腸管上皮のBLT1が粘膜修復を促進する

研究論文GastroenterologyInflammation Open Access | 10.1172/jci.insight.162392

腸管上皮のBLT1が粘膜修復を促進する
林 周作1,2 Chithra K. Muraleedharan1 奥 牧人2 Sunil Tomar1 Simon P. Hogan1 Miguel Quiros1 Charles A. Parkos1 Asma Nusrat1
著者注：MQ、CAP、ANは共著者、共同責任者。

2022年10月27日掲載 - 詳細はこちら

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要旨
腸管の急性・慢性炎症は，上皮障害を伴い，腸管にびらんや潰瘍などの粘膜の傷をもたらす。腸管上皮細胞（IEC）や創傷環境中の免疫細胞は、サイトカインや脂質メディエーターを分泌し、修復に影響を与える。脂質ケモカインであるLeukotriene B4（LTB4）は、その受容体BLT1に結合し、炎症が活発な部位への免疫細胞の移動を促進する。しかし、粘膜創傷修復における腸管上皮BLT1の役割は不明であった。我々は、BLT1がin vitroおよびin vivoの両方でIECに発現し、LTB4だけでなく、別のリガンドであるresolvin E1の受容体として機能していたことを報告する。腸管上皮のBLT1発現は、上皮細胞が炎症性微小環境に曝されると増加した。ヒトおよびマウス初代大腸上皮細胞を用いて、LTB4/BLT1経路が上皮の移動と増殖を促進し、上皮の創傷修復を促進することを明らかにした。さらに、BLT1欠損マウスおよび骨髄キメラを用いたin vivo腸管創傷修復実験から、大腸粘膜の創傷修復に上皮のBLT1が重要な役割を果たしていることが明らかになった。以上のことから、BLT1シグナルを介したIECにおける新規修復機構の可能性が示された。

図1 アブストラクト
グラフィカルアブストラクト
はじめに
消化管上皮は、内腔の抗原や微生物に対する高度に制御された防御壁として機能している。急性および慢性の腸の炎症は、上皮の損傷を伴い、びらんや潰瘍のような粘膜の傷をもたらす。腸管上皮細胞（IEC）は、傷害に応答して移動・増殖し、破壊された表面を覆って重要な上皮バリアを回復する驚くべき能力を有している。このような修復現象は、上皮細胞と、好中球、単球、マクロファージ、間質細胞などの浸潤・定着免疫細胞との時空間クロストークによって組織化されている(1)。創傷環境における上皮細胞や免疫細胞は、サイトカインや特殊なプロレゾルビン脂質メディエーター（SPM）を含むメディエーターを分泌し、修復に影響を及ぼす。多くのSPMはGタンパク質共役型受容体（GPCR）に結合し、炎症の解消を促進する（2, 3）。最近、我々はSPMであるレゾルビンE1（RvE1）がIECの遊走と増殖を促進することにより、腸管上皮の創傷修復を促すことを報告した（4）。RvE1 の受容体には，ロイコトリエン B4 (LTB4) の高親和性受容体である BLT1 と CMKLR1 として知られる ChemR23 がある (5)．好中球などの免疫細胞におけるBLT1の発現と機能は広く研究されているが（6-12）、肺の上皮性BLT1に関する報告は少ない。IECのBLT1発現と関連する受容体を介したシグナル伝達事象についてはほとんど知られていない（13, 14）。

BLT1アゴニストのLTB4とRvE1は、免疫細胞のBLT1と結合すると異なる反応を引き起こす。LTB4は炎症部位への免疫細胞の移動を制御するのに重要な走化性シグナルとして働くが（15）、RvE1は受容体に結合しても下流のシグナル伝達を引き起こさないアゴニストとして記述されている。LTB4/BLT1 経路の活性化は、炎症性腸疾患（IBD）や大腸腺がんで観察されるような病的な腸の炎症に関連した状態で亢進する(16-18)。LTB4 は、IBD 患者の大腸粘膜 (16) や生体外培養大腸生検標本の上清 (17) 、大腸癌患者の血清 (18) で増加している。これらの知見は、LTB4/BLT1経路が多様な腸疾患の病態生理に重要な役割を担っていることを示唆している。

本研究では、大腸上皮の創傷修復の制御におけるBLT1の役割について検討した。我々は、in vitroおよびin vivoのアプローチにより、IECが時間的にBLT1を発現し、炎症性条件にさらされた後に発現が増加することを明らかにした。ヒトおよびマウス大腸上皮細胞（コロノイド）の初代培養細胞を用いて、BLT1のLTB4ライゲーションが上皮の移動と増殖を促進し、創傷修復を増加させることを示す。さらに、BLT1-KO (B6.129Sa-Ltb4r1tm1Adl/J; Ltb4r1-/-) マウスでは創傷修復が遅れること、骨髄移植実験により大腸粘膜創傷修復に非血清系BLT1発現細胞が極めて重要であることが示された。また、LTB4/BLT1軸の修復促進作用は、細胞マトリックスの接着や細胞移動を制御するシグナル伝達と一致していることが確認された。これらのデータから、上皮性BLT1シグナルが腸粘膜の創傷治癒を促進する上で重要な修復促進機能を持つことが明らかになった。

研究成果
BLT1 は、RvE1 の主要な上皮性受容体として機能する。我々は以前、RvE1 が腸管上皮の創傷治癒を促進する強力な修復分子として機能することを報告した(4)。RvE1 がどのように上皮細胞のシグナル伝達を活性化し、修復を促進するかをさらに検討するため、既知の 2 種類の RvE1 受容体の発現を調べました。BLT1 と CMKLR1 の発現を調べた。BLT1 と CMKLR1 の特異的な抗体がないため，ヒトとマウスの大腸粘膜におけるこれらの受容体の空間的な発現を RNAscope in situ hybridization 法で解析した．LTB4R/Ltb4r1（BLT1遺伝子名）のmRNAは大腸上皮と固有層に発現していたが、CMKLR1/Cmklr1のmRNAは固有層細胞のみに検出された（図1、AおよびB）。BLT1は免疫細胞で主に発現していることが報告されており、CMKLR1は免疫細胞と上皮細胞で発現していることが報告されていることを考えると、これは予想外の所見であった。この結果を裏付けるために、ヒト腸管上皮細胞株および上皮初代培養細胞（SKCO-15、T84、モノレイヤーとして培養したコロノイド）を用いて定量的PCR（qPCR）を行ったところ、IECはBLT1を発現していた。その結果、IECはCMKLR1よりも16倍も多くのLTB4Rを発現しており、IECではCMKLR1の発現が低いことがわかった（図1C）。BLT1 が IEC における RvE1 の修復促進活性に寄与しているかどうかを調べるために、2 次元（2D）単層として培養した初代ヒト大腸上皮細胞（コロノイド）を用いて、RvE1 による上皮創傷治癒に対する BLT1 アンタゴニストの効果を in vitro で検討した。ヒト大腸菌を用いた創傷治癒のタイムラプスイメージングにより、RvE1（100 nM）によって誘導される創傷修復の増加は、選択的BLT1アンタゴニストであるCP105,696（1 μM）とのインキュベーションにより阻害されることが示された（図1D）。創傷修復に対する同様の効果は、このBLT1アンタゴニストとインキュベートした初代マウス大腸上皮単層で得られた（補足図1A；この記事とともにオンラインで入手可能な補足資料；https://doi.org/10.1172/jci.insight.162392DS1）。CMKLR1はRvE1受容体であるが、選択的CMKLR1アンタゴニストα-NETA（10μM）で前処理しても、ヒトおよびマウス初代IECにおけるRvE1によって引き起こされるプロ修復反応は消失しなかった（図1Dおよび補足図1A）。RvE1 と BLT1 の相互作用をさらに明らかにするため、標的受容体とリガンドの分子内および分子間エネル ギーを計算するのに有用な手法である計算ドッキングシミュレーションを実施した。解析の結果、RvE1とBLT1の結合が支持された（補足図1B）。以上のことから、BLT1 は腸管上皮に発現しており、創傷修復時に RvE1 の受容体として機能することが示唆された。

BLT1 は RvE1 の主要な上皮性受容体として機能している（図1）。
BLT1 は RvE1 の主要な上皮性受容体として機能する。(A) ヒト大腸組織の凍結切片におけるLTB4RおよびCMKLR1 mRNAの発現を示すRNAscope染色。(B）マウスの大腸組織の凍結切片におけるLTB4r1およびCMKLR1のmRNA発現のRNAscope染色。スケールバー 50μm。(C）SKCO-15、T84、およびヒト2DコロノイドにおけるCMKLR1およびLTB4R mRNAの発現のqPCR分析。データは、平均±SEMとして示される。Cq、定量化サイクル（サイクルとして測定）。(D）ヒト初代IECを用いたスクラッチ傷アッセイにおけるRvE1のプロリペア活性に対するBLT1アンタゴニストの効果。スクラッチ傷を作製した後、IECをRvE1（100 nM）と共に24時間インキュベートした。BLT1（CP105,696; 1μM）またはCMKLR1（α-NETA; 10μM）アンタゴニストはRvE1処理の30分前に適用した。創傷後24時間における創傷修復の定量化を示す。データは平均値±SEMで示した。統計解析は、1-way ANOVA とボンフェローニ補正によるポストホックの Welch の t 検定を用いて行った。RvE1と比較して、*P < 0.05, **P < 0.01。

上皮性 BLT1 は大腸粘膜傷害に応答して発現が上昇する。腸粘膜創傷修復におけるBLT1の役割を調べるために、生検で誘発したマウス大腸粘膜創傷の治癒におけるLtb4r1 mRNA発現および空間局在を分析した。採取した大腸粘膜創傷のqPCR分析により、Ltb4r1 mRNAが創傷後24時間および48時間で有意にアップレギュレートされていることが判明した（図2A）。さらに、Ltb4r1 mRNAは、RNAscope in situ hybridizationにより、マウス粘膜の大腸上皮と層状固有細胞に検出された（図2B）。Ltb4r1 mRNAの発現は、損傷48時間後に創傷床および創傷に隣接する上皮で増加した（図2C）。また、治癒した創傷に隣接する陰窩の基部に位置するIECにおいて、Ltb4r1 mRNAが高発現していることが確認された（図2D）。これらの所見を定量化したところ、Ltb4r1 mRNAは傷害の48時間後に6.9倍に発現が増加していることがわかった（図2E）。IBDのような多くの粘膜炎症性疾患は粘膜の傷を伴うため、IBD（活動性潰瘍性大腸炎）患者のサンプルの組織切片におけるLTB4R mRNAの発現を検討した。重要なことは、IBD生検サンプルの大腸陰窩において、炎症を起こしていない対照群と比較して、上皮性LTB4R mRNAが増加していたことです（図2G）。これらの結果は、in vivoでの粘膜の炎症や傷害に反応して腸管上皮のBLT1の発現が上昇するという概念と一致するものであった。

大腸粘膜傷害に応答して上皮性BLT1が発現上昇する図2
大腸粘膜傷害に応答して上皮性BLT1が発現上昇する。(A) 無傷の大腸組織と大腸粘膜創傷の3 mmパンチバイオプシーにおけるLtb4r1 mRNAの発現の、損傷後の異なる日数における変化を示す。データは、4-5匹のマウスの平均±SEMとして示される。統計解析は、1-way ANOVAとBonferroniの補正をかけたWelchのt検定で行った。*P < 0.05、**P < 0.01、無傷の組織（IT）と比較。 B-D）損傷2日後の無傷の組織および傷ついた大腸組織の凍結切片におけるBlt1 mRNAのRNAscope染色。矢印は創傷に隣接する陰窩におけるLtb4r1発現のアップレギュレーションを示す。W, 傷。スケールバーは50μm。(E）損傷2日後の無傷の大腸組織および大腸粘膜創傷（創傷に隣接する）のクリプトにおけるLtb4r1 mRNA陽性点の数を示す。データは、6匹のマウスの平均±SEMとして示す。統計解析は、Welchの補正を用いた不対(2-tailed)t検定で行った。*P < 0.05、ITと比較。AW, 傷に隣接する。(FおよびG）健常対照者および潰瘍性大腸炎患者からの凍結切片におけるLTB4R mRNA発現のRNAscope染色。

BLT1は、ヒトおよびマウス大腸クリプトの基部に好発し、幹細胞マーカーであるLgr5およびHopXと共局在していることが示唆された（補足図2）。クリプト基部では、増殖性のクリプト上皮細胞が分化し、内腔表面に向かって移動する。増殖性クリプト基底部大腸上皮細胞と分化したルーミナル上皮細胞におけるBLT1発現をさらに検討するために、初代IEC培養とin vitroで分化したコロノイドにおけるLTB4R/Ltb4r1 mRNAの発現を調べた。Wnt含有培地中で3次元シストとして培養されたコロノイドは、幹細胞様／増殖性上皮細胞を含むことが知られている。このような3次元構造体は、分化した2次元単層として解離・培養することが可能である。補足図2に示すように、ヒトおよびマウス大腸上皮細胞において、LTB4R/Ltb4r1 mRNAの発現は、2次元分化単層と比較して3次元培養コロノイドで有意に高かった。これらの結果は、BLT1が増殖性大腸クリプト基底上皮細胞で優先的に発現し、傷害に応答してアップレギュレートされることを示唆するものであった。残念ながら、これらの解析に必要な特異的な市販BLT1抗体がないため、これらの結果をタンパク質発現と関連付けることはできなかった（補足図3A）。しかし、治癒中の大腸創傷では、無傷の健常組織と比較して有意に高いレベルのLTB4が観察され、受容体のmRNA発現の増加がin vivoでの高いリガンド分泌と相関していることが示された（補足図3B）。

BLT1は腸管上皮の創傷修復を制御する。上皮創傷修復の制御におけるLTB4/BLT1軸の役割を明らかにするために、モデルヒトIEC（SKCO-15）の上皮修復に対するBLT1のよく研究された安定なアゴニストを用いてLTB4の効果を評価した。図3Aに示すように、LTB4（1-100 nM）は、濃度依存的にIEC創傷修復を促進した。選択的BLT1アンタゴニストCP105,696（1μM）で前処理すると、LTB4（10nM）で惹起される修復促進反応が消失した（図3A）。さらに、この反応は、スクラッチで傷ついたヒトの初代コロノイド培養物でも再現された（図3、BおよびC）。上皮のBLT1活性化がIECの創傷治癒を促進することをさらに確認するために、WTおよびBLT1欠損（Ltb4r1-/-）マウスのコロノイドから初代大腸上皮単層膜を作製した。これらの細胞における創傷治癒のタイムラプスイメージングにより、LTB4（10 nM）は24時間にわたってWTマウス由来のIECにおける創傷修復を有意に促進し、Ltb4r1-/-マウス由来のコロノイドでは認められなかった（図3、DおよびE）。重要なことは、BLT1を欠損した初代上皮細胞では、WTコントロールと比較して、創傷閉鎖が著しく遅延したことである（図3、DおよびE）。

BLT1は腸管上皮の創傷修復を制御している（図3
BLT1は腸管上皮の創傷修復を制御している。(A）SKCO-15細胞を用いたスクラッチ創傷アッセイにおけるLTB4の効果。データは、平均値±SEMで示した。統計解析は、1-way ANOVAとボンフェローニ補正によるポストホックWelchのt検定を用いて行った。*p < 0.05; **p < 0.01。(BおよびC）ヒト初代大腸上皮単層膜を用いたスクラッチ創傷アッセイにおけるLTB4の効果。(B）創傷後0時間および24時間における代表的な位相差画像を示す。スケールバーは100μmである。(C）創傷修復の経時的変化の定量化を示す。データは、平均値±SEMとして示す。統計解析は、2元配置ANOVAに続いて、ボンフェローニ補正によるポストホックのWelchのt検定を用いて行った。**P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001、ビヒクルと比較した。p < 0.05; ††p < 0.01: ††P < 0.001; ††P < 0.0001、LTB4と比較した。(D と E) 一次上皮単層膜を用いたスクラッチ創傷アッセイにおける LTB4 の効果。(D) 傷の 0 時間後と 24 時間後の代表的な位相差画像を示す。スケールバーは100μmである。(E）創傷修復の経時的変化の定量化を示す。データは、平均値±SEMとして示す。統計解析は、2元配置ANOVAに続いて、ボンフェローニ補正によるポストホックのWelchのt検定を用いて実施した。*P < 0.05; ****P < 0.0001, WT (ビヒクル)と比較した。P < 0.01; †††P < 0.0001、Ltb4r1-/- (ビヒクル)と比較した。(F) IFN-γ（10ng/mL）およびTNF-α（10ng/mL）で刺激したヒト2次元培養コロノイドにおけるLTB4R mRNAの発現の変化をqPCRで解析した。データは、平均値±SEMで示した。統計解析は、Welchの補正を用いた不対（2-tailed）t検定を用いて行った。*P < 0.05. NT、非処置。(G）SKCO-15細胞を用いたスクラッチ創傷アッセイにおける低用量LTB4（1nM）のプロリペア活性に対するIFN-γ（100ng／mL）およびTNF-α（100ng／mL）の影響。データは、平均値±SEMで示した。統計解析は、1-way ANOVAとBonferroniの補正によるポストホックWelchのt検定を用いて実施した。**p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。

傷ついた粘膜の炎症環境は、上皮の修復反応を調節することが現在では理解されている。我々は、サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNF-α）が炎症を起こした腸粘膜内で上昇し、PAFRなどのGPCRの発現を増加させることによって創傷修復に寄与していることを以前に報告した（19）。さらに、炎症性サイトカインであるインターフェロンγ（IFN-γ）は、IECにおけるTNF-α受容体の発現を上昇させることが観察されている。我々は、TNF-αおよびIFN-γがIECにおけるBLT1の発現を調節するかどうかを検討した。ヒト初代2Dコロノイド（図3F）および3Dコロノイド（補足図4）において、IFN-γおよびTNF-αとIECを組み合わせてインキュベートすることにより、LTB4R mRNAの発現が相乗的に増加することが示された。これと並行して、スクラッチ創傷したIEC単層に対するLTB4のプロリペア効果に対するIFN-γとTNF-αの複合刺激の影響を検討した。既報の通り、IFN-γおよびTNF-α（各100ng/mL）による刺激は、SKCO-15モデルIECの創傷閉鎖を有意に促進した（図3G）(19)。IFN-γおよびTNF-α（各100 ng/mL）で前処理したSKCO-15細胞を低用量LTB4（1 nM）でインキュベートすると、サイトカイン前処理なしのLTB4インキュベーションと比較して、IEC創傷修復がさらに促進された（図3G）。SKCO-15細胞をBLT1アンタゴニストのCP105,696（0.1-1μM）で処理することにより、IEC創傷治癒におけるLTB4増加の特異性を確認した。重要なことは、CP105,696は、LTB4とIFN-γ/TNF-αの組み合わせによって促進されるIEC創傷治癒の亢進を濃度依存的に有意に抑制したことである（図3G）。これらの結果から、腸管粘膜の炎症性微小環境は、腸管上皮のBLT1発現を上昇させ、創傷修復を強力に促進することが示唆された。

BLT1の活性化は、IECの移動と増殖を促進する。そこで、傷ついた単層細胞の動きを12時間かけてタイムラプス顕微鏡で記録し、BLT1の活性化が修復中の腸管上皮細胞の移動を促進するかどうかを検討した。細胞運動は、アッセイ中の個々の細胞のセントロイド位置を分析することによって追跡された（補足図5）。図4Aに示すように、Plot_At_Originは、WTマウス大腸由来のLTB4処理大腸上皮細胞の初代培養物が、ビヒクル処理細胞よりも速く、まっすぐに移動することを示した。重要なことは、LTB4処理とビヒクル処理したLtb4r1-/-初代IECの間で細胞の移動に差がなかったことである。さらに、Ltb4r1-/-マウス大腸菌由来の初代IECの動きは、WTマウス大腸菌の動きよりも遅かった（図4A）。DiPerソフトウェアを用いた解析（20）では、方向の持続性と速度に関する情報を提供する古典的な指標である平均二乗変位（MSD）が、LTB4で処理したマウスWT IECで有意に増加することが示された（図4B）。しかし、Ltb4r1-/- IECでは、WT IECと比較してMSDが有意に減少した（図4B）。細胞の軌跡に接するベクトルの角度を求めることで細胞の方向持続性を反映する細胞方向の自己相関では、LTB4はWT IECでは細胞方向持続性を有意に促進したが、Ltb4r1-/- IECでは促進しなかった(図4C)。最後に、細胞移動中の細胞速度を算出した。LTB4で処理すると、WTでは細胞速度が有意に増加したが、Ltb4r1-/- IECでは増加せず、Ltb4r1-/- IECの細胞速度は、LTB4存在下でWTで観察された速度より有意に遅いことが示された（図4D）。LTB4/BLT1軸がIECの移動を促進するメカニズムを探るため、上皮の移動および創傷修復を促進することが示されているシグナル伝達経路を解析した。SrcとFAKのリン酸化／活性化は、マウス2Dコロノイドを用いて調べた。グリッドスクラッチした初代IECモノレイヤーをLTB4と8時間インキュベートした後、解析した。LTB4で処理したIECでは、Src（Y416）およびFAK（Y397およびY925）のリン酸化が増加し、細胞マトリックスのターンオーバーの調節および移動中の細胞の前進に重要な役割を果たす経路の活性化と一致することが観察された（図4E）。重要なことは、BLT1アンタゴニストCP105,696とLTB4を併用すると、Y416でのSrc、Y397およびY925でのFAKのリン酸化の増加が抑制されることであった。創傷治癒は上皮の移動と増殖を介することから、IECの増殖におけるBLT1の役割について検討した。マウス3次元培養コロノイドにおけるthymidine analog 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) の取り込みに対するLTB4の効果を解析した．LTB4（10nM、24時間）は、マウスIECの増殖を有意に増加させた（図4、FおよびG）。重要なことは、LTB4による上皮細胞増殖の増加は、BLT1アンタゴニストCP105,696の前処理により有意に抑制されたことである（図4、FおよびG）。BLT1が大腸上皮細胞の増殖を促進する特異性を確認するために、Ltb4r1-/-マウス由来のコロノイドに対するLTB4の影響を検討した。実際、外因性に添加したLTB4で刺激しても、BLT1受容体欠損マウス由来のコロノイドの増殖に有意な変化は認められなかった（補足図6）。

BLT1活性化はIECsの遊走・増殖を促進する図4
BLT1活性化はIECsの遊走と増殖を促進する。(A-D) DiPerによる遊走解析。(A)20細胞の原点グラフ。(B）20個の細胞の平均二乗変位。データは平均値±SEMで示した。統計解析は2元配置ANOVAとボンフェローニ補正によるWelchのt検定で行った。**P < 0.01, ****P < 0.0001, WT (ビヒクル)と比較した。P < 0.01, †††P < 0.001, †††P < 0.0001, Ltb4r1-/- (ビヒクル)と比較した場合。(C) 速度自己相関は少なくとも20個の細胞で測定した。統計解析は2元配置ANOVAとボンフェローニ補正によるWelchのt検定で行った。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, WT (ビヒクル)と比較した。P < 0.01, Ltb4r1-/- (ビヒクル)と比較した. (D)平均細胞速度は20細胞で計算した。データは平均値±SEMで示した。統計解析は、1-way ANOVAとボンフェローニ補正によるポストホックのWelchのt検定を用いて行った。***p < 0.001, ****p < 0.0001。(E) LTB4（100nM）またはビヒクルで処理したスクラッチ傷のあるIECモノレイヤーのライセートについてイムノブロット処理を行った。リン酸化SRC（p-SRC）（Y416）およびp-FAK（Y397、Y925）のレベルを、総Src、FAK、およびGAPDHと比較して、活性化を評価した。左の数字はkDaを表す。 FおよびG）LTB4（10nM）で24時間刺激したマウス3次元培養コロノイドにおけるEdU取り込み分析。(F と G) BLT1 アンタゴニストの効果。写真は、EdUを取り込んだ（緑色で示す）コロノイドの代表的な画像である。青色、核。スケールバーは10μmである。データは、平均±SEMとして示される。統計解析は、1-way ANOVAとボンフェローニ補正によるポストホックWelchのt検定を用いて行った。*p < 0.05, **p < 0.01。

in vivoでの腸粘膜創傷修復におけるBLT1の役割。BLT1のin vivoでの腸粘膜創傷修復における役割を明らかにするために、よく特徴付けられた大腸生検誘発損傷モデルを用いて、Ltb4r1-/-およびWTマウスの腸粘膜治癒を調べた。図5Aに示すように、Ltb4r1-/-マウスでは、傷害後3日目の大腸粘膜創傷修復がWTマウスに比べて劇的に遅れていた（WTマウス46.1% ± 1.9%, Ltb4r1-/-マウス 27.2% ± 1.6%; P < 0.0001 ）。Ltb4r1-/-マウスでは、傷害後3日目に傷口が閉じるのが著しく遅いことが示唆され、傷の治癒をデジタルで定量化したデータは、傷の治癒を組織学的に分析した結果と一致した。IECと免疫細胞はBLT1を発現しているので（図1A）、粘膜創傷修復の制御におけるこれらの細胞タイプの相対的寄与を評価した。照射されたWTまたはLtb4r1-/-レシピエントマウスに、ドナーのWTまたはLtb4r1-/-マウスのBM細胞を再構成してキメラマウスを作成し（図5B）、生検による粘膜創傷修復実験を実施した。予想通り、傷害後3日目の創傷閉鎖は、Ltb4r1-/-BMで再構成したWTマウスで有意に遅延し（Ltb4r1-/-＞WT）、造血由来（免疫）細胞発現BLT1が結腸粘膜創傷修復を制御する役割を果たすことが支持された。しかしながら、重要なことに、WT BMで再構成したLtb4r1-/-マウス（WT＞Ltb4r1-/-）も、創傷治癒反応に同様の遅延を示し（図5C）、これは、腸粘膜創傷修復の調節における同等の非造血（例えば、上皮）由来BLT1反応と一致する。

in vivoでの腸粘膜創傷修復におけるBLT1の役割.図5
In vivoでの腸粘膜創傷修復におけるBLT1の役割。(A) Ltb4r1-/-マウスのin vivo腸管粘膜創傷修復。小型ビデオ内視鏡と生検ハサミを用い、麻酔下のマウスの大腸粘膜背側に5個の創傷を形成した。創傷後1日および3日目の創傷表面積のデジタル画像を示す（左）。点は個々のマウスのすべての創傷内の平均値を表す（右）。データは9〜10匹のマウスの平均値±SEMとして示した。統計解析は、Welchの補正をかけた、対応のない（2-tailed）t検定を用いて行った。****P < 0.0001. (BおよびC）BMキメラマウスにおけるin vivo腸管粘膜創傷修復。(B）BMキメラ実験の説明図。(C）創傷後1日目および3日目の創傷表面積のデジタル画像を示す（左）。点は、個々のマウスからのすべての創傷内の平均値を表す（右）。データは、5匹のマウスの平均値±SEMとして示される。統計解析は、1-way ANOVAに続いて、ボンフェローニ補正によるポストホックのWelchのt検定を用いて実施した。***p < 0.001, ****p < 0.0001。

考察
IECの移動と増殖を促進する活発で協調的な修復反応は、変性した粘膜表面を覆って腸管粘膜バリア機能を再確立するのに必須である。これらの再上皮化現象は、傷ついた腸管粘膜の上皮や免疫細胞に由来するメディエーターとその受容体の相互作用によって促進される(21)。本研究では、腸管上皮におけるRvE1/LTB4受容体BLT1の発現を同定し、IECに発現するBLT1およびLTB4が上皮の創傷修復を制御する上で重要な役割を担っていることを明らかにした。

BLT1 と CMKLR1 のもう一つの重要なリガンドが RvE1 であることはよく知られている。本報告では、in vivo RNAscope in situ hybridizationを用いて、IECはCmklr1 mRNAではなくLtb4r1（BLT1遺伝子）を優先的に発現し、一方、lamina propria細胞はこれら両方の受容体のmRNAを発現していることを観察した。ヒトおよびマウス大腸上皮は、正常な状態ではクリプト基底部でBLT1 mRNAの強固な発現を示し、粘膜損傷後には創床での炎症環境に対応して発現が高度に上昇した。IECによるBLT2の発現は報告されているが、BLT1の発現は報告されておらず、IECによるBLT1の発現を示す報告は数少ないが、その多くは癌の進行に関連している(18)。我々の発現および薬理学的in vitro研究は、RvE1によるCMKLR1ではなくBLT1のライゲーションが腸管上皮の修復作用を仲介することを示唆し、IECのBLT1がRvE1の活性受容体として機能することを示唆する。我々は以前、マウス修復性大腸粘膜創傷における Cmklr1 mRNA の発現増加を報告し（4）、粘膜創傷修復における CMKLR1 の役割を支持したが、今回の結果は、CMKLR1 が腸粘膜創傷治癒に寄与する免疫細胞シグナルに重要な役割を果たすことと矛盾していない。

時空間解析により、ヒトおよびマウスIECにおけるLTB4R/Ltb4r1の発現が確認され、これまで報告されていない細胞種におけるBLT1の局在が支持された。我々は、マウス大腸組織において、クリプトの底部に位置するIECにLtb4r1 mRNAの発現が濃縮され、生検による粘膜の機械的損傷後に発現が上昇することを観察した。ヒトおよびマウス初代コロノイドを用い、クリプト基部の増殖性上皮細胞でBLT1 mRNAを同定した組織標識実験と類似して、3次元構造で増殖したコロノイドでは、内腔上皮細胞を再現した分化したコロノイドと比較してLTB4R/Ltb4r1の発現が増加していることが確認された。

我々は以前、炎症性サイトカインTNF-αが腸管上皮の創傷修復を促進し、その一部はサイトカインによる修復促進GPCRのアップレギュレーションに媒介されていることを報告した(19)。我々は、TNF-αとIFN-γの組み合わせが、ヒトIECにおけるLTB4Rの発現を増加させることを観察した。このことは、LTB4やTNF-αのような「炎症性」メディエーターが、IECにおいて非常に重要な「修復促進」特性を有していることを示唆している。この結果は、炎症は宿主防御に重要であるばかりでなく、組織修復の舞台設定に極めて重要な役割を果たすという現在の概念を強く支持するものである。私たちの研究は、しばしば有害な分子とみなされる炎症性メディエーターが、組織修復の開始に極めて重要な役割を果たすというパラダイムシフトを支持するものである。炎症の制御は、宿主の防御に不可欠であることは明らかである。炎症性メディエーターは、ダメージを与える有害な分子とみなされがちですが、炎症を鎮め、組織の恒常性を回復させるのに必要な修復現象を促進する舞台を整えています。これらの高度に制御された機構は、組織修復の障害を伴う慢性炎症性疾患において障害されている。したがって、炎症性可溶性メディエーターがどのように修復への橋渡しをするのかについての理解が深まれば、創傷治癒を促進する治療法を合理的にデザインするのに役立つであろう。

慢性IBD患者から得られた粘膜組織では、LTB4とBLT1の両方の発現が増加している(16-18)。我々は、健常対照者と比較して、IBD患者の陰窩で上皮性LTB4Rの発現が高いことを観察した。したがって、LTB4/BLT1軸は、IBDに見られるような慢性的に炎症を起こしている粘膜で観察される創傷修復反応の障害に関与している可能性がある。本論文では、IECが発現するBLT1が急性大腸の創傷修復を促進する有益な役割を持つことを示したが、慢性腸管炎症誘発性傷害におけるBLT1の役割を理解するためには、さらなる研究が必要である。

創傷治癒におけるBLT1の顕著な発現上昇を考慮し、我々はIECの修復に対するBLT1の特異的な寄与を分析した。粘膜の傷の修復には、傷に隣接する陰窩から上皮細胞が協調して移動することが必要である。修復中、上皮細胞は形状の変化を受け、細胞間の接触を修正し、バリアを再形成するために集団で移動する(1)。傷の修復には、上皮細胞の移動が重要であることから、DiPerソフトウェア（20）を用いて、LTB4が上皮細胞の移動方向に与える影響を解析した（22, 23）。これらの解析から、LTB4シグナルは、方向性の持続性と細胞移動速度の向上を通じて、IECの集団移動を制御していることが示唆された。また、アクチン細胞骨格とインテグリンを含む細胞接着斑のリモデリングが、細胞の前進運動の制御に極めて重要な役割を果たすことがよく知られている(21)。私たちは、LTB4を介したBLT1のライゲーションが、細胞接着斑のリモデリングを制御するタンパク質を活性化することを明らかにした。さらに、LTB4がコロノイドの増殖を促進することも確認され、LTB4/BLT1シグナルが修復を促進することが示唆された。BLT1シグナルがB細胞（24）、肝細胞（25）、平滑筋細胞（26）など他の種類の細胞の増殖を促進することは、他の研究でも報告されている。これらの報告は、LTB4/BLT1シグナル軸がIECsの増殖を促進する可能性が高いという我々の知見を支持するものである。BLT1を欠損した2次元コロノイドでは、創傷治癒の遅延が観察された。このことは、上皮細胞がオートクライン様式でLTB4を産生して創傷治癒を促進するか、上皮のBLT1が修復過程に関与する分子の発現を直接制御している可能性が示唆された。5-リポキシゲナーゼ（5-LOX）と5-LOX活性化タンパク質によって生成される炎症性ロイコトリエンは、炎症を開始し維持する一方で、様々なLOXによって生成されるSPMは、治癒と修復を促進する（27、28）。5-LOXはSPMの生合成にも寄与していることから、5-LOX経路の薬理操作や12/15-LOXの活性化により、ロイコトリエンの生成抑制とSPMの生成維持が起こるのではないかと考えられている。以前の報告では、5-LOX阻害剤はLTB4合成と好中球の動員を減少させることにより創傷治癒を増加させることが示唆されている(29, 30)。興味深いことに、我々や他の研究者は、急性傷害時に好中球が枯渇すると修復が遅れることを示し、大腸創傷治癒の初期段階での5-LO阻害が粘膜修復に不利であることを示唆している(31)。5-LO-KO マウスは、WT マウスと比較して、皮膚創傷治癒が速いことを示す(32)。しかし、in vitro で 5-LO を薬理学的に阻害すると、ケラチノサイトの移動と増殖が阻害されることから (29) 、上皮の創傷修復における 5-LO の役割は複雑で、創傷環境における組織固有の分子相互作用に依存している可能性が示唆された。さらに、5-LO は SPM などの抗炎症性可溶性メディエーターの合成も制御していることから、これらの分子を阻害することも、修復反応に影響を及ぼすと考えられる。

最後に、我々はBLT1シグナルがin vivoでの腸粘膜創傷修復の制御に重要な役割を果たすことを観察した。BM移植実験と大腸粘膜創傷修復の解析から、IECと免疫細胞に発現するBLT1が腸粘膜創傷修復の調節に同様に寄与していることが確認された。粘膜の急性傷害部位に最初に反応するのは好中球であることは重要である(1)。このことを裏付けるように、我々は、マウス大腸粘膜創傷において、最初の損傷後4〜6時間以内に豊富な好中球を観察し、生検による損傷後6〜24時間の間に最大数が検出された（33, 34）。好中球が減少すると粘膜の修復が損なわれ、大腸炎からの回復が遅れるので、回復を促進する上で重要な役割を果たす(35, 36)。好中球はSPMの主要な生産者でもあり、LTB4/BLT1経路は炎症部位への好中球の移動を制御する走化性シグナルとしての機能でよく知られている(15)。我々は以前に、急性大腸粘膜創傷では無傷の組織と比較してLTB4レベルが上昇していることを示した（4）。また、浸潤白血球はLTB4の強力な供給源であることから、創傷床で放出されたLTB4が上皮BLT1に関与して腸管上皮の創傷治癒を引き起こすことが示唆された。粘膜傷害部位におけるLTB4の濃度は、他のBLT1リガンドであるRvE1よりもはるかに高い。興味深いことに、創傷部におけるLTB4とRvE1のレベルの動態も異なっている。LTB4は炎症の初期に分泌され、RvE1はLTB4合成が低下する遅い時点で分泌される。以上のように、炎症と修復は、同時に開始されることで修復をオーガナイズする相補的なイベントである。LTB4は粘膜傷害部位への免疫細胞の移動を促進する一方で、上皮細胞の移動も促進する。好中球はBLT1とCMKLR1の両方を発現しているが、IECはBLT1のみを発現している。CMKLR1 と BLT1 を介した RvE1 シグナルは PMN のアポトーシスを促進し、IEC では RvE1 が LTB4 による BLT1 活性化で引き起こされる移動性応答を持続させる。LTB4が上皮細胞上でシグナルを発し、修復反応を引き起こすことができるという我々の発見は、LTB4/BLT1シグナルがもっぱら炎症性事象であるという長年のドグマに挑戦するものである。以上のことから、LTB4/BLT1シグナル経路を介した腸管上皮の修復機構は、粘膜傷害の修復と粘膜バリアの回復に寄与することが明らかになった。

研究方法
マウス C57BL/6バックグラウンドのLtb4r1-/-マウス（B6.129Sa-Ltb4r1tm1Adl/J）は、The Jackson Laboratoryから購入した（11）。すべてのマウスはミシガン大学の実験動物施設に収容され、餌と水への自由なアクセスを与えられた。すべての実験は、NIH（National Academies Press, 2011）のGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsとミシガン大学に従って行われた。

大腸オルガノイドおよび上皮単層培養。ヒト3D大腸オルガノイド（コロノイド）は、Translational Tissue Modeling Laboratory（University of Michigan）から提供され、研究室で維持した（37）。マウスのコロノイドは、我々の以前の報告(38)に従い、佐藤ら(39)が報告した方法に修正を加えて作成し、培養を維持した。WTまたはLtb4r1-/-マウスから単離した腸陰窩をMatrigelに包埋し、LWRN完全培地で維持した(40)。ヒトまたはマウス3Dコロノイドからの2D大腸上皮単層は、以前に記載したように生成し(40)、LWRN完全培地中で維持した。

細胞株。ヒトIECであるSKCO-15およびT84を、以前に記載されたように培養した(19)。いくつかの実験では、SKCO-15細胞を100 ng/mL IFN-γ (catalog 285-IF, R&D Systems) および100 ng/mL TNF-α (catalog 210-TA, R&D Systems)で刺激した。

RNAscope in situ ハイブリダイゼーション。RNAscopeは、ヒトおよびマウスの結腸粘膜の凍結組織切片で実施した。RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (catalog 323100, Advanced Cell Diagnostics) のプロトコルに従ってin situ Hybridizationを行った。本研究では、陽性（Homo sapiens PPIBまたはMus musculus Ppib）および陰性（Bacillus subtilis strain SMY DapB）コントロールプローブと4種類のプローブ（ヒトLTB4RおよびCMKLR1、マウスLtb4r1およびCmklr1）を使用した。画像はNikon A1共焦点顕微鏡（Nikon社製）を用いて取得した。マウス大腸粘膜におけるLtb4r1の定量は、Advanced Cell Diagnostics社が推奨するQuPath（v0.3.0）を用いて解析した。

RNA 抽出と qPCR。ヒトおよびマウスのサンプルにおいて、様々な遺伝子のmRNA発現レベルを、先に述べたように測定した(41)。簡単に言えば、RNeasy Mini Kit（カタログ74106、QIAGEN）を用いて、製造者の説明書に従って、サンプルから総RNAを抽出した。iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (catalog 1708840, BioRad) を用いて逆転写を行い、CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) で iQ SYBR Green Supermix (catalog 1708880, Bio-Rad) を用いて qPCR 増幅を実施した。標的mRNAレベルは、各サンプルにおける内部コントロールとしてのTBPまたはTbpのそれに対して正規化し、2-ΔΔCt法により算出した。結果は、対照群の平均値に対する比率で表した。以下のプライマーペアを使用した。Homo sapiens LTB4R、（フォワード）5′-GTTTTGGACTGGCTGGTTGC-3′および（リバース）5′-GGTACGCGAGGACGGTGGTG-3′。ホモサピエンスCMKLR1（ACAGCATCACTTACCACTT）5′-3′および（GAGTCCTCAGCCAATCAGTC）5′-3′；ホモサピエンスTBP、（前進）5′-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3′および（後退）5′-CACATCACAGCTCCCCACCA-3′．Musculus Ltb4r1、（フォワード）5′-ATGGCTGCAAACACTACATCTC-3′および（リバース）5′-GACCGTGCGTTTCTGCATC-3′。Mus musculus Tbp、（フォワード）5′-GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA-3′および（リバース）5′-GATGACTGCAGCAAATCGCTT-3′（Integrated DNA Technologies）。

創傷治癒アッセイ。in vitroの実験では、SKCO-15、および2Dモノレイヤーとして培養した初代ヒトおよびネズミのコロノイドを、スクラッチ創傷アッセイに供した。モノレイヤーを48ウェル組織培養プレート（Corning）上でコンフルエンスまで培養し、10μLのピペットチップを使用してスクラッチした。コロノイドの場合、モノレイヤーをコラーゲンコートした（カタログC5533、MilliporeSigma）48ウェル組織培養プレート上で培養した。培地は創傷後に交換し、Axio Observer Z1 live-cell microscopy system（ZEISS）で1時間間隔で創傷を撮影し、スクラッチ創傷閉鎖のビデオ定量を実施した。IECをLTB4（Cayman Chemical）またはRvE1（Cayman Chemical）と共に24時間インキュベートした。BLT1アンタゴニスト（CP105,696；MilliporeSigma）またはCMKLR1アンタゴニスト（α-NETA；Cayman Chemical）をLTB4またはRvE1処理の30分前に塗布した。創傷閉鎖は，ImageJ ソフトウェア（NIH）を用いて，指示された時点で定量化した．大腸粘膜のin vivo創傷実験には、生検鉗子を備えた高解像度小型内視鏡システム（Coloview Veterinary Endoscope; Karl Storz）を用いて、麻酔したマウスの大腸背側に沿った5部位に生検による粘膜損傷を生じさせた（100 mg/kgケタミンと5 mg/kgキサラジンを i.p. 投与）、生検による粘膜創傷モデルを採用した。傷の治癒は、損傷後1日および3日目に定量化された。内視鏡手術は、フラットパネルのカラーモニターで高解像度（1,027×768ピクセル）の画像で観察した。各創傷部位は1日後と3日後にデジタル撮影し、創傷面積はImageJソフトウェアを用いて測定した。

上皮細胞移動アッセイ（DiPer）。タイムラプス実験では、細胞を30分ごとに一度に12時間撮像した。画像はエクスポートし、ビデオにスタックした。細胞追跡は、ImageJソフトウェアを用いて、各サンプルから20細胞（10細胞／各側）を用いて行った。データは、Plot_At_Origin（原点から発した細胞軌道をプロット）、MSD、方向自己相関、および細胞速度についてDiPerを介して解析した（20）。

イムノブロット。細胞溶解のために、IECモノレイヤーをRIPAバッファー中で前記のように収穫した(4)。以下の抗体を使用した。FAK（カタログ610088）BD Biosciences；p-FAK（Y861）（カタログPS 1008）Calbiochem；p-FAK（Y397）（ カタログ3283）および p-FAK（Y925）（ カタログ3284）；ならびにSrc（カタログ2108）および p-Src（Y416）（ カタログ2101）Cell Signaling Technology。

上皮細胞増殖アッセイ。細胞を固定する2時間前に、EdUを100μMの濃度で培地に添加した。増殖している細胞は、製造者の指示に従って、Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging および Alexa Fluor 488 dye (catalog C10337, Thermo Fisher Scientific) で検出し、Nikon A1 confocal microscope を用いて撮影した。

BM移植。全BM移植実験のために、ドナーBM細胞をWTマウスおよびLtb4r1-/-マウスから採取した。レシピエントマウスは、4時間間隔で2回5GyのX線を用いて皮下照射された(42)。合計1×106個のドナーBM細胞をレシピエントマウスに眼窩後静脈叢注射で移植した。移植後8週間目にレシピエントの血液を採取し、移植を確認した。BM移植8週間後にレシピエントを用いた実験を行い、血液サンプルを採取して生着と完全血球分析を行った。

ドッキング・シミュレーション ドッキング研究のために、BIIL260は、Protein Data Bank IDの結晶構造から、Protein Data Bank ID: 5x33 (43) を用いてアポ BLT1 構造を作成し、AutoDock Vina (Scripps Research) を用いて RvE1 の BLT1 への結合部位を予測した。

統計情報 データは平均値±SEM で示した。統計解析は，Prism 9 (GraphPad Software) を用いて，1-way または 2-way ANOVA と Bonferroni の多重比較検定， Tukey の多重比較検定，または Welch の補正による対応のない (2-tailed) t 検定で行った．P < 0.05の値は、有意差を示すとみなされた。

研究の承認 動物を用いたすべての実験手順は、NIHガイドラインおよびUniversity Committee on Use and Care of Animals at Michiganで承認されたプロトコルに則って実施された。

著者による貢献
SHとMQは、データ解析・解釈に加え、実験も行った。原稿はSHとMQが執筆した。CKMは技術的支援とヒト初代細胞培養の提供を行った。STとSPHは、骨髄移植実験の計画と実行に協力した。MOはBLT1リガンドのin silicoドッキング解析を行った。MQ、CAP、ANは、プロジェクトの設計と実行を監督し、原稿を編集し、資金を獲得した。

補足資料
補足データを見る

謝辞
Dylan Fink, Sean Watson, Jenna Brokaw, Vicky Garcia-Hernandezの技術サポートに感謝する。また、ミシガン大学のMicroscopy Coreに感謝する。

本研究は、NIH（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK055679, DK059888, and DK089763 to AN; R01 DK061739, DK072564, and DK079392 to CAP.）の支援により行われた。and P30DK034933 to University of Michigan Center for Gastrointestinal Research）、クローン病・大腸炎財団キャリア開発賞（MQに544599）、日本学術振興会科研費（SHにJP17KK0166, 18K06698, 21K06593 ）、Moonshot R&D Program（SH と MO にJPMJMS2021）である。

脚注
利益相反。著者らは、利益相反がないことを宣言している。

著作権：© 2022, Hayashi et al. 本論文は、Creative Commons Attribution 4.0 International Licenseの条件の下で公開されたオープンアクセス論文である。

参考情報 JCI Insight. 2022;7(23):e162392.https://doi.org/10.1172/jci.insight.162392.

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Lgr5幹細胞は、間葉系ニッチを介さずにin vitroでクリプトビラス構造を形成する。Nature. 2009;459(7244):262–265.
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Reed M, et al. 上皮性CD47は、in vivoでのマウス腸の粘膜修復に重要である。Nat Commun. 2019;10(1):5004.
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Hertati A, et al. Interleukin-4 receptor α subunit欠損は、腸管粘膜バリア機能の増強を通じてin vivoでマウス腸管炎症を緩和する。Front Pharmacol. 2020;11:573470.
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Birkl D, et al.ホルミルペプチド受容体2は単球の動員を制御して腸管粘膜の創傷修復を促進する. FASEB J. 2019;33(12):13632-13643.
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Hori T, et al. Na(+)-mimickingリガンドはロイコトリエンB(4)受容体BLT1の不活性状態を安定化させる. Nat Chem Biol. 2018;14(3):262-269.
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バージョン履歴
バージョン1（2022年10月27日）。インプレスプレビュー
バージョン2(2022年12月8日) 電子出版
私たちが推奨するのは
上皮性JAM-Aは生体内の腸管創傷修復の基礎となる
Shuling Fanら、JCIインサイト、2022年
上皮に発現するシアリルルイス糖鎖を標的とすることで、大腸粘膜の創傷治癒が改善され、大腸炎から保護される
Matthias Kelmら、JCI Insight、2020年
過剰な局所のロイコトリエンB4レベルは、糖尿病マウスの皮膚宿主防御の低下を規定する
ステファニー・L・ブラントら、JCIインサイト、2018年
腸管上皮細胞の選択的インターフェロン応答は腫瘍壊死因子αの細胞毒性を最小化する｜Journal of Virol
J Virol、2020年
大腸菌感染とサルモネラ菌感染に対する粘膜免疫反応
オディリア・L・C・ワイブルグら、エコサル・プラス、2021年
HR+/HER2-転移性乳がんにおけるパルボシクリブ＋アロマターゼ阻害剤の全生存率の実臨床試験