域全体を覆っていた（図3b-dおよび拡張データ図4b,c）。さらに、野生型のCENH3分布がTRアレイの中心に向かってピークを持つ濃縮の勾配を示すのに対し、CENH3-OXではアレイが完全にCENH3で占められているように見え、飽和沈着と一致した（図3c,dおよび拡張データ図4b,c）。CENH3-OXでは、TR領域とペリセントロメリック領域のmCHGレベルが減少した（図3e,f）。おそらくCENH3はH3K9を持たず、H3K9meがDNA mCHGを維持するのに必要だからであろう（参考文献38,39,40）。TR領域におけるmCHGのレベルは、CENH3-OXでは非トランスジェニック対照株で見られた最大レベルよりも1桁低いレベルまで低下しており、CENH3-OX株ではTR領域がCENH3を負荷したヌクレオソームで飽和しているという解釈をさらに裏付けている（図3e,f）。
図3：CENH3沈着の広がりは、Tal1統合の鏡像的拡大を誘導する。
図3
a、非トランスジェニック（NT）株とCENH3を過剰発現させたトランスジェニック株（CENH3-OX）の精製核のウェスタンブロット解析。H3と弱い交差反応性を示すCENH3に対する抗体（抗CENH3 C末端抗体）を使用（検証は補足図1a,bに示す）。同じ条件で、抗H4抗体と独立したトランスジェニック株を追加した生物学的複製を、Extended Data Fig. H3ではなくCENH3を認識する抗体（抗HTR12（CENH3 N末端）抗体）を使用（補足図1a,bで検証）。CENH3のChIP-seqプロファイル（マッピングされた100万リードで正規化し、10kb間隔でカウント）をNT株とCENH3-OX株について示す。他の独立したトランスジェニック系統におけるCENH3プロファイルは、Extended Data Fig. e,親NT系統と比較したCENH-OX系統のDNA mCHGレベル。 f,10kb単位で示したセントロメアTR領域のmCHGレベルのヒストグラム。 g,ddm1突然変異体バックグラウンドで、CENH3-OX導入遺伝子を導入した、または導入していない兄弟植物間で比較したTal1インテグレーションの分布。2つの独立したCENH3-OXファミリーのDDM1野生型およびddm1変異体バックグラウンドのF2植物、およびF1植物の結果をExtended Data Fig.5に示す。
次に、Tal1とCENH3-OXを発現するトランスジェニック系統間の交配から得られた子孫を用いて、Tal1の統合に対するCENH3の過剰発現の影響を調べた。CENH3-OXバックグラウンドでは、Tal1の統合はTR領域全体にわたって見られた（図3gおよびExtended Data Fig.） CEN4では、Tal1インテグレーションの拡大がはっきりと観察され、TRクラスターの右半分へのTal1インテグレーションの広がりは、CENH3-OXにおけるTR領域全体へのCENH3シグナルの広がりと類似していた（図3gおよびExtended Data Fig.） CENH3-OX株のddm1および野生型バックグラウンドの両方において、Tal1の統合はTR領域全体に広がっており、これはCENH3の分布の変化を反映している。CENH3-OX系統の一部では、TR領域の外側にもTal1の組み込みが見られ（図3gおよび拡張データ図5）、これはCENH3のペリセンタローマ領域への拡大（図3b-dおよび拡張データ図4b,c）と類似している。これらの結果は、Tal1がin vivoでCENH3クロマチンに標的化されていることを直接的に示している（さらなる考察は補論2参照）。
統合バイアスの遺伝的基盤
Tal1はCENH3クロマチンに標的化されるのに対し、EVDは遺伝子が豊富な染色体アーム領域に標的化される（図2）。Tal1とEVDの異なる統合嗜好性の遺伝的基盤を探るため、キメラ構築体を作製し、その統合スペクトルをゲノムワイドに調べた（図4）。インテグラーゼが標的部位の特異性を決定することが知られていることから、インテグラーゼの保存ドメイン（IN1）を含む領域と、より多様なC末端領域（IN2）を含む領域を試験した（補足図2a）41,42,43,44。EVDバックボーン内にTal1のIN2を持つキメラ構築物（EVD_IN2_T）は、セントロメアTRアレイに特異的にインテグレートすることがわかった（図4aおよびExtended Data Fig.6）。逆に、EVDのIN2領域をTal1のバックボーンに組み込んだキメラ構築物（Tal1_IN2_E）は、染色体アーム領域に組み込まれた（図4aおよび拡張データ図6）。IN1領域の同様のキメラ構築物は、エレメント統合特異性の変化を引き起こさなかった（図4aおよび拡張データ図6）。これらの結果は、インテグラーゼのC末端領域が、Tal1とEVDのセントロメアと染色体アームのそれぞれへの強い統合選好性の原因であることを示している。
図4：求心的統合と求心的統合を規定するインテグラーゼ領域のマッピング。
図4
a, TEd-seqで調べた各キメラTEのde novo体細胞挿入。各キメラTEの構造を左図に模式的に示す。IN1とIN2はそれぞれインテグラーゼの保存ドメインとそのC末端領域に対応する（補足図2）。青と灰色はそれぞれTal1とEVDの配列を示す。2番染色体と4番染色体の統合スペクトルを示す。5本すべての染色体、およびさらなるトランスジェニック系統の結果をExtended Data Fig.