糞便移植材料から真核生物ウイルスを最小化する再現性の高いケモスタット培養

2024年11月8日 14:02

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記事27巻8号1104602024年8月16日オープンアクセス

糞便移植材料から真核生物ウイルスを最小化する再現性の高いケモスタット培養

https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(24)01685-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2589004224016857%3Fshowall%3Dtrue

シグネ・アダムバーグ1・トルベン・ソルベック・ラスムッセン2・サビーナ・ブリジット・ラーセン2・小天王マオ1・デニス・サンド・リス・ニールセン2・カーレル・アダムバーグ1,3 kaarel.adamberg@taltech.ee

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ハイライト

恒温発酵により、腸内ウイルス製剤の再現性のある増殖が可能になった。

恒温槽で増殖したビロームは多様であり、その組成は希釈率に依存した。

恒温増殖により、真核生物ウイルスの相対量が有意に減少した。

要旨

最近の研究から、糞便微生物叢移植（FMT）を成功させるためにバクテリオファージが重要な役割を果たすことが示されている。しかしながら、糞便微生物移植の臨床応用は、ドナーのばらつきや、細菌やヒトウイルスによる感染リスクの懸念によって妨げられている。このような課題を克服するために、マウス糞便とヒト糞便を、真核宿主細胞がない場合には真核ウイルスの増殖が阻害される一方、細菌とファージの増殖を支持するケモスタット発酵セットアップで増殖させた。その結果、分類された真核生物のウイルスのコンティグの相対存在量の中央値は0.01％以下に減少した。また、対応するビロームのプロファイルは希釈率依存性を示し、生物学的複製間で再現性があり、ヒトとマウスの両方の接種に関して高い多様性を維持した。この概念実証的な培養法は、腸関連疾患をターゲットとした、高い再現性とドナーからの感染リスクの低い新規治療ツールの開発の第一歩となる可能性がある。

要旨

研究分野

はじめに

ここ数十年の間に、メタボリックシンドローム、自己免疫疾患、大腸がんなどの複雑な疾患が、腸内細菌叢（GM）のアンバランスと関連していることが明らかになってきた。そのため、腸内細菌叢は糞便微生物叢移植（FMT）の魅力的な治療標的となっている。これまで、糞便微生物叢の移植は、おそらくバクテリオファージ（細菌ウイルス、略してファージ）を介したGMランドスケープ調節により、再発性のクロストリジオイデスディフィシル感染症の治療に成功した。しかし、このプロセスは手間がかかり、すべての安全性ステップをパスしたドナー候補はわずか3%に終わる可能性がある5。さらに、スクリーニングに失敗した場合、FMTを通じて疾患を引き起こす病原体が移行するリスクがある6,7ことは、2019年6月に米国で2人の患者がFMT後に重篤な感染症を発症し、うち1人の患者が死亡した事件で強調されている8。FMTの代替案として、糞便ビローム移植（FVT、無菌濾過ドナー糞便）もC. difficile感染症に対する有望な有効性を示している2,9,10FMTに対するFVTの重要な利点は、潜在的な脅威としての細菌移行が減少することである。しかし、ヒトの消化管に生息するウイルスの大半の長期的影響についてはまだ研究されていないため、既知の病原性ウイルスについてドナー材料をスクリーニングするにもかかわらず、疾患を引き起こす真核ウイルスを移入するリスクは依然として存在する11,12。

腸内細菌とファージとの相互作用は複雑で相互に影響し合うため、腸内ビロームは健康や疾患における重要な構成要素となっている。しかし、ファージオームが腸内細菌叢の構成と機能に与える影響は、健康状態やFMTまたはFVT治療の結果に重要な影響を及ぼすことが示唆されている2,18,19,20,21。推定されるウイルス様粒子（VLP）の数は、糞便1グラムあたり109～1010個であり22,23,24,25、その97％以上がファージである一方、現在までにアノテーションされているのはその10分の1程度である26。

ファージは細菌にのみ感染し、真核細胞には感染しないが、われわれは、マウス糞便微生物叢とヒト糞便微生物叢という2つの異なる接種物を用いて、真核ウイルスの量を最小限に抑えながら、活性のある腸内ファージコミュニティーを作り出す方法を開発することを目指した。30サーモスタット培養は、安定した微生物群集に対するウイルスを介した摂動の研究31や、特定の細菌のファージの濃縮に用いられてきた32。個々の微生物群に由来するばらつきを克服するため、マウス糞便またはヒト糞便をプールした培養液をケモスタット培養の接種菌として使用した。ケモスタット培養の動態は、細菌およびウイルスの組成、増殖特性、代謝産物の測定によって追跡された。連続培養システムは、生物学的複製内の微生物群集の高い再現性を保証すると同時に、希釈によって大部分の真核ウイルスを洗い流すという仮説を立てた。我々の知る限り、ケモスタット培養におけるヒトおよびマウス由来の細菌ウイルスの再現性と安定化については、これまで十分に報告されていない。

結果

真核生物ウイルスの含有量を最小限に抑えたビロームの作製を目的として、マウスの糞便およびヒトの糞便を、2つの異なる希釈率（Dlow 、0.05 1/h およびDhigh 、0.2 1/h ）で、5つの滞留時間（1単位の供給培地[l]が1単位のバイオリアクター[l]に滞留する時間[h]）でケモスタット培養した。ll発酵は、バッチ培養から定常期まで行った後、連続モードで開始した。希釈率は、ヒト消化管の特徴的な通過速度に従って選択した。マウスの糞便培養とヒトの糞便培養の全体的な培養パラメータ（すなわち、希釈率、温度、pH）は、培地組成に若干の違いがある以外は同じであった（図1）。マウスの餌に多く含まれる複合糖質に似せてデザインした培地では、ヒトの糞便を模倣した培地と比較して、総糖質濃度が3倍高くなった（それぞれ15.2 g/L vs. 5 g/L）。

図1 マウス糞便のケモスタット培養の実験セットアップ

キャプション

ケモスタット培養からの真核生物ウイルスの灰化

バッチ終了段階における真核生物のウイルスの相対量は、マウスの糞便培養では0.06%～0.27%、ヒトの糞便培養では0.05%～0.23%であった（図2）。培養開始時のウイルス様粒子（VLP）量は1∗108 VLP/mlであったが、ケモスタットを5容量使用する間に2∗109 VLP/mlまで徐々に増加した。低希釈率（0.05 1/h）での真核ウイルスの相対存在量は0.01％以下に減少したが、ヒト糞便を接種した培養液では0.1％程度を維持した例が2例あった。同時に、細菌ウイルソームはケモスタット期においても高い多様性を維持し、細菌ウイルスOTUの数は真核生物ウイルスOTUの数の少なくとも1000倍以上であった（図3およびS3 ）。

図2 ケモスタット増殖ビロームにおける真核生物ウイルスの相対的存在量

キャプション

図3 インキュラム、バッチおよびケモスタット増殖ビローム中のウイルスの相対的存在量

キャプション

RNAウイルスは主に真核ウイルスであったが、いくつかのRNAファージも両培養液で同定された（図3）。マウスとヒトの両ビロームで最も多く検出された真核ウイルスの分類群は、Duplopi- 、Stepla- 、Megaviricetesであった。マウスの糞便を低希釈率で培養した場合、Steplaviricetes由来のAstroviridaeと Duplopiviricetes由来のPicobirnaviridaeは依然として培養液中に存在したが、高希釈率で培養した場合、真核ウイルスの濃度は0.01％以下であった。

連続培養におけるビロームの再現性

ビロームとバクテリオームの組成パターンを調べたところ、バッチ培養、緩慢培養、高速ケモスタット培養のイノキュラおよびサンプルには、明確なクラスターが形成されていた（図4）。バッチ培養のサンプルは、流出がなかったためイノクラのサンプルに近かったが、これらの条件下でも真核生物のウイルスが持続していた。さらに重要なことは、各サンプルが明確に分離したクラスターを形成していることから、ケモスタット培養の再現性のある動態が示されたことである（図4、マウス糞便およびヒト糞便接種培養におけるPERMANOVA検定のp値は、それぞれ0.04および0.05以下）。バクテリオームについても、同様の明確なクラスター形成が観察された（下記および図S4参照）。

図4 ケモスタットで増殖させたビロームの多様性

キャプション

マウスの糞便を接種した培養液のビロームのシャノン多様性指数は、低希釈率（0.05 1/h）では安定化期（5回の滞留時間）全体を通して高いままであったが、高希釈率（0.2 1/h）では顕著な減少が観察された（図4）。培養ヒト糞便のハノン多様性指標はマウス糞便培養のそれよりも高かったが、ばらつきも大きかった（図4 ）。

希釈率がバクテリオームおよび対応するビロームの組成に及ぼす影響

マウスの糞便を接種した培養液では、ほとんどのウイルス分類群が未同定であった。同定されたホースは、希釈率が高くても低くても、ケモスタット培養に特徴的であった。低希釈率では、同定されたファージ分類群はTubulaviralesに属し、Caudoviricetesのいくつかのウイルスオーダーレベルクラスター（VOC）が観察された。ウイルスコンティグ（vOTU）の要約レベル（DESeq2解析に基づく）では、低希釈率でのケモスタット培養マウス糞便では、高希釈率でのケモスタット培養と比較して、ほとんどの差異変化が観察された（図S5）。

低希釈率でマウス糞便を接種したケモスタットのバクテリオームは、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、ブラウチア属、ルミノコッカス科の未同定分類群で占められていたのに対し、高希釈率ではバクテロイデス属、乳酸菌属、腸球菌属、腸内細菌科（エシェリヒア属を含む）が主な分類群であった（図5およびS6）。増殖の遅いバクテリオームのみに特徴的な分類群は、Akkermansiaと Intestinimonasであった。また、低希釈倍率ケモスタットでは、接種菌と比較して、Aristipesや Anaerotruncusのように2倍以上減少するOTUや、Intestinimonasや Blautia、Escherichiaのように増加するOTUが多く見られた（図S7）。しかし、どちらのケモスタットでも、多様で再現性のあるマウス糞便由来培養が可能であった（図 S4 ）。ペアワイズSpearman相関分析では、細菌OTUとウイルスOTUの間に特異的なクラスターが観察された（図S8）。バクテロイデスOTUのグループは特定のウイルスOTUと相関し、他のウイルスOTUのグループはエシェリヒア属、腸球菌属、ホルデマニア属、クロストリジウム属に特異的であった。

図5 接種菌、バッチ培養菌、ケモスタット培養菌の相対量

キャプション

ヒト糞便を接種した培養液に最も多く含まれるウイルスは、プチウイルス属（Petitvirales）、ツブラウイルス属（Tubulavirales）、およびウドウイルス属（Caudoviricetes）のいくつかのVOCであった（図3）。低希釈率または高希釈率のケモスタット培養の終了時には、ファージのパターンは類似しており、プチウイルス属の存在量が減少し、主にCaudoviricetes属のVOCが優勢であった。

マウスの糞便を低希釈率で培養し、宿主として予測された細菌のほとんど（Akkermansia、Blautia、Ruminococcaceaeなど）は、バクテリオームデータと一致していた（図S9）。一方、ファージ宿主解析では、Faecalibaculumと Enterococcusがファージの宿主として多いことが示された。マウス糞便の高希釈率ケモスタット培養のファージ宿主解析では、低希釈率ケモスタットで観察されたのと同様の宿主パターンが示されたが、高希釈率ケモスタットで増殖させた場合、Faecalibaculumも Akkermansiaも優勢ではなかった。

低希釈率と高希釈率の代謝物プロファイルも異なっていた。低希釈率では酢酸の生産が最も高く（全生成物の 61 ± 2 mol-%）、乳酸は見られなかった（図 S10 ）。酪酸、プロピオン酸、エタノールの各生成量は10 mol-%前後であった（図S11）。コハク酸の生成量は、低希釈率のケモスタットでは全生成物の10 mol-%未満にとどまり、ギ酸の生成量はわずかであった（全生成物の約0.1 mol-%）。ガス状生成物に関しては、CO2（それぞれ0.46±0.06および0.49±0.04mol-CO2/mol-products）と水素（それぞれ0.015±0.002および0.19±0.01mol-CO2/mol-products）の生成は、低希釈率のケモスタットで少なかった。

考察

ビローム増殖の再現性

本実験では、再現性のあるケモスタット増殖腸内ビロームの作製を目指し、真核ウイルスの量を最小限に抑えた。種類の異なる接種液（マウス糞便とヒト糞便）を2つの異なる希釈率で使用し、細菌の低速増殖（希釈率D = 0.05 1/h）と高速増殖（D = 0.2 1/h）をシミュレートした。マウスの糞便およびヒトの糞便を接種した培養液の両方で、真核生物のウイルスのコンティグの相対存在量の中央値は、発酵槽に5回送液した後、ほとんどの場合（低希釈率でマウスの糞便を接種したケモスタット培養液を除く）で0.2%から0.01%以下に減少した。5容量希釈後の全ウイルス量は2∗109 VLP/ml、真核ウイルスの相対量は0.006%であり、真核ウイルス数は105VLP/ml以下と推定された。これまでの研究で、ある腸管ウイルス（ノロウイルス、ロタウイルス、ヘパトウイルス）が集団の50%に感染するための1回の有効量は、103～106VLP/mlであることが示されている。しかし、真核生物のウイルス量をさらに確実に減少させるためには、ケモスタット培養を延長することも可能である。さらに、ウイルスをより正確に同定し、特定のウイルスに対する希釈効果を測定するためには、スパイクした（qPCRで測定した既知の真核生物ウイルスを含む）接種液を用いた実験をさらに行う必要がある。培地には植物や動物由来の成分が含まれていたため、バイオリアクターに継続的に供給されたウイルス粒子が含まれていた可能性がある。このことは、バッチ段階のサンプルの接種物に比べて真核生物のウイルス量が多いことの説明にもなる。しかし、基質は使用前に滅菌されているので、基質に由来する可能性のあるウイルスは感染しない。また、ファージ遺伝子の一部が真核生物ウイルスと類似している可能性があるため、ファージの分類ミスに関連している可能性もある35。真核生物ウイルスがRNAウイルスで占められていることと一致するため、主にRNAウイルスを同定できたことはポジティブであった36,37。

また、ケモスタット実験において、ウイルスOTUの再現性が確認された（図4、S3、S9）。糞便または糞便を接種した連続培養のウイルスプロファイルについては、ほとんど知られていない。ファージコミュニティは、宿主とファージの固有の関係から、バクテリオームプロファイルを反映すると予想される。しかし、ファージの相対量は、バイオインフォマティクスによって予測された宿主細菌と必ずしも一致しなかった（図5およびS9）。しかし、Akkermansia 属、Blautia属、Ruminococcaceae属などの豊富な細菌については、ファージ-宿主予測解析がよく一致した。豊富な属のうち、バクテロイデス属やビフィドバクテリウム属のファージだけがファージ宿主予測で同定されなかった。

希釈率が微生物の多様性に及ぼす影響

真核生物のウイルスは希釈率が高いほど効率的に減少するが、微生物コンソーシアムの構成は、本研究および以前の研究で示されたように、希釈率に大きく依存する。希釈率0.2および0.05 1/hは、それぞれ盲腸での高速通過と食物繊維の分解、および結腸での低速増殖を示す39。混合培養の定常状態では、微生物組成は基質への親和性、基質をバイオマスに変換する速度、交差摂食、細胞の最大比増殖速度によって駆動される。あらかじめ設定された希釈率が細胞の比増殖率より高ければ、それらは洗い流されると予想される。さらに、Attaiと共著者らは、低希釈率（0.04 1/h）で高度に多様なビロームの形成を示した。低希釈率での増殖は、多様な腸内細菌叢とファージオームの生成に適しているようである。対照的に、腸内細菌科細菌とそのウイルスの増殖は、腸内細菌科細菌の最大比増殖速度の高さを反映し、マウスの糞便を接種した培養液の高速希釈（Dhigh= 0.2 1/h）によって顕著に支持された41。全体として、ケモスタットの応用は、前臨床試験でのさらなる試験のために、多様な細菌およびウイルス化合物を調製するためのいくつかの可能性を提供する。

前臨床試験用細菌ビロームの恒温増殖

個々のマイクロバイオームから生じるばらつきを避けるため、マウス糞便培養物およびヒト糞便培養物をプールしたものをケーストマット培養の接種菌として用いた。異なる腸内細菌叢をプールすることで、全く新しい微生物群集を生成する機会が得られ、遺伝子組み換え治療薬や標的プロバイオティクスなど、さらなる応用に向けた新たな特性を保持する可能性がある。プーリングアプローチはまた、複雑な糞便コンソーシアムにおける増殖傾向を研究するためにマイクロバイオームの標準化を改善し、個々のドナーのばらつきを減少させることができる。プーリングの欠点は、特定の細菌の共存間のメカニズムを研究する場合、生理学的研究に関連することである。

現在、FMTは主に臨床現場で再発性C. difficleの治療に用いられている。しかし、FMTの可能性はもっと広い。FMTの規制とドナーのスクリーニングプログラムによると、ドナー材料中のC. difficileの存在は認められておらず、C. difficileファージも認められていない。メタボリックシンドローム、20、44C.ディフィシル感染症、1、4壊死性腸炎、18抗生物質による腸内細菌叢の擾乱、45ストレス関連行動、46タイトジャンクション発現の改善47 などの個別の疾患モデルの治療において、独立した研究グループにより、GMのバランスを整えるFVTに基づく治療の有益な効果が示されている。最近、我々は、アッカーマンシアを豊富に含むドナーを起源とするFVT群集が、アッカーマンシア株を投与することなく、レシピエント結腸内のネイティブアッカーマンシアを増加させることを示した48。この研究では、C. difficile感染マウスにケモスタット増殖ビロームを移植すると、FVT治療マウスと同程度の生存率（それぞれ8匹中5匹、7匹中5匹が生存）を示したのに対し、偽治療対照群では7匹中2匹であった10。このことは、生存に関与するウイルスが両方のビローム調製で引き継がれたことを示している。このことは、生存に関与するウイルスが、両方のビローム調製において引き継がれたことを示している。本研究では、ウカリオティックウイルスは全ウイルスリードの0.1-3.0%を占め、アバンダンス解析の感度が非常に高くなっている。さらに、このレベルの分類学的解像度は、ビローム調製物間で真核ウイルス分類群を明確に区別するのに十分ではない。また、培地成分からのわずかな真核ウイルスの混入や、真核ウイルスの偽陽性分類の影響も受ける可能性がある。今後の研究では、関連する真核ウイルスをスパイクしてqPCRを実施し、ケモスタットや動物モデルにおける真核ウイルスなどの希釈効果を示す必要がある。ケモスタット培養の有力な論拠は、再現性のあるビロームの増殖が可能であることと、糞便や糞便の初期量が少量であるにもかかわらず、十分な量のウイルス製剤を供給できることである。

結論として、ケモスタット培養は、再現性のあるマウス糞便ファージオームおよびヒト糞便ファージオームを、真核生物ウイルスの含有量を最小限に抑えて作製する、非常に有望な方法であることが示された。本研究では、この現象をマウスの糞便培養で確認した。GM由来のファージ集団は、GMを調節するためにすべての細菌を除去した後、移植実験に用いることができる。ここでテストした条件では、真核生物のウイルス数は初期負荷の100倍以上に減少した。この概念実証研究は、広範な腸関連疾患を対象とする治療ツールの開発の第一歩となる可能性があり、それによってFMTをより安全なファージ介在療法で補うことができる。

研究の限界

本研究の限界は以下の通りである：(i)試験管内培養では腸内環境を完全に模倣することはできない。したがって、ケモスタットに最適なパラメーター（基質、pH、希釈率、滞留時間）をこれまでの研究に基づいて選択した。しかし、これはこの研究の主な目的ではなかった。この研究の目的は、最小量の真核ウイルスを用いて再現性のあるビロームを増殖させるためのケモスタット培養の適用性を示すことである。培養条件は、今後の実験で系統的に研究される予定である。iii) ウイルス解析の感度は同定の限界である。サンプル調製では、より大きな微生物はすべて除去し、配列解析のためのウイルス粒子のみを残すという予防措置をとった。

TAR★方法

EYリソース表

EAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER

実験モデル 生物／株

マウス 57BL/6N Taconic, Lille Skensved, Denmark; Janvier, Le Genest-Saint Isle, France; Charles River, Sulzfeld, Germany N/A

試薬

pple ペクチン Sigma-Aldrich, USA 93854

ヒコリーイヌリン Orafti, Belgium HP

オルコア・キシラン TCI, 日本 X0078

トウモロコシデンプン Sigma-Aldrich, USA S9765

アーチウッドアラビノガラクタン TCI, 日本 A1328

カラマツムチンタイプII Sigma-Aldrich, USA M2378

Acterial DNA extraction kit A&A Biotechnology (Gdynia, Poland) ビーズビートマイクロAXグラビティ(mod.1)

ウイルス DNA/RNA 抽出キット Qiagen Viral RNA mini kit

NA増幅キット Cytiva GenomiPhi V3

エクエンシングライブラリー調製キット Illumina Nextera XT

エポスデータ

Acterial 16S rRNAおよびウイルスショットガン配列 European Nucleotide

アーカイブ (ENA) PRJEB58787

ソフトウェアおよびアルゴリズム

rimmomatic v0.35 Bolger et al.,201449 http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic

BMap N/Ahttps://www.osti.gov/servlets/purl/1241166

pades v3.13.1 Bankevich et al.

irSorter2 Guo et al.

IBRANT Kieftら,202052

HeckV Nayfach 他,202153

irBot Chenら,202354

OPSAC Neriほか,202255

PHoP Rouxら,202333

owtie2 Langmead and Salzberg,201256 https://github.com/frejlarsen/vapline3

TU-テーブル、分類リスト、マッピングファイル、Rスクリプト GitHubhttps://github.com/MaoAria15/Chemostat

バージョン 4.3. 2https://cran.r-project.org/doc/manuals/fullrefman.pdf https://www.r-project.org/

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リソースの有無

連絡先

リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトであるKaarel Adamberg(kaarel.adamberg@taltech.ee)までお願いします。

試薬の入手可能性

本研究では、独自の試薬は開発していない。

データおよびコードの利用可能性

ENAデータベースにアクセッション番号PRJEB58787で登録されている。

TU-テーブル、分類リスト、マッピングファイル、シーケンスデータ解析用RスクリプトはGitHub: https://github.com/MaoAria15/Chemostat で入手可能。OTUテーブル、分類学リスト、マッピングファイル、RスクリプトはGitHub: にある。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要望に応じて主担当者から入手可能である。

実験モデルと研究参加者の詳細

植菌

培養は、それぞれマウス由来とヒト由来の2種類の腸内接種菌を用いて行った。C57BL/6N雄マウス18匹を購入し、下流への応用のために腸内容物を採取した。C57BL/6NTacマウス6匹（Taconic社、Lille Skensved、デンマーク）、C57BL/6NRjマウス6匹（Janvier社、Le Genest-SaintIsle、フランス）、C57BL/6NCrlマウス6匹（Charles River社、Sulzfeld、ドイツ）の3業者から購入し、到着時に耳標を付けた。

動物飼育は、デンマークのコペンハーゲン大学実験動物モデル課のAAALAC認定施設において、既述の条件下で行った57,58。マウスの飼育は、デンマーク・コペンハーゲン大学実験動物モデルセクションのAAALAC認定施設において、既報の条件下で行われた57,58。13週齢以降のマウスには、18週齢で飼育を終了するまで低脂肪食（LF、Research Diets D12450J、米国・ニューブランズウィック）を自由摂取させ、2週間ごとに体重を測定した。厳密な嫌気性菌の生存性を維持するため、マウスは頸椎脱臼により犠牲にし、直ちに嫌気性小袋（cat. no. N0035A AnaeroGen, Thermo Fisher Scientific, Basingstoke, UK）に移し、その後、室温の嫌気チャンバー（Model AALC, Coy Laboratory Products, Grass Lake, Michigan, USA）に移し、マウスの盲腸内容物を採取した。嫌気チャンバー内で、サンプルはベンダー（Janvier、Charles River、Taconic）に従って処理された；秤量し、PBS（NaCl 137 mM、KCl 2.7 mM、Na2HPO410 mM、KH2PO41.8 mM）と50%グリセロールを混合し、BagPage 100 mLフィルターバッグ（Interscience, Saint-Nom-la-Bretèche, France）中でラボラトリーストマッカー（Stomacher 80, Seward, UK）を用いて中速で120秒間ホモジナイズした。このサンプルは凍結され、ケモスタット実験に使用するまで-80℃で保存された。上記のプロセスをフローダイアグラムで示した（図 S1 ）。ドナー材料に使用されたこれらの動物の取り扱いに関する全手順は、指令2010/63/EUおよびデンマーク動物実験法（ライセンスID：2012-15-2934-00256）に従って実施された。

ヒトを対象とした研究は、エストニアのTallinn Medical Research Ethics Committeeによって承認された（プロトコル番号554）。参加者は研究前にインフォームド・コンセントに署名した。7人の健康なドナー（年齢19-37歳、白人、男性3人、女性4人、診断された疾患なし、抗生物質の使用なし、過去3ヶ月間に亜熱帯諸国への渡航歴あり）から採取したecalサンプルは、Adamberg et al.59に記載されているように、ジメチルスルホキシドリン酸生理食塩水緩衝液で5倍に希釈し、等量にプールし、使用するまで-80℃で凍結保存した。

方法の詳細

行程培地

ヘミン(5 mg/L)、メナジオン(0.5 mg/L)、胆汁酸塩(0.5 g/L)、NaHCO3(2.0 g/L)、Tween-80(0.5 g/L)、チオグリコール酸Na(0.5 g/L)およびCys-HCl(0.5 g/L、酸素を減らした水で新しく作ったもの)を加えた。マウス培養用の培地に添加した炭水化物源およびその他の成分は、リンゴペクチン（2 g/L、Sigma-Aldrich、米国）、チコリイヌリンHP（1 g/L、Orafti、Oreye、ベルギー）、トウモロコシコアキシラン（2 g/L、 CI、東京、日本）、トウモロコシデンプン（5 g/L、Sigma-Aldrich、米国）、カラマツ材アラビノガラクタン（2 g/L、TCI、東京、日本）およびブタムチン（4 g/L、タイプII、Sigma-Aldrich、米国）、酢酸（0.3 g/L、Sigma-Aldrich、USA）、トリプトン（3g/L、 LABM、Heywood、UK）および酵母エキス（3g/L、 LABM、Heywood、UK）を用いた。ヒト糞便接種培養の炭水化物源は、リンゴペクチン（2.5 g/L、Sigma-Aldrich、USA）およびブタムチン（2.5 g/L、Type II、Sigma Aldrich、USA）であった。炭水化物源は別々に滅菌し、実験前に培地に加えた。マウスの糞便を接種した培地には、ヒトの糞便を接種した培地の約3倍の炭水化物が含まれていた。

培養システムおよび培養条件

ヒト糞便およびマウス糞便接種培養には、前述の培養系29を用いた。簡単に説明すると、発酵槽、ADI 1030バイオコントローラー、培養制御プログラム "BioXpert"（Applikon, The Netherlands）からなるBiobundle培養システムを用いた。発酵槽にはpH、pO2、温度制御用のセンサーが装備されていた。供給と流出用の可変速ポンプは、ケモスタット・アルゴリズムによって制御された： = ここで、Dは希釈速度（1/h）、Fは供給速度（L/h）、Vは発酵槽の作業容積（L）である。pHは、pH設定値に従って1M NaOHを添加することで制御した。嫌気性菌を維持するため、接種前および培養期間中、無菌ろ過窒素ガス（99.9％、AS Linde Gas社、エストニア）で供給ボトル内の培地と培養液をフラッシングした。培養容量は一定に保った（マウスの糞便は600 mL、ヒトの糞便は300 mL）。温度は36.6℃に保った。pHは宿主の生理的pHに応じて、マウス糞便培養では6.4、ヒト糞便接種培養では7.0に一定に保った。マウスの盲腸分泌物を接種した培養液を用いた実験のスキームを図 1 に示す。プールしたマウス盲腸糞便を5倍に希釈し、600mLの培地に接種して実験を開始した。ケモスタット法は、接種から15-20時間後に開始した。これは、糞便培養の指数関数的増殖期の中間に相当する。ヒトの糞便およびマウスの糞便を、0.051/h（Dlow ）と 0.21/h（Dhigh ）の 2 種類の希釈率で 3 回反復した。すべての実験において、5つの滞留時間（D = 0.05 1/h および D = 0.2 1/h の場合、それぞれ100時間および25時間に相当）の安定化が用いられた。実験コントロールに使用したn-lineおよびat-lineパラメータは、図S2に示した。

分析方法

流出したサンプルは氷上で回収し、遠心分離（14,000 g、5分、4℃）し、ペレット（-80℃）と上清（-20℃）として別々に保存した。クロマトグラフィー分析では、培養上清をAmiconR Ultra-10K Centrifugal Filter Devices（カットオフ3 kDa）を用いて、製造元の指示に従ってろ過した（Millipore、米国）。有機酸（コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソバレラート、バレラート）およびエタノールの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC、Alliance 2795システム、Waters、Milford、MA、USA）により、BioRad HPX-87Hカラム（Hercules、CA、USA）を用い、0.005 M H2SO4のアイソクラティック溶出、流速0.5 mL/分、35℃で測定した。屈折率検出器（モデル2414；米国Waters）およびUV検出器（210 nm；モデル2487；米国Waters）。物質の定量には、分析グレードの標準物質を使用した。メソッドの検出限界は0.1 mMであった。

熱伝導率検出器に接続した Agilent 490 Micro GC Biogas Analyzer（Agilent 269 Technologies Ltd.、米国）を用いて、流出ガスの組成（H2、CO2、H2S、CH4、N2）を分析した。ガス流の量は、MilliGascounter（RITTER Apparatebau GMBH & Co, Germany）を用いて定期的に記録した。

増殖培地と培養上清の酸化還元電位は、InLabRedox電極（Mettler Toledo, USA）を用いたpH/酸化還元メーターで測定した。バイオマス乾燥重量は、10 mL培養液を遠心分離（6,000 rpm、20分）し、蒸留水で洗浄した後、105℃のオーブン中で20時間乾燥させることにより、重量測定した。

ウイルスとバクテリアを分離するためのサンプルの再処理

マイクロバイオームの経時的変化を調べるため、培養サンプルと菌床サンプルを加えた。培養・接種試料からウイルスと細菌を分離するために、遠心分離と0.45 μmフィルターでペレットと上清を調製した。

作用DNAの抽出、配列決定、および生データの前処理

A&A Biotechnology社（ポーランド、グディニア）のBead-Beat Micro AX Gravity（mod.1）キットを用いて、製造元の指示に従って培養/糞便ペレットから細菌DNAを抽出した。最終精製 DNA を-80℃で保存し、Qubit HS Assay Kit（Invitrogen, Carlsbad, California, USA）を用いて Qubit 4 Fluorometric Quantification device（Invitrogen, Carlsbad, California, USA）で DNA 濃度を測定した。細菌群集組成は、NextSeqベース（Illumina）の16S rRNA遺伝子V3-領域のハイスループットシーケンシングにより決定した。リードの品質管理、複製除去、キメラリードからのパージ、zOTUの構築はUNOISEパイプライン61で行い、分類学的な割り当てはSintaxで行った62。このパイプラインを記述したコードはgithub.com/jcame/Fastq_2_zOTUtableでアクセスできる。全サンプルの16S rRNA遺伝子アンプリコンの品質管理（Accession: PRJEB58787、ENAで入手可能）後の平均シーケンス深度は60,719リード（最小11,961リード、最大198,197リード）であった。

iralのRNA/DNA抽出、塩基配列決定、生データの前処理

滅菌フィルターで濾過した培養/接種試料を、100 kDAでフィルターカットオフした遠心フィルターCentrisart（Sartorius社製）を用いて、1,500 x g、4℃で遠心分離して濃縮した（dx.doi.org/10.17504/protocols.io.b2qaqdse）。濃縮上清(140μL)は、遊離DNA/RNA分子を除去するために、ウイルスDNA抽出の前に5単位のPierce Universal Nuclease(ThermoFisher Scientific)で室温で10分間処理し、ウイルスDNA/RNAは、前述のようにViral RNA mini kit(Qiagen)を用いて抽出した57。逆転写は、SuperScript VILO Master mixを用いて、製造業者の指示に従って実行し、その後、DNeasy blood and tissue kit(Qiagen)を用いて、製造業者の標準プロトコルのステップ3-8のみに従って洗浄した。簡単に言えば、DNA/DNAサンプルをエタノールと混合し、シリカフィルターに結合させ、2回洗浄し、40μLの溶出バッファーで溶出した。GenomiPhi V3 DNA増幅キット（Cytiva）を用いた多重置換増幅（MDA、ssDNAウイルスを含む）、およびNextera XTキットを用いたシーケンスライブラリー調製を、既述の方法で行い57、NovaSeqプラットフォーム（NovoGene）を用いて商業施設でシーケンスした。糞便ウイルスメタゲノムの生リード（Accession: PRJEB58787、ENAで入手可能）の平均シーケンス深度は22,701,135リード（最小342,022リード、最大203,403,294リード）であった。03,403,294リード。高品質リードは、BBMap (bbduk.sh)(https://www.osti.gov/servlets/purl/1241166) を用いて複製を解除し、PhiXコントロールの有無をチェックした。irus様粒子由来のDNA配列は、Spades v3.13.150を用いてサンプル内de novoアセンブリーのみを行い、最小長2,200 ntのコンティグを保持した。全サンプルから得られたコンティグをプールし、Shahらによって記述され、https://github.com/shiraz-shah/VFCs で利用可能なスクリプトを使用して、同一性が約95%でキメラのない種レベルのクラスタリングによって複製を解除した。VirSorter251（"full "カテゴリ｜dsDNAphage｜ssDNA｜RNA｜Lavidaviridae｜NCLDV｜viral quality = 1）、VIBRANT52（High-quality｜Medium-quality｜Complete）、CheckV53（High-quality｜Medium-quality｜Complete）、およびVirBot54によってコンティグをウイルス性に分類した。各図で使用されている「その他」、「未分類ウイルス」、「不明」の分類学的カテゴリーは異なるものである。Other "は、プロットに描かれていない残りの低存在分類群すべてを包含する。Unknown」は、ウイルスである可能性はあるが、そのウイルス起源を確認する具体的なデータ記録がないコンティグを指し、「Unclassified virus」は、ウイルス起源であると同定されたが、それ以上分類できなかったウイルスを表す。axonomyは、以下から作成されたウイルスタンパク質のデータベースに対してウイルスORFをブラストすることで推論された： OGDBv217（vogdb.org）、NCBI（14/10/2023ダウンロード）、COPSAC12、およびRNAファージデータベース55から作成されたウイルスタンパク質データベースに対して、ウイルスORFをブラストし、最小e値10e-6で最もヒットしたものを選択した。ファージの宿主予測はiPHoP33で行った。iPHoP33は異なる宿主予測因子の組み合わせを利用する。アセンブル、品質管理、アノテーションの後、bowtie256と、コンティグ長とシーケンス深度を正規化したリードの分割表（ここではvOTU-table（viral contigs）と定義）を用いて、全サンプルのリードをウイルス（高品質）コンティグ（vOTU）に対してマッピングした。このパイプラインを記述したodeはhttps://github.com/frejlarsen/vapline3。ckファージコミュニティ（ファージC2、T4、phiX174、MS2、およびPhi6、表S110）は、ssDNA、dsDNA、ssRNA、およびdsRNAの異なるゲノムタイプを含むシーケンスプロトコルの能力を検証するために、ビロームシーケンスの陽性対照（各ファージについて約106PFU/mLに正規化）として使用した。

細菌およびウイルス配列の情報解析

このコンティグはサンプルの5%未満しか検出されなかったが、それでも全リードの99.8%を維持していた。バージョン4.3.0がその後の解析とデータ表示に使用された。バクテリオーム解析とビローム解析のシーケンスリードの最小閾値は、それぞれ2,200リードと15,000リードに設定した。使用した主なパッケージは、phyloseq,64vegan,65DESeq2,66ampvis2,67ggpubr, psych, igraph, ggraph, pheatmap, ComplexHeatmap, ggplot2である。ウイルスコンティグのコンタミネーションは、RパッケージのmicroDecon68（run = 1, regressions = 1）を用いて、ネガティブコントロールで検出されたリードカウントで除去し、12.24%のエントリーを除去した。累積和スケーリング正規化は、metagenomeSeqパッケージを用いてRソフトウェアで行った。-多様性解析は生のリードカウントに基づき、統計はANOVAに基づく。-多様性はBray-Curtis非類似度で表し、統計はFDR（偽発見率）で補正したペアワイズPERMANOVAに基づく。ESeq2は、要約された細菌種レベルとウイルスコンティグ（vOTUs）レベルで差分微生物を同定するために使用された。細菌zOTUとウイルスcontigs（vOTU）の相関ネットワークヒートマップは、ペアワイズSpearman相関を用いて計算し、FDRで補正した。シャノン多様性指数（α-多様性）の解析にはノンパラメトリックの2側ウィルコクソン順位和検定を、β-多様性の解析にはPERMANOVAを採用した。

蛍光顕微鏡法

異なるビロームのファージ力価を測定するために、SYBR Gold（Cat.no S11494 Invitrogen、Thermo Fisher Scientific）でウイルス様粒子（VLP）を染色し、オンラインdx.doi.org/10.17504/protocols.io.bx6cprawに記載されているように、酸化アルミニウムフィルター（CytivaのWhatman 6809-6002 Anodisc）に捕獲して、蛍光顕微鏡観察を行った。各ビロームの平均 VLP を測定するため、各ビロームごとに新しいフィルターを作製し、蛍光顕微鏡で撮影した。VLPはImageJを用いてカウントした。

謝辞

資金提供ストニア科学教育省、プロジェクト番号IUT1927。アリン工科大学、プロジェクト番号SSGF24016。ルンドベック財団、助成金ID： 324-2019-1880、頭文字は "SafeVir"。ノボノルディスク財団（助成金ID：NNF-20OC00638）： NF-20OC0063874、頭文字は「PrePhage」。

著者貢献

.A.、T.R.、D.N.およびK.A.が実験を考案し計画した。S.A.、S.L.、K.A.はケモスタット実験を行った。.R.とX.M.がバクテリオームとビロームの解析を行った。llの著者は結果の批判的評価と解釈に関与した。原稿はK.A.とK.A.が執筆し、他のすべての著者の意見を参考にした。

利害関係

著者らは競合する利害関係はないと宣言している。

補足情報 (1)

DF (3.96 MB)

S1. 図S1-S11

参考文献

ujimoto, K. ∙ Kimura, Y. ∙ Allegretti, J.R. ...

糞便微生物叢移植によるバクテリオームとウイルス叢の機能的回復

astroenterology。021;160:2089-2102.e12

糞便移植材料から真核生物ウイルスを最小化する再現性の高いケモスタット培養

糞便移植材料から真核生物ウイルスを最小化する再現性の高いケモスタット培養

ハイライト

要旨

要旨

研究分野

はじめに

結果

ケモスタット培養からの真核生物ウイルスの灰化

連続培養におけるビロームの再現性

希釈率がバクテリオームおよび対応するビロームの組成に及ぼす影響

考察

ビローム増殖の再現性

希釈率が微生物の多様性に及ぼす影響

前臨床試験用細菌ビロームの恒温増殖

研究の限界

TAR★方法

EYリソース表

リソースの有無

実験モデルと研究参加者の詳細

方法の詳細

謝辞

著者貢献

利害関係

補足情報 (1)

参考文献

記事メトリクス

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