皮膚リーシュマニア症感染のマルチオミクスプロファイリングにより、重症化の根底にある微生物叢主導のメカニズムが明らかになった。

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研究論文
人獣共通感染症
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皮膚リーシュマニア症感染のマルチオミクスプロファイリングにより、重症化の根底にある微生物叢主導のメカニズムが明らかになった。

https://www.science.org/doi/full/10.1126/scitranslmed.adh1469

CAMILA FARIAS AMORIM HTTPS://ORCID.ORG/0000-0001-8249-7265, VICTORIA M. LOVINS, [...], AND ELIZABETH A. GRICE HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-3939-2200 +8著者著者情報&所属
サイエンス トランスレーショナル メディシン
2023年10月18日
15巻 718号
DOI: 10.1126/scitranslmed.adh1469

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編集者サマリー
リーシュマニア症は、サンドフライに刺されることでヒトに感染する人獣共通寄生虫感染症であり、皮膚リーシュマニア症などいくつかの病型を示すことがある。Farias Amorim氏らは、リーシュマニア・ブラジリエンシスに感染した患者62人を対象に、皮膚マイクロバイオームが疾患の転帰に及ぼす影響を検討した。皮膚微生物負荷が大きく、ブドウ球菌属が過剰発現していることは、皮膚リーシュマニア症病変の治癒が遅いことと相関していた。宿主と微生物の転写産物を解析した結果、黄色ブドウ球菌が多い病変では炎症マーカー、特にIL-1βファミリーが多く発現していた。彼らは、黄色ブドウ球菌でコロニー形成され、L. braziliensisに感染したマウスにおいて、皮膚IL-1βが病変の治癒を遅延させることを検証した。これらの知見は、皮膚微生物叢が皮膚リーシュマニア症の治癒に影響を及ぼすことを明らかにし、IL-1βが皮膚リーシュマニア症の免疫療法の標的となりうることを強調している。-クリスティアーナ・N．フォッグ
要旨
リーシュマニア・ブラジリエンシスは寄生虫感染症であり、炎症と皮膚傷害を引き起こし、その臨床転帰は非常に多様で予測不可能である。我々は、リーシュマニア・ブラジリエンシスに感染した62名の患者コホートにおいて、皮膚マイクロバイオームと宿主トランスクリプトームの統合解析を行い、微生物叢が感染によって誘発される炎症反応と疾患の治癒に及ぼす潜在的影響について検討した。その結果、全体的な細菌負荷とブドウ球菌属が優占するマイクロバイオーム構成が、治癒の遅延と炎症反応の亢進、特にIL-1ファミリーメンバーによる炎症反応の亢進と関連していることが判明した。ヒトの病変部における宿主と細菌の転写産物を定量化した結果、病変部の黄色ブドウ球菌の転写産物量が多いことは、治癒の遅延とIL-1βの発現亢進と関連していることが明らかになった。このサイトカインは、黄色ブドウ球菌にコロニー形成されたL. braziliensis感染マウスの病態を制御するのに重要であり、その中和によって病態と炎症が抑制された。これらの結果は、ヒトのマイクロバイオームが皮膚リーシュマニア症の疾病転帰をどのように形成しうるかを明らかにし、炎症性の結果を緩和するための宿主主導の治療への道筋を示唆するものである。
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はじめに
皮膚リーシュマニア症は、サンドフライに咬まれることによって感染する原虫によって引き起こされる人獣共通感染症のひとつである。リーシュマニア感染の臨床症状は非常に多様であり、単発の自然治癒する皮膚病変から、播種性・粘膜症状を含む重篤な慢性潰瘍まで、そのすべてが醜状を呈することがある(1-4)。寄生虫の負荷と宿主の免疫反応は、患者がこの臨床スペクトルのどの位置に位置するかに影響する。最も重篤な病型では、寄生虫を制御しているにもかかわらず、慢性的な炎症が特徴的である(2)。五価アンチモン（Sbv）のような寄生虫を標的とした薬物治療は、一部の流行地域では高い確率で失敗しており、この疾患に対するワクチンは現在のところ存在しない。したがって、破壊的な免疫病理学的反応を引き起こすメカニズムを明らかにすることは、皮膚リーシュマニア症の重症型を改善するための新たな治療標的を提供する可能性がある。
皮膚マイクロバイオームは、皮膚のバリア機能を強化する恒常性維持機構に寄与している(5)。対照的に、リーシュマニア感染によるような皮膚バリアの破綻は、常在細菌叢を乱し、その下の組織を微生物による侵襲にさらす可能性がある(6)。皮膚リーシュマニア症の実験モデルにおいて、皮膚マイクロバイオームが疾患の拡大を促進することを示唆する研究がいくつかある(7-9)。大リーシュマニアに感染した無菌マウスは、従来のマウスで観察された病変よりも小さな病変を発症し、表皮ブドウ球菌を無菌マウスにコロニー形成させると、大リーシュマニア感染マウスの潰瘍発症が回復する(8)。従来の飼育マウスでは、Staphylococcus aureus、S. epidermidis、Staphylococcus xylosusのコロニー形成や共感染は、L. major単独感染と比較して、病変部の病態を促進し、炎症の亢進や病変部におけるinterleukin-1β（IL-1β）やIL-17などの炎症性サイトカインの高発現を伴う(7, 9, 10)。これらの実験モデルは微生物叢の病理学的役割を示唆しているが、これらの知見とヒトリーシュマニア感染症の臨床経過や病変の消失との関連性は不明である。
このギャップを解決するために、我々はリーシュマニア・ブラジリエンシス患者コホートにおいて統合的マルチオミクスメタ解析を行った。病変部および対側皮膚スワブの16SリボソームRNA（rRNA）アンプリコンシークエンシング（16S-seq）を行い、微生物群集を縦断的にプロファイリングした。並行して、病変部の生検を採取してRNA配列決定（RNA-seq）を行い、宿主のトランスクリプトームをプロファイリングし、総細菌負荷を定量化した。病変部の細菌負荷は、無傷の対側皮膚と比較して増加しており、病変部の細菌負荷は炎症性宿主遺伝子発現および治癒遅延と相関していた。病変は16S-seqプロファイルに基づき8つの異なるクラスターに分類されたが、ほとんどはStaphylococcus属の相対的存在量が高いことで定義されるクラスター内に分類された。臨床分離株を用いてカスタム黄色ブドウ球菌パンゲノムを構築し、各病変生検で検出された黄色ブドウ球菌リードを定量化した。黄色ブドウ球菌のリード数が多いことは、細胞溶解をコードする遺伝子やIL-1関連遺伝子の発現の増加と関連していた。我々は、黄色ブドウ球菌のリード数が多い患者で治癒の遅延を認めた。最後に、黄色ブドウ球菌が誘導するIL-1βが疾患の増加に寄与しているかどうかを調べるために、黄色ブドウ球菌の臨床分離株でコロニー形成されたL. braziliensis感染マウスでIL-1βシグナルを中和した。その結果、黄色ブドウ球菌のコロニー形成は、IL-1β依存的に病変の大きさと病態の拡大を促進することが確認された。これらの知見は、皮膚マイクロバイオームがヒトリーシュマニア感染症に影響を及ぼすことを示すとともに、この疾患においてマイクロバイオーム指向の治療戦略を実施し、臨床転帰を改善する可能性を強調するものである。
研究結果
研究デザインとアプローチの概要
微生物叢がL. braziliensis感染患者における皮膚の炎症性免疫反応と臨床転帰に影響を及ぼすかどうかを調べるため、マルチオミクスデータセットの統合解析を行った。L.braziliensis感染患者62人のコホートから収集したサンプルを用いて、以下のデータセットを作成した：(i) Sbv治療前に採取した病変部生検51検体の全トランスクリプトームRNA-seqデータセット、(ii) Sbv治療前および患者のサブセット（受診日30～240日）のフォローアップ受診時に病変部表面から採取したスワブの16S-seqデータセット、(iii) S. (iii)病変部から培養されたS.aureus分離株とそのゲノム配列のライブラリー、(iv)患者のデモグラフィックを含む臨床メタデータ。コホートは女性20人、男性42人で構成され、平均年齢は30歳（範囲：17～56歳）であった。収集された臨床的メタデータには、病変の大きさと位置、遅延型過敏症（DTH）測定値、リンパ節腫脹、治癒までの期間、治療成績が含まれた。ほとんどの場合、同一患者から複数の種類のサンプルが収集された。研究デザインと目録の詳細は図S1、表S1、S2に示す。S1および表S1、S2に詳述されている。
病変部の細菌負荷は宿主の炎症性遺伝子発現の亢進と関連している
L.braziliensis感染における宿主の転写経路を媒介する皮膚マイクロバイオームの役割を調べるため、リーシュマニア病変の生検と非感染者の対照皮膚からRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作成した。RNA-seq解析と並行して、同じcDNAライブラリーを用いて、原核生物の16S rRNA遺伝子を標的とした定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により病変部の細菌負荷を推定した（図1A）。連続的な遺伝子発現差（DGE）解析を行い、病変部の細菌負荷と正の相関を示した148の宿主遺伝子を同定した（線形モデルの傾き係数＞0.2、P＜0.01）（表S3）。この遺伝子リストをジーンオントロジー（GO）解析したところ、炎症性免疫応答に富み、IL-1シグナル伝達経路のメンバー（IL1A、IL1B、IL1RN、IL1R2）をコードする遺伝子や、主に走化性遺伝子のCXCLファミリーに代表される好中球走化性をコードする遺伝子が顕著に関与していた（図1、CおよびD、表S4）。qPCRによって生検で定量されたL. braziliensis負荷量は、総細菌負荷量とは相関しなかった（Spearman rho = 0.002、P = 0.99）。

図1. 病変部の細菌負荷は炎症性遺伝子発現の亢進および治癒期間の遅延と関連している。
(A）パンチ生検からのcDNAライブラリーを用いてRNA-seqを行い、原核生物の16S rRNA遺伝子を標的としたqPCRを行って総細菌負荷を定量化することを説明する概略図。抽出したRNAはcDNA化する前に真核生物のrRNAを除去した。(B）CL病変から採取した生検とL. braziliensisに感染していない健常皮膚（HS）対照検体におけるqPCRによる細菌負荷量の定量。各群の平均値を表し、統計的有意性の算出にはt検定を用いた**P < 0.01。(C) 細菌負荷の連続変数と正の相関を示すDEGsのリストに関するGO BP解析（係数勾配の閾値＞0.2、P＜0.01）。(D）好中球走化性と注釈された遺伝子とIL-1シグナル伝達のメンバーをコードする遺伝子を強調したDEG。(E）細菌負荷の高い病変と低い病変を比較した病変治癒時間の生存曲線。細菌負荷の高い病変と低い病変を分ける閾値は、HS生検で検出されたqPCRレベルに基づいている。統計的有意性の算出にはログランク（Mantel-Cox）検定を用いた。GO BP, Gene Ontology with Biological Processes; ES, enrichment score; DEGs, differentially expressed genes.
われわれの結果は、病変部における高い細菌負荷が炎症性遺伝子発現プログラムを駆動することを示唆しており、L. braziliensis患者の臨床転帰不良に寄与している可能性があると仮定した。健康な対側皮膚における細菌の16S rRNA転写産物量に基づいて、皮膚リーシュマニア症コホートを細菌負荷の高い群と低い群に分け（それぞれn＝26とn＝25の患者）、治癒期間を比較した。細菌負荷の高い患者は治療に対する反応が遅れ（P = 0.05）、一部の病変は300日以上持続した（図1E）。これらの所見は、病変部の微生物叢とそれが皮膚リーシュマニア症に関連する免疫病理に及ぼす潜在的な影響についてさらなる調査を行う動機となった。
病巣微生物叢の群集構造はブドウ球菌が支配的であることが多い。
病変の治癒遅延に関与している可能性のある細菌を同定するために、治療開始前のL. braziliensis患者の病変部および対側皮膚から採取したスワブ検体の微生物叢を、16S-seqを用いてプロファイリングした（図2A）。その結果、皮膚マイクロバイオームはL. braziliensisの感染により、対側皮膚と比較して顕著な影響を受け、シャノン多様性指数で測定した細菌のアルファ多様性は病変部で有意に低いことがわかった（図2B）。微生物群集構造もまた、L. braziliensis感染の影響を受けており、群集間の組成を比較するための統計的手法であるWeighted UniFrac非類似度指標によって算出された（図2C）。ベースライン時（治療前）の病変部で濃縮された細菌分類群を同定するため、病変部と対側皮膚スワブ間の分類群存在量の差分分析を行った。病変部ではブドウ球菌属が最も豊富であり、次いでコリネバクテリウム属とレンサ球菌属が多かった［fold change > 2およびfalse discovery rate（FDRs）<0.05の閾値］（図2D）。我々はまた、患者の対側の非感染皮膚に存在する微生物群集のシグネチャーをとらえ、差次的に多い上位5属をNesterenkonia、Cutibacterium、Kocuria、Micrococcus、Brachybacteriumと同定した（図2D）。これらの属は、プロピオニバクテリウム科、ミクロコッカス科、ダーマバクテリウム科に属し、ヒトの皮膚上に様々な量で一般的に存在する(11)。

図2. L.braziliensisに感染した病変部では、マイクロバイオームプロファイルが明瞭である。
(A）16S-seq解析のために病変部と対側の皮膚部位からスワブを採取した。(B）シャノン指数で細菌のアルファ多様性を評価した。同一患者から採取した病変部と対側の皮膚サンプルを灰色の線で結ぶ。統計的有意性の算出には対のt検定を用いた。(C)重み付けしたUniFrac非類似度指標（コミュニティ間の組成を比較する方法）で実行した主座標分析（PCoA）は、座標1と2に配置した病変部と対側皮膚マイクロバイオームプロファイルを示す。 (D)0日目に採取したすべての病変部と対側皮膚サンプル間の差分分類群存在量分析。オレンジの線は調整P値=0.05を示す。(E) Ward D2凝集法で計算した教師なしHCは、0日目に採取した病変部サンプルを上位10属のマイクロバイオームプロファイル（クラスターM0～M7）でクラスタリングした。病変部における上位10分類群の相対量を積み重ね棒グラフで表した（上）。対側の皮膚におけるマイクロバイオームの相対量は、同じ患者の病変サンプルのすぐ下に示されている（下）。(F）マイクロバイオームクラスター（M0～M7）ごとの病変部および対側皮膚サンプルにおける各タクソンのRAmeansを算出し、円グラフとして可視化した。FC, fold change.
病変部の細菌群集をさらに調べるため、16S-seqデータセットの次元を下げ、最も豊富な10分類群を得た。これらの分類群の相対存在量に基づく教師なし階層クラスタリング（HC）解析により、8つの異なるマイクロバイオーム・プロファイルまたは「クラスター」が明らかになった（図2、EおよびF）。これらのクラスターを定義する閾値は、サンプルごとの相対存在量平均値（RAmean）（図S2A）と、コミュニティ内の優占分類群数（それぞれ、総優占率の80％以上と2分類群以上）のコンセンサスに基づいていた。最も大きなクラスターであるマイクロバイオームクラスター6（M6）には、ブドウ球菌（95％RAmean）による支配的なコロニー形成を示す病変を有する患者16人が含まれていた。次いで、Arcanobacterium（RAmean56％）、Streptococcus（RAmean17％）、Corynebacterium（RAmean11％）、Staphylococcus（RAmean11％）によるユニークなコロニー形成を示した7人の患者を有するクラスターM7、Corynebacterium優位のコロニー形成を示した6人の患者を有するクラスターM5（RAmean80％）； M4はStreptococcus優勢コロニー（RAmean90％）4人、M3はStreptococcusとStaphylococcusの共コロニー（それぞれRAmean40％と60％）3人、LactobacillusまたはFinegoldia優勢コロニー（それぞれRAmean88％と85％）2人であった（Fig. 2、EおよびF）。7人の患者は、分類群が均等に分布し、より多様なマイクロバイオームを示した。これらの患者の病変部マイクロバイオームプロファイルは、対側の皮膚マイクロバイオームにより近く、Cutibacterium（RAmean13％）、Bacillus（RAmean19％）、Kocuria（RAmean13％）などの分類群に富んでいた。この病変のマイクロバイオームクラスターM0は、他のクラスターと比較して不均一な皮膚様マイクロバイオータを有していた（図2、EおよびF）。宿主レベルの因子が皮膚微生物叢に影響を及ぼす可能性があるため、多変量線形回帰分析を用いて、マイクロバイオームクラスターと臨床的メタデータとの間の統計的に有意な関連を同定した。これらの解析では、これらのパラメータ間に統計的に有意な関連は検出されなかった（図S2B）。しかし、コホートの規模が検出の制限因子であることを否定することはできない。これらのデータを総合すると、L. braziliensisによる感染は、病変部の微生物叢を様々な構成に変化させるが、その中でブドウ球菌が最も頻度が高いことは、我々の以前の知見と一致している（9）。
マイクロバイオームプロファイルによる層別化により、臨床的治癒の遅延に関連する徴候が明らかになった。
次に、病変部のマイクロバイオームクラスターが臨床的治癒の遅延と関連しているかどうかを調べた。これらの病変を特徴づける微生物叢は不均一で皮膚に類似しているため、M0クラスターを参照対照とした。M1～M7クラスターとM0クラスターの治癒時間を比較したところ、臨床的治癒が遅れる傾向が観察され、P = 0.09であった（図3A、上）。サンプルをマイクロバイオームクラスター別に層別化すると、M6病変はM0病変に比べて治癒時間が遅れ、P = 0.02であった（図3A、下）。他のマイクロバイオームクラスターは、M0と比較して臨床転帰に有意差はなかった。しかし、これらのクラスターはサンプル数が少なく、統計的検出力が低かった（図S3A）。M6クラスターとM7クラスターの病変部では、M0クラスターの病変部と比較して、qPCRで測定したL. braziliensisの寄生虫量が増加していた（図3B）。このことは、寄生虫量の増加が治療失敗と関連するという我々の以前の知見と一致している（12）。

図3. ブドウ球菌の優勢なコロニー形成は、治癒期間の遅延とマイクロバイオームの回復障害と関連している。
(A)M1～M7クラスターとM0クラスター、およびM6クラスターとM0クラスターを合わせた患者の病変治癒期間の生存曲線。臨床で進行中の臨床試験から別の治療法を受けた患者は考慮せず、臨床転帰に関連する解析にも加えなかった。統計学的有意性の算出にはLog-rank（Mantel-Cox）検定を用いた。(B）qPCRにより測定した、治療開始直前に採取したCL病変からの4mmパンチ生検で検出された寄生虫の絶対数。統計学的検定にはt検定を用いた、**P < 0.01。(C）重み付けUniFrac非類似度分析から算出された成分1を示すPCoA。M6クラスターからの縦断的綿棒サンプル（0日目から180日目まで）と、同一患者の対側皮膚からの綿棒サンプルを含む。患者は、完全治癒に必要なSbvのラウンド数（1ラウンドのSbvと1ラウンド以上のSbv）に従って解析のために分けられた。連結線は同一患者から経時的に採取したサンプルを示す。(D）M0（患者番号55）およびM6（患者番号54）の病変クラスターから撮影した写真の代表的な2例。経時的に評価した16S-seqプロファイリングからの相対存在量円グラフを関連写真の上に示す。
病変部微生物群集の経時的な変化と臨床経過との関係を検討した。初診時（治療前）と経過観察時に採取したスワブサンプルについて、重み付けしたUniFrac非類似度指標を計算した（図3Cおよび図S3B）。この分析をM6クラスターに焦点を当て、1回以上のSbv治療を必要とした患者と1回の治療で治癒した患者を比較した。Sbvを1回投与して治癒した患者では、病変部のマイクロバイオーム構造が60日目までに一貫してシフトし、対側の皮膚コミュニティ構造により近くなった（図3C、左）。Sbvの投与が1回以上必要な患者では、追跡調査終了時までに病変部のシグネチャーが皮膚コミュニティと類似したものに回復することはなかった（図3C、右）。また、治癒に1回以上のSbv投与を必要とした患者は、病変の発生過程を通じて、個々に顕著なマイクロバイオーム構造の変化を示した（図3C）。患者#54と#55を比較すると、これらの動態の一例がわかる。患者#54は、当初M6クラスター（ブドウ球菌優位）であったが、2回のSbv治療を必要とし、150日目まで治癒しなかった。この間、病変部のマイクロバイオームはレンサ球菌優位のコロニー形成（M4クラスターのプロフィールに類似）に移行したが、治癒時には80％のブドウ球菌相対量に戻った（図3D）。対照的に、M0クラスターの患者#55はSbvを1回しか必要とせず、60日目までに治癒し、治癒時にはCutibacterium、Bacillus、Kocuriaなどの健康なマイクロバイオームに関連する分類群からなる皮膚マイクロバイオームを有していた（図3D）。M6患者の対側皮膚から得られた経時的データを用いて算出された重み付けUniFrac非類似度分析では、抗寄生虫薬Sbvは皮膚マイクロバイオームに有意な影響を及ぼさなかった（図S3C）。従って、病変部マイクロバイオームで観察される縦断的な変化は、治療のみによるものではなさそうである。
変化したマイクロバイオームは炎症性病変遺伝子発現の亢進と関連している。
われわれは、病変部マイクロバイオームの構成が異なれば、炎症反応や免疫反応も異なるものになると考えた。これを検証するために、主成分分析（PCA）（図S4、AおよびB）とDGE分析（表S5）を組み合わせて行い、マイクロバイオームクラスターと病変遺伝子発現の関係を調べた（図4）。まずM4、M5、M6、M7クラスターをM0参照クラスターと比較して発現差のある遺伝子（DEG）を同定し（個別解析）、DEGの結果を組み合わせてHCを行い、遺伝子モジュールを同定した。M1～M3クラスターはサンプル数が少ないため、DGE解析は行わなかったが、教師なしHC分類には含まれた。デンドログラムの構造から、2つの主要な遺伝子モジュールが示唆された：M0クラスターで過剰発現した遺伝子を含むモジュール1と、M4からM7クラスターで過剰発現した遺伝子を含むモジュール2である。GO解析の結果、モジュール1は細胞接着、Wntシグナル伝達、神経系発生遺伝子シグネチャーに有意に富み（図4B、上、表S6）、創傷治癒と皮膚修復プロセスの誘導を示唆した。モジュール2は、顆粒球／骨髄球／リンパ球関連走化性、インターフェロン-γなどのサイトカインに対する応答、リポ多糖に対する応答、アポトーシス過程などの自然炎症シグネチャーに有意に富んでいた（図4B下、表S7）。上位10個のDEGを調べると、IL1AやIL1Bを含む炎症関連遺伝子が、M0病変と比較してM1〜M7の病変転写プロファイルで過剰に発現していることが明らかになった（図4C）。これらの所見は、病変部のマイクロバイオームが皮膚のようなM0プロフィールから逸脱することが、炎症性遺伝子発現の亢進と関連していることを示唆している。

図4. 変化したマイクロバイオームは炎症性遺伝子発現の亢進と関連している。
(A）参照クラスターM0とクラスターM4、M5、M6、M7の病変の間で別々のDGE解析を行った。次に、教師なしHC（P < 0.05およびfold change > 1.5）により、その転写プロファイルに従ってすべての病変を分類するために、組み合わされたDEGが用いられた。M1、M2、M3クラスターについては、サンプルサイズが不十分であったため、DGE解析は行われなかったが、教師なしHC分類には含まれた。2つの遺伝子モジュールがピアソンの距離によって捕捉された（モジュール1、オレンジ、モジュール2、青）。(B) (A)の2つの遺伝子モジュールにおいて、BP用語のGO解析を行った。棒グラフはGO遺伝子セットで同定された遺伝子数を表し、カラースケールはBenjamini-Bonferroni多重補正検定によって計算された統計的強度を表す。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001。(C)クラスターM4、M5、M6、M7の病変間でM0と比較して行われた各DGE解析の上位10遺伝子を連結し、HCによる転写プロファイルに従ってすべてのCL病変を分類するために用いた。
宿主の炎症反応の大きさは、病変部の微生物叢のタイプと相関する
すべての異なるマイクロバイオームクラスターで炎症性遺伝子発現シグネチャーが観察されたので、炎症性転写プログラムの大きさと種類がマイクロバイオームクラスターによって異なる可能性があるかどうかを検討した。このことを検証するために、先に述べたデータセット還元的計算ワークフローを用いた（図5A）(12)。簡単に説明すると、統計的検出力を高めるために、病変間で発現が大きく変動する遺伝子に注目し、これを病変に関連する変動転写産物（ViTALs）と名付けた。ViTALsのリストをPCAから主成分（PC）に還元した（図5Aおよび表S8）。次に、これらのPCを多変量線形回帰分析で16S-seq変数および臨床メタデータ変数と関連付けた（図5A）。PC2は、マイクロバイオームクラスターおよびアルファ多様性の指標である観察された運用分類単位（OTU）数を含むマイクロバイオーム変数と最も強い関連を示した（図S5A）。PC2は臨床転帰（1ラウンド以上のSbv）および治癒期間の延長とも関連していた［図5A、（ステップ3）下、および図S5、AおよびB］。PC1はデータセット中のより大きな変動量（26.01％、PC2の13.21％）を占めたが、臨床メタデータやマイクロバイオーム変数とは関連しなかった。そこで、PC2と最も強く関連する遺伝子を定義することに焦点を当てた（図S5B）。

図5. 異なるCL病変部マイクロバイオームは、異なる大きさで炎症性遺伝子発現プロファイルに影響を与える。
(A）本研究に含まれる3つの主要データセット（RNA-seq、16S-seq、および臨床メタデータ）からの出力パラメータを統合するために、データセット次元削減計算ワークフローを実行した。簡単に説明すると、RNA-seqからの遺伝子発現マトリックスを、CL対HSで過剰発現し（ステップ1）、変動係数（CV）によって計算されるCLサンプル間で高い変動性を示す〜400遺伝子のリストに縮小した（ステップ2）。これらの遺伝子はViTALであり、PCA（ステップ3）でさらにPCに縮小された。PCと16S-seqパラメータの間で多変量線形回帰分析が行われ、臨床メタデータにより出力特徴が削減された。(B）PC2関連遺伝子の上位50個をヒートマップで表示し、HCで計算したマイクロバイオームクラスターM4～M7による転写プロファイルの分類。(C) MCP-counterを用いて、RNA-seqデータセットから細胞集団の存在量を推定した。細胞集団の差分解析が行われ、M0に対するM4、M5、M6、M7の結果が倍数変化とP値で表示されている。
PC2に関連する上位50遺伝子には、PRF1、GNLY、GZMB、KIR2DL4などの細胞毒性関連エフェクター分子および受容体をコードする遺伝子が含まれていた（図5B）。これらの遺伝子は、APOBEC3A、ISG15、LILRA3とともに、治療成績遅延の潜在的なバイオマーカーとして以前に同定されている（12）。PC2に関連する他の遺伝子は、CEACAM3、CXCL1、CXCL3のような好中球の走化性やエフェクター機能をコードする遺伝子、IL-1α、IL-1β、オンコスタチンM（OSM）、IL-24、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター（SLPI）のような炎症性サイトカインをコードする遺伝子であった（図5B）。これら上位50のPC2遺伝子は、マイクロバイオームクラスターM6およびM7の病変部で最も高発現し、マイクロバイオームクラスターM0の病変部では最も低発現であった。PC1は臨床転帰やマイクロバイオーム指標とは関連していなかったが、PC1に関連する遺伝子にはB細胞反応関連遺伝子発現パターン（免疫グロブリンおよびB細胞受容体コード遺伝子）が含まれていた（図S5B）。これらの所見を総合すると、病変部の微生物叢、臨床転帰、炎症および細胞傷害性転写シグネチャーの関係は支持されるが、B細胞関連応答との関係は支持されない。
炎症性病変の発現プロファイルはマイクロバイオームクラスターによって大きく異なることが観察されたので、免疫細胞集団も同様に異なる可能性があると考えた。そこで、バルクRNA-seqサンプル中の免疫細胞の絶対量を遺伝子マーカーベースで定量化できるMCP-counter（Microenvironment Cell Populations-counter）法を用いた。M4からM7では、骨髄球、顆粒球、リンパ球細胞集団の頻度がM0に比べて増加していることが観察された（fold change > 0）。細胞傷害性Tリンパ球とナチュラルキラー（NK）細胞は、M0クラスターと比較してM6とM7クラスターの病変部で有意に増加していると推定された（M7ではP < 0.01、M6ではP ≤ 0.05）（図5C）。さらに、CD8+ T細胞はM6クラスターで有意に増加したと推定された（P < 0.05）（図5C）。これらのことから、M6およびM7マイクロバイオームクラスターの病変では、臨床転帰に関連した炎症性転写シグネチャーが発現していることが強く示唆された。
病変部生検における黄色ブドウ球菌は、病原性炎症および治癒期間の遅延と関連している。
我々は、M6およびM7マイクロバイオームクラスターに分類される病変では、炎症性シグネチャーの増強とブドウ球菌の相対量の増加が特徴的であることを見出した。スタフィロコッカス属には、宿主の免疫応答に異なる影響を及ぼす様々な種が含まれる。表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）は、哺乳類の重要な皮膚常在菌であり、組織の恒常性に必要な防御的および適応的免疫応答を媒介する。対照的に、黄色ブドウ球菌は皮膚および軟部組織感染症の最も一般的な原因であり、このコホートの患者の病変部から培養されたブドウ球菌分離株の3分の2を占めている（図6Aおよび表S8）。しかし、16S rRNA遺伝子の短いアンプリコンに基づくブドウ球菌の種や株の分離は困難である。スワブ検体は一般的に非侵襲的であるため、病変部や創傷部の微生物叢の収集には魅力的であるが、組織深部の細菌負荷や生存・複製細菌を反映していない可能性がある。そのため、病変部生検における黄色ブドウ球菌の転写産物を同定するために、洗練されたRNA-seqパイプラインを用いて、その後の解析を病原体である黄色ブドウ球菌に焦点を絞って行った。

図6. 社内S.aureusパンゲノムリファレンスを用いたデュアルRNA-seq解析により、S.aureusの存在量に関連する宿主の炎症性機序の可能性が同定された。
(A）62のCL病変から分離された臨床細菌検体の名前と数。黄色ブドウ球菌属は円グラフに注釈を付けた。(B）CL病変における黄色ブドウ球菌の存在量を定量・推定するための、パンゲノムベースのデュアルRNA-seqワークフロー。51のCL RNA-seqサンプルから得られた非ヒトリードは、13のCL S. aureus臨床分離株と22のS. aureus参照公開株のゲノムからなるパンゲノムリファレンスにマッピングされた。(C）健常な6つのRNA-seq病変サンプルで定量された存在量は、CL病変を黄色ブドウ球菌の存在量が増加するグループに分けるための閾値（log10CPM = 1）となった： S.アウレウス高値病変とS.アウレウス低値病変である。S.アウレウス濃度が過度に高い病変は12例（S.アウレウス++、変化倍率＝18倍）であり、中間の15例（S.アウレウス+、閾値＝2 log10CPM）であった。(D）S.aureus-low病変とS.aureus++および+の存在する病変（S.aureus-ushigh病変）の治癒期間の生存曲線。臨床で進行中の臨床試験から別の治療法を受けた患者は考慮せず、臨床転帰に関連した解析にも加えなかった。統計的有意性の算出にはログランク（Mantel-Cox）検定を用いた。(E）対応する16S-seqマイクロバイオームクラスター分類に従ってCL RNA-seq病変サンプルで定量化された存在量レベル。ピンクの水平線は、HSサンプル（log10CPM = 1）に基づく閾値を示す。統計的有意性の算出にはt検定を使用し、*P < 0.05および**P < 0.01とした。(F)S.aureushigh病変とS.aureuslow病変間のViTALを用いてDGE解析を行った（fold change > 1.5、P < 0.05）。
このコホートの病変から培養された13の黄色ブドウ球菌臨床分離株から、カスタム参照黄色ブドウ球菌パンゲノムを構築し、黄色ブドウ球菌転写産物の検出能力を向上させた（図S6、AおよびB）。これらの臨床分離株はすべてメチシリン耐性であった。全ゲノム配列決定後、これらの分離株は、一般に公開されている黄色ブドウ球菌参照株の22のゲノムとともに、黄色ブドウ球菌パンゲノムを構築するために用いられた（図6、AおよびB、ならびに図S6、AおよびB）。ヒトリファレンスにマップできなかった転写産物は、黄色ブドウ球菌パンゲノムにマップされ、組織負担を推定するために定量化された。感染していない健康な皮膚から採取した生検と比較して、27の病変部（S. aureushigh）で黄色ブドウ球菌の転写産物が上昇していた（図6Cおよび図S6C）。さらに、これらの病変のうち12病変では、中程度のレベルの病変（S. aureus ++）と比較して、約18倍という過剰に高いS. aureus転写物量を発現していた（図6Cおよび図S6C）。これらのS. aureus ++病変は、無傷の皮膚と同程度の量の病変と比較すると治癒が遅れていた（P < 0.05）（図6D）。皮膚スワブではM7クラスターにおけるブドウ球菌の優位性は認められなかったが、これらの患者からの臨床分離株では黄色ブドウ球菌の転写産物量が増加しており、これらの細菌がスワブではアクセスできない深部組織に存在する可能性が示唆された（図6E）。これらの結果から、病変組織で黄色ブドウ球菌の転写産物が検出されることは、臨床的転帰が不良であることを示している。
我々は、病変部において転写活性のある黄色ブドウ球菌に関連する宿主遺伝子の発現プロファイルを調べた。先に作成したViTALSのリストを用いてDGE解析を行い、S. aureusushighとS. aureuslowの病変を比較した（図6Fおよび表S9）。S. aureushigh病変で濃縮された遺伝子には、IL1A、IL1B、CXCL5、CXCL8、GNLY、PRF1、GZMBが含まれ、これらの遺伝子はすべて、マウスにおけるより重篤な疾患や患者における治療失敗と関連していた(12)。さらに、これらの遺伝子はM7およびM6マイクロバイオームクラスターの病変部でも同様に発現が上昇し、これらの病変部では黄色ブドウ球菌の転写産物も高レベルであった。これらの知見は、黄色ブドウ球菌がリーシュマニア病変における炎症と臨床転帰に寄与する潜在的な免疫機構を示す強力な証拠となる。
マウスL.braziliensis感染モデルにおいて、黄色ブドウ球菌はIL-1依存性の病態を媒介する。
ヒト病変における我々の知見に基づき、我々は、黄色ブドウ球菌がリーシュマニア感染によって誘発される炎症性プログラムを増強し、それが疾患の転帰に影響を及ぼす可能性があるという仮説を立てた。これを直接検証するために、我々はB6マウスにL. braziliensis患者から採取した黄色ブドウ球菌をコロニー形成させた（図S6B）。マウスを細菌でコロニー形成した後、L. braziliensisの寄生虫に感染させた（図7A）。黄色ブドウ球菌のコロニー形成により、コントロールマウスと比較して皮膚の厚みが増加した（図7B）。これに対応して、黄色ブドウ球菌が寄生したマウスの病変部では、免疫細胞、特にT細胞（CD4＋およびCD8＋細胞）と好中球の増加が認められた（図7Cおよび図S7）。これらの結果は、黄色ブドウ球菌のコロニー形成が、過剰な炎症反応を促進することによって、マウスの疾病を増加させることを示している。S.aureusのレベルが上昇したヒト病変生検では、IL-1ファミリーをコードする遺伝子の転写が亢進していることがわかったので、次にIL-1βまたはIL-1レセプターをブロックして、マウスで観察された病態の亢進にどちらかが必要であるかどうかを調べた。その結果、IL-1βまたはIL-1Rを中和すると、疾患の重症度が有意に減少することがわかった（図7、BおよびC）。IL-1シグナルの枯渇は病態を軽減したが、同時に黄色ブドウ球菌の増殖がみられた（図7D）。この結果は、病態が細菌の直接的な影響ではなく、免疫介在性のものであることを示している。抗IL-1β抗体または抗IL-1R抗体で処置したマウスでは、寄生虫の負荷に有意な変化は見られなかった（図7E）。これらの結果から、IL-1はマウスにおけるS. aureus支配病変の重症度を高める重要な因子であり、IL-1がヒト皮膚リーシュマニア症に適用可能な治療標的となりうることが示唆された。

図7. S. aureusとL. braziliensisの同時感染はIL-1依存的に炎症反応を亢進させる。
(A）C57BL/6マウスにおけるS. aureusおよびL. braziliensis（L.b）治療プロトコールを、第1段階：S. aureusコロニー形成前、第2段階：L. braziliensis感染コースに分け、モノクローナル抗体を用いてIL-1βおよびIL-1Rを遮断した模式図。アイソタイプIgGを対照治療として用いた。示されたデータは、2回の実験の代表的な1回分のものである（各群4〜5匹）。(B）マウスにおける経時的な耳の厚さの測定。(C）コイン感染した耳から回収したCD45+、CD90.2+、Ly6G+、CD4+、およびCD8+細胞の数。(D)6週目の異なる治療群の耳における、回収されたピンク色の黄色ブドウ球菌のコロニー形成単位（CFU）と(E)寄生虫負荷。統計学的有意性にはノンパラメトリックMann-Whitney検定を使用した、*P < 0.05、**P < 0.01。バイオリンプロットおよび中央値はプロットで表した。NDは未定。
考察
L.braziliensis感染症は慢性潰瘍性病変と関連しており、寄生虫を標的とした薬物治療に対する反応は不良である(1-4, 13)。治療の失敗には複数の要因が関与していると考えられるが（13, 14）、そのひとつに、CD8+ T細胞やNK細胞を介する細胞溶解経路のアップレギュレーションがあり、その結果、インフラマソームの活性化とIL-1βの産生が引き起こされる（12）。ここでは、皮膚マイクロバイオームの変化も治療成績に影響することを示す。我々は、L. braziliensisに感染した62人の患者を含むマルチオミクスデータセットを解析し、皮膚マイクロバイオームをプロファイリングし、宿主の遺伝子発現や臨床的メタデータと関連付けた。その結果、L. braziliensisに感染した患者の多くは、病変部の皮膚マイクロバイオームが変化しており、ブドウ球菌が最も多かったが、少数の患者ではコリネバクテリウム、レンサ球菌、アルカノバクテリウムが優勢であった。細菌負荷と細菌群集構造の両方が治癒期間に影響を及ぼし、黄色ブドウ球菌は臨床転帰の遅延に関連する重要な菌種であった。また、黄色ブドウ球菌のレベルが高い患者では、IL-1αやIL-1βを含む炎症性遺伝子の発現が増加していた。最後に、S. aureusでコロニー形成されたマウスでIL-1βシグナルを中和すると、L. braziliensis感染後のIL-1依存性病態が減少した。これらの結果から、リーシュマニア病変部における皮膚マイクロバイオームが疾患の進行に影響を及ぼし、IL-1レベルの上昇によって治癒が遅れる可能性が示唆される。
皮膚リーシュマニア症患者における皮膚マイクロバイオームと臨床転帰との関連を評価するため、16S-seq解析により病変部および非罹患皮膚（同一患者の対側皮膚）の微生物組成をプロファイリングした。このコホートの患者のほとんど（84％）が、病変部のマイクロバイオームに変化を生じていた。しかし、少数の患者（16％）は、罹患していない皮膚と同様に、より多様な細菌群集を維持していた。このため、これらの患者における宿主の転写反応を、マイクロバイオームが変化した病変部で観察されたものと比較することができた。マイクロバイオームが変化した病変は、7つの異なる群集構造（M1～M7）と関連していたが、最も一般的なのは、ブドウ球菌が優勢にコロニー形成していることであった（M6、このコホートの患者の36％を含む）。病変部から分離培養された臨床検体の数で評価すると、ブドウ球菌は病変部から最も分離に成功した属であった。この観察結果は、ブドウ球菌がL. braziliensisによる潰瘍に特に効率よく定着することを示唆している。このことは、L. braziliensis感染患者の別のコホートにおいて、われわれ（9）および他の研究者（15-17）が以前に報告している通りである。
我々は、皮膚リーシュマニア症におけるマイクロバイオームと宿主の転写プロファイルの相互作用を調べるために、いくつかの計算機的アプローチを用いた。ひとつは、我々のデータセット（16S-seq、RNA-seq、臨床メタデータ）の次元を小さくするための一連のフィルタリングステップを行い、それらの主要な側面（マイクロバイオームクラスターと臨床転帰）を統合し、多変量線形回帰分析によって宿主遺伝子発現と関連づけた。また、社内の黄色ブドウ球菌パンゲノムリファレンスを用いてデュアルRNA-seq解析を行い、各病変における細菌の転写量を推定した。これらの計算機的アプローチにより、皮膚リーシュマニア症では、黄色ブドウ球菌の存在量とマイクロバイオーム組成の変化の両方が観察されることがわかった。さらに、定量的要因（総細菌負荷量およびS.aureusレベル）および定性的要因（特定のマイクロバイオームコミュニティ構造）と、いくつかの炎症性遺伝子の増加との間に統計学的に有意な相関があることを同定した。IL-1β遺伝子の高発現は、リーシュマニア病変における細菌の変化と、治療に対する反応の遅延と関連していることを明らかにした。さらに、IL-1βはS. aureusおよびL. braziliensisに感染したマウスの疾病を増加させることを示した。これらの所見は、S. aureusがIL-1依存的にリーシュマニア症の免疫病理に寄与していることを示している。病態を促進するIL-1のこの役割は、実験的マウスリーシュマニア症における他の研究(18-24)や、L. braziliensis患者の病変におけるIL1Bレベル（IL1Aではなく）が治療失敗の予測因子であることを見出した我々のヒトでの研究(12)と一致している。私たちは以前、IL-1β依存性の病態を引き起こす2つの経路を同定した。その1つはIL-10の遮断に依存し、寄生虫数は減少するがIL-1β依存性の病態は増加する経路である(24)。もう一つの経路は、細胞死を促進する細胞溶解性T細胞によって開始され、NLRP3の活性化とそれに続くIL-1βの放出につながる(22, 25)。ここでわれわれは、IL-1βに依存する疾患の増加につながる新たな経路として、調節不全の皮膚マイクロバイオームがあることを示した。
高レベルの黄色ブドウ球菌を持つ患者の生検では、PRF1、GZMB、GNLYをコードする遺伝子などの細胞溶解性遺伝子の発現が上昇していた。S.aureusの増加は治癒の遅延と関連していたため、細胞溶解遺伝子もまた発現が上昇していたことが予想される。このように、他の状況では細胞溶解経路がある種の細菌の制御を促進することがあるが(26)、このコホートではそうではなかったようである。むしろ、細胞溶解性T細胞が介在する組織損傷が、この患者集団に黄色ブドウ球菌が侵入し複製するための環境を提供しているのかもしれない。このことは、黄色ブドウ球菌が壊れた皮膚や軟部組織をコロニー形成する能力と一致する(27, 28)。しかし、S. aureus優勢病変における細胞溶解とIL-1の両方に関連する遺伝子の濃縮は、S. aureusのコロニー形成と感染を合併する他の皮膚疾患と比較して、L. braziliensis感染患者の特徴である。Fyhrquistら(27)は、アトピー性皮膚炎(AD)と乾癬の皮膚について同様の解析を行ったところ、ADの皮膚は高レベルの黄色ブドウ球菌を示し、Tヘルパー2(TH2)に関連した炎症経路の転写活性化を伴っていた。この研究ではTH2遺伝子の発現は明らかでなかったので、黄色ブドウ球菌は状況に応じて異なる炎症反応と関連しうるようである。微生物叢が変化した患者では、イタコン酸（Irg1）をコードする遺伝子ACOD1の発現上昇が観察された。他の文脈では、イタコン酸はインフラマソームの活性化と下流のIL-1β放出を阻害することが報告されている(29)が、ACOD1が高レベルのサンプルではIL1Bの低発現は観察されなかった。しかし、黄色ブドウ球菌がイタコン酸を増加させ、それが細菌の殺傷を制限することも報告されており、ブドウ球菌負荷の増加に関与している可能性が示唆されている(28)。
マウス実験ではIL-1β/IL-1Rの遮断は寄生虫負荷に影響を与えなかったが、ブドウ球菌のマイクロバイオームが優勢な一部の患者（M6）の病変では、L. braziliensisの負荷が増加していた。寄生虫と特に黄色ブドウ球菌との間の複雑な生態学的・生物学的関係の可能性は、患者においては研究されておらず、宿主の遺伝学、免疫応答、細菌株などがすべて患者における寄生虫の増加（あるいはその逆）に関与している可能性があるが、近交系マウスでは再現できないかもしれない。
ブドウ球菌優位のプロファイルに加え、患者によってはあまり観察されない微生物叢の構成も観察された。例えば、あるマイクロバイオームクラスターはアルカノバクテリウム属（M7クラスター）によって特徴づけられ、我々はリーシュマニア病変からアルカノバクテリウム・ヘモリチカムの培養と単離に成功した（表S5）。これらの患者の病変部では、生検サンプルの全コホートと比較して、細胞溶解関連遺伝子やIL-1α/βコード遺伝子を含む異常な炎症性遺伝子発現が認められた。さらに、これらの病変では黄色ブドウ球菌と寄生虫が最も多く見られた。A. haemolyticumは、糖尿病性足潰瘍のような慢性創傷(30)や、免疫不全集団（癌やその他の悪性腫瘍、リウマチ、高血圧、痛風）の軟部組織感染症(30)で、S. aureus、Corynebacterium diphtheriae、A群、C群、G群のb-溶血性連鎖球菌とともに検出される(30, 31)。A. haemolyticumはホスホリパーゼDを産生し、S. aureusに関連した溶血から身を守っている。このような特異的な微生物叢の構成が、他の皮膚感染症に関連する免疫反応に与える影響については、ほとんど知られていない。A. haemolyticum患者のサンプル数は治癒遅延と関連付けるには少なすぎたが、我々の結果は、リーシュマニア病変におけるA. haemolyticum-S. aureus群集が臨床的な疾患経過に特に有害な影響を及ぼす可能性を示唆している。本研究の限界は、病変部のマイクロバイオームがブドウ球菌優位でなかった患者のサンプル数が比較的少なかったことであり、このため、これらの患者における宿主の遺伝子発現と臨床転帰の包括的評価を提供することが制限された。
皮膚リーシュマニア症は、宿主と寄生虫の複雑な相互作用を特徴とする感染症である。ここでわれわれは、皮膚リーシュマニア症が皮膚マイクロバイオームの顕著な変化をもたらすことを証明した。臨床検体と実験的マウス感染を用いた統合的アプローチを用いて、リーシュマニア感染症の転帰にマイクロバイオームが重要な役割を果たすことを直接的に証明した。多くの流行地域でSbvに対する耐性菌が増加しており、代替治療戦略の探索は極めて重要である。ここでは、アナキンラやヒト化抗IL-1βカナキヌマブ(22)のような、皮膚リーシュマニア症で見られる炎症反応を軽減するIL-1を標的とした免疫療法を支持する新たな証拠を提供する。さらに、我々の結果は、抗生物質、プロバイオティクス、およびリーシュマニア病変のケア戦略の改善によって達成されるかもしれない、患者の皮膚マイクロバイオームに影響を与える新たな治療法の根拠となる。
材料と方法
研究デザイン
ブラジルのバイーア州コルテ・デ・ペドラにあるリーシュマニア症レファレンスセンターで、L. braziliensis患者からサンプルとメタデータを収集した。リーシュマニア症の診断は、PCR法によるL. braziliensisのDNAの証明、寄生虫の分離、または典型的な病変と以下のいずれかによって行われた： リーシュマニア抗原に対するDTHおよび病理組織検査。除外基準には、抗リーシュマニア治療歴のある者、18歳未満の者、妊娠中の者、他の合併症のある者、HIVの血清学的検査が陽性である者が含まれた。研究参加者からインフォームド・コンセントを得た後、病変の計測と写真撮影を行った。病変部と対側の皮膚は、16S-seqマイクロバイオームプロファイリングと細菌分離株の取得のために綿棒で採取した。病変の境界からパンチ生検を採取し、RNAlater（Thermo Fisher Scientific、#AM7020）に保存した。健常対照者の生検も追加で採取した。ほとんどの場合、同じ患者から異なる種類のサンプルが採取された。スワブと生検の採取後、患者には標準治療（Sbvを毎日静脈注射；20 mg/kg/日を20日間）が行われた。30日目および治療後30日ごとに病変の消失を評価し、治癒を評価した。少数の患者コホートでは、30～210日目に16S-seqマイクロバイオーム・プロファイリング用のスワブと病変部の写真を採取した（図S1）。本研究は、ヘルシンキ宣言に規定された原則に従い、現地の倫理ガイドライン（ブラジル、バイーア州サルバドールのバイーア連邦大学医学部倫理委員会およびペンシルバニア大学施設審査委員会#2.867.123）に従って実施した。
綿棒の処理と16S-seqによるマイクロバイオーム・プロファイリング
病変部および対側皮膚からのスワブ検体は、滅菌した0.15M NaClに0.1% Tween 20を加えた1×リン酸緩衝生理食塩水で採取し、-20℃で保存した。32の陰性対照綿棒サンプルは、患者が受診したのと同じ部屋で空気に触れており、「環境」サンプルと呼ばれる。これらのサンプルは、患者の募集と本研究への参加を通じて収集された。綿棒からのゲノムDNA抽出、ライブラリー調製、綿棒検体からの16S-seqはすべて、フィラデルフィア小児病院（CHOP）のPennCHOPマイクロバイオームプログラムのHigh-throughput Sequencing and Analytical Coreで行われた。核酸精製用ロボットワークステーションQIACube HT（Qiagen社製）とDNeasy 96 PowerSoil Pro QIAcube HTキット（Qiagen社製、#47021）を用いて、標準プロトコールに従ってDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子V1〜V3領域の増幅は、フォワード5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′およびリバース5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′のプライマーを用いて行い、次いでライブラリーの調製、定量およびプーリングを、以前に記載されたように行った(9)。シーケンシングはIllumina MiSeqで300-bpペアエンドケミストリーを用いて行った。環境汚染の可能性を評価するため、抽出ブランクとDNAを含まない水を同じ増幅・精製手順にかけた。環境対照サンプルで検出されたカウント数（<896カウント）を下回る総カウント数が配列決定されたサンプルは、さらなる解析から除外された。QIIME2パイプラインは、qiime2 q2cliバージョン2020.8.0を使用して、16Sシーケンスデータの処理および解析に使用された。簡単に言うと、サンプルはdemuxを用いて多重化解除し、Dada2を用いてノイズ除去した。配列をmaaftで整列し、系統樹をfasttreeで再構築した。Shannon Indexのα多様性指標はα-group-significanceを用いて推定した。加重UniFracおよびBray-Curtisβ多様性指標は、サンプルあたり896リードに希釈した後、core-metrics-phylogeneticを用いて推定し、P値はBenjamini-Hochberg FDR補正を用いて多重仮説検定用に調整した。分類は、Silva rRNA reference database, version 138 (silva-138-99-nb-classifier.qza)に対してq2-feature-classifier classify-sklearnを用いて配列に割り当てた。分類群は属に折りたたんだ。データセット全体の少なくとも5%に存在しないOTUはフィルターで除外した。微生物群のクラスタリング分類は、上位10分類群対病変サンプルのマトリックスにおいて、HCおよびWard D2凝集法を用いて、アンターゲッティングの方法で行った。
生検処理およびRNA-seq遺伝子発現プロファイリング
患者の開放性潰瘍の境界および非感染ボランティアの健常皮膚から採取した皮膚生検をMP tissue homogenizer（MP Biomedicals）でホモジナイズし、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を用いてRNAを抽出した、 #74034 ）を用いて抽出し、真核生物の細胞質およびミトコンドリアrRNA枯渇のためのRibo-Zero Gold付きIllumina TruSeq Total Transcriptomeキット（Illumina）を用いてcDNA配列対応ライブラリーを調製するために使用した。RNA調製物およびライブラリーの品質評価および定量は、それぞれAgilent 4200 TapeStationおよびQubit 3を用いて行った。サンプルは、Illumina NextSeq 500でシーケンス深度を高めるために5回シーケンスし、生検サンプルあたり平均総シーケンス深度4,200万リードの75bpシングルエンドリードを作成した。生のリードをKallistoバージョン0.46.0を用いてヒト参照トランスクリプトーム（Ensembl; Homo sapiensバージョン100）にマッピングし、MultiQC v.18を用いてアライメントの質をチェックした。その後の解析はすべて、統計計算環境Rバージョン4.1.0、RStudioバージョン1.4.1717、Bioconductorバージョン3.13を用いて行った。簡単に言うと、転写産物の定量データはBiomaRtとtximportパッケージを使って遺伝子にまとめられ、edgeRのtrimmed mean of M valuesメソッドを使って正規化された。少なくとも6サンプル（レプリカの最小グループ、健康な皮膚のサイズ）において＜1カウント／ミリオン（CPM）の遺伝子はフィルターで除外された。正規化されたフィルターデータは、limmaのvoom関数を用いて分散安定化され、DGE解析は、Benjamini-Hochberg FDR補正を用いて多重検定を補正した後、limmaを用いた線形モデリングで行われた。DGE解析は、3サンプル以上のマイクロバイオームクラスター間（M4～M7対M0）で行った。GO解析は、National Institute of Allergy and Infectious Diseases/National Institutes of HealthのDAVID Bioinformatics Resources (2021 Update)と生物学的プロセスの用語、およびReactome、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes、Biocarta Pathway Databaseを時折用いて実施し、アノテーションの類似性によって遺伝子セットをクラスタリングした。RNA-seqデータセットから細胞集団の存在量を推定するために、MCP-counter（33）とimmunedeconv（34）のRパッケージを組み合わせた。ログランク（Mantel-Cox）検定による生存曲線は、GraphPad Prismバージョン8で実施した。
次元削減ワークフローとデータセットの統合
本研究に含まれる3つの主要データセットの次元を縮小し、主な出力パラメーターを統合多変量線形回帰分析に使用した。次元削減のワークフローと出力パラメータは以下の通りである： (i)サンプル対遺伝子マトリックスにマッピングされた約17,000のヒトコーディング遺伝子の生検全トランスクリプトームRNA-seqは、病変サンプル間の「病変に関連する可変転写産物」（ViTALs）の401遺伝子リストに還元された。このパイプラインは以前の報告(12)に記載されており、Code Ocean (https://doi.org/10.24433/CO.5903311.v1)にアーカイブされたドッカー化コード "capsule "で再現可能である。(ii)0日目に採取されたサンプルからの全スワブ16S-seqデータセットは、QC前処理後の患者サンプルの約30,000 OTUマトリックスから開始され、低存在フィルタリングステップの後、86の個々の上位頻度属に折りたたまれ、病変サンプル中の上位10個の豊富な分類群に縮小され、最後にWard D凝集法（M0～M7）を用いた教師なしHCによって8つのマイクロバイオームクラスターに出力された。また、スワブサンプルあたりの観察されたOTU数とShannon Indexもマイクロバイオームパラメータとして含まれた。(iii) 臨床メタデータのパラメータは、カテゴリー変数（臨床転帰：Sbvラウンド1回以上、性別、リンパ節腫脹の有無）および連続変数（治癒時間（日）、病変サイズ（平方ミリメートル）、年齢（歳））である。これらの出力パラメータは、rexposomeフレームワーク(35)を用いて統合した。rexposomeの出力は、tidyverse Rパッケージを用いてRプログラミング言語で可視化のためにモデル化した。
黄色ブドウ球菌分離株ライブラリー、汎ゲノム参照、および皮膚生検における黄色ブドウ球菌存在量の定量化
細菌分離株はスワブで採取し、直ちに凍結培地［オートクレーブで濾過したトリプティックソイブロス（TSB）を脱イオン水に溶解し、1％滅菌Tween 80％と15％グリセロールを加えたもの］とともに-20℃のクライオチューブに保存した。細菌同定のため、綿棒をTSBから取り出し、37℃で一晩、血液寒天プレート［羊血液プレート付きトリプトン大豆寒天（TSA）］（Remel, R01201）にストリークした。形態学的にユニークなコロニーを血液寒天培地プレート上で下培養し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間法（Pennsylvania Animal Diagnostic Laboratory System, New Bolton Center）を用いて個々の細菌種を同定した。同定後、黄色ブドウ球菌分離株はショートリード全ゲノム配列を決定した。Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit（Zymo Research、#D6005）を用いて黄色ブドウ球菌DNAを抽出・精製し、PennCHOP Microbiome CoreでショートリードペアエンドIllumina Hiseq 2500シーケンスした。社内の黄色ブドウ球菌パンゲノムは、皮膚リーシュマニア症分離株と一般に入手可能な黄色ブドウ球菌参照ゲノムを用いて構築し、Roary（表S2）を用いてコア遺伝子とアクセサリー遺伝子を同定した（36）。S.aureus転写物の同定と定量は、KneadDataを用いてヒトのリードをフィルター除去した後のリードをS.aureusパンゲノムにマッピングすることにより、CL病変のRNA-seqファイルで行った。RNA-seq病変サンプルあたりのS. aureus量は、100万（非ヒト）リードあたりのマッピングカウント数を表す。
qPCRによる皮膚生検の細菌負荷の定量化
病変部RNA-seq転写プロファイリングに用いたのと同じcDNAライブラリーから、qPCRにより細菌負荷を定量した。標準曲線を作成し、続いて黄色ブドウ球菌（subsp. aureus Rosenbach, 502A, American Type Culture Collection #27217 ）のcDNAライブラリーを用いた。このS. aureus標準曲線では、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen、#74034）を用いてRNAを抽出し、High-Capacity RNA-to-cDNA Kit（Applied Biosciences）を用いてcDNA化を行った。qPCRは、Power SYBR Green Master Mix（Applied Biosciences）と16Sリボソームサブユニットを標的とするプライマー（357F_534R；フォワード5′-CTCTACGGGAGGCAGCAG-3′およびリバース5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）を用いて、ViiA 7マシン（Applied Biosciences）で行った（37, 38）。qPCRの結果は、最初の生検組織重量に対して正規化した。反応はすべて二重に行い、データは生検1ミリグラム当たりピコグラムで表した。
qPCRによるCL皮膚生検における寄生虫負荷の定量化
CL病変部生検におけるL. braziliensisの寄生量は、前述の方法で定量した（12）。
黄色ブドウ球菌のコロニー形成とL. braziliensis感染
C57BL/6マウス（雄性、6～8週齢）に、滅菌綿棒を用いて懸濁した黄色ブドウ球菌（108～109コロニー形成単位、患者番号50のCLSA50）を、10日目に1回、15日目にL. braziliensis感染と同時に1回、その後治療プロトコール期間中は1週間に1回、合計4日間毎日、耳と背中に300mlまで塗布して局所的に関連付けた。発表された研究結果や予備的なデータから、1群あたり4～5匹のマウスで病変の大きさの有意差を検出できることがわかった。感染には、Ficoll（Sigma-Aldrich）密度勾配遠心法によりL. braziliensisのメタサイクリックプロマスチゴートを分離し、106匹のL. braziliensis寄生虫を耳内に皮内注射した。一部のマウスに500μgの抗IL-β抗体、抗IL-1R抗体、またはアイソタイプ免疫グロブリンG（IgG）抗体（BioXcell社、#BE0246、#BE0256、#BE0297）を実験期間中、週2回注射した。病変は耳の厚さでモニターした。寄生虫数は限界希釈アッセイで行った。すべての実験は、ペンシルバニア大学の機関動物飼育使用委員会（#804512）の承認を得た。
組織処理とフローサイトメトリー解析
単細胞懸濁液を調製するため、耳の腹側および背側シートを軟骨から分離し、Liberase TL（0.25 mg ml-1; Roche Diagnostics, #5401020001 ）を含む1ml容量のRPMI 1640（Sigma-Aldrich、#R7388）中、37℃のCO2インキュベーターで90分間インキュベートした。消化した耳を3mlのシリンジに通し、単細胞懸濁液とした。細胞を70μmのナイロンメッシュで濾過し、蛍光活性化細胞選別（FACS）バッファーで1500rpm、5分間洗浄した。細胞をFACSバッファーに懸濁し、さらに分析した。表面染色には、以下の抗体をFACSバッファーで1:100希釈し、メーカーの仕様書に従って使用した： CD45（30-F11、eBiosciences）、CD3（17A2、eBiosciences）、CD90.2（53-2.1、eBiosciences）、βTCR（H57-597、eBiosciences）、CD4（RM4-5、BioLegend）、CD8（YTS5167.7、eBiosciences）、CD11b（M1/70、eBiosciences）、Ly6G（1A8、eBiosciences）、Ly6C（AL-21、BD Pharmingen）。細胞の計数には、AccuCount Fluorecent particles（Spherotech社製）を用いた。染色された細胞はBD FACSymphony A3（BD Biosciences社製）で処理され、取得されたデータはFlowJoソフトウェア（Tree Star社製）を用いて解析された。
謝辞
本研究における患者スクリーニングとサンプル採取を支援してくれたブラジル、バイーア州サルバドールのCorte de Pedraのスタッフに深く感謝する。
資金提供 この研究は、米国国立衛生研究所から資金提供を受けた（P.S.とE.A.G.にはR01AI143790、E.A.G.にはR01NR015639、F.O.N.にはR01AI162711、 およびE.M.C.にP50AI030639）、Penn Skin Biology and Disease Resource-based Center（Penn SBDRC supported by NIH/NIAMS P30AR069589 to E.A.G. )、国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS F31AR079901 to V.M.L. and F31AR079845 to J.C.H.)、Penn Dermatology Research T32 Training Grant NIH/NIAMS (T32AR007465 to J.C.H.)。
著者貢献： C.F.A.、D.P.B.、F.O.N.、E.A.G.、P.S.が研究の構想を練った。C.F.A.、V.M.L.、T.P.S.、F.O.N.、A.S.L.、L.P.C.、J.C.H.は方法論の開発と統計的検定に参加した。C.F.A.、V.M.L.、T.P.S.、F.O.N.、J.C.H.、D.P.B.、P.S.、E.A.G.が調査に参加。C.F.A.はデータの可視化を開発した。E.M.C.、D.P.B.、F.O.N.、L.P.C.、P.S.、E.A.G.が資金を獲得。C.F.A.、D.P.B.、E.A.G.、P.S.がプロジェクトを管理した。C.F.A.、D.P.B.、P.S.、E.A.G.が研究を監督した。C.F.A.は原案を執筆した。C.F.A.、D.P.B.、P.S.、E.A.G.が最終原稿の執筆、査読、編集を行った。
競合利益： 著者らは競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 本研究に関連するデータはすべて論文または補足資料に掲載されている。バルクRNA-seq GEO BioProject PRJNA885131、16S-seq、S. aureus臨床分離株の全ゲノムシーケンス SRA BioProject PRJNA922957。シェルスクリプトとメインRスクリプトはGitHub https://github.com/camilafarias112/Amorim_LeishMicrobiome で入手可能。DGE解析およびGO解析の表は、補足表として本原稿に掲載されている。
補足資料
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参考文献および注釈
1
P. ケイ、スコット、リーシュマニア症： 宿主と病原体の接点における複雑性。Nat. Rev. Microbiol. 9, 604-615 (2011).

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2
P. Scott, F. O. Novais, 皮膚リーシュマニア症： 皮膚リーシュマニア症：防御と発症における免疫応答。Nat. Rev. Immunol. 16, 581-592 (2016).
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論文誌
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3
M. P. Oliveira-Neto, A. Schubach, M. Mattos, S. C. Goncalves-Costa, C. Pirmez, アメリカ皮膚リーシュマニア症患者159人における低用量アンチモン治療： 広範な追跡調査（10年まで）。Am. J. Trop. J. Trop. Med. Hyg. 57, 651-655 (1997).
クロスリファレンス
パブコメ
ISI
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4
A. アンガー、S.オニール、P.R.L.マチャド、L.H.ギマランイス、D.J.モーガン、A.シュリーファー、O.バセラ、M.J.グレスビー、E.M.カルバーリョ、ブラジル北東部における潰瘍発症前のアメリカ皮膚リーシュマニア症の治療と高率の失敗との関連。Am. J. Trop. J. Trop. Med. Hyg. 80, 574-579 (2009).

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