生後14年間の腸内細菌叢の発達と思春期における内面化・外面化困難および社会不安との関連性

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発行：2023年4月18日
生後14年間の腸内細菌叢の発達と思春期における内面化・外面化困難および社会不安との関連性

Development of the gut microbiota in the first 14 years of life and its relations to internalizing and externalizing difficulties and social anxiety during puberty - European Child & Adolescent Psychiatry

ヤンウェンシャン オウ
クララ・ベルツァー
...
カロリナ・デ・ウィールト
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European Child & Adolescent Psychiatry (2023)この記事を引用する
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メトリックス詳細
アブストラクト
腸内細菌叢と宿主の精神的健康との関係は、多くの症例対照研究や横断研究によって示唆されているが、長期間にわたって追跡調査した大規模なコミュニティサンプルでは、裏付けとなる証拠は限られている。そこで、今回の事前登録研究（https://osf.io/8ymav、2022年9月7日）では、生後14年間の子どもの腸内細菌叢の発達について説明し、メンタルヘルス問題の発症に関連性の高い時期である思春期の内向的・外向的困難や社会不安との関係を探りました。193人の子どもから採取した合計1003サンプルについて、16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンシークエンスにより、糞便微生物叢の組成を分析した。クラスタリング法により、4つの異なる微生物クラスターが思春期に新たに同定された。これらのクラスターのうち3つのクラスター内のほとんどの子どもは、12歳から14歳まで同じクラスターに留まり、この時期の微生物の発達と移行が安定していることが示唆された。これらの3つのクラスターは、それぞれBacteroides、Prevotella、Ruminococcusに富む腸型（すなわち、異なる集団間での組成に基づく腸内細菌叢の強固な分類）と組成的に類似していた。2つのPrevotella 9優勢クラスターは、私たちが先に報告した中年期と思春期のクラスターを含み、14歳時点でのより多くの外向的行動と関連していた。Faecalibacteriumが枯渇した思春期クラスター1つは、14歳時の社会不安の多さに関連していた。この発見は、14歳児におけるFaecalibacteriumと社会不安の間の負の横断的な関係によって確認された。本研究の結果は、出生時から追跡調査した比較的大規模なコミュニティサンプルにおける腸内細菌叢の発達をマッピングし、思春期までの知識を重要な形で拡張するものである。その結果、Prevotella 9とFaecalibacteriumが、それぞれ外向的行動と社会不安に関連する微生物分類群である可能性が示されました。これらの相関的な知見は、因果関係を推論する前に、他の類似のコホート研究による検証や、設計されたメカニズムに基づく前臨床試験を行う必要がある。
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はじめに
腸内細菌叢は健康の多くの基本的側面において重要な役割を担っており、幼少期やその後の人生において宿主の体力を維持するためには、幼少期におけるその正常な発達が必要です [1、2]。縦断的な研究により、腸内細菌叢は乳幼児期に比較的ダイナミックなパターンで発達することが明らかになっています[3,4,5]。重要なことは、この生態系の継承は、これまで信じられてきたように生後3年以内に終息するのではなく[6, 7]、少なくとも小児期中期までは変化が続き、外的影響因子の結果であると考えられることです[8]。しかし、身体的、ホルモン的、感情的、社会的に大きな変化を伴う思春期においても、微生物群集の継承過程が続くかどうかは、現在までのところ不明である。
腸内細菌叢は、精神的な健康や障害に深く関わっています[9, 10]。特に人生の初期には、急速に発達する腸内細菌叢が、免疫反応の活性化、迷走神経の刺激、宿主の代謝や内分泌系への影響など、微生物叢-腸-脳軸（MGBA）に沿って現在およびその後の脳や行動の発達に影響を与える可能性があり、その逆もまたしかりです [9, 10] 。生後3年間の腸内細菌叢と5歳までの子どもの行動との間だけでなく、青年期以前の腸内細菌叢と行動との間にも、微生物と行動の関係が見出されていることは注目に値する [11,12,13,14,15,16]。生後6カ月で乳酸菌が枯渇した子どもは、10歳で多動性と衝動性を示した[17]。このような長期にわたる関連性は、多感な時期の腸内細菌叢に対する複数の内的要因（例えば、宿主の生物学的性別や遺伝）と外的要因（例えば、抗生物質の使用や食事）の影響に起因しているかもしれません［1、9、18］。
思春期は、身体的および精神的に大きな変化が起こる敏感な発達の窓である。思春期には、子どもは内面化行動と外面化行動の困難が顕著になる傾向があります。内面化の問題は、内的な心理環境に影響を及ぼし（引きこもり、不安、抑うつ的特徴）、外面化の問題は、外的な環境に現れる（衝動的、攻撃的、多動的特徴） [19] 。注目すべきことに、乳児期と幼児期中期の両タイプの行動困難は、腸内微生物のアルファ多様性と個々の微生物分類群の相対存在量に関連している [8, 13, 16, 20] 。思春期にも同様の関連性があるかどうかは、これまで未解明のままであった。思春期には、典型的な発達段階にある子どもは、仲間との絆を深めようとし、親からますます独立するようになります [21, 22] 。このような子どもの行動の変化は、内面化行動に該当する訴えである社会不安の発症リスクを高め、うつ病や孤独感などの他の内面化症状の潜在的な先行要因として重要な役割を果たす [23]。MGBAについては、全般性不安障害（GAD）患者において、α多様性レベルが低く、BacteroidesとEscherichia-Shigellaの相対量が高いことが報告されています[24、25、26]が、思春期の地域の子どもにおける社会不安症状と腸内細菌の関連性に関する情報はまだ不足しています。
したがって、我々の最初の目的は、縦断的コホート（出生時のN = 193）において、出生から思春期までの腸内細菌叢の発達を記述することであった。この目的のために、12歳と14歳のサンプルで思春期クラスターを決定し、以前に決定した乳児期（1歳、3歳、4カ月）と中年期（6歳、10歳）の微生物クラスターに結合した[8]。その後、生後14年間の腸内細菌叢と、14歳時点での内面化・外面化困難および社会不安との関連性を調査した。関連性は、（1）微生物クラスターおよび系統的多様性の経時的変化と14歳時の子どもの行動指標との関係、（2）個々の分類群相対量と14歳時の行動指標との横断的関係の2つの方法で分析された。
方法
研究対象者
本研究は、BIBOと名付けられた進行中の縦断コホート（N = 193はもともと妊娠中に募集された）から、1、3、4か月齢、および6、10、12、14歳に採取した糞便サンプルを含み、オランダ、ナイメーヘンのラドバウド大学社会科学部の倫理委員会の承認を得た（ECG300107、ECG13012012、SW2017-1303-497およびSW2017-1303-498）。当初の募集基準および手続きは、別の場所で説明されている[27]。本研究は、OSFプラットフォーム（https://osf.io/8ymav）に事前登録された。
データ収集の手順
当初の募集のプロセスと基準については、別の場所で説明されている[27]。10歳までのデータ収集手順は以前に説明されており[8]、12歳でのデータ収集の説明はリンク（https://osf.io/wu2vt）を通して見ることができる。10歳までの糞便微生物組成は以前に分析されたが[8]、14歳の行動指標と関連付けることを目的としたものではなかった。12歳時の微生物データは、横断研究（https://osf.io/wu2vt）で分析されましたが、微生物の発達を記述し、14歳時の行動指標と関連付けることを目的としたものではありませんでした。14歳時のラウンドには合計143人の子どもが参加し、そのうち125人の子どもが糞便サンプルを提供しました。14歳時の腸内細菌叢と行動指標のデータは、基本的な記述統計（行動指標の分布、相関、内部整合性など）を除き、本研究の予備登録前に分析されていない。子どもの特性と記述、およびそれらの欠落を表1に表示する。
表1 14歳時の集団特性および記述
フルサイズテーブル
腸内細菌叢の構成
14歳の糞便サンプルについては、それ以前のサンプルに使用したのと同じDNA分離プロトコルを使用した[8]。簡単に言うと、0.01から0.13gの糞便サンプルを、Maxwell 16 Total RNAシステム（Promega、Wisconsin、USA）を通して微生物DNA抽出に使用した。細菌および古細菌の16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子のV4領域の重複アンプリコンを精製し、配列を決定する前にサンプルあたり200ngに調整した。
思春期の配列データ（すなわち、12歳および14歳で利用可能なN = 139および125のサンプル）を含み、アンプリコン配列変異（ASV）を特定するためにNG-Tax 2.0パイプラインを用いて処理した[28、29]。これらのASVは、SILVA_138_SSU 16S rRNA遺伝子参照データベース[30]に基づいて分類学的に割り当てられました。合計52,054,996リードが得られ、サンプルあたりの中央値は182,740リードであった。思春期に観察された分類群は、以下に概説する微生物クラスター同定と行動関係調査に使用した。10歳までの微生物データ（すなわち、生後1、3、4ヶ月、6、10歳のN = 739サンプル）については、我々の先行研究[8]で提示した微生物クラスター（すなわち、乳児期に3クラスター、中年期に4クラスター）および系統的多様性をそのまま使用した。
行動学的測定
14歳の子どもには、内面化・外面化の困難さについてはStrengths and Difficulties Questionnaire（SDQ）［31］、社会不安の訴えについてはSocial Anxiety Scale for Adolescents（SAS-A）［32］を記入してもらった。SDQには、内面化サブスケールと外面化サブスケールがある。それぞれの下位尺度には10項目が含まれ、3点満点（0～2）で採点され、0～20点の最終スコアとなる。SAS-Aには、不安評価に使用される18項目と、スコア算出に使用されない4つのフィラー項目が含まれています。SAS-Aの各項目は5段階評価（1～5）で採点され、社会不安の総スコアは18～90の範囲となります。内面化行動、外面化行動、社会不安のスコアが高いほど、より困難な状況を反映しています。コミュニティサンプルにおける臨床的な行動問題のカットオフ値は、内面化行動＞7 [33]、外面化行動＞8 [33]、社会不安≧50 [34, 35] です。これらの行動指標は、ωtotal値[36]で表される許容可能な内部一貫性を有することが確認された、すなわち、psych Rパッケージ[37]で計算したところ、内面化＝0.71、外面化＝0.68、社会不安＝0.94。内面化行動と社会不安は高い相関があり（スピアマンのRho＝0.72、p＜0.001）、外面化行動は内面化行動や社会不安と相関がなかった（スピアマンのRho＝0.11、0.10、それぞれ）。
共変量の可能性
また、腸内細菌叢と宿主行動に関連することが知られている変数を、子ども年齢14歳の時点で測定した： (1）年齢（年）、（2）子どもの性別（男の子と女の子）、（3）タナーステージ（Therarcheまたは精巣の発達と初潮を含む）（いずれも5段階評価で、スコア1は思春期前の状態、スコア5は完全な性的成熟を意味します）； (4) zscore RパッケージによりWHO Growth Referenceで算出したzBMI [38]; (5) 家庭訪問前の1週間に子どもが病気になったかどうか [27]; (6) 過去1年間に子どもが抗生物質を服用したかどうか [27]; (7. 1）食事の質、オランダの食事ガイドラインの遵守を評価するEetscore [39]と名付けられたオンライン自己報告式アンケートによって測定される。総スコアは0～160点の範囲で、スコアが高いほどガイドラインの遵守度が高く、一般的に健康的な食事であることを表す。最終的なPAQ-Aの活動サマリースコアは1～5で、スコア1は身体活動が低いことを、スコア5は身体活動が高いことを示す。（9）アルコール、タバコ、薬物の使用（Brief Screener for Tobacco, Alcohol, and Other Drugs（BSTAD）［41］により測定）；（10）便の硬さは、7段階のBristol stoolスケールで測定し、タイプ1は最も塊状、タイプ7は最も液状のものを示す ［42］．3型と4型（すなわち、ソーセージ状または蛇状で表面に亀裂があるか、滑らかで柔らかい）は、一般集団の正常な便型と考えられている[43];（11）母親と父親の教育レベルは1～8で、得点が高いほど教育レベルが高いことを示す;（12）Pittsburg Sleep Quality自己報告質問票で測定した、一晩の睡眠時間の時間;（13）ペット（はいまたはいいえ）.
統計分析
すべての解析は、R studio（バージョン4.1）を用いて、phyloseq, microbiome, picante, dplyr, data.table, tidyr, moments, faraway, gtsummary, ComplexHeatmap, ggpubr, microbiomeMarker, MASS Rパッケージで実施されました。
最初の目的：生後14年間における腸内細菌叢の発達
我々は、出生から14歳までの腸内細菌叢の発達を説明するために、微生物クラスター（すなわち、腸内細菌叢の保存された組成パターン）を使用しました。出生から10歳までの微生物クラスターは、私たちの先行研究[8]でディリクレ多項混合（DMM）モデル[45]によって同定されたため、今回の研究にも直接組み込んだ。ここでは、同じクラスタリング方法を用いて、12歳と14歳の微生物データをまとめて解析した。思春期微生物の最適なクラスタ数は、ラプラス近似スコアが最も低いものによって決定した。
思春期の微生物クラスターの発達と推移は、以前に報告された乳児期と小児期の微生物クラスターと一緒に表示された。ASVベースの系統的多様性と属レベルのβ多様性（加重UniFrac距離使用）を思春期微生物クラスター間で比較した。LEfSe（すなわち、線形判別分析Effect Size）を用いて、思春期クラスター間で異なる豊富な微生物分類群を同定した。多重比較は、偽発見率（FDR）法で補正した。
さらに、思春期微生物クラスターが前述の潜在的共変量と関連しているかどうかを評価した。この目的のために、冗長性分析（RDA）を用いて、14歳時点での微生物の分散が、どの程度、潜在的な共変量によって説明されるかを評価した。単純効果と限界効果の両方が測定された。単純効果とは、他の変数を考慮せずに1つの変数で説明される分散を意味する。限界効果とは、他の変数によって説明される分散を取り除いた後に、1つの変数によって説明される分散を意味します。
第二の目的：生後14年間にわたる腸内細菌叢と14歳時の行動指標との関連性
一般化線形モデル（GLM）を用いて、微生物クラスターおよび系統的多様性の経時的変化と、14歳時点での行動指標（すなわち、内向・外向行動、社会不安）の関係を評価した。注目すべきは、腸内細菌叢は生後間もない時期に急速に発達し[4, 6]、様々な年齢における微生物叢は、行動の結果に対して異なる関係を示す可能性がある[46]。そこで、まず、各年齢の微生物データを個別に分析した（すなわち、生後1、3、4カ月、および6、10、12、14歳）。第二に、個々の時点を折りたたんで、腸内細菌叢が行動に影響を与える可能性のある広い窓（例：乳児期、小児期、思春期）を提供するため、異なる発達段階（例：乳児期、小児期、思春期）での分析を実施した。この2つの分析により、腸内細菌が発達に影響を及ぼす可能性のある敏感な時期や窓についての洞察を得ることができます。さらに、属レベルの個々の分類群相対存在量と14歳時の行動指標との横断的な関係を測定するために、GLMも実施しました。また、14歳時点での微生物の変動が、RDAを通じて同年齢の行動指標でどの程度説明できるかを記述しました。
行動成果に対して最も適合する分布を選択するために、その分布の正規性と歪度を測定しました。内向的行動と社会不安は右寄りで（歪度＝0.97と0.60）、非正規分布（シャピロ・ウィルク検定で正規性を評価、いずれもp＜0.01、非正規分布を示す）だったため、負の二項分布がGLMに用いられた［47］。外向行動は正規分布（p = 0.08 > 0.05）であり、歪曲していない（歪度 = 0.12）ので、GLMでは正規分布が用いられた。
以下のように2種類のモデルを実施した：
(1)
行動指標と微生物パラメータとの独立した関係を測定するために、Bi〜Mjの粗モデルを使用した。"Bi "は行動指標の行列を表し、"i "は内面化行動、外面化行動、社会不安のいずれかを指す。"Mj "は微生物パラメータを示し、"j "は微生物クラスター、系統的多様性、または14歳サンプルの10％以上に蔓延する個々の属レベルの分類群の相対存在量のいずれかを示す。
(2)
Bi〜Mj＋潜在的共変量の調整済みモデルは、対応する粗モデルが元の未調整のp＜0.05であることが判明した場合に実施された。調整済みモデルを実施する前に、行動指標とその潜在的な共変量の間の独立した関係をGLMで評価した（表S1）。内面化行動については、（a）子どもの性別、食事の質、一晩の睡眠時間が含まれ、外面化行動については、（b）一晩の睡眠時間、アルコール摂取量が含まれ、社会不安については、（c）子どもの性別、食事の質、一晩の睡眠時間、父親の教育水準が含まれるなど、元のp < 0.05のものが調整モデルで用いられた［48］：。すべての調整済みモデルにおけるMjと潜在的共変量の分散インフレーション因子（VIF）値は3未満であり、多重共線性の問題がないことを示していた[49]。
多重GLM検定は、FDR法で補正した。
有意性
有意性は、多重検定でない場合はp<0.05、多重検定の場合はFDR調整p<0.05と定義した。ただし、RDAはパーミュテーション検定により有意性を決定した。
結果
母集団の特徴および記述事項
14歳のラウンドに参加した子どもの約半数は男子であった（表1）。男児と比較して、女児は性成熟が有意に早く、自己申告による内面化行動や社会不安も強かった。さらに、女児はzBMI値が有意ではないがわずかに高く、食事の質が良く、Bristolスコアが低く（Bristol便の一貫性のタイプの分布をカテゴリー形式で図S1に表示）、睡眠時間が短かった（未調整p<0.10）。潜在的な共変量によって説明される微生物の分散について（表S2；有意性はFDR調整なしのパーミュテーション検定によって決定）、一晩の睡眠時間は総変動の3.05％を占め（単純効果、p < 0.01）、次いでアルコールを飲む（単純効果、R2％=1.72％だがp = 0.07と有意ではない）。一晩の睡眠時間については、他の変数で説明される分散を分割しても有意性が残った（限界効果、R2％＝2.07％、p＝0.03）。
生後14年間における腸内細菌叢の発達
微生物クラスターとその変遷
12歳と14歳のN = 264個の思春期サンプルから、DMMモデルで最も低いラプラス値によって決定された組成上の特徴（図1a）に基づいて、4つの微生物クラスターを同定した（図S2）。FDR補正後、これらのクラスター間の潜在的な共変量に有意な差は観察されなかった（表S3）。しかし、Puberty_2とPuberty_4はより多くの男児を含む傾向があり（Puberty_2は67％、38/57人、Puberty_4は60％、52/87人）、Puberty_3はより少ない男児（37％、17/46人）で構成されていた（ピアソンのカイ2乗検定p = 0.009、調整p = 0.2. また、Puberty_1では、抗生物質の経口摂取が多かった（Puberty_1では8.1%、6/74、他の3クラスターでは5%未満）；Fisherの正確検定p = 0.034、調整後p = 0.2. さらに、Puberty_2内の14歳児の38％（10/26）が過去1年間にアルコールを飲んでおり、この年齢で他の思春期クラスターに属する者（20％未満）よりも頻度が高かった；Fisherの正確検定p = 0.016、調整後p = 0.2.
図1
微生物クラスター。a 生後14年間の微生物クラスター間の遷移。微生物クラスターは、DMMクラスタリング法により、属レベルでの構成上の特徴に従って決定された。乳児期（生後1、3、4ヶ月）と中年期（生後6、10歳）のクラスターは既報[8]、思春期（生後12、14歳）のクラスターは本研究で決定した。微生物クラスターはノードとして表示され、サイズと数字は対応するクラスターに属するサンプルの数を示している。思春期の4つのクラスターは、それぞれピンク、グラスグリーン、レイクブルー、パープルで色分けされている。クラスター間の移行率は、完全症例サンプルに基づいて計算され、大きめの線で示されている。10歳から12歳までの完成例はN=130、12歳から14歳までの完成例はN=116である。10歳から14歳までの線はオレンジ色で強調し、移行率（>10%）をパーセントで示した。 b 思春期微生物クラスターの系統的多様性。ボックスプロットは、四分位範囲と中央値を示す。ヒゲは四分位数範囲の1.5倍を示す。ウィルコクソン検定はFDR補正でクラスタ間で実施した（調整p：ns, not significant; * < 0.05; ** < 0.01）。 c 思春期微生物クラスター間のβ多様性。属レベルの微生物分類群の相対存在量データに基づく重み付けUniFrac距離により算出した。楕円は、多変量正規分布を仮定した思春期クラスターの95％信頼区間を表す。 d 思春期の微生物クラスター間で差分的に存在する属レベルの分類群。これらの分類群は、FDR調整p < 0.05、LDA（線形判別分析）効果量 > 4のLEfSe（線形判別分析効果量）により同定されました。個体における分類群相対存在量を左側のヒートマップに示す。右側のバープロットはLDAスコアを表し、色は濃縮されたクラスターを示す
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12歳では、26％、22％、16％、36％（36、31、22、50/139）の子供が、それぞれPuberty_1、Puberty_2、Puberty_3、Puberty_4という微生物クラスターに属していた。14歳では、30％、21％、19％、30％（38、26、24、37/125）の子どもが、それぞれこれら4つの思春期クラスターに所属していた。
思春期には、N = 116人の子供が12歳と14歳の時に両方のサンプルを提供した。このうち、22％が思春期_1に、22％が思春期_4に、14％が思春期_2に属していた（図1a）。さらに、12歳時にPuberty_1にいた子どもの81%（25/31）が14歳時にも同じクラスターにとどまり、Puberty_2では62%（16/26）、Puberty_4では59%（26/44）であり、この時期、Puberty_2やPuberty_4と比べて、より安定したPuberty_1の中での推移が示唆された（表S4）。一方、12歳時のPuberty_3内の子どもは、12歳から14歳にかけて、より多様な発達の軌跡を示した。10歳と12歳のN = 130の完成例では、これらの子供の16%と15%が小児期の微生物クラスター3と4からPuberty_4に移行し、15%が小児期のクラスター1からPuberty_1に発展した（図1a；移行率は表S4に詳しく示されている）。
思春期微生物クラスターの組成的特徴
Puberty_1が最も系統的多様性が低く、次いでPuberty_2、Puberty_3とPuberty_4が最も系統的多様性を示した（図1b）。Puberty_1、Puberty_2、Puberty_3の楕円は部分的に重なり、Puberty_4の楕円は前述の3つのクラスターの重なり部分にほぼ完全に収まっていた（図1c）。さらに、Puberty_2の楕円は他の3つのクラスターの楕円よりも大きく、Puberty_2の腸内細菌叢にはより個人差があることが示唆されました。その上、思春期クラスター間で異なる組成の分散（すなわち分散の不均一性）が観察された（betadisper p = 0.005）．具体的には、Puberty_4はPuberty_2およびPuberty_3と異なっていた（いずれもbetadisper p = 0.001）。アドニス関数（p = 0.001）はさらに、思春期クラスター間の微生物組成における一般的な非類似性を示した。クラスター間の一対比較でもこの結果が確認された（adonis p = 0.001 for all）。さらに、Puberty_2内の31サンプル（12歳のN = 14と14歳のN = 17を含む）が、思春期の他のサンプルと比較して、分散して配置されている（垂直破線の右側に示すように）ことを発見しました。
LEfSe解析（効果量＞2、FDR調整p＜0.05）に基づき、門、クラス、目、科、属のレベルで思春期クラスター間にそれぞれ9、15、28、43、105の微生物分類群が差分的に存在することがわかった。特に、Puberty_1はBacteroides、Lachnospiraceae科の未同定属、Faecalibacterium、Blautia、Fusicatenibacterに富み、Puberty_2はPrevotella 9に優位であった、 Puberty_3はBifidobacterium、Akkermansia、Subdoligranulum、Christensenellaceae R-7グループ、Dialisterに、Puberty_4はRuminococcusとOscillospiraceae UCG-002に濃縮されていた（図）。1d).
生後14年間にわたる腸内細菌叢と14歳時の行動指標との関連性
微生物クラスターおよび系統的多様性の経時変化と14歳時の子どもの行動指標との関係
まず、各時点または期間における微生物予測因子（すなわち、1、3、4カ月を含む乳児期、6、10年を含む児童期、12、14年を含む思春期の微生物クラスターまたは系統的多様性のいずれか）と14歳の行動結果（すなわち、内向・外向行動、社会不安）の独立関係を、共変量を考慮しない粗一般化線形モデル（GLM）で決定した。次に、行動学的アウトカムについて、潜在的な共変量でGLMを調整しました。これは、粗GLMで0.05以下のp値を示した共変量に基づいている（表2；クラスターと系統的多様性に関する詳細なGLM結果は、それぞれ表S5とS6を参照）。
表2 生後14年間の微生物クラスターまたは系統的多様性のいずれかと14歳時の行動アウトカムとの関係の主な所見
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調整GLMでは、Infancy_2クラスタにおいて、生後1ヶ月から4ヶ月までの期間に内向的行動の増加が見られたが（推定値=0.2、調整p=0.021）、個別の時点では見られなかった。同様に、Childhood_2とPuberty_2においても、対応する時期に外向的行動の増加が調整GLMで認められた（推定値＝それぞれ1.4と1.3、調整p＝0.023と0.029）。そのほか、生後3ヶ月のInfancy_2、14歳のPuberty_3では、思春期の時期に社会不安の増加が見られた（共変量を考慮した上で、推定値≦0.2、調整後p＜0.05）。系統的多様性に関しては、乳幼児期にのみ有意な知見が認められ、14歳時の社会不安と軽度の正の関係があった（推定値＜0.1、調整GLMで調整p＝0.004）、すなわち乳幼児期の系統的多様性の増加は、14歳時の社会不安困難性の増加と関連していた。
さらに、β多様性に基づく思春期の分散型Puberty_2サンプルと他のサンプルの行動関係の違いを探った（表S7）。この目的のために、上述と同じ粗および調整GLMを実行した。14歳のDisperse Puberty_2サンプルは、共変量を考慮しない場合、同年齢の内面化行動が有意に多かったが（推定値＝0.4、調整後p＝0.02）、共変量を考慮するとその差はわずかなものになった（推定値＝0.3、調整後p＝0.079）。同様に、共変量による影響を除外した結果、思春期のPuberty_2サンプルは外向行動の増加を示さなかった（粗GLM：推定値＝1.3、調整後p＝0.041、調整GLM：推定値＝0.6、調整後p＝0.338）。
14歳児における腸内細菌叢と行動指標との横断的な関係
RDAの結果、外向行動は、他の変数を考慮することなく、14歳の微生物分散を有意に説明する唯一の行動指標であった（単純効果、R2% = 1.93%、p = 0.04; 表S2）。しかし、一晩の睡眠時間と飲酒によって説明される分散を分割した後、外向行動は有意なままではなかった（限界効果、R2％＝0.58％、p＝0.71）。さらに、14歳時点での個々の属レベルの分類群の相対的な存在量と行動指標との間の横断的な関係を測定した。表3は、粗GLMにおける本来の有意性がp < 0.05であった分類群の結果である。
表3 14歳児における属レベルの分類群相対存在量と行動指標との関係の主な結果
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粗GLMでは、Agathobacter、Lachnospira、Turicibacterの相対量が多いほど内面化問題が多く、Barnesiella、Faecalibacteriumの相対量が多いほど内面化行動が少ないとの関連が認められた（調整p < 0.05）。しかし、共変数を考慮した結果、いずれも有意ではなかった。
外向性行動に関しては、粗GLMにおいて、Holdemanella、Oscillospiraceae NK4A214グループ、Phascolarctobacteriumの相対量が多いほど外向性行動が多く、Erysipelatoclostridium、Lachnospiraceae ND3007グループの相対量が多いほど、外向性問題が少ないことが認められた（Erysipelatoclostridiumを除く、調整p = 0.051）。共変量や多重検定を考慮しても、Holdemanella、Oscillospiraceae NK4A214グループ、Phascolarctobacteriumでは有意性が保たれた。さらに、Erysipelatoclostridiumについては、調整後のモデルで推定値が有意になった（調整後のp = 0.039、ただし平均相対存在量は0.1%未満と低い）。有意ではなかったが、共変量で補正すると、Prevotella 9と外向行動の関係が顕著に変化することがわかった（推定値4.2→1.8、変化率2.33）。
社会不安については，粗GLMではErysipelatoclostridiumとTuricibacterに正の関係が，Collinsella，Faecalibacterium，Lachnospiraceae ND3007に負の関係が認められた（調整p＜0.05）．共変量でGLMを調整した後も、ErysipelatoclostridiumとFaecalibacteriumでは有意差が残っていた。なお、Faecalibacteriumは14歳児に非常に多く（99.2％）、平均相対存在率は9.3％であった。
考察
本研究では、縦断的な出生コホート（1ヶ月から14年まで追跡調査）に参加する子どものコミュニティサンプルに焦点を当てました。DMM法を用いて、思春期の子どもたちの間で4つの異なる微生物クラスターを同定し、この敏感な時期における腸内細菌叢の発達と移行に関する知識を拡大しました。人生の最初の10年間に決定された微生物クラスターを含めることによって[8]、2つのPrevotella 9に富む微生物クラスター（すなわち、Chilhood_2およびPuberty_2）が、14歳においてより外向的行動に関連していることが判明しました。さらに、Puberty_3は、Puberty_1に比べてFaecalibacteriumが少ないという特徴があり、14歳時点での社会不安と関連があった。さらに、Faecalibacteriumの相対量が多いほど、14歳時の社会不安が少ないことが横断的に関連し、Puberty_3の知見を支持した。
この結果から、中年期の微生物クラスターと思春期の微生物クラスターには、いくつかの類似性があることが示されました[8]。Puberty_1はChildhood_1に似ており、同様に系統的多様性が低いことが示された。Puberty_2はPrevotella 9が優勢であり、これはChildhood_2でも顕著な特徴であった。さらに、Puberty_3とPuberty_4では高い系統多様性が観察され、一見Childhood_3やChildhood_4と一致しているように見えた。生後10年間の微生物クラスターのダイナミックな継承に比べ、この子供たちのグループでは、思春期クラスター間の移行はより安定していた。12歳から14歳まで、Puberty_1、Puberty_2、Puberty_4内のほとんどの子どもは、同じクラスターにとどまった。重要なことは、これらの3つのクラスターはそれぞれBacteroides、Prevotella 9、Ruminococcusに富んでおり、これは2011年に報告された3つの腸型とよく一致し、異なる集団において年齢に依存しないと思われました[50]。したがって、Puberty_1、Puberty_2、Puberty_4は、より成熟した腸内細菌叢のスタジアムを表している可能性があります。逆に、Puberty_3は、12歳からの移行が比較的乖離していたため、成熟していない段階に相当する可能性がある（すなわち、移行はほぼ均等にPuberty_1、Puberty_2、Puberty_3に向かっており、優位な移行パターンを持たないより不安定なクラスターの存在を示す）。
思春期微生物クラスターにおける男女間の差は弱いが（つまり、差はFDR補正に耐えられなかった）、これらの差の中には注目に値するものもあるようだ。例えば、Puberty_2とPuberty_4は男子が多く、Puberty_3は女子が多い傾向があった。Puberty_3は、β-グルクロニダーゼ活性を持つビフィズス菌が豊富で、不活性な結合型エストロゲンを活性な非結合型エストロゲンに脱共役させることができる [51] 。脱共役したエストロゲンは、腸で再吸収され、血流を循環することができます。肝臓で抱合された後、不活性エストロゲンの一部は腸に到達し、微生物叢の構成に影響を与える可能性があります [52] 。エストロゲンは、アンドロゲンと共に、思春期における性的成熟の自然なプロセスを誘発する [53]。腸内細菌叢の組成は、性差のある思春期の段階間で異なる可能性が示唆されている [54, 55]。しかし、このような矛盾は、思春期の状態のみを考慮し、子どもの性別との相互作用を考慮しなかった我々の研究においては、観察されなかった。もう一つの予想外の発見は、一般的な食事は思春期クラスターの違いを説明しないようであったが、アルコール消費は説明したことであった。14歳では、Prevotella 9が優勢なPuberty_2は、アルコールを摂取する割合が高いことが示された。これは、成人集団において、中程度のアルコール消費量であっても増加すると、プレボテラ9の相対量が高くなるという最近の発見と一致した[56]。微生物クラスターとアルコール摂取量に基づいて14歳の子供たちを層別化した後、サンプルサイズが縮小したという事実を考慮すると、私たちの発見は、マッチした子供たちの別の大きなグループで検証されなければならない。
行動指標と微生物との関係については、Prevotella 9が優勢なChildhood_2およびPuberty_2クラスター内の子どもは、14歳の時点でより多くの外向的行動を示していた。アルコール摂取と一晩の睡眠時間を考慮した後、プレボテラ9と14歳の外向性行動との間に正の横断的関係は観察されなかったが、このような傾向は、私たちが以前に中年期に得た知見（すなわち、6歳から10歳までのプレボテラ9は、10歳の子どもおよび母親報告の外向性行動と正の関係があった）［8］と一致する。これに関連して、衝動的で多動な外向性症状を特徴とすることが多いADHD（注意欠陥多動性障害）児は、定型発達児と比較して、P. amnii、P. buccae、P. copriなどのプレボテラ種の過剰繁殖を示した [57]．特に、P. buccaeの相対量が多いほど、衝動性や多動性の問題と関連していましたが、別の研究では、ADHDの子どもではプレボテラ菌が少ないと報告されています [58]。さらに、ASD（自閉症スペクトラム障害）の多くの症例では、最近のシステマティックレビュー [59] で結論付けられているように、プレボテラの減少が見られ、一方、早世の逆境（ELA）にある若者は、プレボテラの相対量が高い [60] とされています。確固とした結論を出す前に、プレボテラ菌の種や株のレベルのばらつきが大きく、研究間の整合性が不明瞭であることを認識する必要がある [61] 。さらに、結果を比較する際には、共変量（年齢、性別、食事、ライフスタイルなど）の潜在的な影響や、精神的問題の背後にある異なる病因を慎重に考慮する必要がある。
微生物クラスターPuberty_3では、主に14歳において、より多くの社会不安が観察された。しかし、このクラスターで最も濃縮された分類群（すなわち、Bifidobacterium、Akkermansia、Subdoligranulum、Christensenellaceae R-7グループ、Dialister）は、14歳の社会不安と断面的に関連はなかった。しかし、MDD（大うつ病性障害）ではBifidobacteriumが、GADではSubdoligranulumとDialisterが、健常対照と比較して高いことが頻繁に報告されている[62]。他の分類群について調べてみると、Puberty_3では濃縮度が低く、14歳で高頻度に見られるFaecalibacteriumの低下は、Puberty_3の知見と同様に、より社会不安の困難と関連していることがわかりました。同様に、Faecalibacteriumの減少は、GAD患者[24]で観察され、若年成人における社会的排除体験の期間と強度の増加と関連している[63]。さらに、最近のメタ分析研究では、MDD、双極性障害、ASDなどの複数の精神障害[62, 64]において、Faecalibacteriumが減少していることが報告されていますが、別のメタ分析研究ではASDの結果が矛盾していることが報告されています[65]。腸内常在菌であるFaecalibacteriumは、成人集団の90%以上の個体に存在する[66]。最も研究され、豊富な種であるFaecalibacterium prausnitziiは、酪酸に代表される抗炎症分子を産生することができます[67]。炎症の制御とは別に、酪酸は腸内ホルモンの濃度に影響を与えることで、食物摂取を抑制し、認知を媒介する可能性がある[68]。これらの知見を総合すると、Faecalibacteriumはメンタルヘルスにとって重要な微生物マーカーとなる可能性があることが示唆されます。
私たちの事前登録研究の強みは、出生から14歳まで追跡した独自の縦断的コミュニティコホートを使用していることです。これにより、乳児期および小児期を通じて腸内細菌叢の発達を追跡し、思春期における関連行動指標に対する予測値を評価することができます。重要なのは、分類学的データを識別可能な微生物クラスターに凝縮することで、腸内細菌叢と行動の間の複雑な相互作用を単純化したことです。さらに、本研究では、行動指標と腸内細菌叢との関係を探る際に、行動指標の複数の潜在的な共変量を説明し、相関バイアスをある程度減少させました。しかし、いくつかの限界と展望についても言及する必要がある。第一に、本研究は、子どもの性別と思春期の交互作用を考慮しなかったという制約があり、これは主に、グループをさらに層別化するための統計的検出力が不十分であったためである。第二に、共変量が含まれていたとはいえ、腸内細菌叢と宿主の行動は、多くの観察されない、あるいは未知の変数によって影響される可能性があることである。特に観察研究においては、別の縦断的コミュニティコホートまたは慎重にデザインされた動物実験において、その結果をさらに検証することが必要である。第三に、相関的知見の適合性が検証されれば、ショットガンメタゲノムシーケンスに基づく腸-脳モジュールやメタボロミクスに基づく腸-代謝プロファイルによる腸内細菌叢の機能的可能性の解釈にもっと注意を払うことができる [69]. 第四に、繰り返し測定される微生物叢データと連続的な数値結果変数の間の関係を探ることは、統計的な課題として残っている。現在、経時的に異なる豊富な分類群を同定するための統計的に洗練されたアプローチは、SplinectomeRやゼロインフレートベータ回帰法など、主にグループ比較のために作成されています[70]。今後の研究では、経時的な微生物の軌跡をプロファイリングし、宿主の結果表現型や、できれば宿主の表現型の発達と関連付けることができるような、異なる軌跡を特定することを目指す必要があります[71]。最近、腸内細菌叢の発達を説明する試みがなされているが、軌道の変動を宿主の行動表現型に関連付けるというステップはまだ取られていない[4]。本研究の最後の限界は、16S rRNA遺伝子アンプリコン配列では、微生物種レベルでの結果を得ることができないという事実にある。
要約すると、本研究では、思春期に4つの異なる微生物クラスターを同定し、そのうちの3つは、異なる年齢にわたって集団レベルで以前に記述された腸型と組成的に類似しており [50]、12歳から14歳まで安定して移行することがわかった。子どもの性別は、思春期における微生物クラスターの形成を促す要因である可能性があるが、この考えを支持する証拠はあまり見いだせなかった。Childhood_2やPuberty_2を含むPrevotella 9優位のクラスターは，14歳時点でのより多くの外向的行動と関連していたが，Faecalibacteriumを欠くPuberty_3クラスターは，同じ年齢でのより多くの社会不安と関連があった。14歳の子どもにおけるFaecalibacteriumと社会不安の横断的な負の関係は、この知見をさらに支持した。この観察的縦断研究において、因果関係は明らかにされなかった。腸内細菌叢と子どもの思春期の精神的健康との因果関係を説明できるようにするには、単一の分類群または相互作用する分類群に関するメカニズム研究が必要である。
データの入手方法
本研究の結果は、現在進行中の縦断的コホートのデータセットによって裏付けられているため、これらのデータセットは現在公開されていませんが、C.deW. (Carolina.deWeerth@radboudumc.nl)からのリクエストに応じて入手可能です。
コードの入手方法
Rコードは、こちらのリンクからアクセスできます https://doi.org/10.5281/zenodo.7529267
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リファレンスのダウンロード
謝辞
BIBO研究の参加者とデータ収集に協力してくれた学生に感謝したい。本研究は、オランダ科学研究機構VIDI助成金（575-25-009、C.deW.へ）およびVICI助成金（016.Vici.185.038、C.deW.へ）、欧州連合の研究・イノベーションプログラム「ホライゾン2020」のEat2beNICEプロジェクト（助成契約番号728018）からの支援を受けている。Y.O.は、中国奨学会からの財政支援として、フェローシップ（No.201806350255）を受けた。
資金提供について
本研究は、オランダ科学研究機構VIDI助成金（575-25-009、C.deW.へ）およびVICI助成金（016.Vici.185.038、C.deW.へ）、欧州連合の研究・イノベーションプログラムHorizon 2020のEat2beNICEプロジェクト（助成契約番号728018）により支援されています。Y.O.は、中国奨学会からの財政支援として、フェローシップ（No.201806350255）を受けた。
著者情報
著者と所属
ワーヘニンゲン大学・研究所 微生物学研究室 P.O. Box 8033, 6700 EH, Wageningen, The Netherlands
オウ・ヤンウェンシャン、クララ・ベルツァー、ハウケ・スミット
ラドバウド大学医療センター認知神経科学部ドンダース脳・認知・行動研究所 P.O. Box 9010, 6500 GL, Nijmegen, The Netherlands
オウ・ヤンウェンシャン & カロリーナ・デ・ウィアース
貢献度
YO、CB、HS、CWが研究を設計した。YOは事前登録の作成、文献検索の管理、実験室での実験、統計解析の実施、原稿の執筆を行った。すべての著者が原稿の修正と改訂に貢献した。
筆頭著者
オウ・ヤンウェンシャンに対応する。
倫理に関する宣言
利益相反行為について
Y.O.、C.B.、H.S.、C.deWは、利益相反がないことを宣言する。
倫理的承認
本研究の倫理的承認は、オランダのナイメーヘンにあるラドバウド大学社会科学部の倫理委員会から得た（ECG300107、ECG13012012、SW2017-1303-497、SW2017-1303-498）。
出版に関する同意
研究参加者は、本研究で得られた知見を公表することに同意している。
補足情報
以下は、電子補足資料へのリンクです。
補足資料1 (PDF 36 KB)
補足ファイル2 (XLSX 43 KB)
権利と権限
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更があった場合にそれを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布および複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可
この記事について
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Ou, Y., Belzer, C., Smidt, H. et al. 生後14年間の腸内細菌叢の発達と、思春期における内面化・外面化困難および社会不安との関連性. Eur Child Adolesc Psychiatry (2023). https://doi.org/10.1007/s00787-023-02205-9
引用元：ダウンロード
2023年1月13日受理
2023年4月3日受理
2023年4月18日発行
DOIhttps://doi.org/10.1007/s00787-023-02205-9
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