再現性の高い小腸内細菌叢モデルの開発と動的in vitro腸内モデル「SHIME®-system」への統合
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ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. Microbiol.、2023年3月17日
第2回 脊椎動物の消化器官における微生物について
第13巻～2022年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1054061
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脊椎動物の消化器官における微生物のインサイト： 2022
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再現性の高い小腸内細菌叢モデルの開発と動的in vitro腸内モデル「SHIME®-system」への統合
Stef Deyaert1† Frédéric Moens1 Walter Pirovano2 Bartholomeus van den Bogert2 Eline Suzanne Klaassens2 Massimo Marzorati1,3* Tom Van de Wiele1,3 Michiel Kleerebezem4 and Pieter Van den Abbeele1†.
1ProDigest BV、ゲント、ベルギー
2Baseclear, ライデン、オランダ
3ゲント大学バイオサイエンス工学部微生物生態・技術センター（CMET）（ベルギー、ゲント市
4ワーヘニンゲン大学動物科学部（オランダ、ワーヘニンゲン
ヒトの消化管は様々な部位から構成されており、それぞれが異なる生理学、解剖学、微生物群によって特徴づけられています。最近の研究プロジェクトでは、大腸の微生物相が注目されていますが、小腸の微生物相や摂取した化合物との相互作用については、主にこの領域が生体内でアクセスしにくいことが原因で、ほとんど知られていません。そこで本研究では、SHIME®技術を用いた回腸微生物叢の動的長期シミュレーションを開発し、検証することを目的としました。18日間にわたり、さまざまな接種戦略、栄養培地、環境パラメータをテストしたスクリーニング実験から、必須パラメータを特定し、最適化しました。合成細菌コンソーシアムを選択した条件下に置くことで、存在量（8.81 ± 0.12 log（cells/ml））、組成、機能において代表的な微生物相が安定的に得られました。実際、観察された群集は、主にStreptococcus属、Veillonella属、Enterococcus属、Lactobacillus属、Clostridium属からなり（qPCRおよび16S rRNA遺伝子標的イルミナ配列）、栄養投与により乳酸生産が増加し、その後酢酸およびプロピオン酸への相互摂食作用が見られた。さらに、生体内と同様に、胆汁酸塩は部分的にしか脱共役されず、二次胆汁酸塩への変換はわずかであった。小腸微生物叢モデルの再現性を確認した後、確立されたM-SHIME®に統合し、大腸微生物叢の組成的関連性をさらに高めた。この長期in vitroモデルは、回腸細菌群集の代表的なシミュレーションを提供し、例えば、微生物や食事成分を補充した場合の回腸細菌群集の動態や活性に関する研究を容易にします。さらに、このin vitroシミュレーションを統合することで、現在のM-SHIME®技術の生物学的関連性を高めることができます。
はじめに
ヒトの消化管（GIT）は、それぞれが固有の生理学、解剖学、および微小環境からなる異なる領域で構成されています（Booijink et al., 2007; Donaldson et al.） 胃、小腸、大腸（または大腸）の生態系は、合わせて数千億個の細菌からなり、これらは腸内細菌叢と呼ばれる（Bäckhed et al., 2005; Ley et al., 2006）。この腸内細菌叢は、未消化の栄養素の代謝、健康に有益な分子の生産、病原体のコロニー形成の防止、およびヒトの免疫系の訓練を通じて、ヒトの健康に影響を与えます（Macfarlane and Macfarlane, 2011; Zoetendal et al., 2012; Arpaia et al., 2013; El Aidy et al., 2015; Marchesi et al., 2016）。このような相互作用を調査することを目的とした多くの研究にとって重要な制限は、消化管にアクセスできないことであり、多くの場合、活動現場で起こっていることの近似値でしかない糞便サンプルを使用することになる（Kastl et al.、2020）。そのため、小腸に生息する微生物叢は未解明な部分が多い。この微生物叢は、摂取された食品化合物に最初に遭遇し、宿主の生理学とともに、摂取された治療薬の安定性と有効性に重要な影響を与える可能性があるため、それでも高い関心を集めている（Zhangら、2018；van Kesselら、2019；van Kessel and El Aidy、2019；Liら、2020年）。
小腸は、十二指腸、空腸、回腸から構成されています。これらの領域内では、微生物群集は、pH（Moore and Holdeman, 1974; Evans et al., 1988）、通過時間（Silvester et al., 1995）、分泌物などの明確な生理学的パラメータを通じて形成される（Kitahara et al、 2004; Begley et al., 2005; O'May et al., 2005; Whitcomb and Lowe, 2007; Ridlon et al., 2014）、および栄養利用性（Hao and Lee, 2004; review in Booijink et al., 2007; Donaldson et al., 2016; Thursby and Juge, 2017）。さらに、結腸領域と比較して、小腸はより高い表面積を構成し、それによって、例えばパイエルパッチを介した宿主上皮細胞および免疫系との激しい相互作用を可能にする（Staggら、2004；Rakoff-Nahoum and Medzhitov、2006）。小腸の管内pHは、十二指腸の約6から終末回腸の7.4まで徐々に上昇する（Evansら、1988；Booijinkら、2007）。胆汁酸塩は、通常、小腸全体で4〜10mMの間に存在し、細菌の細胞膜の乳化を通じて細菌に毒性を示すことがある（Islam et al.、2011；Kakiyama et al.、2013；Ridlon et al.、2014；Staley et al.、2017）。分泌物は、トリプシン、キモトリプシン、アミラーゼ、リパーゼが最も多く含まれる膵臓酵素で構成されているかもしれません（Whitcomb and Lowe, 2007）。さらに、小腸の通過時間は3±1時間であり（Davis et al., 1986）、大腸の滞留時間（39±5時間; Arhan et al., 1981）と比較して桁違いに短い。複雑な繊維がバクテリアの主な炭素源となる大腸とは異なり、小腸の微生物はむしろ、上部消化管で消化された後の未吸収の残り物である単糖を発酵させる（Borgström et al., 1957; Booijink et al, 2007, 2010; Zoetendal et al., 2012）。
小腸の細菌密度は、地域特有の生理的条件に大きく影響されます。十二指腸（103-105個/g）と空腸（104-105個/g）は、胃から来る初期酸性と胆汁酸塩や膵臓酵素の高濃度により、その存在量はかなり低いですが、よりアルカリ性の回腸ではかなりの数の細菌（107-108個/g；Booijink et al.、2007）からなっています。しかし、微生物の負荷と多様性は、結腸のそれと比較して比較的小さい（Booijink et al., 2007; Zoetendal et al., 2012; Thursby and Juge, 2017; Kastl et al., 2020）. 微生物組成に関しては、研究間でかなりのばらつきがある（Thadepalli et al., 1979; Bouhnik et al., 1999; Riordan et al., 2001; Hayashi et al., 2005; Wang et al., 2005; Ivanov et al., 2008; Hartman et al., 2009; Booijink et al., 2010; Zoetendal et al., 2012; van den Bogert et al., 2013; El Aidy et al., 2015; Seekatz et al、 2019; Kastl et al., 2020）、試験集団（健康な成人 vs. イレオストミー患者 vs. 突然死被害者）、サンプリング手順（イレオストミー排水 vs. 検死 vs. 生検）、サンプリング部位（内腔 vs. 粘液、近位回腸 vs. 末端回腸）、微生物叢を分析する方法論の違いによるものと考えられる。さらに、回腸内細菌叢に固有の個体間および時間的な強い変動によって発生するノイズが加わります（Booijink et al., 2010; Zoetendal et al.） 回腸微生物叢は、主にStreptococcus属、Veillonella属、Lactobacillus属、Enterococcus属、Clostridium属のFirmicutes属で占められているが、一部の個人の小腸では、Proteobacteria属やActinobacteria属、Fusobacterium、Faecalibacterium、Bacteroides、Ruminococcus、Blautia、Prevotellaなどの特定属が高い相対量で存在している（Booijink et al、 2010; Zoetendal et al., 2012; van den Bogert et al., 2013; El Aidy et al., 2015; Cieplak et al., 2018; Seekatz et al., 2019). さらに、代謝の機能性にも一貫性があるようです。解明された各回腸コミュニティは、一次発酵菌（例えば、Streptococcus、Enterococcus、Lactobacillus）からなり、単純炭水化物を、例えば、二次発酵菌（例えば、Veillonella）の成長をサポートする乳酸に代謝する。後者は乳酸を消費して短鎖脂肪酸（SCFA、Veillonellaの場合は主に酢酸とプロピオン酸）を生成するプロセスで、クロスフィーディングと呼ばれる（Foubert and Douglas, 1948; Egland et al, 2004; Hosseini et al, 2011; Scott et al, 2013; Kastl et al, 2020）.
個人差、縦断的な動態、そして生体内での回腸微生物叢のアクセス性の悪さから、回腸微生物叢の強固なin vitroモデルの開発は、小腸微生物叢を駆動するプロセスをより良く理解するために有用である（Booijink et al.、2010）。現在利用可能な小腸のin vitroモデルの多くは、宿主の生理学に焦点を当て、そのコロニー形成微生物叢を表現していない（Guerra et al.、2012）。対照的に、回腸微生物叢を組み込んだモデルはむしろ短期的であり、例えば、回腸特異的な細菌株の混合物を投与し、その後すぐに調査されるため、適用環境でうまく増殖するかどうかは不明である（Cieplakら、2018）。他のモデルでも、より長期間にわたる回腸微生物叢のシミュレーションが試みられているが、出現したコミュニティは、Bacteroidetes（Stolakiら、2019）またはEnterobacteriaceae（Rousselら、2020）のいずれかの存在量が高い、より結腸に近いコミュニティに似ているか、強い時間変動を示す（Rousselら、2020）ようになった。最後に、ガットオンチップなどの小型化されたin vitroモデルは、粘膜-細菌の微小環境を規定する無酸素-有酸素界面まで再現できるように設計されている（Bein et al.、2018年）。しかし、長期的な研究のためにこのようなシステムで安定した腸内細菌叢を確立することは、取り扱い量が非常に小さいため、ほぼ不可能です。これらのモデルにはそれぞれの利点がありますが、回腸微生物群集の動的で長期的なin vitroモデルがあれば、目的の化合物を投与した際の微生物相互作用の変化や代謝シフトの研究など、よりメカニズムに基づいた研究が可能になります。我々の知る限り、このようなモデルはまだ存在しません。
そこで、本研究の目的は、環境条件を最適化することで、生体内の回腸微生物相を代表する機能・組成の微生物相を数週間にわたって支持する新規のin vitroモデルを開発することである。第二の目標は、この小腸微生物相モデルを、すでに大腸微生物相の生体関連シミュレーションが可能なMucosal Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (M-SHIME®) に統合することでした (Molly et al., 1993; Van den Abbeele et al., 2012).材料と方法
2.1. 化学物質
化学物質は、Alfa Aesar（Kandel、ドイツ）、Carl Roth（Karlsruhe、ドイツ）、Chem-Lab（Zedelgem、ベルギー）、Keyser & Mackay（Brussels、ベルギー）、Merck (Overijse, Belgium), Oxoid (Merelbeke, Belgium), Sigma-Aldrich (Overijse, Belgium) および VWR (Leuven, Belgium) より入手し、以下に詳細に示す。
2.2. 微生物植菌
本研究では、いくつかの接種戦略を比較した。これは、健康なヒト成人から採取し、以前に記載されたように嫌気性リン酸緩衝液中の糞便サンプルの20％（w/v）溶液として調製した糞便接種物（Mollyら、1993）、イレオストミー排水および12細菌種（表1）からなる合成コンソーシアムを使用した。ヒトドナーに由来するサンプルは、参照番号B670201836585のUniversity Hospital Ghentの倫理承認に従って収集されました。
表1
表1. 細菌株、その由来、適用された増殖条件。
2.3. 小腸コンソーシアム用に選択された菌株のグリセロールストックの調製
グリセロールストックは、各菌株について別々に調製した。成長した培養物を指数関数的成長中に収穫し、0.5mlの培養物を0.5mlのグリセロールベースの凍結保護剤（50％v／vグリセロール（86％）［Merck］、0. 5g L-1 L-システイン-HCl［Merck］、10g L-1 トレハロース［Sigma-Aldrich］、3g L-1 トリプティックソイブロス（TSB）［Oxoid］、18g L-1 NaCl［Chem-Lab］、1ml L-1 レザズリン［Alfa Aesar］ストック溶液（2％ w／v）と50％（v／v） dH2O）。厳密な嫌気性菌株については、オートクレーブ処理前に、グリセロールベースの凍結保護剤を1′間煮沸して酸素含有量を減少させた。グリセロールストックは、使用するまで-80℃で保存した。
2.4. In vitro M-SHIME®技術
すべての実験は、Van den Abbeele et al. (2012)が以前に説明したM-SHIME®技術を改変して実施しました。セットアップは、容器の無菌性を保証するため、接種前にオートクレーブで滅菌した。さらに、反応器は攪拌して連続的に均質化し、37℃に維持し、1日3回、15分間N2でフラッシングして嫌気的に維持した。
2.4.1. 栄養媒体
L-1）NaHCO3（50g；Chem-Lab）、NaH2PO4（10g；VWR）、K2HPO4（10g；Chem-Lab）、MgSO4.7H2O（0.9g；Chem-Lab）、MgCl2.4H2O（0.5g；VWR International Europe BVBA）を含むフィルター滅菌したストック溶液を無菌添加し、回腸栄養媒体（100%）を作成した（5%）v/v）。 7H2O (0.9 g; Chem-Lab), MnCl2.4H2O (0.5 g; VWR International Europe BVBA), CaCl2.2H2O (0.9 g; VWR), FeSO4.7H2O (0.05 g; Sigma-Aldrich), ZnSO4.7H2O (0.05 g; Sigma-Aldrich), hemin(0. 05g；Sigma-Aldrich）、グルコース（12g；Merck）、フルクトース（12g；Sigma-Aldrich）、スクロース（12g；Sigma-Aldrich）、マルトース（12g；Carl Roth）、ラクトース（12g；Oxoid）、マンノース（7.5g；Carl Roth）およびガラクトース（7.5g；Sigma-Aldrich）からなるオートクレーブ培地に（L-1）バイエルサルト（1. 9 g; BD Bioscience, Erembodegem, Belgium）、特殊ペプトン（0.7 g; Oxoid）、酵母エキス（2.2 g; Oxoid）、ムチン（2.2 g; Carl Roth）、L-システインHCl (0.4 g; AXO Industry SA, Wavre, Belgium) およびTween®80 (1.1 ml; Sigma-Aldrich) を含むオートクレーブ培地。回腸栄養培地（30%）は、単糖、特殊ペプトン、酵母エキス、ムチン、システイン-HClが70%減少した以外は、回腸栄養培地（100%）と同等だった。オートクレーブ処理した大腸栄養培地（37％HClでpH2に設定）を近位結腸（PC）リアクターに加え、アラビノガラクタン（1.2、Keyser & Mackay）、ペクチン（2.0、Pectin）を（g L-1 で）構成した。 0; Keyser & Mackay）、キシラン（0.5; Carl Roth）、デンプン（4.0; Carl Roth）、グルコース（0.4; Merck）、酵母エキス（3.0; Oxoid）、ペプトン（1.0; Oxoid）、ムチン（2.0; Carl Roth）およびL-システイン塩酸（0.5; Merck）。回腸リアクターに先行する場合、PCリアクターは栄養結腸培地の代わりに50mlのファイバー溶液を受け取った。繊維液は、（g L-1で）アラビノガラクタン（3.4; Keyser & Mackay）、ペクチン（5.6; Keyser & Mackay）、キシラン（1.4; Carl Roth）、デンプン（11.2; Carl Roth）、ブドウ糖（1.12; Merck）、ペプトン（2.1; Oxoid）、酵母エキス（6.3; Oxoid）、ムチン（4.2; Carl Roth）と L-cysteine-HCl (1.0; Merck)を持っていました。この結果、回腸リアクターの組み込みとは無関係に、近位結腸で同じように栄養が流入した。
2.4.2. 粘膜微生物叢のシミュレーション
小腸シミュレーションにはムチン-アルジネートビーズを用い、5倍煮したムチン-アルジネート溶液［50 g L-1 ムチン（Carl Roth）、12 g L-1 寒天（VWR）、12 g L-1 アルギン酸（Carl Roth）、2.22 ml L-1 10 M NaOH（Chem-Lab）］ を 7.6 g L-1 CaCl2.2H2O（VWR) 含む架橋液に滴下して準備した。この方法は、アルギン酸ビーズが小さいため、コロニー形成されたビーズを無菌的にサンプリングでき、入口ポートに接続したカテーテルチップ付き50mlシリンジ（Novolab）を介して新しいビーズを加えることができたため実施された。このような取り扱いの無菌性は、複数の回腸シミュレーションで合成コンソーシアムを扱う際の必須条件であった。一方、大腸微生物群については、Van den Abbeeleら（2012）が以前に説明したように、ムチンで覆われたマイクロコズムを使用する従来のアプローチを使用しました。(g L-1) K2HPO4 (8.8; Chem-Lab) と KH2PO4 (6.8; Chem-Lab) からなるバッファーを使用して、粘膜サンプルからの管腔内容物をすすいだ。粘液アルジネートビーズとムチンで覆われたマイクロコズムの半分は、2日ごとに交換した。
2.4.3. 実験デザイン
2.4.3.1. スクリーニング実験
最初の実験では、回腸を代表する微生物叢を維持する可能性について、異なる条件を比較した（図1A）。この目的のために、SHIME®（ProDigest、Ghent、BelgiumおよびGhent University、Ghent、Belgium）は、4つの平行な回腸シミュレーションと1つの結腸シミュレーションを比較するように設定されました。回腸シミュレーションでは、接種方法が異なり、合成コンソーシアム（容器1および2：12株の等量のグリセロールストックを含む混合物-表1）、回腸瘻排液（容器3：1：5希釈の5ml）および糞便スラリー（容器4：1：5希釈の5ml）であることがわかった。さらに、回腸シミュレーションの標準保持時間は4時間であるが、保持時間を8時間に延長した条件も追加で評価した（反応器2）。開始時、回腸リアクターには100 mlの回腸栄養培地（100%）と5 gの滅菌ムチン-アルギン酸ビーズを入れ、結腸容器には500 mlの結腸栄養培地と32個のムチン被覆マイクロコズムを入れた（Van den Abbeele et al, 2012）。回腸容器のpHは7.05～7.35に制御し、結腸容器のpHは6.15～6.40に設定した（結腸の滞留時間は20時間を模倣した）。新鮮な栄養培地が1日3回投与された。SCFA、乳酸、分岐鎖脂肪酸（BCFA）、胆汁酸塩およびqPCRによる微生物組成の分析のために、14日目、16日目、17日目および18日目にサンプルを収集した。さらに、14日目には、SCFAと乳酸の生成に関する動態代謝プロファイルを解明するために、新鮮な栄養培地を投入してから0、0.5、1、2、4、8時間後にサンプリングを実施した。
図1
図1. A）基準条件（RT = 4時間）または保持時間を2倍にした条件（RT = 8時間）で、さまざまな接種戦略（合成コンソーシアム、イレオストミー排水、または糞便スラリー）を比較するスクリーニング実験と、対照のコロンシミュレーションの実験デザイン； (B）スクリーニング実験から選択された基準条件下での合成コンソーシアム接種の再現性を確認する再現性実験、（C）糖度を下げた栄養培地をシミュレーションに与えた場合の細菌量への影響を評価する細菌量低減実験、（D）回腸シミュレーションをM-SHIME®モデルに統合する検証実験。数字はモデルへの接種後の日数を示す。REF = 基準条件、RT = リテンションタイム、IE = イレオストミー排水、FS = faecal slurry。
2.4.3.2. 再現性実験
2回目の実験では、容器1の試験条件を3回繰り返すことで、スクリーニング実験からの観察結果を検証した（図1B）。SCFA、乳酸、BCFAおよび16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスの分析のために、15、18および21日目に試料を採取した。
2.4.3.3. 細菌負荷の低減
第3の実験は、回腸シミュレーションの細菌密度を下げることを目的とした（図1C）。そのため、2つの回腸シミュレーションを並行して実施した。両容器のパラメータは、スクリーニング実験の容器1および再現性実験の容器1〜3の試験条件と同じであったが、2番目の容器には30％の回腸栄養培地を供給したことを例外とする。SCFA、乳酸、BCFAの分析のため、12、13、14、15日目に試料を採取した。最終日には、フローサイトメトリーと組み合わせた16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスにより、微生物組成を分析した。
2.4.3.4. M-SHIME®モデルにおける回腸シミュレーションの統合
最後の実験では、Šuligojら（2020年、図1D）が説明したように、M-SHIME®モデルにおける回腸シミュレーションの統合を評価しました。近位結腸（PC）および遠位結腸（DC）シミュレーションに対する先行回腸の影響を評価するために、構成を変更した。このため、PCとDCに回腸を先行させる第1アーム（すなわち、ILE-M-SHIME®）と、回腸を先行させないPCとDC（すなわち、M-SHIME®）からなる第2アームを設定し、これを2人のドナーのために行いました。回腸の反応器は、細菌負荷が減少した反応器と同じ条件でシミュレーションを行い、回腸栄養培地を30%投与しました。大腸のシミュレーションでは、pHをPC容器では5.70-5.90、DC容器では6.60-6.90の間で制御しました。また、PC容器での滞留時間が20時間、DC容器での滞留時間が32時間となるように送液時間を設定しました。ILE-M-SHIME®ユニットでは、近位結腸に回腸血管からの余剰量（約150ml）と50mlの繊維液の両方が供給されました。代わりに、M-SHIME®ユニットでは、近位結腸血管は、結腸栄養培地と、以前に記載したように胃血管からの膵臓および胆汁液の混合物を受け取った（Mollyら、1993；Possemiersら、2004；Van den Abbeeleら、2012、2013；Ghyselinckら、2020；Šuligojら、2020）。SCFA、乳酸、BCFAおよびフローサイトメトリーと結合した16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスの分析のために、11、13および14日目に試料を収集した。
2.5. 代謝活性の解析
酢酸、プロピオン酸、酪酸、および分岐SCFA（BSCFA；すなわち、イソ酪酸、イソバレレート、およびイソカプロ酸）を含むSCFAの定量化は、Ghyselinckら（2020）によって以前に報告されたように実施した。乳酸濃度は、上清のアリコート（7,690×gで5分間遠心分離）を用いて、市販の酵素アッセイキットを用いて、製造者の説明書に従って測定した。スクリーニング実験および再現性実験にはRoche社の酵素測定キットを使用し（Roche Diagnostics, Machelen, Belgium）、最適化実験および組み入れ実験の乳酸定量にはR-Biopharm社のキットを使用した（R-Biopharm, Darmstadt, Germany）。胆汁酸塩であるタウロコール酸（TCA）、グリココール酸（GCA）、タウロデオキシコール酸（TDCA）、グリコデオキシコール酸（GDCA）の濃度は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP-HPLC；日立クロマスター、ベルギー、ブリュッセル）を用いて、ダイオードアレイ検出器（DAD；VWR）により逆相C18カラム（Hydro-RP、4μm、80 Å、250 × 4. 6mm、Synergi、Phenomenex BV、Utrecht、The Netherlands）を用いた。流速0.7 ml/minの移動相は、アセトニトリル（溶離液A；VWR）とpH2の超高純度HPLCグレードH2O（溶離液B；VWR）からなり、以下のグラジエントがあった： 0.0 min, 30% A and 70% B; 70 min, 90% A and 10% B; 71 min, 30% A and 70% B; および 75 min, 30% A and 70% B. 胆汁酸塩は波長210 nmのDADにより検出した。サンプル調製では、サンプルを7,690×gで5分間遠心分離した後、-20℃で保存した。その後、7,690×gで5分間遠心分離した後、500μlの上清を500μlのメタノールに添加した。最後に、上清をPTFEフィルター（0.2μm；VWR）でろ過してから、カラムに注入した（50μl）。サンプルの定量は、外部標準物質を用いて行った。
2.6. 微生物群集の分析
細菌群集分析のために、DNAは、Boonらによって以前に記述された通りに、若干の修正を加えて抽出された（Boonら、2003年）。ホモジナイズは、Beadblaster装置（Benchmark Scientific, Edison, NJ, United States）を用いて行い、6.00 m/sで40秒間2回、振盪の間に5分間の冷却期間を置いた。例外として、最終実験のサンプルからのDNAは、ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA Kit（Zymo Research, Irvine, CA, United States）を用いて、KingFisher Flex Purification System（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, United States）で製造者の指示に従い抽出されました。Luminal DNAは1mlのサンプルから得られたペレットに由来し、粘膜DNAは0.25gのムチンアルギン酸寒天（回腸）またはムチン寒天（結腸）から抽出された。
標的微生物の定量は、QuantStudio 5 Real-Time PCRシステム（Applied Biosystems, Forster City, CA, United States）を用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により決定しました。標準曲線は、106遺伝子コピー/μlから10遺伝子コピー/μlまでの10倍希釈系列から作成した。PCR産物を使用するStreptococcaceaeとVeillonellaceaeを対象としたqPCRを除き、プラスミドDNAは標準曲線を作成するために使用された。各サンプルはテクニカルトリプリケートで実施し、リプリケート間の標準偏差が0.5を超えた時点で外れ値を除去した。以下のグループのqPCRは、既述のように実施した： Lactobacillus spp. (Furet et al., 2009)、Bifidobacterium spp. and Eubacterium rectale/Clostridium coccoides (Rinttilä et al., 2004)、Bacteroidetes (Guo et al., 2008), Faecalibacterium prausnitzii (Sokol et al.、 2009）、Veillonellaceae（Rinttilä他、2004）、Enterobacteriaceae（Nakano他、2003）、Streptococcaceae（van den Bogert他、2011）、Enterococcaceae（Rinttilä他、2004）、Akkermansia muciniphila（Collado他、2007）。Illumina 16S rRNA遺伝子アンプリコンライブラリーは、BaseClear BVで生成され、配列決定されました。つまり、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域からのバーコード付きアンプリコンは、2ステップPCRを用いて生成された。10ngのゲノム（g）DNAをテンプレートとして、イルミナアダプター配列を付加した341F（5′-CCTACGGNGGCWGCAG-3′）および785R（5′-GACTACHVGGTATCTAATCC-3′）プライマーで、総容量50μlの最初のPCRに使用された。PCR産物を精製し、Fragment analyzer (Agilent, Santa Clara, CA, United States)でPCR産物のサイズを確認し、蛍光分析で定量した。精製したPCR産物は、サンプル特異的なバーコード付きプライマー（Nextera XT index kit; Illumina, San Diego, CA, United States）と組み合わせて、2回目のPCRに使用した。その後、PCR産物を精製し、Fragment analyzer（Agilent）で確認し、定量した後、ペアエンド（2×）300 bpプロトコルとインデックスを用いた多重化、クラスタリング、Illumina MiSeqでのシーケンサーを実施した。シーケンスランは、サンプル固有のバーコードに基づくデマルチプレックスで、Illumina CASAVAパイプライン（v1.8.3）を用いて解析しました。生シーケンスデータは、品質が低すぎるシーケンスリードを除去し（「パスフィルター」リードのみを選択）、アダプター配列またはPhiXコントロールを含むリードを社内フィルタープロトコルで破棄して処理しました。残りのリードの品質評価は、FASTQC品質管理ツールバージョン0.10.0を使用して実施した。データ処理のため、イルミナペアリードは、フォワードプライマーとリバースプライマーを除去した後、配列の重なりによってシングルリード（pseudoread）にマージされた。キメラ擬似リードを除去し、残ったリードをRDP 16S遺伝子データベースにアライメントした。シュードリードのアライメントスコアに基づき、その系統の分類学的深さをランクの同一性閾値；種99％、属97％、科95％、目90％、類85％、門80％に基づいて決定した。
全細菌細胞は、16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスで得られた比例データを定量データに変換するため、フローサイトメトリーで定量化した（乗算）。サンプルは凍結保護剤で1：1希釈し、Hoefmanら（2012）に従って分析するまで-80℃で保存した。0.01 mM SYTO24（Life Technologies Europe NV, Merelbeke, Belgium）で室温、暗所で15分間染色した後、BD Facsverse（BDBiosciences, Merelbeke, Belgium）で高流量設定を用いてサンプルを分析し、SYTOチャネルに200の閾値を適用してバクテリアを媒体破片および信号ノイズから分離した。フローサイトメトリーデータは、FlowJo、バージョン10.5.0を使用して分析した。
2.7. 統計情報
酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、乳酸塩、胆汁酸塩濃度の統計的有意差は、それぞれの実験について個別に決定した。細菌量に関する有意差は、それぞれの実験について、管腔サンプルについては絶対レベル、粘膜サンプルについては相対レベルで判定した。統計解析は、Excel 2011（Microsoft, Redmond, WA, United States）を用いて実施した。すべての実験の統計解析中、異なる血管間の比較のために、両側t検定を適用した。Benjamini-Hochberg偽発見率（FDR）を適用して（FDR = 0.05で）、以前に記載されたように多重性の問題を補正した（Lee and Lee, 2018）。主成分分析（PCA）は、コンソーシアム属を代表する分類学的ファミリーで補足された、すべてのシミュレーションコミュニティにわたる内腔の最も豊富な15ファミリーの比例16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスデータを用いてCLUSTVIS（biit.cs.ut.ee/clustvis/）で実施したが、上位15最も豊富なファミリーには含まれなかった。結果
3.1. 異なる環境条件が細菌の組成と活性に強く影響した
最初のスクリーニング実験では、4つの試験条件を並行して評価し、対照となるコロンシミュレーションと比較しました。リアクター1および2には合成コンソーシアムを、リアクター3および4にはそれぞれイレウス瘻の廃液および糞便サンプルを接種した。リアクター2はリアクター1と異なり、保持時間が長い（4時間ではなく8時間）。接種戦略と保持時間の両方が、微生物の組成と活性の点で、回腸シミュレーション中の微生物コロニー形成に影響を与えた。
まず、10種類の分類群を対象としたqPCRパネルの有効性を、回腸吻合器の流出液と糞便サンプルを用いて評価しました（補足表S1）。その結果、両サンプルにおいて、文献と一致する、異なる微生物群集組成が存在することが確認されました、 すなわち、回腸瘻サンプルでは、Veillonellaceae、Streptococcaceae、Enterococcaceae（プロバイオティクス摂取量に応じてLactobacillaceaeも）が濃縮されているのに対し、腸内細菌科、Akkermansiaceae、Bifidobacteriaceae、Bacteroidetes、Lachnospiraceae、およびF．prausnitziiが多く含まれており（Supplementary Table S1）、qPCRパネルによって、微生物群集が回腸的か大腸的かを代表的に示すことができることが確認されました。
このことから、2週間培養したスクリーニング実験の定常状態の群集は、接種戦略に大きく影響され、合成コンソーシアムを接種すると、より回腸に近い群集が得られると結論づけることができた。実際、後者（トランジットタイム4時間）では、Veillonellaceae [8.73±log(copies/ml)], Streptococcaceae [8.94 log(copies/ml)], Enterococcaceae [9.16 log(copies/ml)] と、それほどでもないがLactobacillaceae [6.81 log(copies/ml)] が支配するコミュニティーとなった（表2）。驚くべきことに、同じコンソーシアムを保持時間を長くして（8時間）培養すると、Veillonellaceae [3.50 log(copies/ml)]とStreptococcaceae [3.46 log(copies/ml)] を犠牲にして、Enterococcaceae [9.52 log(copies/ml)] とLactobacillaceae [7.53 log(copies/ml)] が支配的になる。さらに、イレウス瘻の廃液または糞便スラリーを接種すると、大腸関連分類群であるEnterobacteriaceae [それぞれ6.79および7.15 log(copies/ml)]、Akkermansiaceae [4.45 および 4.]が増加した。 38 log(copies/ml)、Bifidobacteriaceae [8.38 and 8.40 log(copies/ml), respectively]、Bacteroidetes [7.83 and 7.96 log(copies/ml), C. coccoides/E. rectale [8.64 and 8.90 log(copies/ml)] and F. prausnitzii [5.91 and 7.41 log(copies/ml)] といった分類群である。］ 後者は、コントロールの結腸容器内の安定した群集組成により近いものであった。
表2
表2. 回腸または大腸の条件下でリアクターで培養した場合、文献によると小腸および/または大腸をコロニー形成する10種類の分類群（群別qPCRプロトコルで決定）の平均絶対量［10log（16S rRNAコピー/ml）］。
このような微生物叢の組成の大幅な違いは、微生物の活性に大きく影響した。第一の側面では、合成コンソーシアムを接種すると、回腸吻合流出液および糞便スラリーを接種した基準条件（それぞれ64.5 ± 1.1 mMおよび61.7 ± 2.3 mM）と比較して、基準条件の総SCFAレベルが大幅に低下し、保持時間が増加するとさらに低下した（6.5 ± 0.2 mM）一方で総SCFAレベルは対照結腸で最も高かった（69.4 ± 1.9 mM、図2A）。第二の側面として、定常状態の乳酸レベルは、すべての基準条件および対照結腸で同様に低く、これは、例えば、プロピオン酸および/または酪酸への乳酸の効率的なクロスフィーティングを示すかもしれない。一方、保持時間の延長は乳酸を有意に増加させ、それによりクロスフィードが損なわれていることを示唆した（図2B）。さらに、実験14日目に新鮮な栄養培地を投与して8時間後のカイネティクスサンプリングを行ったところ、基準コンソーシアム条件では、最初に乳酸生産が増加し、その後乳酸が消費されて酢酸とプロピオン酸が同時に生産された（図3）。この動態は、イレウス瘻の廃液と糞便スラリーを接種した基準条件でも、より低い程度ではあるが観察された。一方、保持時間を延長した条件に栄養培地を投入すると、乳酸産生は増加したが、乳酸の消費とそれに伴う酢酸およびプロピオン酸の産生は見られなかった（保持時間の延長によりVeillonellaceaeレベルが低くなることに対応する）。コントロールコロンでは、時間の経過とともに酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度が緩やかに上昇したが、乳酸レベルの上昇は見られなかった。
図2
図2 （A）異なる回腸シミュレーション試験条件における14、16、17、18日目の短鎖脂肪酸（SCFA）濃度の平均値（mM）。互いに有意に異なる値は異なる文字で示す（酢酸はa、b、c、d、プロピオン酸はA、B、C、D、酪酸はα、β）。(B) 異なる試験条件における平均乳酸濃度（mM）。互いに有意に異なる値は異なる文字で示した（a、b、c）。(C-F）異なる試験条件下での平均胆汁酸塩濃度。赤棒は、新鮮な栄養培地を投与した際のシミュレーションにおけるそれぞれの胆汁酸塩の初期濃度を示す。回腸の試験条件は、基準条件（REF）または保持時間の延長（+RT）のいずれかを、異なる接種戦略（SC、IE、FS）で試験しました。大腸については、M-SHIME®テクノロジーのパラメータを適用した。SC = 合成コンソーシアム、IE = イレオストミー排水、FS = 糞便スラリー、TCA = タウロコール酸、GCA = グリココール酸、TDCA = タウロデオキシコール酸、GDCA = グリコデオキシコール酸。
図3
図3. 定常状態のコミュニティを構成するさまざまな試験条件に新鮮な栄養培地を投与したときのSCFAおよび乳酸濃度（mM）の時間的プロファイル：（A）合成コンソーシアムを接種した基準条件、（B）合成コンソーシアムを接種した2倍の保持時間、（C）イレオストミー排水を接種した基準条件、（D）糞便スラリーを接種した基準条件、（E）M-SHIME®近位大腸のシミュレーション。
さらに、異なる条件は、試験条件間および対照結腸と比較した場合の両方で胆汁酸代謝に影響を与えた（図2C-F）。後者では、TCA、GCA、TDCA、GDCAが完全に脱共役されたのに対し、回腸血管では前記胆汁酸が部分的に脱共役されたに過ぎなかった。胆汁酸の変換率は、合成コンソーシアムを接種した場合に最も低く、より具体的には、保持時間の延長との組み合わせで観察されました。
全体として、すべての試験条件から、参照条件下での合成コンソーシアム接種が、in vivoの回腸コミュニティ（Booijink et al., 2010; Zoetendal et al., 2012; El Aidy et al., 2015; Cieplak et al., 2018; Seekatz et al., 2019）を最もよく表すものとして選択されました。
3.2. 選択した条件により、安定した再現性のある群集の確立が可能である。
次に、シミュレーションの再現性を検証するために、スクリーニング実験から選択した参照条件を3連で実施した。
内腔SCFAプロファイルは経時的に安定し（レプリケート1、2、3でそれぞれ87、86、88％）、選択した条件の複数のレプリケート血管にわたって高い再現性（95％）を示した（図4A）。乳酸レベルは平均1.40±0.69mMであり、レプリケートシミュレーション間で有意差はなかった（データ示さず）。16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスにより、異なるタイムポイントにおける複製容器内の群集組成がほぼ同一であることが示され、これにより細菌群集の安定性と再現性の両方が確認された（図4B）。内腔のコミュニティは、Streptococcus属（41.2±2.5%）、Veillonella属（30.7±2.0%）、Enterococcus属（11.2±2.7%）、およびClostridium属（8.4±1.3%）によって支配されていました。Lactobacillus属（2.6±0.8%）、Blautia属（1.6±0.4%）、Faecalibacterium属（0.7±0.2%）、Prevotella属（0.1±0.1%）は低濃度での存在であることがわかった。
図4
図4 （A）3つの異なる時点（接種後15、18、21日目）における3つの複製回腸シミュレーションの短鎖脂肪酸（SCFA）濃度（mM）。すべての複製は、合成コンソーシアムを接種した基準条件を表している。(B）3つの異なるタイムポイント（接種後15、18、21日目）で合成コンソーシアムを接種した後、基準条件下で培養した3つの回腸シミュレーションレプリケートの平均属レベルの相対微生物群集組成を示す。コンソーシアムに含まれる属は、定常状態の群集のほぼ100%を占めている。なお、基準となるLactobacillusは、Limosilactobacillus属とLigolactobacillus属の両方を含むと考えられている。
3.3. 回腸栄養培地の適合による菌濃度の低下
総細胞濃度は、フローサイトメトリーとqPCR解析のポストホック比較に基づき、qPCR測定値から推定した。この相関に基づき、スクリーニング実験中のqPCR解析では、回腸シミュレーションで109個/mlを超えるレベルが得られたが、これは108個/mlの範囲のレベルが報告されているin vivoの状況に対して高すぎると考えられた（Booijink et al., 2007）。そこで、回腸シミュレーションにおける細菌負荷を低減することを目的として、2つの同じ構成の容器で、適合した回腸栄養培地（30%）と初期の回腸栄養培地（100%）を比較しました。重要なことに、フローサイトメトリーによる細菌細胞の定量化により、初期回腸栄養培地（給餌サイクルの開始時と終了時にそれぞれ6.65と19.95 * 108 cells/ml、図5D）と比較して、適合回腸栄養培地の投与により総菌密度が約3倍減少した（給餌サイクルの開始時と終了時にそれぞれ2と7の58 * 108 cells/ml）ことが示された。
図5
図5 （A）基準条件下で合成コンソーシアムを接種し、2種類の回腸栄養培地（100％対30％含有）を与えた定常状態の回腸シミュレーションの平均SCFA濃度（mM）。(B) 16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスにより決定した、2種類の回腸栄養培地（100%対30%）を与えた定常状態の回腸シミュレーションの内腔属性微生物組成の割合と(D)定量。定量的な組成は、16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスとフローサイトメトリーデータを通じて得られたものである。(C) 16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスによって決定された、異なるタイプの栄養培地（100％対30％）を与えられている2つの回腸シミュレーションにおける比例的な粘膜微生物組成を示す。基準となるLactobacillusは、LimosilactobacillusとLigolactobacillusの両属を含むと考えられる。
このように細胞密度が低下しても、微生物の活性や群集組成は変化しませんでした。実際、適応培地（30％）は、総SCFA濃度を有意に（p = 2 * 10-8）減少させたが、酢酸／プロピオン酸／酪酸比（約55／45／0；図5A）を変化させなかった。乳酸は、初期培地（0.007±0.002mM）よりも適応培地（0.025±0.003mM）で有意に（p < 10-5）高く、しかしまだわずかであった。16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスにより、両栄養培地間の管腔および粘膜領域の両方で同様の微生物組成が明らかになった（図5B、C）。栄養レベルが低下すると、クロストリジウム（12.5%対6.8%）と腸球菌（16.7%対8.7%）が比例して穏やかに増加し、レンサ球菌（46.7%対55.6%）とベヨネラ（21.8%対26.7%）が犠牲になりました。したがって、100%栄養培地を投与した容器では、連鎖球菌とVeillonellaeが全体の80%以上を占めたのに対し、適合した回腸栄養培地を投与した容器では、これらの分類群が約65%を占めていました（30%）。さらに、Lactobacillus (0.2% vs. 0.2%), Blautia (0.1% vs. 0.1%), Faecalibacterium (<0.1% vs. <0.1%) and Prevotella (<0.1% vs. <0.1%) は影響を受けていない。合成コンソーシアムで構成される属を合わせると、模擬群集の98%以上を占めた（調整栄養培地と初期栄養培地ではそれぞれ98.0と98.2%）。不足する約2％の相対的存在量は、Lactococcus（調整済みおよび初期の栄養培地でそれぞれ1.2％対1.3％）、Hungatella（調整済みおよび初期の栄養培地でそれぞれ0.20％対0.15％）および無数の低存在属（< 0.1%; データ非表示）で表されます。
3.4. M-SHIME®モデルにおける回腸シミュレーションの統合
最終実験では、回腸のシミュレーションを、大腸の微生物相をシミュレーションする確立されたM-SHIME®モデルに統合しました。このために、2人のドナーのそれぞれについて、2つのアームを並行して実行しました。1人のドナーに対して、1つのアームは回腸、近位結腸、遠位結腸で構成され、2つ目のアームは近位結腸と遠位結腸のみで構成されています。
PCAで示されるように、すべての反応器の内腔に最も多く存在する15科と、回腸コンソーシアムの属が属するが最も多い上位15科には含まれない科を組み合わせると、結腸領域特有のコミュニティがM-SHIME®モデルを構成しています（図6）。M-SHIME®に回腸シミュレーションを組み込むことで、この大腸領域特異性が維持され、先行する回腸が後続のシミュレーション大腸コミュニティを乱さないことが示された。さらに、回腸の微生物相は、両ドナーのin vitro腸内モデルにおいて、多様性の増加（図7）および種の豊富さの増加（データなし）に寄与し、in vivoで報告されていることをより反映しています。さらに、遠位結腸は、回腸が先行する場合、回腸が先行しない遠位結腸と比較して、より糞便接種に類似していることが観察された（図6）。
図6
図6. 比例16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスデータに基づく微生物叢の主成分分析（PCA）。合計16の分類学的ファミリーが考慮された。すなわち、最も豊富な15ファミリーに、上位15ファミリーに含まれないコンソーシアム属を表す分類学的ファミリーが補足された。軸のパーセンテージは、データセットの全分散を説明するための主成分の寄与度を示す。PCとDCの前に回腸を統合すること（ILE-M-SHIME®）の影響を、2人のドナーの標準的なM-SHIME®と比較しました。
図7
図7. 16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスデータから算出した、回腸シミュレーション、および回腸シミュレーションを先行させたかどうか（ILE-M-SHIME®対M-SHIME®）に基づく（OUTの）シャノン多様性指標。多様性推定値は、3つの異なるタイムポイント（接種後11日目、13日目、14日目）において、2人のドナーの別々の容器と総リアクターユニットについて決定した。多様性指標の合計が互いに有意に異なる場合は、アスタリスク（）で表示されます。25以上のリードを持つOTUのみを考慮した。
回腸リアクターの統合により、近位結腸（0.84 ± 0.14 mM→2.20 ± 0.06 mM）および遠位結腸（0.22 ± 0.04 mM→0.32 ± 0.01 mM）の初期乳酸レベルが上昇したが、乳酸は回腸リアクターで先行してより急速に消費された。SCFA分析により、両回腸シミュレーションがほぼ同じSCFAプロファイルを示すことが確認された（図8）。総SCFA濃度は13.5±0.7mMおよび13.9±0.5mM、酢酸/プロピオン酸/酪酸比は反応器1および2の回腸血管でそれぞれ50/49/1および54/45/2であった。回腸ベッセルを組み込んでも、近位結腸ベッセル（54.8 ± 3.8 mM 対 53.1 ± 6.3 mM、それぞれ先行回腸あり/なし）および遠位結腸ベッセル（73.0 ± 4.2 mM 対 72.5 ± 2.1 mM、それぞれ先行回腸なし）の総SCFA濃度には影響がなかった。しかし、先行回腸のシミュレーションは、後続の結腸コンパートメントにおけるSCFAプロファイルの比例に影響を及ぼした。ドナー1では、回腸の先行により、両大腸血管の酪酸濃度が上昇し、酢酸とプロピオン酸が犠牲になった（SCFA比はPCで58/22/21から51/17/32へ、DCで67/21/12から62/18/19へと変化）。それにもかかわらず、ドナー2では、SCFA比は一定であった（PCでは52/14/34から54/11/35へ、DCでは63/17/20から64/16/20へ）。
図8
図8. 回腸シミュレーションを先行させたか否かの定常状態の結腸血管における平均SCFA濃度（mM）（それぞれILE-M-SHIME® vs. M-SHIME®）。記号は、同一ドナーの対応する領域のシミュレーション間の酢酸（）、プロピオン酸（$）または酪酸（#）の有意差を示す。ILE = 回腸、PC = 近位結腸、DC = 遠位結腸。
微生物組成については、両回腸シミュレーションの内腔および粘液の定常状態の群集は、合成コンソーシアムに含まれる属でほぼ構成されており（ユニット1および2の回腸血管の内腔および粘液について、それぞれ98.8±0.4%および99.3±0.2%、ならびに97.3±0.3%、98.8±0.2%）汚染株によるコロニーがないことを示しています（図9A-C）。1号機および2号機の回腸血管では、安定した内腔群はVeillonella属（それぞれ30.6±4.6%、24.3±6.8%）、Streptococcus属（それぞれ13.0±5.0%、27.8±7.0%）、Enterococcus属（それぞれ55.1±1.6%、38.5±1.1%）が優勢である。
図9
図9（A）16S rRNA遺伝子標的イルミナシーケンスにより決定した、回腸シミュレーション（それぞれILE-M-SHIME®対M-SHIME®）を先行させたか否かの定常結腸シミュレーションにおける内腔および粘膜（C）群集の比例および（B）定量組成。回腸血管には、基準条件下で合成コンソーシアムを接種した。16S rRNA遺伝子標的イルミナとフローサイトメトリーデータの組み合わせにより、定量的な組成を求めた。合成コンソーシアムに含まれる属のみを表示した。リファレンス乳酸菌は、Limosilactobacillus属とLigolactobacillus属の両方を含むと考えられています。
回腸シミュレーションをM-SHIME®技術に組み込んでも、その後の近位および遠位結腸反応器における細菌密度に影響はなかった。さらに、回腸シミュレーションを組み込んでも、近位結腸と遠位結腸のいずれにおいても、内腔細菌群集組成に大きな影響を与えなかった（補足表S1）。軽微な変化としては、ドナー1では、Bacteroidaceae（PC）、Selenomonadaceae（PC）、Synergistaceae（DC）、Akkermansiaceae（DC）が減少し、Enterococcaceae（PCおよびDC）、Streptococcaceae（PCおよびDC）のレベルが増加した。また、有意ではなかったが、回腸シミュレーションを組み込んだPCでは、ルミノコッカス科のレベルが増加した。ドナー2では、PCとDCの両方でStreptococcaceaeとEnterococcaceaeが増加し、RuminococcaceaeはPCで有意に増加し、DCで有意に減少した。粘膜の群集組成の変化はあまり顕著ではなかった。考察
本研究では、生体内を代表する腸内細菌叢の安定した長期再現性のあるin vitroモデルの開発に焦点を当てました。独立したモデルとしての開発に成功した後、これまで大腸微生物叢のみをシミュレーションしていたM-SHIME®モデルに統合し、後者のモデルの関連性をさらに高めました。
まず、合成コンソーシアムの接種、短い保持時間（4時間）、単糖類を豊富に含む栄養培地など、基準条件下で2週間培養した後に確立した回腸細菌群集のシミュレーションは、Streptococcus属、Veillonella属、Enterococcus属が優勢なモデルで、生体内の状況にも関連していました。これらの属の濃縮は、回腸のコミュニティを調査するための代理としてしばしば使用されてきた回腸瘻排液の微生物組成に関する文献と一致している（Colladoら、2007；Booijinkら、2010；van den Bogertら、2011、2013；Zoetendalら、2012；Dlugoszら、2015；El Aidyら、2015；Chungら、2016）。2週間の培養後、選択されたコンソーシアムメンバーの存在量は検出限界を超えており、適用された環境条件との関連性が確認されました。保持時間を8時間に延長すると、VeillonellaとStreptococcusのメンバーのコロニー形成が阻害されるという観察結果は、正しい環境条件を特定することの複雑さを示しています。このような群集の変化は、保持時間を8時間に延長した場合、好ましくない糖の代謝が長く続くため、特定のコンソーシアムメンバーのコロニー形成が促進され、阻害代謝物の蓄積や関連製品の阻害を促す可能性があると推測された。これは、4時間の保持時間は、より好ましくない糖の発酵には潜在的に短すぎるため、最も好ましい炭素源（例えば、グルコース）を繁栄させるコンソーシアムメンバーを刺激する基準条件とは対照的であろう。一方、基準条件では、糞便サンプルや回腸吻合器の廃液を接種しても、結腸様微生物群のコロニー形成が阻害されなかったことから、例えば、最近試みられたように、充填・排出機構の組み込みや結腸から回腸への還流シミュレーションの組み込みなど、環境条件の微調整の可能性がある（Roussel et al, 2020）. それにもかかわらず、現在のモデルでは、組成と重要な量の点で代表的な細菌群集の確立と維持が可能であった。
微生物組成は、回腸に関連する微生物活性を示した。より具体的には、新鮮な栄養培地を入れると、最初の30分間は乳酸レベルが急速に上昇し、その後、乳酸が消費される一方で酢酸とプロピオン酸レベルが上昇したことから、細菌の相互摂食の相互作用を示唆した。乳酸産生の最初のブーストは、単糖の消費時に乳酸を産生することが知られているStreptococcus、Enterococcus、およびLactobacillus種に起因すると思われた（Hoefmanら、2012；Lee and Lee、2018）。翻って、酢酸とプロピオン酸への乳酸の連続的な交差供給は、おそらくVeillonella種の高濃度存在に起因していた（Distler and Kröncke, 1981; Arif et al., 2008）。比較的短い保持時間（4時間）は、回腸での実質的な酪酸産生を防ぐと考えられ、低成長のFaecalibacteriumとClostridiumが少ないことが裏付けられている。保持時間の延長は乳酸産生を強く増加させ、クロスフィードインタラクションを防止した。後者は、グルコース枯渇時に、より好ましくない炭水化物を長時間利用することで説明できるかもしれない。Enterococcus属やLactobacillus属は、炭水化物発酵においてより柔軟性があることが知られており、そのため保持時間の延長が有利であると考えられる。これらの属がより多く存在すると、乳酸やエタノールなどの阻害代謝物の生産が促進され、StreptococcusやVeillonellaなどの増殖が阻害される可能性がある。しかし、この仮説をさらに検討することは、滞留時間の延長が模擬群集に与える影響のメカニズムを解明する上で極めて重要である。一方、回腸吻合器からの流出液や糞便スラリーを接種すると、乳酸濃度の大幅な上昇が抑制された。これは、これらの血管における交差摂食効率が高く、結腸様群集の乳酸産生能が低いためであると考えられる。さらに、選択した基準条件および保持時間を長くした条件で確立されたコミュニティは、モデルにおいて胆汁酸塩TCA、TDCA、GCA、GDCAを部分的にしか脱共役化しなかった。生体内では、胆汁酸塩の大部分は回腸で再吸収されるが（腸肝循環）、一部は腸内細菌叢によって生体内変換される。この生体内変換には、まず脱共役の段階（回腸）があり、その後、脱共役した胆汁酸は大腸でデヒドロキシル化および／または再共役化されます。これらの生体内変換は、輸送を促進し、胆汁酸塩の機能性やシグナル伝達特性を向上させます。したがって、観察されたことは、吸収されなかった胆汁酸が回腸領域で部分的にしか変換および/または脱共役化されないという、生体内で起こることに対応している（Hofmann, 1999; Martinez-Augustin and Sanchez de Medina, 2008）。これに対して、回腸吻合器からの流出液や糞便スラリーを接種した条件では、対照結腸で観察される胆汁酸代謝に近い状態、すなわち、第一胆汁酸の脱共役と変換がほぼ完全に行われることが確認された。本研究では確認できなかったが、これらの観察結果は、大腸コミュニティと比較して、確立された回腸コミュニティの遺伝子プールにおける胆汁酸ヒドロラーゼおよび7-α-デヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の存在が限られていることに関連していると思われる。全体として、最適化された回腸シミュレーションは、代表的な胆汁酸代謝を明らかにしながら、コンソーシアムの主要メンバー間の代謝クロスフィード相互作用の模倣を可能にし、したがって、このモデルは、非常に動的な小腸環境における微生物代謝物フラックスを研究する将来の研究において有用なツールとなり得ることを示唆している（Seekatz et al.、2019）。
選択したシミュレーション戦略により、独立した実験内で再現性の高い微生物組成と活性を再現することができました。とはいえ、異なる実験間では、代謝機能に影響を与えないように見えるものの、相対的な細菌プロファイルのマイナーなシフトが検出されました。例えば、再現性実験では、Streptococcus属、Enterococcus属、Veillonella属が回腸の群集の約85%（それぞれ41、11、31%）を占めていましたが、最終実験では、Streptococcus属、Enterococcus属、Veillonella属の相対存在量を合計すると約95%で、StreptococcusはEnterococcusより存在度が低く（それぞれ平均19、47、28%）なりました。このような組成の違いは、栄養培地中の糖分濃度が再現実験時の30％程度に低下したことに起因しているものと考えられる。特に、グルコースの投与量を減らしたことで、より好ましくない糖類へのジオキシーシフトが促進され、その結果、より好ましくない糖類を効率的に代謝するコンソーシアムメンバー（例：Enterococcus）が相対的に刺激されたのかもしれません。しかし、これらの仮説を確認するためには、さらなる研究が必要である。
回腸シミュレーションの細菌密度を下げると、シミュレーションの生物学的関連性が高まり、回腸をM-SHIME®技術に統合することが可能になります。回腸容器に適応した回腸栄養培地（30%）を供給すると、初期の回腸栄養培地（100%）を供給したモデルと比較して、総細菌量が3倍減少しました。平均して、細菌負荷は2.53および7.58 * 108細胞/ml（それぞれ給餌サイクルの開始時と終了時）からなり、報告されている107～108細胞/mlの生体内レベルよりわずかに高い（Kastl et al.、2020）。しかし、サンプリング時の患者の絶食状態の偏りにより、実際のin vivoレベルは報告されているものよりも大幅に高いという仮説がすでにありました（Zoetendalら、2012；El Aidyら、2015；Villmonesら、2018、2020）。これは、炭水化物を多く含む食品を摂取した後のイレオストーム患者のサンプルにおいて、より高い細菌密度が観察されることによって説明される。このように、回腸の細菌レベルは、栄養素の通過時に局所的に変動し、栄養豊富なチャイムと細菌との相互作用が長く続くと細菌負荷が増加するという仮説が立てられました。しかし、今回のモデルで最適化された細菌負荷は、代謝シフトとコミュニティダイナミクスを研究することができる一方、細菌レベルが低いと、定量化の限界に近いシフトになり、誘導された変化を適切に調査することができない可能性があります。全体として、細菌負荷の最適化後、後者は107-108細胞/gの生体内レベルをより忠実に模倣し、回腸シミュレーションをM-SHIME®技術に統合することを容易にした。
M-SHIME®モデルは徹底的に検証され、近位および遠位結腸の生体内コミュニティを確実に表現することが知られていますが（Van den Abbeele et al.、2010）、回腸モデルをM-SHIME®に組み込むことで、その生物学的妥当性がさらに高まったように思います。第一に、上述の基準に従って回腸微生物叢に似た細菌群を含めることで、すでに生体内の状況をより忠実に模倣しています。第二に、先行する回腸は、観察された種数と多様性を増加させる傾向があった。おそらく、先行する回腸の培養により、代謝物や基質が大腸領域に供給され、そうでなければ洗い流されてしまう種の増殖がサポートされるのだと思われる。M-SHIME®を用いた糞便サンプルと安定化群集の間の細菌株の高い回収率にもかかわらず、一部の分類群は従来のSHIME®モデルでのコロニー形成にあまり効果がないようである。例えば、Ruminococcaceaeは、F. prausnitziiのような健康を促進する種を含むため、しばしば健康マーカーとしてターゲットにされています。しかし、M-SHIME®の特に近位（または上行）結腸では、接種材として使用した糞便サンプルと比較して、一般的にRuminococcaceaeの割合が低くなります（Van den Abbeele et al.、2010）。回腸モデルを組み込むと、回腸微生物相を先行させないシミュレーションと比較して、ドナー1および2の近位結腸におけるルミノコッカスの存在量が増加した。これは、回腸から特定の代謝産物（酢酸など）が流入し、Ruminococcaceaeにとって刺激的なニッチを作り出したことに起因していると思われます。このような代謝の相互作用が、回腸が先行するSHIME®の遠位結腸由来の試料が、回腸が先行しないSHIME®の遠位結腸由来の試料よりも糞便接種に近いクラスターを形成するという観察結果につながったのかもしれません。したがって、ILE-M-SHIME®モデルの開発により、SHIME®技術を用いた大腸微生物叢の長期in vitroシミュレーションの関連性をさらに高めることができます。まとめ
結論として、本研究では、ヒト大腸微生物叢のための確立されたM-SHIME®技術に組み込むことができる、ヒト回腸微生物叢の安定した、再現性のある、代表的な長期in vitroシミュレーションの開発について述べています。消化率、薬物の安定性、栄養吸収に影響を与えるこの特定の微生物群集の役割を解明するためには、さらなる研究が必要です。In vivoの実験的研究に取って代わるものではありませんが、このモデルは、回腸微生物叢、治療薬との相互作用に関する洞察を明らかにし、より効率的な治療法の開発を刺激する一次スクリーニング方法として役立つことが示唆されます。
データ提供について
本研究で発表されたデータは、NCBIリポジトリ、アクセッション番号PRJNA940490 (link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA940490) に寄託されています。
著者貢献
SD、FM、Bv、MM、TV、MK、およびPVが研究コンセプトを開発した。SDは、WP、Bv、EKが作成したシーケンスデータを除き、実験を実施し、データを収集した。SD、FM、PAはデータを評価し、原稿を書き、Bv、MM、TW、MKが校正・承認した。すべての著者がこの論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
この研究は、Eurostars project Promise (E12091)の財政的支援を受けたものである。
謝辞
特に、イレオストミー排水サンプルを提供してくれたストマイルコVZW社に感謝したい。
利益相反
FM、MM、TWは、本研究で開発したモデルを用いて他社にサービスを提供するProDigestの社員である。SDとPAは、このプロジェクトが実施されたとき、ProDigestの従業員だった。今回のプロジェクトでは、WP、Bv、EKは、本研究を通じてNGSサービスを提供するBaseClear社に勤務していた。
残りの著者は、潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で研究が行われたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
補足資料
本論文の補足資料は、オンラインにてご覧いただけます：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.1054061/full#supplementary-material。
略語の説明
BCFA、分岐鎖脂肪酸、GIT、消化管、SCFA、短鎖脂肪酸、M-SHIME、Mucosal Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem、ILE、Ileum、PC、Proximal Colon； DC、遠位結腸、SC、合成コンソーシアム、FS、糞便サンプル、IE、イレオストミー廃液、TSB、トリプティックソイブロス、MRS、de Man, Rogosa and Sharpe培地、RCM、強化クロストリジウム、RT、保持時間； REF, 基準条件; TCA, タウロコール酸; GCA, グリココール酸; TDCA, タウロデオキシコール酸; GDCA, グリコデオキシコール酸; OTU, 分類単位; LOQ, 定量限界; DAD, 半導体検出器; FDR, 誤発見率; PTFE, ポリテトラフルオロレン; RP-HPLC, 逆相高圧液体クロマトグラフ; PCA, 主成分分析; BSH: 胆汁酸ハイドロラーゼ.
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キーワード：回腸、微生物叢、in vitroモデル、短鎖脂肪酸、小腸、ヒト腸内微生物生態系シミュレーター
引用元 Deyaert S, Moens F, Pirovano W, van den Bogert B, Klaassens ES, Marzorati M, Van de Wiele T, Kleerebezem M and Van den Abbeele P (2022) 再現可能な小腸微生物相モデルの開発と動的in vitro腸モデルであるSHIME®システムへの統合. Front. Microbiol. 13:1054061. doi: 10.3389/fmicb.2022.1054061
Received（受理）された： 26 September 2022; Accepted： 2022 年 12 月 14 日；
発行：2023年3月17日
編集者
中国・スーチョー大学・Weiqi He氏
レビューした人
スーザン・ウェストフォール（カナダ、マギル大学ヘルスセンター
Mapitsi Thantsha（プレトリア大学、南アフリカ共和国
Copyright © 2022 Deyaert, Moens, Pirovano, van den Bogert, Klaassens, Marzorati, Van de Wiele, Kleerebezem and Van den Abbeele. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、学術的に認められた慣例に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： マッシモ・マルゾラティ、massimo.marzorati@ugent.be
†Present address： Stef Deyaert and Pieter Van den Abbeele, Cryptobiotix NV, Gent, Belgium.
免責事項：本記事で表明されたすべての主張は、あくまで著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または支持されるものではありません。
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