SARS-CoV-2感染は腸管透過性と関連している、 SARS-CoV-2感染は腸管透過性と

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研究論文
2024年9月30日
SARS-CoV-2感染は腸管透過性と関連している、 SARS-CoV-2感染は腸管透過性と

https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.00680-24

関連している： Christopher M. Basting https://orcid.org/0009-0001-7744-3673, Robert Langat, Courtney A. Broedlow, Candace R. Guerrero, Tyler D. Bold, Melisa Bailey, Adrian Velez, Show All (18 Authors), Nichole R. Klatt https://orcid.org/0000-0003-2968-5480 klat0037@umn.eduAuthors Info & Affiliations
https://doi.org/10.1128/spectrum.00680-24
引用
PDF/EPUB

Spectrum
第12巻、 ABSTRACT
INTRODUCTION
RESULTS
DISCUSSION
MATERIALS AND METHODS
ACKNOWLEDGMENTS
SUPPLEMENTAL MATERIAL
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ABSTRACT
コロナウイルス疾患2019（COVID-19）とそれに関連する重症度は、制御不能な炎症と関連しており、消化管や口腔を含む粘膜部位のマイクロバイオームの変化と関連している可能性がある。これらの部位は、宿主と微生物のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしており、COVID-19における上皮バリアの完全性の崩壊は、炎症と免疫機能障害の悪化につながる可能性がある。COVID-19の転帰は、無症状から致死的なものまで非常に多様であり、疾患の重症度に対する微生物異常の影響は不明である。ここでは、COVID-19で入院した患者86人と健康なボランティア12人から血漿、直腸スワブ、口腔咽頭スワブ、鼻腔スワブを入手した。粘膜ぬぐい液中の微生物群集の特徴を明らかにするために16S rRNA配列決定を行い、血漿サンプル中の循環サイトカイン、腸管バリア完全性のマーカー、脂肪酸の濃度を測定した。これらの血漿濃度とマイクロバイオームを、健康なボランティアとCOVID-19患者の間で比較し、血漿変数と細菌量の相関解析を行った。COVID-19患者の直腸スワブでは、Faecalibacterium prausnitziiを含むいくつかの常在菌の存在量が減少し、日和見病原体であるEggerthella lentaとHungatella hathewayiの存在量が増加していた。さらに、死亡したCOVID-19患者の口腔咽頭ぬぐい液には、口腔病原体Scardovia wiggsiaeがより多く含まれていた。H. hathewayiとS. wiggsiaeの存在量は、IL-6を含む循環炎症マーカーと相関しており、COVID-19の重症度におけるマイクロバイオームの役割の可能性を強調し、COVID-19を管理するための治療標的の可能性を示した。
重要性
コロナウイルス疾患2019（COVID-19）の転帰は非常にばらつきがあり、制御不能な炎症と関連している；しかし、この制御不能な炎症につながる個々の因子は完全には理解されていない。ここでわれわれは、重症のCOVID-19が、全身性の炎症、微生物の転位、および微生物のディスバイオシスと関連していることを報告する。COVID-19患者の直腸および口腔咽頭のマイクロバイオームは、常在菌の減少、日和見病原体の増加によって特徴づけられ、これらは炎症および微生物転座のマーカーと正の相関を示した。したがって、これらの微生物の擾乱は、COVID-19における疾患の重症度に寄与している可能性があり、COVID-19の転帰を改善するための微生物学に基づく介入の可能性を強調している。
はじめに
コロナウイルス疾患2019（COVID-19）の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、無症状から重症化、死亡に至るまで、非常に多様な転帰を示すことで知られている。しかし、様々な転帰を決定する要因や、個人間の重症化しやすいか軽症化しやすいかの違いは、まだよく分かっていない(1, 2)。高齢（60歳以上）、男性、肥満、糖尿病、心血管疾患などの合併症を有する患者は、COVID-19の重症化および関連死亡のリスクが高いことが多くの研究で報告されているが（3-6）、このリスク上昇のメカニズムはよくわかっていない（7）。
ウイルス感染に対する防御の第一線の一つは、適切な炎症反応を誘導する効果的なサイトカイン反応である。しかし、これは諸刃の剣である。COVID-19は攻撃的な炎症反応と「サイトカインストーム」と呼ばれるサイトカインの過剰放出を伴うことがある(8-11)。サイトカインストームとは、あからさまな、あるいは無秩序な炎症を指す言葉で、最終的には多臓器不全や死に至ることもある(10)。この調節不能な炎症は、COVID-19患者の主な死因のひとつである急性呼吸窮迫症候群を含む重篤な臨床合併症を引き起こす可能性があり、SARS-CoV-2ウイルスそのものというよりもむしろ過剰な免疫反応によって誘発された可能性が高い(12)。COVID-19における炎症は死亡率の予測因子であり、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、TNF-αを含むいくつかのサイトカインの血漿中濃度の上昇と関連している(13)。さらに、死亡したCOVID-19患者の肺の組織分析から、ウイルス複製だけでなく、炎症によるアポトーシス、ネクロプトーシス、パイロプトーシスが死亡に関連していることが示された(14)。宿主の炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの不均衡が共通の特徴であるが、このような明白な炎症の発症に寄与するメカニズムは完全には解明されていない(9)。さらに、肺感染によって誘発された炎症は腸管透過性を引き起こし、その結果、腸内微生物やリポ多糖（LPS）などの微生物産物の移動が増加する。微生物の移動がもたらす正味の効果は、全身の炎症と肺の傷害を増強し、呼吸器関連疾患の重症化を促進する(19, 20)。さらに、SARS-CoV-2は腸管細胞に直接感染し(21)、上皮バリアーの破壊を引き起こし(22)、微生物転移している可能性がある。したがって、COVID-19における全身性炎症とサイトカインストームにおける腸内細菌叢の役割は、口腔咽頭や鼻腔などの上気道の他の粘膜上皮部位と同様に、重要な研究分野である。
ヒトの消化管には、腸内細菌叢として知られる生態学的群集を形成する数兆個もの微生物が生息しており、この微生物叢が変化すると、腸内細菌叢異常症を引き起こし、様々なヒト疾患と関連している(23)。腸内細菌叢は、ウイルス感染症における疾患の重症度、免疫学的機能障害、長期転帰と一貫して関連しており、COVID-19の文脈でも実証されている(24, 25)。COVID-19は、抗生物質の交絡効果を除いても、正常な腸内細菌叢の劇的な変化と関連していることがいくつかの研究で報告されている(24, 26, 27)。例えば、COVID-19は、FaecalibacteriumやRoseburiaなどの重要な酪酸産生菌の減少と関連している(28-30)。Roseburia属は粘膜の完全性と大腸の運動性に寄与し、IL-10産生を調節することで顕著な抗炎症作用を発揮する(31)。同様に、Faecalibacterium prausnitziiという種は、NF-κB経路の阻害を介して炎症性腸疾患患者に抗炎症効果を示すことが認められている貴重な腸内共生細菌である(32)。逆に、日和見病原体は、COVID-19に関連した腸内細菌叢で一般的に過剰発現しており、バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）などは、IL-6やIL-8のレベル上昇と関連している(29)。IL-6などの炎症性サイトカインはさらに、LPS結合タンパク質（LBP）、β-グルカン、ゾヌリンのレベル上昇と関連しており、微生物の移動と腸管バリア透過性が全身性の炎症を増加させることが示唆されている(28-30, 33)。腸内細菌叢における微生物異常は、COVID-19患者における炎症性サイトカインの高値と相関することが示されており、腸内細菌叢が、おそらく宿主免疫応答の調節を介して、COVID-19の重症度の大きさに関与していることが示唆されている(34)。さらに、COVID-19患者では、特に高齢者において多様性の減少を含む口腔マイクロバイオームの変化が認められており(35)、歯周病に関連する細菌が免疫細胞によるIL-6およびTNF-α産生を刺激することが示されている(36)。したがって、口腔内のマイクロバイオームもまた、COVID-19の重症化に寄与する炎症とサイトカイン産生の源である可能性がある。しかし、COVID-19におけるマイクロバイオームの役割は、疾患の重症度に寄与するその能力において完全には解明されていない。
短鎖脂肪酸（SCFA）は主に腸内細菌による難消化性炭水化物の嫌気性発酵によって産生されるが、中鎖脂肪酸（MCFA）は主に食事由来である(37, 38)。最も多く産生されるSCFAは酢酸、酪酸、およびプロピオン酸であり（39）、それぞれに作用がある。酪酸は結腸細胞の主要なエネルギー源であり（40）、腸管上皮のバリアー維持に重要であることが示されている（41）。これまでの研究で、酪酸とプロピオン酸はともに、炎症性サイトカインであるIL-6とTNF-αの発現を抑制し、Gタンパク質共役型受容体を介したシグナル伝達によって免疫細胞の分化と活性化を調節することが示されている(42, 43)。プロピオン酸塩はまた、結腸臓器培養におけるIL-6放出を減少させ(44)、腸上皮細胞におけるタイトジャンクションバリアを強化し、それによって腸管透過性を低下させることにより、抗炎症特性を有することが示されている(45)。COVID-19は以前、Roseburiaのような腸内のSCFA産生菌の減少との関連を示したが(46)、これはSCFAの産生を減少させ、その潜在的な健康効果を失わせる可能性がある。さらに、入院中の食生活の変化により、MCFA濃度も変化する可能性がある。したがって、COVID-19の循環脂肪酸濃度を評価することで、疾患進行中の重要な生物学的変化を知ることができるかもしれない。
ここでは、入院中のCOVID-19患者のサイトカイン・プロファイル、循環脂肪酸、腸管バリア機能のマーカー、鼻腔、口腔咽頭、直腸スワブの微生物叢を調べた。また、異なる粘膜部位のマイクロバイオーム、臨床的特徴、および全身の宿主免疫応答との関係をよりよく理解するために、数名の非感染健康ボランティアも対象とした。
結果
研究参加者の特徴と研究の概要
SARS-CoV-2陽性の入院患者を、研究登録終了時までに生存（n=69）しているか死亡（n=17）しているかによって2つの重症度グループに分け、死亡したグループはより重症であると定義した。死亡した患者の平均年齢は生存した患者より有意に高かった（P = 0.003）。死亡した患者は入院期間も長く（P = 0.003）、生存した患者（50.7％）に比べて男性（76％）が多かったが、この差は統計学的に有意ではなかった（P = 0.377）。死亡した患者では、心血管疾患、高血圧、糖尿病を含むいくつかの併存疾患の有病率も高かったが、がんの既往歴が唯一統計的に有意な差であった（P = 0.003）。好中球数、乳酸脱水素酵素（LDH）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アラニントランスアミナーゼ（ALT）、クレアチニンキナーゼ値に関しては両群間に有意差は認められなかったが、死亡した患者は生存した患者に比べてアルブミン値が有意に低かった（P = 0.012）。死亡したCOVID-19患者は、生存した患者と比較して、口腔咽頭ぬぐい液中のSARS-CoV-2ウイルス量も有意に高かった（P = 0.030）。鼻腔ぬぐい液中のSARS-CoV-2ウイルス量は、死亡したCOVID-19患者でも高かったが、この差は統計的に有意ではなかった（P = 0.202）。COVID-19患者の臨床的特徴、病院での検査結果、およびウイルス量の測定値を表1；図S1に示す。以前に報告されたように(3)、死亡した患者は生存した患者に比べて主に高齢で、男性であり、既往症が多かった。また、入院期間が長く、SARS-CoV-2ウイルス量が多く、アルブミン濃度が低い傾向があった。
表1
表1 COVID-19患者の臨床的特徴a
生存者（n=69） 死亡者（n=17） ％欠測 P値
年齢［年、平均（SD）］ 59.26（15.41） 71.82（10.55） 0 0.003b
性別 0 0.377d
女性［n（％）］ 34（49.3） 4（23.5）
男性［n（％）］ 35（50.7） 13（76.5）
入院期間［日、中央値（IQR）］ 6. 00 (4.00, 12.00) 13.00 (8.00, 19.00) 0 0.003c
人工呼吸器装着期間［中央値（IQR）］ 2.00 (0.00, 5.00) 9.00 (0.00, 14.00) 0 0. 101
入院中のICU訪問 [n (%)] 43 (62.3) 13 (76.5) 0 0.625d
ICU滞在期間 [日、中央値(IQR)] 2.00 (0.00, 5.00) 5.00 (0.00, 13.00) 0 0. 142c
病院での検査結果
アルブミン［g/dL、平均（SD）］ 2.88（0.45） 2.41（0.44） 36 0.012b
AST［U/L、中央値（IQR）］ 35.00（23.00, 76.00） 34.14（28.80, 41. 00) 37.2 0.967c
ALT [U/L、中央値(IQR)] 45.25 (26.63, 86.25) 48.50 (31.60, 67.00) 38.4 0.967c
LDH [U/L、平均値(SD)] 332.10 (112.31) 381.10 (110. 89) 20.
9 0.
266bALT [U/L、中央値(IQR)] 35.
00 (23.00, 76.00) 34.14 (28.80, 41. 89） 20.9 0.269b
好中球数［千/μL、平均（SD）］ 6.70（3.04） 8.12（3.50） 7 0.266b
クレアチンキナーゼ［U/L、中央値（IQR）］ 171.67（30.00, 298. 00) 51.33 (45.00, 76.75) 67.4 0.493c
SARS-CoV-2 N1 ウイルス量（copies/μL）
鼻腔ぬぐい液［中央値（IQR）］ 3.22 (0.22, 58.41) 44.82 (1.49, 2,039.58) 30.2 0. 202c
口咽頭ぬぐい液［中央値（IQR）］ 0.84 (0.00, 23.35) 118.07 (9.86, 371.51) 24.4 0.030c
直腸ぬぐい液［中央値（IQR）］ 0.03 (0.00, 0.66) 0. 00 (0.00, 0.00) 76.7 NA
併存疾患
がん性疾患[n (%)] 0 (0 %) 5 (29.4%) 0 0.003e
冠動脈疾患[n (%)] 6 (8.7%) 6 (35.3%) 0 0. 109d
心不全［n（％）］ 5 (7.2%) 4 (23.5%) 0 0.357e
心血管疾患［n（％）］ 24 (34.8%) 9 (52.9%) 0 0.581d
高血圧［n（％）］ 24 (34.8%) 9 (52. 9％） 0 0.581d
血液疾患［n（％）］ 15（21.7％） 7（41.2％） 0 0.546d
糖尿病［n（％）］ 15（21.7％） 6（35.3％） 0 0.625d
高脂血症［n（％）］ 18（26. 1%) 7 (41.2%) 0 0.625d
肥満 [n (%)] 14 (20.3%) 5 (29.4%) 0 0.724d
腎臓病 [n (%)] 21 (30.4%) 7 (41.2%) 0 0. 724d
代謝性疾患（糖尿病以外）［n(%)］ 29 (42%) 9 (52.9%) 0 0.724d
リウマチ性疾患［n(%)］ 24 (34.8%) 7 (41.2%) 0 0.893d
肺疾患［n(%)］ 20 (29%) 5 (29. 4％） 0 1.000d
a
連続変数は、正規分布の場合は平均値と標準偏差（SD）、非正規分布の場合は中央値と四分位範囲（IQR）で報告されている。
b
両側Welch t検定
c
両側Wilcox検定
d
カイ二乗検定
e
Fisher exact検定。
重症COVID-19は高レベルの炎症性サイトカインおよび腸管透過性マーカーと関連している
重症COVID-19の全身性炎症反応を評価するために、入院中のCOVID-19患者と数名の健常対照者の血漿中の多数の炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの濃度を測定した（表2；図1に要約）。IL-6の血漿中濃度は、死亡したCOVID-19患者で最も高く、次いで生存した患者と健常対照者で高かった{Med: 117 pg/mL [四分位範囲(IQR): 58.6-268.5] vs 5.96 pg/mL (IQR: 3.14-25.82) vs 1.42 pg/mL (IQR: 1.29-1.67), Kruskal-Wallis, P < 0.05}。同様に、IL-2も死亡したCOVID-19患者で最も高く、生存した患者と健常対照がそれに続いた［Med：0.79 pg/mL（IQR：0.39-0.97） vs 0.29 pg/mL（IQR：0.19-0.44） vs 0.23 pg/mL（IQR：0. 22-0.27）、それぞれ、Kruskal-Wallis、P＜0.05]。ただし、有意な一対比較は、死亡群と健常群（P＝0.035）および死亡群と生存群（P＝0.018）のみであった（図1B）。TNF-α濃度もまた、疾患の重症度に応じて上昇するようであり、死亡した患者で最も高く、生存した患者および健常対照者がそれに続いた。しかし、この差は統計学的に有意ではなかった［Med：16.15pg/mL（IQR：10.77-26.70）、11.55pg/mL（IQR：8.06-14.55）、および6.98pg/mL（IQR：6.23-7.20）、それぞれ、Kruskal-Wallis、P = 0.064］（図1K）。抗炎症性サイトカインについては、IL-10は、生存した患者および健常対照と比較して、死亡したCOVID-19患者で有意に高かった［Med: 9.56 pg/mL（IQR: 5.23-22.25） vs 4.56 pg/mL（IQR: 2.86-8.17） vs 2.01 pg/mL（IQR: 1.41-2.71）、それぞれ、Kruskal-Wallis、P < 0.05］。入院中のCOVID-19患者では、IL-8、IL-18、IFN-γなど他のサイトカイン濃度も上昇しているように見えたが、多重比較で調整した結果、いずれも統計学的に有意ではなかった（Kruskal-Wallis、P > 0.05）。
図1
健常群、生存群、死亡群のサイトカインレベルを比較した箱ひげ図。IL-6、IL-2、IL-10レベルに有意差が認められ、p値が強調されている。残りのサイトカインについてはKruskal-Wallisのp値を記した。
図1 COVID-19患者と健常対照者におけるサイトカインの血漿中濃度。入院中のCOVID-19患者と対照者のIL-6（A）、IL-2（B）、IL-10（C）、IL-17A（D）、IL-23（E）、IL-8（F）、IL-1β（G）、IL-12p70（H）、IL-18（I）、IFN-γ（J）、TNF-α（K）の血漿中濃度。Tukeyの枠はIQR、中央の線は中央値、縦の線は隣接値（第1-1.5 IQR、第3四分位＋1.5 IQR）。Kruskal-Wallis検定は全分析物について行ったが、偽発見率（FDR）調整後のP値が0.05未満の場合のみ一対のDunn検定を行った；したがって、一対の比較を示すプロットはすべて有意なKruskal-Wallis検定を有していた。各サイトカイン内での一対のDunn検定も、Benjamini-Hochberg法を用いてFDR調整した（47, 48）。P値＜0.05を有意とみなした。
表2
全登録患者における血漿バイオマーカー濃度a
健常者（n = 5） 生存者（n = 38） 死亡者（n = 10） 欠損率 P値
サイトカイン（pg/mL）
IFN-γ 0.86（0.67, 0.92） 0.78（0.49, 1.37） 2.37（0.84, 5.69） 0 0.320
IL-10 2. 02（1.99, 2.18） 4.63（2.91, 8.30） 9.56（5.70,13.42） 0 0.002
IL-12p70 1.28（1.20, 1.52） 0.88（0.64, 1.28） 0.86（0. 50, 1.02) 0 0.233
IL-18 183.00 (166.00, 293.00) 441.00 (278.00, 613.75) 397.00 (203.25, 931.00) 0 0.107
IL-1β 0. 62（0.62, 0.70） 0.44（0.26, 0.71） 0.32（0.21, 0.68） 0 0.687
IL-2 0.23（0.22, 0.27） 0.29（0.19, 0.44） 0.79（0.39, 0. 97) 0 0.046
IL-6 1.42 (1.29, 1.67) 5.96 (3.14, 25.82) 117.00 (58.60, 268.50) 0 <0.001
TNF-α 6.98 (6.23, 7.20) 11. 55（8.06, 14.55） 16.15（10.77, 26.70） 0 0.064
IL-23 20.40（11.52, 27.50） 40.57（23.45, 68.72） 28.14（22.16, 51. 12) 0 0.233
IL-17A 0.89 (0.55, 1.01) 1.25 (0.90, 1.57) 0.94 (0.68, 1.25) 0 0.267
IL-8 0.12 (0.12, 4.84) 0.68 (0. 25, 1. 25, 1.88） 1.64（0.63, 7.44） 0 0.196
腸管バリアマーカー（ng/mL）
sCD14 1,772.46（1,633.74, 1,965.35） 2,128.58（1,661. 82, 3,071.70） 2,922.96（2,180.24, 3,705.77） 0 0.233
ゾヌリン 5.35（4.16, 8.95） 10.53（7.57, 17.45） 10.95（6.63, 17. 56) 0 0.196
i-fabp 1.37 (1.04, 1.44) 1.27 (0.78, 1.76) 0.95 (0.68, 1.15) 5.6 0.548
lbp 27,426.06 (27,113.30, 28,709. 94)
36,405.90 (27,113.30, 28,709. 94) 36,405. 94) 36,405.90 (28,813.66, 54,620.61) 79,024.78 (60,555.45, 97,675.48) 0 0.007
脂肪酸 (ng/μL)
プロピオン酸 8. 12（7.95, 8.40） 5.24（3.99, 5.88） 5.79（4.41, 6.19） 1.9 0.015
酪酸 0.41（0.38, 0.50） 0.40（0.27, 0.54） 0.44（0. 35, 0.52) 1.9 0.834
ノナン酸 0.83 (0.68, 0.97) 1.06 (0.92, 1.42) 1.10 (0.93, 1.33) 1.9 0.320
デカン酸 1. 69 (1.50, 2.16) 0.21 (0.09, 0.39) 3.59 (0.90, 7.80) 1.9 0.002
イソ吉草酸 0.15 (0.13, 0.18) 0.27 (0.20, 0.33) 0.25 (0.21, 0.32) 1.9 0.158
a
データは中央値（IQR）で示し、P値はすべてKruskal-Wallis検定で求めた。
次に、全身性炎症を引き起こす粘膜機能不全の可能性を考慮し（49, 50）、重症のCOVID-19が腸管バリアの完全性と微生物移動のマーカーの違いと関連しているかどうかを検討した。この目的のために、腸管透過性の4つの重要なマーカー、腸脂肪酸結合蛋白（I-FABP）、LBP、可溶性CD14（sCD14）、ゾヌリンの血漿中濃度を測定し、表2にまとめた；図2。腸管透過性のマーカーで唯一、これらのグループ間で統計的に有意であったのはLBPであり、COVID-19患者では健常対照群と生存群に比べ、かなり高い濃度が観察された（それぞれP = 0.003とP = 0.005；図2C）。LBPは存在する細菌性LPSの量を示しており(51, 52)、COVID-19の重症例では増加していることが以前に示されている(53)。興味深いことに、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質もLPSと結合し、炎症活性を高めることが示されている(54)。腸管透過性の追加マーカーであるゾヌリンとsCD14は、健常対照と比較してCOVID-19患者でともに上昇したが、これらの差は有意ではなかった（Kruskal-Wallis、P > 0.05；図2BからD）。これらの結果から、重症のCOVID-19は、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカイン、および腸管透過性と微生物移行のマーカー濃度の上昇と関連しており、これらのマーカーのいくつかは疾患の重症度とともに上昇することが示唆される。
図2
健常群、生存群、死亡群におけるバイオマーカー値の箱ひげ図。LBP、プロピオン酸、デカン酸には有意差が認められたが、他のバイオマーカーには有意差は認められなかった。
図2 COVID-19患者と健常対照者における腸管バリア障害マーカーと循環脂肪酸の血漿中濃度。I-FABP（A）、ゾヌリン（B）、LBP（C）、sCD14（D）の血漿中濃度は酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）で測定し、循環脂肪酸のプロピオン酸（E）、デカン酸（F）、酪酸（G）、ノナン酸（H）、イソ吉草酸（I）は液体クロモグラフ-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）で測定した。グループ間の比較は、すべての分析項目についてKruskal-Wallis検定で行ったが、調整P値が0.05以下の場合のみDunn post hoc検定に従った。各変数内の一対のDunn検定もBenjamini-Hochberg法(48)を用いてFDR調整した。P値＜0.05を有意とみなした。
図3
相関行列と散布図は、サイトカイン、腸管透過性マーカー、ウイルス量の関係を示している。強い相関はr値とp値で強調表示され、特定のバイオマーカーとウイルス量との間に有意な関連があることを示している。
図3 サイトカイン、腸管バリア障害マーカー、脂肪酸、病院の検査結果とSARS-CoV-2ウイルス量との相関。スピアマン相関プロット；アスタリスクはFDR調整P値＜0.05を示す（A）。病院の検査結果、腸管バリアー障害、短鎖脂肪酸、SARS-CoV-2ウイルス量の代表的な相関を（B）、（C）、（D）、（E）に示す。線は単純線形回帰を表し、網掛け部分は95％信頼区間を表す。
重症COVID-19の循環脂肪酸の変化
重症COVID-19が、粘膜の完全性の維持と免疫の制御に重要な循環脂肪酸の変化と関連しているかどうかを評価するために（55）、血漿中のプロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、ノナン酸、デカン酸を含むいくつかのSCFAとMCFAを測定した（図2；表2）。プロピオン酸はCOVID-19患者の生存者、死亡者ともに健常対照者と比べて減少していた（それぞれP = 0.003、P = 0.022）。酪酸やイソ吉草酸の濃度には、どの群間でも差はなかった（Kruskal-Wallis、P > 0.05）。MCFAについては、死亡したCOVID-19患者では生存した患者に比べてデカン酸が有意に高かった（P = 0.001）が、健常対照群では差はなかった（P = 0.938）。さらに、デカン酸は生存したCOVID-19患者と比較して健常対照群で増加していた（P = 0.029）。ノナン酸濃度にはどの群間でも差はなかった（Kruskal-Wallis, P > 0.05）。全体として、これらの結果から、重症のCOVID-19は、SCFAとMCFAの両方の循環濃度にいくつかの変化を伴うことが示唆され、これらの変化は、微生物の転位につながる腸内の損傷の根底にある可能性がある。
重症COVID-19におけるサイトカイン、ウイルス負荷、腸管バリア障害との関係
サイトカイン、SCFA、腸管バリア障害のマーカー、病院での検査結果、SARS-CoV-2ウイルス負荷との関係を調べるため、スピアマン相関解析を行った（図3）。その結果、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γなどの炎症性サイトカインの間に強い相関が認められた。例えば、TNF-αはIL-6（r = 0.61、P = 3.55e-5）およびIFN-γ（r = 0.63、P = 1.41e-5）と正の相関があった。また、IL-6やIL-10（r = 0.63, P = 1.41e-5）など、いくつかの炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの間にも強い相関が観察された。IL-6とLBP（r = 0.64、P = 1.28e-5）、IFN-γとsCD14（r = 0.68、P = 2.69e-6）、IL-18とゾヌリン（r = 0.83、P = 2.09e-12）など、多くの炎症性サイトカインは腸管バリア損傷のマーカーとも強い正の相関があった。SCFAと他のバイオマーカーとの相関は限られていたが、酪酸とイソ吉草酸はともにIL-12p70と負の相関を示した（それぞれr = -0.43、P = 0.015およびr = -0.51、P = 0.001）。アルブミン濃度は、LBP（r = -0.54, P = 0.012）と同様に、IL-6（r = -0.56, P = 0.009）およびIL-2（r = -0.54, P = 0.012）を含むいくつかの炎症性サイトカインと負の相関を示した。最後に、口腔咽頭SARS-CoV-2ウイルス量とIL-10（r＝0.64、P＝2.23e-4）、IL-6（r＝0.55、P＝0.004）、TNF-α（r＝0.49、P＝0.013）の間に正の相関がみられ、鼻腔SARS-CoV-2ウイルス量（r＝0.57、P≦0.001）とも予想される正の相関がみられた。これらの相関は、SARS-CoV-2感染と全身の宿主免疫応答、炎症および腸管バリア機能障害との関係を強調している。さらに、これらの関連は、SARS-CoV-2感染によって引き起こされる全身性の炎症が腸管透過性を引き起こし、微生物の移行を増加させ、それがさらに悪循環のフィードバックサイクルにおいて全身性の炎症を引き起こすという、潜在的に新規のメカニズムを提供するものである。
重症COVID-19を特徴づける特徴の同定
死亡または生存した患者と健常対照を識別する上で最も重要な変数を同定するために、MixOmics Rパッケージ（56）を用いて、疎部分最小二乗-判別分析（sPLS-DA）による教師ありクラスタリング分析を行った（図4）。死亡群と生存群の間には中程度の重複が見られ、健常対照群との重複は少なかった。群間の分離の大部分はsPLS-DAモデルの成分1で生じており、最も寄与の大きい変数は主に炎症性サイトカイン（主にIL-6、IL-2、TNF-α）、腸管バリア損傷のマーカー（LBPとsCD14）、デカン酸、鼻腔スワブウイルス量である。これらの変数は、生存した患者や健康な対照群と比較して、死亡した患者で上昇し、離別の一因となった。さらに、アルブミン、IL-23、IL-17Aは、成分1に沿って生存群と健常群の分離に寄与した。sPLS-DAモデルの成分2は、健常対照群とCOVID-19患者群を大きく分離した。この成分に最も寄与した変数はプロピオン酸で、健常対照群で上昇していた。全体として、この教師付き分析は、炎症性サイトカイン、腸管バリア損傷のいくつかのマーカー、およびSCFAが、このデータセット内で重度のCOVID-19を特徴付けるための最も重要な変数であることを示している。
図4
sPLS-DAの散布図は、成分に基づく健常群、生存群、死亡群のクラスタリングを示している。棒グラフは、IL-6、LBP、成分1のデカン酸、成分2のプロピオン酸を含む主要な寄与変数を強調している。
図4 COVID-19患者と健常対照者の識別に最も重要なバイオマーカーの同定。血漿バイオマーカー、病院検査値、口腔咽頭ぬぐい液および鼻腔ぬぐい液からのSARS-CoV-2ウイルス負荷量のsPLS-DAを用いて、死亡または生存した患者と健常対照者の識別に最も重要な変数を同定した。サンプルの順序付けは、成分1と成分2で示され、それらのグループによって色分けされている（A）。それらの成分に寄与する変数は、以下に示され（B）、各変数の負荷値と方向を示します。各変数は、中央値が最も高かったグループで色分けされている。
重症COVID-19患者の鼻腔、口腔咽頭、直腸のマイクロバイオームの変化
粘膜の健康にマイクロバイオームが大きな影響を与えることから、次に重症COVID-19感染時のマイクロバイオームの変化を調べた。健常対照者および試験登録終了までに生存または死亡した入院COVID-19患者から採取した直腸、口腔咽頭、鼻腔スワブについて、V3V4領域の16S rRNA配列決定を行った。死亡した患者から採取した直腸ぬぐい液の数が限られていたため（n＝2）、健常対照者の直腸ぬぐい液とすべての入院患者の直腸ぬぐい液とを比較した。その結果、COVID-19患者の直腸スワブでは健常対照群と比較してα多様性が減少しており（P = 0.013；図5A）、また死亡した患者の口腔咽頭スワブでは健常対照群と比較してα多様性が減少していた（P = 0.003；図5B）。α多様性は口腔咽頭ぬぐい液の健常対照者で最も高く、COVID-19の重症度とともに低下するようであった。鼻腔ぬぐい液のα多様性には有意差は認められなかった。パーミュテーショナル多変量分散分析（PERMANOVA）では、直腸ぬぐい液（P = 0.007、PERMANOVA；図5A）、口腔咽頭ぬぐい液（P = 0.003、PERMANOVA；図5B）、鼻腔ぬぐい液（P = 0.045、PERMANOVA；図5C）の微生物組成全体に有意差が認められた。COVID-19患者において、直腸ぬぐい液の組成に寄与した主な因子は、サンプル採取前の抗生物質の使用であったが、その影響は統計的に有意ではなかった（P = 0.093；図5A）。口腔咽頭ぬぐい液の分散を説明する主要因は年齢であり（P = 0.003；図5B）、鼻腔ぬぐい液の主要因はCOVID-19のグループ分け（生存／死亡）であった（P = 0.025；図5C）。さらに、直腸および口腔咽頭サンプルのグループ内組成非類似度（β分散度）はCOVID-19患者で有意に高く、これは疾患の重症度とともに増加するように見えたが、鼻腔スワブのβ分散度はどのグループ間でも有意差はなかった（図5A～C）。
図5
直腸、口腔咽頭、鼻腔ぬぐい液の微生物多様性を、健常群、生存群、死亡群で比較した箱ひげ図、散布図、棒グラフ。
図5 COVID-19患者と健常対照群における直腸、口腔咽頭、鼻腔の微生物群集。V3V4 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を用いて、直腸ぬぐい液（A）、口腔咽頭ぬぐい液（B）、鼻腔ぬぐい液（C）において、健常対照者と生存または死亡したCOVID-19入院患者における微生物群集の特徴を明らかにした。アルファ多様性はシャノン多様性指数で測定し、2群間比較ではマン・ホイットニーのU検定、3群間比較ではDunnポストホック比較を伴うクラスカル・ワリス検定で有意性を検定した。β多様性はアンプリコン配列変異（ASV）レベルでのBray-Curtis距離によって決定し、PERMANOVAによって検定した。β分散は、vegan Rパッケージのpermutest関数を用いて、Bray-Curtis距離行列によって決定されたグループ分散を用いて検定した；箱ひげ図は、同一グループ内の各サンプル間のBray-Curtis距離を示す。微生物組成に影響する因子はPERMANOVAで決定した。各変数のP値は棒グラフの横に示した。
重症COVID-19における日和見病原体の濃縮と常在菌の減少
重症COVID-19患者の直腸、口腔咽頭、鼻腔マイクロバイオームの違いをさらに特徴付けるために、門、属、種レベルでの存在量差検定を行った。その結果、健常対照者と入院中のCOVID-19患者の直腸ぬぐい液で、有意に豊富な分類群が多数同定された（図6A）。種レベルでは、COVID-19患者ではEggerthella lentaとHungatella hathewayiが豊富で、Faecalibacterium prausnitzii、Fusicatenibacter saccharivorans、Dorea longicatenaが減少していた。属レベルでは、COVID-19患者ではActinomyces、Clostridium innocuum group、Eubacterium brachy groupが濃縮され、Coprococcus、Dorea、Ruminococcus、Roseburiaを含むいくつかの常在菌が枯渇していた。生存または死亡したCOVID-19患者と健常対照者の一対比較を鼻腔および口腔咽頭ぬぐい液について行った（図6B）。種レベルでは、死亡したCOVID-19患者の口腔咽頭ぬぐい液は、生存者と健常対照者の両方と比較して、Veillonella parvulaとScardovia wiggsiaeが濃縮され、Veillonella atypicaが減少していることが特徴的であった。属レベルでは、死亡したCOVID-19患者ではLactobacillus、HowardellaおよびScardoviaが濃縮され、FusobacteriumおよびLeptotrichiaは健常対照者および生存患者と比較して枯渇していた。門レベルでは、死亡した患者では、健常対照者および生存した患者と比較してFusobateriotaが有意に減少していた。生存したCOVID-19患者も死亡したCOVID-19患者も、健常対照者と比較して、Haemophilus、Stomatobaculum、Catonella、Selenomonas、Lachnoanaerobaculum、TM7x、Candidatus Saccharimonas、Mogibacterium、Fusobacterium periodonticum、Campylobacter concisusを含むいくつかの分類群が減少していた。鼻腔ぬぐい液で観察された分類群のうち、生存者または健常対照者と比べて、死亡したCOVID-19患者ではクチバクテリウムが減少していた（図6B）。これらを総合すると、COVID-19患者におけるマイクロバイオームのこれらの変化が、観察された粘膜機能障害の根底にある可能性がある。
図6
直腸、口腔咽頭、鼻腔ぬぐい液中の微生物分類群を健常者とCOVID-19患者で比較した棒グラフ、ヒートマップ、箱ひげ図。
図6 重症COVID-19患者の直腸、口腔咽頭、鼻腔ぬぐい液における発現量の異なる分類群。入院中のCOVID-19患者と健常対照との間で有意に豊富な分類群は、MaAsLin2を用いて、各サンプルタイプについて門、属、種のレベルで同定された。(A)直腸ぬぐい液で差次的に豊富な分類群が同定された；採取された直腸ぬぐい液の数が限られていたため、生存群と死亡群の患者を健常対照と比較するために合わせた。(B)口腔咽頭ぬぐい液および鼻腔ぬぐい液で同定された差次的に豊富な分類群。赤いセルは、比較群（x軸の2番目に記載）に対して参照群（x軸の1番目に記載）でその分類群が濃縮されていることを示し、青いセルはその分類群が減少していることを示す。アスタリスクは以下のようにFDR調整したP値を示す： *P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。(C）直腸ぬぐい液と口腔咽頭ぬぐい液から得られたいくつかの注目すべき分類群の相対的な存在量を示す代表的な箱ひげ図。
日和見病原体の存在量は、炎症性マーカー、タイトジャンクション透過性、およびSARS-CoV-2ウイルス量と相関する
重症COVID-19のマイクロバイオームが宿主の免疫応答にどのような影響を及ぼす可能性があるかを理解するために、COVID-19患者に濃集していると同定された細菌種の相対存在量と、重症COVID-19を特徴づける血漿バイオマーカーとのスピアマン相関を行った。直腸スワブでは、細菌種Hungatella hathewayiとEggerthella lentaが健常対照と比較してCOVID-19患者で濃縮され、Hungatella hathewayiの相対存在量とIL-6血漿濃度との間に強い正の相関が観察された（r = 0.8、P = 0.003；図7A）が、Eggerthella lentaの相対存在量とどの血漿バイオマーカーとの間にも有意な相関は観察されなかった。口腔咽頭ぬぐい液では、死亡したCOVID-19患者ではScardovia wiggsiaeとVeillonella parvulaが濃縮されており、Scardovia wiggsiaeの相対存在量と血漿中IL-6濃度との間に有意な正の相関が観察された（r = 0. 39、P = 0.044）、IL-10（r = 0.45、P = 0.044）、LBP（r = 0.42、P = 0.044）、および口腔咽頭ぬぐい液のSARS-CoV-2ウイルス量（r = 0.28、0.044；図7B）との間に有意な正の相関が認められた。これらの関連は、COVID-19におけるマイクロバイオームの変化が、微生物の転座と炎症を引き起こす可能性のあるメカニズムを示す証拠となる。
図7
ヒートマップと散布図は、サイトカイン、LBP、ウイルス量、および細菌分類群間の相関を示している。H. hathewayiとIL-6、S. wiggsiaeとLBPの間に有意な関係が見られ、r値とp値が有意性を示している。
図7 重症COVID-19に濃縮された細菌は、炎症性サイトカイン、腸管バリア損傷のマーカー、およびSARS-CoV-2ウイルス量と相関している。直腸スワブ（A）、口腔咽頭スワブ（B）に濃縮された細菌種の相対的存在量と、炎症マーカー、タイトジャンクション透過性、口腔咽頭SARS-CoV-2ウイルス量との相関を示すヒートマップ。統計解析にはスピアマンの順位相関検定が用いられた。アスタリスクはFDR調整後のP値を以下のように示す： *p＜0.05；**p＜0.01。
考察
本研究では、COVID-19の重症化に潜在的に寄与する因子を理解するために、入院中のCOVID-19患者と健常対照者の炎症、微生物転座、脂肪酸、院内検査結果、鼻腔、口腔咽頭、直腸のマイクロバイオームを調べた。我々は、炎症性サイトカインであるIL-6とIL-2の血漿中濃度が重症のCOVID-19で上昇しており、死亡したCOVID-19患者と生存したCOVID-19患者を区別する主要なサイトカインであったことを示した。われわれの結果は、COVID-19患者を対象とした他のいくつかの研究で、血中および糞便中の炎症性サイトカインレベルが高く（11、57、58）、COVID-19の重症化に関与する現象であるサイトカインストームの発症にそれらのサイトカインが関与していることが示されている（10、59）と一致している。さらに、強力な免疫抑制作用で知られる抗炎症性サイトカインであるIL-10(60)は、健常対照と比較してCOVID-19患者で劇的に上昇し、死亡したCOVID-19患者では顕著に高かった。この所見は、重症のCOVID-19患者でレベルが上昇していることを示した他の研究(61-63)の結果と一致している。COVID-19患者におけるIL-10レベルの上昇の臨床的意義は、急速に増加する炎症性メディエーターによって引き起こされる免疫抑制性の負のフィードバックツールであり(64, 65)、組織損傷を防ごうとする試みであると解釈されている(60)。IL-10は従来、抗炎症性サイトカインとして知られているが、初期の急激な上昇は重症のCOVID-19における炎症亢進の特徴であるようであり(66)、IL-10レベルがCOVID-19患者の予後不良と関連することがいくつかの研究で証明されている(13, 63, 65, 67, 68)。このように、我々のデータは、炎症がIL-10反応を促進するという概念を支持しているが、この免疫調節反応は重症COVID-19感染で起こる全身性の炎症を克服するものではない。
血漿中サイトカイン、腸管バリア障害マーカー、循環脂肪酸、病院での検査結果、SARS-CoV-2ウイルス量間の関係をさらに理解するために相関分析を行った。多くの炎症性サイトカイン、主にIL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γの間に強い正の相関が観察され、サイトカインストームの症例にみられるような正のフィードバックループの可能性が示唆された(69)。また、抗炎症性サイトカインIL-10とIL-6、IL-2、TNF-αのようないくつかの炎症性サイトカインとの間に正の相関が観察され、これは負のフィードバックループを支持する可能性がある。さらに、いくつかの炎症性サイトカインは、腸管バリアーの損傷や腸管透過性のマーカーと正の相関を示した。SARS-CoV-2を含むウイルス感染時に産生されるTNF-αやインターフェロンのような可溶性免疫メディエーターは、特に重症のCOVID-19患者のように炎症反応が持続すると、腸管上皮に損傷を与える(70-72)。我々は、IL-6がLBP濃度と強い相関があることを観察し、腸管透過性と微生物の移動が全身性免疫に寄与している可能性を示唆した。興味深いことに、IL-18とタイトジャンクションタンパク質であるゾヌリンとの間にも非常に強い相関が認められた。IL-18は粘膜部位で高発現し、腸管バリアーの維持と免疫の両方に重要である(73)。ゾヌリンとの強い正の相関は、腸管上皮の修復の必要性の増加、あるいは微生物の移動に対する炎症反応を示している可能性がある。アルブミンはIL-6、IL-2、LBP濃度と負の相関があることも観察された。炎症は毛細血管の透過性を亢進させ、アルブミンを間質腔に逃がす(74)。低アルブミン血症はCOVID-19死亡率の予測マーカーとして以前に報告されており(75)、アルブミン輸液を受けたCOVID-19患者はIL-6とIL-2R濃度が低下することが示されている(76)。従って、我々の結果は、IL-6とIL-2による全身性の炎症を緩和するためにアルブミンを使用することを支持するかもしれない。全体として、これらの結果は、重症COVID-19における血漿バイオマーカー間の関係の潜在的な特徴、および全身性炎症と腸管透過性の関係を強調している。
腸内細菌叢とアレルギー、炎症性疾患、呼吸器疾患との関連を示した最近のいくつかの研究(78, 79)が示すように、腸内細菌叢には約1,000種の細菌が生息しており(77)、個人の健康と複雑な関係がある。さらに、口腔マイクロバイオームは、700以上の細菌種を有する2番目に多様性のある身体部位であり(80)、鼻腔マイクロバイオームとともに、いくつかの疾患状態に関与している(81, 82)。我々は、重度のCOVID-19に存在する微生物異常症のいくつかの指標を観察し、微生物異常症を示すCOVID-19の多様性の変化を示した。多くの研究が、COVID-19に関連した日和見病原体の濃縮と常在菌の枯渇について述べている（27、30、46、83）。ここでわれわれは、COVID-19入院患者の直腸ぬぐい液において、健康な対照群と比較して、Eggerthella lenta、Hungatella hathewayi、Actinomyces、Clostridium innocuum group、Eubacterium brachy groupを含むいくつかの日和見病原体の濃縮と、Faecalibacterium prausnitzii、Fusicatenibacter saccharivorans、Dorea、Coprococcus、Ruminococcus、Roseburiaを含む常在菌の減少を観察した。これらのような常在細菌は、腸の恒常性の維持に重要な役割を果たすことが示されており（84, 85）、COVID-19のLBP濃度が著しく上昇していることから、日和見病原体の濃縮とともにこれらの細菌が減少していることは、腸上皮の損傷を反映している可能性がある。口腔咽頭ぬぐい液では、COVID-19患者では乳酸桿菌、ブドウ球菌、Veillonella parvula、Scardovia wiggsiae、Howardellaの濃縮とLeptotrichia、Haemophilus、Fusobacterium periodonticum、Stomatobaculum、Catonella、Selenomonas、Lachnoanaerobaculumの枯渇が観察された。Scardovia wiggsiaeは、新たに同定された口腔病原体(86)であり、う蝕の発症に関連するが、これは酢酸などの酸性化合物を大量に産生する能力とフッ化物に対する高い耐性に起因する可能性がある(87)。生存しなかったCOVID-19患者におけるこの細菌の存在量の増加は、消化管マイクロバイオームに加えて、う蝕と口腔咽頭マイクロバイオームのディスバイオーシスがCOVID-19の重症化に関与している可能性を示唆している。
微生物異常、重症COVID-19、炎症性サイトカインの上昇、腸の完全性マーカー、および微生物の転座の関係を調べた今回の我々の研究も、先行研究を支持するものである。日和見菌の多さはいくつかの炎症性サイトカインと相関することが報告されており（29, 34, 78）、これらがCOVID-19感染におけるサイトカイン応答を制御する潜在的な標的となりうることが示唆される。本研究では、Hungatella hathewayiは血漿中のIL-6濃度と正の相関を示した。同様に、Scardovia wiggsiaeはIL-6、IL-10、LBPおよびSARS-CoV-2の口腔咽頭ウイルス量と正の相関があった。これらの関係から、COVID-19患者における日和見病原体の濃縮は、炎症性サイトカインの産生と上皮タイトジャンクションの破壊を誘発することによって、全身性の炎症と疾患の重症化に寄与している可能性が示唆される。しかしながら、これらのデータは、COVID-19疾患における健康状態を改善するために、腸内および口腔内マイクロバイオームの微生物異常症に対処することが介入のターゲットになりうることを示唆している。これを裏付けるように、無作為化臨床試験では、プロバイオティクスがCOVID-19患者の死亡率の低下や臨床転帰の改善に有効であることが示されているが、COVID-19の発症予防に有効であることは示されていない(88)。これらの試験は、COVID-19の重症度におけるマイクロバイオームの重要性を示している。同様に、糖尿病管理のために頻繁に処方される薬であるメトホルミンは、腸の健康に有利であり、COVID-19患者にとって有効な治療法であることが証明されている（89-94）。したがって、プロバイオティクスやメトホルミンのような粘膜や微生物の健康を改善する治療法の継続的な研究は、COVID-19に対する最適な治療介入を決定する上で非常に重要である。プロバイオティクスや歯科衛生による口腔マイクロバイオームの改善は、COVID-19の治療法として十分に検討されていない。実際、本研究で同定された細菌またはバイオマーカーは、新規感染患者の臨床転帰を予測する能力を調べるだけでなく、COVID-19疾患患者の転帰を改善するための治療を個別化する能力についても調べることができる。
COVID-19パンデミックの初期は非常にストレスの多い病院環境であったため、またサンプル採取方法が任意であったこと、採取時に病院で実施されていた隔離手順のため、いくつかの種類のサンプルは限られた数しか採取されなかった。例えば、死亡したCOVID-19患者からは2種類の直腸スワブしか採取できなかったため、健常対照者、生存患者、死亡患者の間で直腸微生物群集を統計的に比較することは不可能であった。また、この研究に登録された健常対照者の数は合計12人であったが、COVID-19の最初のロックダウン中に健常成人に対して行われた処置が不十分であったため、血漿サンプルは5つしか採取できなかった。さらに、COVID-19感染患者と同様に入院中の肺炎患者との違いを示す可能性のある非COVID入院対照が欠けていた。最後に、健常対照のサンプルサイズと利用可能なメタデータが限られていたため、本研究では年齢、性別、BMI、抗生物質の使用量などの潜在的な交絡変数を調整しなかった。これは、世界的なCOVID-19の流行とそれに伴う強制的な封鎖により、健康なサンプルと関連するメタデータの収集が困難になったために生じた残念な制限である。重症COVID-19に関連する交絡変数がサイトカイン産生および微生物組成に影響を及ぼすことが示されているため、これらの要因に完全に対処する今後の研究が必要である(95, 96)。われわれは、入院中のCOVID-19患者の微生物組成全体におけるこれらの因子のいくつかの影響を調査したが、口腔咽頭マイクロバイオームに対する年齢の影響を除けば、これらが大きな影響を及ぼすとは認められなかった。しかし、このような注意点はあるものの、2020年のパンデミック初期にサンプルが採取された極端な状況を考えると、これらの結果は非常に頑健であり、COVID-19の病原性の根底にあるいくつかのメカニズムを示している。
要約すると、我々のデータは、重症のCOVID-19が、腸管バリアーの崩壊と微生物移動のマーカー、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカイン、循環脂肪酸の変化、直腸、口腔咽頭、鼻腔スワブのマイクロバイオームの崩壊と関連していることを示唆している。われわれの研究は、重症COVID-19の病態生理における微生物異常とその結果生じる微生物転座の重要な役割、および特定の微生物と全身性炎症との潜在的な関係に光を当てるものである。COVID-19のこれらの基盤を理解することで、リスク分類のためのバイオマーカーを同定し、COVID-19の重症化を予防または軽減し、COVID-19患者の管理を改善するための新規戦略を開発するための基盤を構築することができる。
材料および方法
研究デザイン
この横断観察研究では、米国ミネソタ州で2020年5月から10月にかけて、M Health Fairview Bethesda HospitalからCOVID-19で入院した患者86人と非感染対照者12人を登録した。すべての参加者は、全血、鼻腔スワブ、直腸スワブ、口腔咽頭スワブの提供を選択できた。試料採取は任意であるため、表S1にまとめたように、採取可能な試料数は試料の種類ごとに異なる。例えば、12人の健常対照者が登録されたが、このグループで採取できた血漿サンプルは5つだけであった。試験登録終了時までに、17人のCOVID-19感染患者が死亡し、69人が生存した。死亡したグループの患者は生存した患者よりも重症であったと定義する。表1に示すように、人口統計、既往歴、病院での検査結果、入院情報は電子カルテから入手した。
サイトカインおよび腸管バリア障害の測定
全血検体をエチレンジアミン四酢酸（EDTA）抗凝固チューブに採取し、遠心分離により血漿を分離し、-80℃で保存した。血漿中のサイトカイン濃度は、ProteinSimple SimplePlexアッセイ（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-18、TNF-α、IFN-γ）およびMilliplex High Sensitivity T Cell Panel（IL-8、IL-17A、IL-23）を用いて測定した。LBP（cell sciences CKH113）、sCD14（R&D Systems QK383）、ゾヌリン（MyBioSource MBS706368）、およびI-FABP（R&D Systems DFBP20）を含む腸管バリア損傷バイオマーカーは、製造業者のガイドラインに従って市販のアッセイを用いて測定した。未検出値は、各アッセイの検出限界に置き換えた。
血漿中の循環脂肪酸の測定
試料は、以前に記載されたプロトコールを修正したものを用いて処理した(97)。簡単に説明すると、90 µLのEDTA血漿を10 µLの内部標準混合物[各10 mg/mLの重水素化標準物質2.5 µL、アセトニトリル/水(1/1; vol/vol)、最終容量1,000 µL]と合わせた。上清40μLを新しい2mL遠沈管に移し、3-ニトロフェニルヒドラジン20μLおよび1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド溶液20μLと合わせた。サンプルを40℃で30分間インキュベートした後、1,520 µLの水/アセトニトリル（9/1; vol/vol）で希釈した。LC-MS/MS 分析は、Agilent LC-1290 Infinity II (Agilent Technologies, Consumer Electronics Inc, Santa Clara, CA) と Agilent 6495C 質量分析計 (Agilent Technologies, Consumer Electronics Inc, Santa Clara, CA) を用いて、多重反応モニタリング法を用いて分析物を検出しました。クロマトグラフィ分離は、C18 Acquity UPLC BEHカラム（2.1 × 100 mm、1.7 µm）を60℃で使用した。分離の移動相は、A：メタノール/2-プロパノール（1/1、vol/vol）、B：メタノール/水（1/1、vol/vol）。注入量は10 µLで、マイナスイオンモードを使用した。流速は0.5 mL/minで0-4分間、その後0.25 mL/minに減少して4-12分間、残りの12-25分間は最初の流速0.5 mL/minに戻った。溶出は、95%-55% A のリニアグラジエントで開始し、0-4 分間、4-12 分間は 55%-52.5% A のリニアグラジエント、12-15 分間は 52.5%-2% A のリニアグラジエント、15-17 分間は 2% A のアイソクラティックホールド、17-17.1 分間は 2%-95% A のリニアグラジエント、17.1-25 分間は 95% A のアイソクラティックホールドで行いました。検出されなかった値は、サンプルセットで最も低い補間値で置き換えられました。
DNA/RNA 抽出、ウイルス負荷測定、および 16S メタゲノム配列決定
DNA および RNA は、Qiagen AllPrep PowerViral DNA/RNA 抽出キットを用いて、鼻腔、口腔咽頭、および直腸スワブから製造元の指示に従って抽出した。鋳型DNA量は、rRNA遺伝子のV3V4遺伝子座を標的とするV3_357F_NexteraおよびV4_806R_Nexteraプライマーを用いてqPCRを行うことにより決定した。サンプルは必要に応じて水で希釈し、同じV3V4プライマーを用いて25サイクルのPCR反応を行い、アンプリコンを生成した。PCR産物を水で1:100に希釈し、2回目の10サイクルPCR反応を行い、イルミナシーケンスプライマーと互換性のあるDNA領域と、各サンプルの個別バーコードを付着させた。前述のように、サンプルはすべて一意にデュアルインデックス化した(98)。最終PCR産物は、SequalPrepキット（Invitrogen）を用いて正規化し、シーケンスライブラリにプールし、AMPure XPマグビーズ（Beckman Coulter）で洗浄した。シーケンスライブラリーは、2×300 v3フローセル（Illumina, San Diego, CA）を用いてIllumina MiSeqにロードし、サンプルあたり平均87,099リードの深度でシーケンスした。N1およびN2遺伝子のDroplet digital PCR（ddPCR）を用いてSARS-CoV-2ウイルス量を測定した。
病院での検査結果
アルブミン、AST、ALT、LDH、好中球数、クレアチニンキナーゼの病院での検査結果は、入院から退院までの電子カルテから抽出した。患者が検体を提供してから±3日以内の検査結果は、下流の解析のために平均化された。
データ処理
変異領域プライマーは、cutadapt（バージョン4.4）を使用して、脱多重化配列から除去され、その後、R（バージョン4.2.1）でdada2パッケージ（99、100）を使用して、品質フィルター、トリミング、ノイズ除去、およびマージされた。マージされた配列は、V3V4アンプリコンの予想塩基対長以内のものだけを含むようにさらにフィルターされ、アンプリコン配列バリアント（ASV）テーブルの作成に使用された。分類はSILVA v138データベース(47, 101)を用いて割り当てた。シーケンシングリードが1,000未満または16Sコピー/μLが100未満のサンプルは解析から除外した。未割り当てのASV、または古細菌、真核生物、ミトコンドリア、もしくは葉緑体に割り当てられたASV、またはサンプルの5%未満で流行しているASVは削除した。
マイクロバイオーム解析
アルファ多様性については、まずCminを決定するためにSRS.shiny.appを使用し、ランク付きサブサンプリング（SRS）によるスケーリング（バージョン0.2.3）によってサンプルを正規化した。シャノン多様性指数は、マイクロバイオームパッケージ（バージョン1.20.0）を用いてASVレベルで測定し、2群間の差はマン・ホイットニーのU検定で、3群間の差はGraphPad Prism（バージョン9.5.1）を用いてKruskal-Wallis検定後にpost hoc Dunn検定で決定した。β多様性は、ASV表の相対存在量に対するBray-Curtis距離の多次元尺度化によって決定し、veganパッケージ（バージョン2.6-4）のAdonis2関数を用いたPERMANOVAによって検定した。ベータ分散は、Bray-Curtis距離行列によって決定されたグループ分散を用いて、vegan Rパッケージのpermutest関数を用いて検定した。分類群の存在量の差は、MaAsLin2パッケージ（バージョン1.12.0）を用いて、門、属、種の各レベルで、最低30%の有病率を必要とする範囲で決定した。有意に存在量の多い種の相対的存在量と、死亡患者で上昇したバイオマーカーとの間のスピアマン相関は、psychパッケージ（バージョン2.3.3）を用いて実行し、corrplotパッケージ（バージョン0.92）を用いて可視化した。すべてのP値は、有意水準を0.05としてBenjamini-Hochberg法（48）を用いて偽発見率で調整した。鼻腔スワブ、口腔咽頭スワブ、直腸スワブの比較は別々に調整した。
統計解析
統計解析はR（バージョン4.2.3）を用いて行った。各連続変数の分布を可視化し、正規分布か非正規分布かを判定した。2群以上の比較は、Kruskal-Wallis検定に続き、有意な場合は一対のDunn検定を用いた。2群間の比較は、正規分布または非正規分布変数について、両側ウェルチ検定またはウィルコックス検定を用いて行った。カテゴリー変数については、カイ2乗検定またはFisher exact検定を用いて比較した。サイトカイン、腸管バリア損傷マーカー、SCFA、および病院の検査結果間の相関は、スピアマン相関を用いて決定した。教師ありクラスタリングは、MixOmics Rパッケージ（バージョン6.22.0）を用いてsPLS-DAにより行った。すべてのP値はBenjamini-Hochberg法（48）を用いて適切に調整した。
謝辞
著者らは、16SシークエンシングとddPCRを実施してくれたUniversity of Minnesota Genomics Core、サイトカイン濃度測定を実施してくれたUniversity of Minnesota Cytokine Reference Laboratory、統計的サポートをしてくれたUniversity of Minnesota Clinical and Translational Instituteに感謝する。著者らはNichole R. Klatt教授職とミネソタ大学外科学教室に謝意を表する。
構想はC.M.B.、L.S.、N.R.K.が行い、監督はN.R.K.、T.W.S.、C.J.T.、P.J.S.、C.T.B.、T.D.B.が行った、 およびS.E.S.、資金獲得はN.R.K.、調査はC.M.B.、J.S.、R.C.、C.A.B.、C.R.G.、A.V.、T.S.、 およびZ.J.M.、正式な解析はC.M.B.、可視化はC.M.B.、執筆（原案）はC.M.B.およびR.L.、執筆（校閲および編集）はN.R.K.、M.B.およびL.S.が行った
。表S1：各群で使用可能なサンプル。
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Artemisia argyi polysaccharide alysis alleviate intestinal inflammation and intestinal flora dysbiosis in lipopolysaccharide-treated mice
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長期無症候性SARS-CoV-2感染は複数の免疫細胞の欠損と関連している
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