ヒト腸内細菌叢の発酵によって生成されたH2は、腸内酪酸生産者の代謝と競争力に影響を与える

H2 generated by fermentation in the human gut microbiome influences metabolism and competitive fitness of gut butyrate producers - Microbiome

オープンアクセス
発行：2023年6月15日
ヒト腸内細菌叢の発酵によって生成されたH2は、腸内酪酸生産者の代謝と競争力に影響を与える
オースティン・キャンベル
クリスティ・グダネッツ
...
トーマス・M・シュミット（Thomas M. Schmidt
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マイクロバイオーム11巻、記事番号：133（2023） この記事を引用する
2 Altmetric（アルトメトリック
メトリクス詳細
概要
背景
水素ガス（H2）は、ヒトの腸内細菌叢における炭水化物発酵の一般的な生成物であり、その蓄積は発酵を調節することができます。大腸のH2濃度は個人差があり、H2濃度が個々のマイクロバイオームとその代謝産物を区別する重要な因子である可能性がある。ヒト腸内の酪酸産生菌（酪王菌）は、通常、グルコースを酢酸と二酸化炭素に酸化する際に生じる還元力を管理するために、分岐した発酵経路で酪酸、乳酸、ギ酸、酢酸、H2の何らかの組み合わせを産生します。我々は、腸内のH2濃度が高いと、酪酸、乳酸、ギ酸が酪王ホルモンによって生産され、酢酸、H2、二酸化炭素が犠牲になると予想した。酪酸は、抗炎症作用や抗発ガン作用など、大腸の健康維持に重要な役割を果たすことから、ヒトの腸内における酪酸産生の制御は特に重要である。
結果
ヒドロゲナーゼを含む酪王菌は、高H2雰囲気下またはヒドロゲナーゼ阻害剤CO存在下での増殖により、解糖時に生じる還元力に対応した有機発酵産物、特に酪酸、乳酸、ギ酸の生産を促進しました。また、予想通り、ヒドロゲナーゼを持たないFaecalibacterium prausnitzii A2-165株の培養物における発酵産物の生産は、H2またはCOに影響されなかった。合成腸内細菌群では、H2を消費するヒト腸内メタン菌Methanobrevibacter smithiiを添加すると、H2濃度と同時に酪酸生産量が減少した。この観察と一致して、大規模なヒトのコホートにおけるM. smithiiの代謝活性は、糞便中の酪酸の減少と関連していたが、レジスタントスターチの栄養補助食品を摂取している間だけであった。この効果は、腸内のH2生産量が特に高いときに最も顕著になる可能性を示唆している。また、M. smithiiを合成群集に添加すると、E. rectaleの成長が促進され、F. prausnitziiの相対競争力が低下した。
結論
H2は、ヒト腸内細菌叢における発酵の制御因子である。特に、H2濃度が高いと、抗炎症代謝物である酪酸の生産が促進される。H2を消費することで、腸内メタン生成は酪酸産生を減少させることができる。このような酪酸産生のシフトは、腸内細菌叢における酪酸産生の競争力にも影響を与える可能性があります。
動画の概要
背景
水素ガス（H2）は、嫌気性呼吸の電子受容体が限られている無酸素環境において、細菌代謝の一般的な生成物である。H2は、発酵微生物が電子受容体としてプロトンを使用して還元力を捨て、ヒドロゲナーゼを介してH2に還元することで一般的に生成されます[1,2,3]。熱力学的な原理により、H2濃度が高いとH2生産が不利になり、H2生産微生物の代謝に影響を与える[4,5,6]。ヒドロゲナーゼ遺伝子は、Human Microbiome Project Gastrointestinal Tractデータベースの参照ゲノムの71%を含む系統的に多様な微生物に存在し、H2濃度がヒト腸内細菌叢の発酵に影響を与える主要因である可能性を示唆しています［7］。
大腸で細菌が発酵する際に生成されたH2は、他の微生物に消費されたり、扁桃腺に排出されたり、血流に拡散して、その後肺に放出されて呼気となります。これらのプロセスの総和として、腸内ガス中のH2濃度は、検出できないものから40%v/vを超えるものまであります（補足図1） [8, 9]。食事は、ヒトの大腸におけるH2生成の主要な決定要因である。特に、発酵可能な微生物がアクセスできる炭水化物（MAC）[10]は、H2産生を大きく左右します[11, 12]。大腸の環境にはH2が偏在しているにもかかわらず、水素の濃度が特定の腸内微生物の発酵をどのように制御するかについて、具体的な情報は不足しています。ヒトの腸内酪酸菌に対する水素濃度の影響は予測されており [13] 、酪酸菌の抗炎症作用や抗発がん作用 [14,15,16,17] から、特に重要視されるであろう。
図1Aは、典型的なヒト腸内酪酸菌の発酵スキームを示したものである。炭水化物基質（最も単純にグルコースで表される）は、まず解糖により処理される。グルコースあたり、解糖反応は2つのピルビン酸を形成し、2つのADPを基質レベルのリン酸化（SLP）によりATPを形成させる。重要なのは、グルコースが酸化されてピルビン酸になると、補酵素であるNAD+が2モル減少してNADHになることである[18]。酸化還元バランスを維持するために、このNADHからNAD+を再生する必要があることは、発酵の可能性に対する中心的な制約であると同時に、さらなるエネルギーを節約する機会でもあります [2, 19] 。
図1
ヒト腸内酪酸菌における発酵の化学量論と熱力学。A H2、CO2、ギ酸、乳酸、酢酸、酪酸の組み合わせを得ることができるヒト腸酪王における一般的な発酵経路（Louis and Flint, 2017 [18]から引用した）。Fd フェレドキシン、LDH 乳酸脱水素酵素、PFOR ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素、PFL ピルビン酸フォルマートリラーゼ、Ack 酢酸キナーゼ、Hyd フェレドキシン水素化酵素、Bhbd ヒドロキシブチリルCoA脱水素酵素、ETF-Bcd ブチリルCoA脱水素酵素電子伝達性フラビンタンパク質複合体、Butyl-CoA :acetyl CoA転移酵素、Rnf複合体．アセチルCoAの酢酸生成（緑枠）と酪酸生成（青枠）への分配は可変であり、単純な化学量論で均等に分配される場合を代表例として示している。ピルビン酸のアセチル-CoA生成のPFORルートとPFLルートの間の分割も可変である。グルコースから乳酸（オレンジ色の枠）、あるいはPFORまたはPFLを経由して酪酸と酢酸に至る化学量論は均衡している。B ブチレートとアセテートへのグルコース発酵の∆Gに対する[H2]の効果を示す図解。グルコースあたりの酪酸（but）、酢酸（ace）、H2の正味モル生産または消費量を示し、発酵バランスの可能性を示したものである。点線の横線は、ADPリン酸化の∆Gを+ 70 kJ/mol [19]と仮定し、所定の数のATPを形成するための理論的な∆Gの閾値を示す。破線は、ヒトの腸内酪酸菌で実現可能と思われる最小の酪酸生成量を示している。代表的な生理学的条件は、指示されたとおりに使用された。反応と熱化学パラメータの詳細は、補足表4を参照。
フルサイズ画像
解糖後、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）により乳酸に還元されることがある。この経路は、解糖で生成されたNADHを完全に再酸化するが、追加のATPは生成されない[20]。より一般的には、ピルビン酸は、アセチル-CoAとCO2またはギ酸に変換される。アセチル-CoAとCO2の生成は、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素（PFOR）が触媒となり、NAD+よりも還元電位の低い小さな鉄硫黄タンパク質であるフェレドキシン（Fd）の還元と連動している [19, 21, 22]. 一方、ピルビン酸のアセチルCoAとギ酸への分解は、ピルビン酸フォルマートリアーゼ（PFL）によって触媒され、追加の還元種は発生しない [21, 23]。ギ酸はその後、同化経路で使用されるか、あるいは単に発酵産物として分泌されるかもしれない[23]。生体内では、アセチルCoA形成のPFOR経路とPFL経路の両方が同時に活性化されることがある[24]。
ピルビン酸の場合と同様に、ヒトの腸酪酸中のアセチル-CoAは、2つの分岐した経路のいずれかを進み、最終的に酢酸または酪酸を生成することができる [2, 13, 18]. 酢酸の生産では、アセチル基がCoAからリン酸に移動し、リン酸アセチル（アセチル-P）を形成する。このリン酸は、アセテートキナーゼ（Ack）を触媒とする反応により、ADPに転移し、SLPを介してATPを生成し、酢酸が放出される。この経路はATPとしてエネルギーを保存するが、NADHや還元型フェレドキシン（Fdred-）の再酸化には寄与しない [2, 13, 25] 。一方、酪酸の生成は、還元力の重要な供給源となる。この経路では、2つのアセチル-CoAが結合してアセトアセチル-CoAを形成し、次にヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素（Bhbd）によって3-ヒドロキシブチリル-CoAに還元され、NADH補酵素1つをNAD+に再酸化する反応を行う [26] 。次の反応でクロントニル-CoAが形成され、さらにブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ電子伝達性フラボ蛋白複合体（Bcd-Etf）によりブチリル-CoAに還元されます。この電子分岐型複合体は、クロトニル-CoAの還元を、NADHによるFdoxのエンドエルゴニック還元と結合させ、全体として熱力学的に実現可能な反応を行う [19, 27] 。得られたFdred-は、PFORによって形成されたものに加えて、フェレドキシンヒドロゲナーゼによってプロトンがH2に還元されることによって再酸化される[18, 28]。酪酸生成経路を通る十分なフラックスは、Fdred-が過剰になり、NADHが不足する結果となる。この場合、酪王は、Fdred-の酸化とNAD+の還元（フェレドキシン：NAD+酸化還元酵素）を膜を介した陽イオン輸送に結びつけるRnf複合体を用いた嫌気性呼吸により、さらなるエネルギーを節約し、化学浸透圧機構によりATPを合成することができる [19, 29]. 酪酸の最終的な放出は、ブチリル-CoA：アセチルCoA転移酵素（But）の触媒による遊離酢酸との交換によって行われ、酢酸の生成よりも酪酸の生成に多くのアセチルCoAが流れると酢酸の純消費となる [18, 25, 30] 。
上記のような腸内酪酸菌の分岐した代謝の顕著な特徴は、酪酸の生産量を増やすと、H2生成に利用できる還元剤が減少することである。逆に、酢酸の生産量を増やすと、NAD+を再生するために、より多くのH2が生成されることになる [2, 18] 。その結果、熱力学的平衡は、周囲のH2濃度が高くなるにつれて、酢酸生成よりも酪酸生成にますます有利になる（図1B）[6, 13, 31]。このことから、腸内のH2濃度が高くなると、酢酸の生産よりも酪酸の生産が有利になると予想されている [6, 13]。この結果や、同じ原理を示す同様の結果は、ヒトの腸内酪酸菌に関連する種で観察されているが [32,33,34]、我々の知る限り、Roseburia intestinalis, Eubacterium rectale, Faecalibacterium prausnitziiによる発酵に対する周囲のH2濃度の影響 [13, 35]は、直接調査されていない。ただし、自己由来のH2には、腸内細菌の培養に効果がないとの研究結果がある [36].
細菌培養中の H2 濃度は、攪拌 [34, 37]、スパージング [32]、または水素消費微生物 (hydrogenotrophs) との共培養 [4, 33, 38, 39] によって低下することがあります。このような環境下では、ヒドロゲナーゼはより多くのH2と酸化最終生成物（酢酸など）を生成し、それに対応して還元有機最終生成物（エタノール、酪酸など）の生成は少なくなる [32,33,34,37,39] 。ヒトの腸内には、メタン生成菌、硫酸還元菌、還元型酢酸菌の3種類の従属栄養細菌が生息している [40,41,42,43,44]．これらの従属栄養細菌はH2を積極的に消費するため、ヒトの腸内酪王がさらされるH2濃度を調節する上で重要な役割を担っている可能性がある。
本研究では、R. intestinalis、E. rectale、F. prausnitziiの発酵最終生成物のプロファイルに対するH2濃度の影響を調査した。その結果、H2濃度の生理的な変化が、H2産生ヒト腸酪王の還元剤処理経路に影響を与え、その結果、発酵産物の生産が変化することがわかった。特に、高濃度の水素にさらされると、酪酸、乳酸、ギ酸の生産が増加し、酢酸やおそらくはCO2が犠牲になることが判明した。このような代謝シフトは、ある種の酪農家の競争力に影響を及ぼすと考えられる。我々は、これらの分類群やヒト大腸内の代謝的に類似した発酵菌から得られる発酵産物のプロファイルが、局所的な大腸H2濃度によって調節されるモデルを提案する。これは、発酵菌による生産と従属栄養細菌による排泄のバランスである。最後に、発酵とH2産生を刺激すると予想されるMACとして、レジスタントポテトスターチを摂取した大規模なヒトコホートからの観察結果を報告する。我々のモデルと一致して、サプリメント摂取中の従属栄養性腸内メタン生成は、糞便中酪酸の低下と関連していることがわかった。
研究方法
ヒトのコホート
本研究のヒトコホートの一部からの結果は、Baxterら（2019）[45]によって以前に報告された。参加者は、ミシガン大学BIO173入門生物学コースのAuthentic Research Sectionsを通じて募集された。被験者は、自己申告の炎症性腸症候群、炎症性腸疾患、大腸がん、および過去6ヶ月間の抗生物質の消費に基づいて除外された。年齢と性別を含む非識別化された被験者のメタデータは、補足表1に記載されている。
微生物株と培養
Methanobrevibacter smithii F1（DSM 2374）、Faecalibacterium prausnitizii A2-165（DSM 17,677）、Roseburia intestinalis L1-82（DSM 14,610 ）は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（DSMZ）から入手した。Ruminococcus bromii VPI 6883（ATCC 27,255）は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手した。Eubacterium rectale A1-86（DSM 17,629）、Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482（DSM 2079）、Bacteroides vulgatus Eggerth and Gagnon（ATCC 8482）、Prevotella copri CB7（DSM 18,205）は共同研究先から入手しました。
また、ヒトのコホート研究の過程で得られた糞便サンプルから分離されたBifidobacterium adolescentis 269-1株とAnaerostipes caccae 127-8-5株も合成群に含まれる。B. adolescentis 269-1を糞便サンプルから連続希釈して入手し、製造者の指示に従ってBSMサプリメントを含むBifidus Selective Medium寒天培地（BSM Agar, Sigma-Aldrich）上にプレーティングしました。プレートは、嫌気性チャンバー（Coy Laboratory Products Inc.、Grass Lake、MI）内で、5％の二酸化炭素、1.5～3.5％のH2、およびバランスN2の無酸素雰囲気下で37℃でインキュベートした。ビフィドバクテリウムのコロニーは、中心がピンク色で縁が薄茶色であることが確認され、BSM寒天培地で再剥離された。
A. caccae 127-8-5は、OMNIgene-Gut collection kit tube (DNA Genotek, Ottawa, Ontario, Cat#OMR-200)で-80℃に保存した糞便サンプルより得た。糞便サンプルを連続希釈し、胞子の発芽を刺激するために2g/Lのタウロコレートを含む培地であるSABU寒天にプレーティングした（補足表2に培地成分の全リストを掲載）。プレートは上記の嫌気室で37℃でインキュベートし、成長したコロニーを摘出した。
269-1および127-8-5分離株の分類学的同一性は、16S rRNA遺伝子のサンガー配列決定により決定した。16S rRNAは、8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）および1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）を指定したプライマーで増幅し、8Fプライマーから配列を決定した。これらの配列決定結果は、Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.6643453）に寄託されている。
本研究で使用したすべての微生物株は、主担当者に依頼すれば入手可能である。
すべての微生物株は、凍結保存剤として5％DMSOまたは20％グリセロールを用い、-80℃の凍結保存とした。培養を開始するために、M. smithii F1 を除くすべての菌株について、凍結ストックから少量の材料を掻き出し、上述のコイ嫌気槽で、4 g/L D-glucose または D-glucose と D-fructose 各 2 g/L を添加した 5-10 mL の SAB4 基礎培地に加えた（補足表 2 の成分）。これらの培養物を37℃でインキュベートし、必要に応じて継代（4回以下、最も一般的には1〜2回）して、実験培養物の接種に用いる指数関数期の中期または後期の培養物を作製した。M. smithii F1については、冷凍ストックを嫌気室で解凍し、23ゲージの針を装着した1mLシリンジを用いて、20psigで80％H2＋20％CO2混合ガスのヘッドスペース下で、5mLのSAB4ベース培地を含む、ブチルゴムストッパーとアルミニウムクリンプで密封したバルチ管（Chemglass Life Sciences, Vineland, NJ, Cat#CLS-4209) に移す。これらの初代培養物を37℃で150rpmのオービタルシェーカーでインキュベートし、必要に応じて嫌気的に継代して、実験培養物の接種に用いる指数関数期の中期または後期の培養物を生産した。
単培養実験
培養は、4 g/L D-グルコースと2.31 gの炭酸水素ナトリウムを添加した10 mL（H2ヘッドスペース実験）または5 mL（COヘッドスペース実験）のSAB4基礎培地（補足表2）中、ブチルゴムストッパーとアルミニウムクリンプで封止したバルーチ管で37℃で培養した（実験モデルおよび被験者詳細で述べたとおり）。振盪培養では、バルチ管を150rpmのオービタルシェーカーに横向きに設置した。
すべてのバルチック管は、大気圧で80％N2＋20％CO2混合ガスのヘッドスペースで準備した。ヘッドスペースにH2を添加する実験では、すべての培養液は、指示されたH2の分圧と残りのN2を含む3気圧のゲージ圧のヘッドスペースで準備されました。ガスはカスタムガスマニホールドで添加し、圧力計でレギュレーターを調整して適正な圧力を供給した（SSI Technologies Inc.、Janesville、WI、Cat#MG-30-A-9 V-R）。N2およびH2は、超高純度グレードを使用した。一酸化炭素（CO）の添加を伴う実験では、ストップコックと針を取り付けた注射器を用いて、純COまたはN2を2.2mL添加した。この研究で使用されたすべてのガスは、Metro Welding Supply Corp.の一部門であるCryogenic Gases Inc.（ミシガン州デトロイト）から購入しました。
成長曲線は、Spec-20分光光度計（Thermo Spectronic Model 333,183）を用いて培養管内のOD600を定期的に測定することにより得られた。一連の測定の前に、実験に使用したのと同じバッチから接種していない培地を入れたバルヒ管を用いて分光光度計をゼロ点化した。
H2 での単培養実験は、E. rectale と F. prausnitzii については 2 回、R. intestinalis については 3 回実施した。E. rectaleとR. intestinalisについては、0, 1atmに加え、2, 3atmのppH2条件での実験も各1回行った。H2下でのすべての実験では、すべての条件で3～5回の生物学的複製が行われた。COを用いた単培養実験は、各酪農家に1回ずつ、4回（R. intestinalis, F. prausnitzii）または5回（E. rectale）生物学的複製を行った。
合成群集実験
合成群集メンバー（M. smithii F1を除く）の培養は、D-グルコースとD-フルクトースを各2g/L添加したSAB4基礎培地中で、上記の嫌気性チャンバーでストックから増殖した（そして全ての微生物の指数期中期または後期の培養物を同時に得るように継代した（上記の実験モデルおよび対象物の詳細に記載））。これが達成されると、各合成コミュニティメンバーの等しい細胞数（OD600測定値を用いて推定）を組み合わせて接種ミックスを作成し、これを実験培養用のバルーチ管に接種するために用い、これをその後密封した。このバルチ管には、上述のD-グルコースとD-フルクトースを添加したSAB4基本培地を10mL入れた。嫌気槽に植菌して密閉したため、初期ヘッドスペースは嫌気槽のもの（二酸化炭素5%、H2 1.5～3.5% 、バランスN2）と一致させた。各実験培養は24時間培養した後、1:100の希釈率で別のバルチチューブに移し、その後2回24時間培養した。振盪培養では、バルチ管を150rpmのオービタルシェーカーに横向きに設置した。
M. smithii F1の培養は、バルチック管でストックから増殖させ、他の合成コミュニティメンバーと同時に指数関数期の中期または後期の培養を得るように継代した。M. smithiiの細胞は、上記の接種ミックスとは別に、接種物として適切な実験培養物に添加した。M. smithiiの追加接種は、実験期間中バルーチ管で維持されたM. smithiiの純粋培養物から、合成コミュニティの各通過で追加した。各インキュラムで添加したM. smithiiの細胞数はOD600を用いて推定し、一定に保った。
合成群集実験は、各条件について毎回5つの生物学的複製で2回実施された。振盪培養は2回目の実験にのみ含まれた。
合成群集の相対存在量の定量化
合成群集培養の1ミリリットルサンプルを11,000gで2分間遠心分離し、DNeasy PowerLyzer Microbial Kit (Qiagen, Cat#12,255-50) を用いて製造者の説明書にしたがってペレットからゲノムDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅し、Kozichら（2013）[46]に記載されているように、2×250bpペアエンドキットを用いてIllumina MiSeqプラットフォームで配列決定した。
得られた16Sアンプリコンデータは、mothur v1.39.5 [47]を用いて解析した。mothurのスクリプトとログファイルはZenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6621661)に寄託されています。要約すると、ペアエンドリードはコンティグにマージされ、シーケンスエラーをスクリーニングし、SILVA v132参照データベース[46]にアライメントされました。アライメントされた配列は、1差で事前にクラスタ化し、キメラをスクリーニングし、SILVA v132参照データベースを用いて分類した。ミトコンドリア、葉緑体、真核生物と同定された配列は削除した。その後、配列は99%のOTUにクラスタリングされ、培養物中に存在することが知られている9つのコミュニティメンバー（プラスM. smithii）が再現され、共有ファイルがエクスポートされた。Microsoft Excel（Microsoft Corporation, Redmond, WA）を用いて共有ファイルから相対量を計算し、結果をGraphPad Prism 9（GraphPad Software, San Diego, CA）にインポートし、図解にあるように統計解析を実施した。
水性発酵産物の定量化
1mLの細菌培養物のサンプルを11,000gで2分間遠心分離し、上清を0.22μm MultiScreenHTS GV 0.22-µm フィルタープレート（Millipore Sigma, Burlington, MA）に通した。Baxterら（2019）[45]が記載した手順と同様に、HPLCによる分析に備えて、濾液を1.5mlスクリューキャップバイアル内の100μl挿入液に移した。SCFAの定量は、LC-10AD vpポンプA、LC-10AD vpポンプB、DGU-14A脱気装置、CBM-20A通信バスモジュール、SIL-20AC HTオートサンプラー、CTO-10AS vpコラムオーブン、RID-10A RID検出器、Aminex HPX-87Hコラム（バイオラッドラボラトリーズ、ヘラクレス、カリフォルニア）を含む島津HPLCシステム（島津科学機器、コロンビア、MD）を用いて実施しました。移動相は0.01N H2SO4を使用し、カラムオーブン温度は50℃、総流量は0.6ml/minとした。サンプル注入量は10 µlで、各サンプルは40分間溶出した。濃度は、40, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25, 0.1 mMの濃度の短鎖有機酸標準物質のカクテルから各製品について作成した標準曲線を使用して計算した。これらの標準物質は、各バッチのサンプルの前後に実行され、平均値を用いて標準曲線が作成されました。クロマトグラフのベースラインは、サンプルと標準の間の一貫性を確保するために手動で補正されました。サンプルはランダムな順序で分析されました。
ガス状発酵生成物の定量化
ガスサンプルは、ストップコックを取り付けたシリンジを使用して、培養物のヘッドスペースから除去した。メタン含有量は、超高純度H2およびゼログレードの空気を供給する火炎イオン化検出器（FID）を備えた島津GC-2014A温室効果ガス分析器ガスクロマトグラフ（Shimadzu Scientific Instruments, Inc.、コロンビア、MD）を用いて測定された。キャリアガスには超高純度N2を使用した。サンプル分離は、1.0M Hayesep T 80/100メッシュカラム、4.0M Hayesep D 80/100メッシュカラム、0.7M Shimalite Q 100/180メッシュカラムで行いました。各シリーズの測定前に、500ppmのメタン標準物質（Argus-Hazco, Byron Center, MI, Cat#GD40-007-A-221S）を用いて精度を確認した。
H2含有量は、10ppmのH2標準（GASCO 105L-H2N-10, Cal Gas Direct Incorporate, Huntington Beach, CA）を用いて校正した還元化合物光度計（RCP）検出器およびポストカラムダイリューター（Peak Laboratories, Mountain View, CA）付きのPeak Performer 1ガスクロマトグラフ（Cat#910-105）で測定しました。キャリアガスには超高純度N2を使用した。必要に応じて、測定前にストップコックを取り付けたシリンジを用いてサンプルを室内の空気で希釈し、H2濃度を検出上限値である100ppm以下にした。
総タンパク質量測定
終点の微生物培養液1mLを11,000gで2分間遠心分離し、上清画分を-80℃で保存し、後の分析に使用した。ペレットを1.5 mLの蒸留H2Oに再懸濁し、細胞を溶解するために超音波処理した。超音波処理は、102Cコンバーターとマイクロチップを備えたBranson Digital Sonifier 450を使用して氷上で行い、細菌懸濁液に直接入れた。35%の振幅で、1秒オン、14秒オフの3分間サイクルを行った（合計12秒の超音波処理時間）。得られたライセートおよび保存した上清画分中のタンパク質濃度は、製造者の指示に従い、ウシ血清アルブミン（BSA）を標準とするPierce Coomassie Plus Bradford assay試薬（Thermo Scientific, Cat#23,238） を使用して測定した。溶解液と上清の結果を合計して、培養物の総タンパク質収量を求めた。
ヒト・コホート研究のデザインおよびサンプル収集
本研究は、2016年の冬学期から2019年の冬学期までの3年間にわたり、いくつかの別々の学期で行われました。消費されたすべてのサプリメントはジャガイモ由来のレジスタントスターチ（RSP）で構成されていたが、それらはソース、総量、および頻度において様々であった。消費されたサプリメントは、Bob's Red Mill potato starch（Bob's Red Mill Natural Foods, Milwaukie, OR）が20g量を1日2回、20g量を2.5gサイリウムと混合して1日2回、40g量を1日1回、または40g量を1日2回として消費、またはLODAAT Pharmaceuticals（Oak Brook, IL）のresistant potato starchが20g量として1日1回消費されました。各被験者が摂取したサプリメントと摂取量は、補足表1に記されている。
各学期において、研究は3週間のコースに従った。第1週目は、RSP摂取前に糞便と呼気サンプルを採取した。2週目、RSPの摂取は半量から始まり、全量まで増加した。3週目は、糞便と呼気サンプルを採取しながら、RSPの摂取を継続した。
ヒトサンプルの分析
糞便サンプルの収集、調製、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による短鎖脂肪酸濃度の定量は、Baxterら（2019）［45］に以前に記載されているように実施した。呼吸サンプルは、30mLガストシリンジに採取した呼気終末の30mLで構成した。採取後すぐに、サンプルをQuinTron BreathTracker SCアナライザー（QuinTron Instrument Company Inc.、Milwaukee、WI、Cat#QTLNRBTGCSC）に注入し、分析を行った。H2、メタン、および炭酸ガスの濃度を測定し、水素とメタンの測定値は、3.5％の炭酸ガスの想定公称濃度に基づき正規化した。BreathTrackerアナライザーは、150ppmのH2、75ppmのメタン、6％の二酸化炭素を含む標準校正ガス（QuinTron、Cat#QT07500-G）を用いて毎日校正されました。各糞便サンプル中の糞便酪酸、各呼気サンプル中のH2およびメタンの定量値は、補足表1に記載されている。
微生物培養の発酵産物
R. intestinalis、E. rectale、F. prausnitziiの単培養菌では、発酵したグルコースあたり生成する酪酸のモル数に応じて、酢酸は発酵の純生成物（グルコース1molあたり酪酸1mol未満）または純基質（グルコース1molあたり酪酸1mol以上）のいずれかとなりうる。しかし、正味の基質であっても、一部のアセチル-CoAは酢酸生成と酢酸キナーゼによるATP生成に流れます。一部の培養で観察された酢酸の純消費を報告することでこのニュアンスを曖昧にしないために、発酵産物の結果は、単純な炭素回収ではなく、各産物の形成に使用された消費炭素の割合で表現しました。この指標は、まず、これら3つの酪酸菌はすべて、ブチリル-CoA:酢酸CoA酵素を介して酢酸を消費して酪酸を生成するので、酪酸1モルの生成は、酢酸（SAB4培地に豊富に存在する）の消費1モルを表すと推論して算出した[30]。したがって、理論的に消費される酢酸のモル値は、生成された酪酸のモル値と同等に設定された。次に、消費されたグルコースの炭素モル数と理論的に消費された酢酸の炭素モル数を加算して、総発酵炭素量を算出した。酢酸の総生産量は、理論的に消費された酢酸のモル数と、終点の培養で測定された酢酸の変化量（ブランク培地に対する変化量）を加算することで算出された。酪酸、ギ酸、乳酸は培地中に存在せず、微生物代謝中に消費されることも期待できないため、これらの総生産量は単純に終点濃度とされた。各基質中の発酵炭素の割合は、生成した基質中の炭素のモル数を発酵炭素の総モル数で割った値として算出した。
合成生物群では、多様な代謝経路が存在するため、上記の方法は現実的でない。その代わりに、各発酵産物の結果は、産物の変化（酢酸が減少した1つの培養を除くすべてで増加）を、その培養で消費された基質（グルコースとフルクトース）の総モルで割ったモルで表しました。
微生物培養から得られた代謝物データのすべての統計解析は、GraphPad Prism 9を用いて行い、図の説明に記載した。
ヒトサンプルとメタン生成の分類
HPLC（上述）から得られた糞便代謝物の濃度は、糞便の湿重量に対して正規化した。呼気サンプル中のCH4とH2の濃度は、上記のように定量化した。各糞便代謝物および呼気ガスについて、Tukey's Fences [48]の方法に従って、値が下位四分位範囲より3つ以上下または上位四分位範囲より上にある試料を分析から除外した。
被験者は、サプリメント摂取前と摂取中に分けて分類し、メタン生成型と非メタン生成型に分類された。メタン生成の被験者は、少なくとも1つの呼気サンプルで4ppmを超えるメタンを検出した者と定義された。このカットオフは、ラクチュロース（ヒトの酵素にはアクセスできないが、腸内細菌叢によって急速に分解される繊維）の摂取に対する反応に関する研究に基づいており、バックグラウンドより4 ppm高いベースラインの閾値が呼気メタンの増加を最も予測することを示唆した [49]。私たちは、メタン生成が単に存在するだけでなく、腸内生態系の重要な構成要素である被験者を特定することを意図していたため、この閾値を使用しました。2016年冬学期と2019年冬学期では、ほとんどのサンプルで1ppmのメタンというベースライン濃度の上昇が観察された。これは生物学的活動ではなく機器の校正によるものと考えられるため、この上昇したベースラインは、個体をメタン生成型または非メタン生成型に分類する前に差し引かれた。次に、各被験者について、デンプンサプリメント摂取前と摂取中の各糞便代謝物および呼気ガスの平均濃度を算出しました。そして、メタン生成者と非生成者の糞便代謝物および呼気ガスの平均濃度を、GraphPad Prism 9の両側Studentのt検定を使って比較した。
結果
H2がヒトの腸内酪酸菌による発酵産物の生産を調節するという仮説を検証するために、ヒトの胃腸管に多く存在する酪酸菌の純培養株を調査した。Eubacterium rectale A1-86とRoseburia intestinalis L1-82は、H2が影響を及ぼす可能性のある酪王菌の一般的な代謝経路を表すものとして選択した（図1）。Faecalibacterium prausnitzii A2-165は、ヒドロゲナーゼを持たないため、H2の影響を受けにくい酪王菌の代表として選ばれた。
これら3つの酪王菌の複製培養を、H2またはN2のヘッドスペースで培養し、ヘッドスペースのガスと培養液を平衡化するために連続的に振とうした。予想通り、H2ヘッドスペースの存在により、H2産生酪王の発酵プロファイルは、酢酸からより還元的な有機酸（乳酸や酪酸など）へとシフトした（図2A、C）。発酵産物の同じパターンは、フェレドキシン水素化酵素の強力な阻害剤である一酸化炭素 (CO; Fig. 2B, D) の存在下でも再現された [50]。還元された有機酸のプロフィールは、水素を産生する酪農家の間で異なっていた。R. intestinalisの培養物では、還元力は酪酸とギ酸に振り向けられた。乳酸の生産は非常に著しく増加したが、いずれの条件でも微量生産物にとどまった（< 0.5% 基質炭素）。一方、E. rectaleの培養では、還元力は主に乳酸に移行し、ギ酸への移行は少なく、酪酸への移行は見られなかった。ギ酸の生産は、CO2の代替生産に対して細胞内のFdredを減少させるので、酪酸の生産と同様に、フェレドキシン水素化酵素によるH2生産からの還元力の転換であることは明らかである（図1A）。ヘッドスペースのH2分圧を3気圧まで上げると、大まかな用量反応パターンで、より大きなシフトが見られた（補足図2）。E. rectaleやR. intestinalisとは異なり、F. prausnitziiはヒドロゲナーゼ活性を有していない[51]。予想通り、その発酵産物は、ヘッドスペースにH2やCOが存在しても影響を受けなかった（Fig. 2E, F）。
図2
異なる雰囲気下で培養したヒト腸管酪酸菌の培養物における発酵生成物の変化。R.intestinalis（右軸に乳酸を小さく表示）（A-B）、E. rectale（C-D）、F. prausnitzii（E-F）をH2、N2、CO（強力な水素添加酵素阻害剤）と振盪培養したときの終末発酵産物。エラーバーはSEMを示す。統計的有意性は、Studentの両側2標本t検定で算出（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)
フルサイズ画像
H2がより複雑な微生物群集における酪酸産生に影響を与えるかどうかを評価するために、ヒトの腸から分離した微生物からなる合成群集を組み立てた。この混合物は、一般的な酪酸産生菌の代表株（F. prausnitzii, E. rectale, R. intestinalis, Anaerostipes caccae）、一般的な繊維分解菌2種（Bifidobacterium adolescentis, Ruminococcus bromii）、豊富な腸内細菌門Bacteroidetesのメンバー数名（Bacteroides vulgatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Prevotella copri）からなる。我々は、ヒトの腸内でH2を消費する主要なメタン生成物質であるM. smithiiの存在下、等モルのグルコースとフルクトースからこのコミュニティによる酪酸生成を比較した [52, 53].
構成微生物の相対的な存在量、CH4、H2、および発酵生成物の生産量は、合成群集の連続した3回のサブカルチャーにわたってモニターされた。M. smithiiの添加により、メタンが生産され（図3A）、予想通りH2濃度と酪酸の生産が減少した（図3B、C）。モノカルチャーで観察された、対応する酢酸の増加は、合成群集の第2サブカルチャーでのみ観察された（補足図3D）。ブチロゲンによる酢酸生産の予想されるシフトは、2種のBacteroidesのような合成群集の他のメンバーによる大量の酢酸生産によって覆い隠されたのかもしれない。乳酸とギ酸も生産され、Bacteroidesの特徴的な発酵産物であるプロピオン酸とコハク酸も生産された（補足図3E-H）。乳酸の生産は、M. smithiiの添加により減少した。M. smithiiは利用可能なギ酸をすべて消費するため、ギ酸産生への影響は判断できなかった。
図3.
図3 合成腸内細菌群集とヒト腸内細菌叢におけるメタン生成の酪酸生成物への影響。M. smithiiを添加した場合（斜線バー）と添加しない場合（オープンバー）の9種のヒト腸内細菌群集によるメタン（A）、H2（B）、酪酸（C）生産。酪酸は、M. smithiiを添加した3回の連続培養で測定された。抵抗性ポテトスターチサプリメントを摂取しているヒトのコホートにおいて、呼気および糞便サンプルを用いて、測定期間中に4ppm CH4を超える呼気メタン測定が少なくとも1回ある（MG）、または同期間に4ppm以上の呼気測定がない（非MG）と定義した、腸の活性メタン生成の有無による週平均呼気CH4（D）、呼気H2（E）および糞便酪酸（F）の測定に使用しました。エラーバーはSEMを示す。統計的有意性は、両側スチューデント2標本t検定を用いて算出（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001）. メタン生成群で示された呼気H2測定のうち、60ppmを超える値（赤で示したデータポイント）を統計解析から除外した。
フルサイズ画像
M. smithiiを合成群集から取り除くと、H2レベルが上昇し、F. prausnitziiの増殖が促進されました（図4）。F. prausnitziiの増加は、メタン生成物質が存在しない状態でH2が蓄積され、フェレドキシン水素化酵素を持つ酪農家が、よりエネルギー的に好ましくない経路に発酵をシフトさせざるを得なかったことを示唆しています。この説明と一致するのは、E. rectale（図4）の存在量が減少したことである。E. rectaleは、単培養でH2が高い状態では成長速度が遅く、収量も少なかった（補足表3）。メタン生成物質が存在しない場合、R. intestinalisも同様に、より顕著ではないが存在量の減少を示した（図4）。
図4
合成腸内細菌群集における酪酸菌の競争力に対するメタン生成の影響。9種のヒト腸内細菌群集において、M. smithiiを添加した場合のF. prausnitzii、E. rectale、R. intestinalisの相対存在量のFold変化と、M. smithiiを添加しない場合の同一群集の比較。相対的な存在量は、24時間の連続した3回のサブカルチャー（最初のサブカルチャーはライトグレー、2回目はダークグレー、3回目はブラック）の終了時に定量化し、それぞれの通過時にM. smithiiの新しい接種量を適切な培養物に追加した。各生物種について、各条件で5つの複製培養が行われた。統計的有意性は、Studentの両側2標本t検定を用いて相対存在量値から算出した（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)
フルサイズ画像
合成群集培養を激しく振盪させると、M. smithiiによる酪酸生産と酪酸生産者の相対存在量への影響は完全に消失した（補足図3C、I）。これは、培養液中のH2がヘッドスペースと急速に平衡化されると、溶存H2の局所的な蓄積が妨げられ、M. smithiiによるH2消費がこの蓄積を減少させることで違いを生み出すことができなくなるためと思われる。また、振盪することで乳酸の純生成が完全に阻止され、酪酸の高濃度H2への曝露が減少することも示唆された（補足図3）。
酪酸産生に対するM. smithiiの影響が、ヒトの腸内で関連するかどうかを調べるため、ヒトのコホートから、ジャガイモ由来のレジスタントスターチ（RSP）の摂取前と摂取中に呼吸サンプルを採取しました。レジスタントスターチはヒトのアミラーゼでは分解されず、未消化のまま腸内細菌叢に到達し、発酵の基質となりうる。我々は以前、このコホートの一部でRSPの補給が糞便中の酪酸を全体的に増加させたことを報告した[45]。本研究では、RSP摂取前と摂取中の腸内メタン生成を評価するため、呼気メタンの測定を行った。RSP摂取中、活発な腸内メタン生成は、腸内メタン生成を欠く個体と比較して、呼気H2レベルの低下（図3E）および糞便酪酸濃度の低下（図3F）に関連していた。これらの結果は、in vitro培養の結果と一致し、腸内のRSP分解から生成されるH2が、微生物叢による酪酸産生の刺激に重要な役割を果たす可能性が示唆された。実際、腸内メタン生成のある個体は、RSP摂取中に糞便中の酪酸が増加する全体的な傾向を示さなかった（補足図4D）。M. smithiiのような従属栄養細菌による水素の除去は、in vitroと同様にin vivoでも酪酸代謝を変化させるようである。興味深いことに、RSP摂取前の同じ個体における腸内メタン生成は、呼気H2や糞便中酪酸の減少とは関連していなかった（補足図4A-C）。
考察
本研究で報告されたin vitroの結果は、1気圧のH2分圧を含むヘッドスペースで培養したヒト腸酪王の発酵産物のシフトを明らかにした。この量のH2は腸内ガスには含まれないが、微生物生理に関連するH2濃度は、微生物培養上空のガスの濃度ではなく、微生物が棲む水相に溶解したH2の濃度である [41, 54]. バイオリアクターでの研究により、H2産生微生物群集は、ヘッドスペースとの平衡よりも何倍も高い溶存H2濃度を経験することが示されており、さまざまな条件やバイオリアクターの設計において3倍から100倍の過濃度を示す報告がある[54,55,56,57]。腸内ガス（バイオリアクターのヘッドスペースガスに相当）中のH2は、<1%から>40%（v/v）、中央値は約15%であることから（補足図1） [8, 9] 、ヒト大腸内の溶存H2は、1気圧H2との平衡で生成するH2以上と以下の範囲であると考えられる。したがって、in vitroの培養で使用した1気圧のH2ヘッドスペースによってヒトの腸内酪酸が誘導される代謝シフトは、in vivoでも起こりうる。ヒトのコホートからの観察結果は、この仮説と一致していた（図3-F）。
ヒトの腸内で生成されたH2の多くは、水素栄養微生物によってその場で消費される [40, 41]。したがって、本研究では、活発なメタン生成は、あるレベルでは溶存H2の減少につながるはずだと考え、腸内メタン生成菌によるH2の消費について調査しました。ヒト腸内のほぼすべてのCH4が単一の培養可能な種であるMethanobrevibacter smithii [53, 58]によって生産されるという事実から、シンプルなin vitroの合成腸コミュニティを使用して、ヒト腸内の発酵に対するメタン生成の影響をモデル化することができました。
腸内メタン生成の役割に関するこれまでの研究は、しばしば人間の健康に関する側面に焦点を当てており、時には矛盾した結果をもたらすこともある [44, 59] 。こうした矛盾を説明し、相関関係と因果関係を区別することは、H2除去が腸内細菌叢に及ぼす影響について、メカニズム的に根拠のある予想がなければ困難である[59]。本研究では、まず重要な腸内微生物の純粋培養を行い、理論的な予想を検証することで、より解釈しやすい結果を得たいと考えました（図2）。このシステムでH2濃度の効果を確立したことで、ヘッドスペースガスを直接実験的に操作するのではなく、M. smithiiによって（腸内と同様に）H2を調節する、非常に単純化した合成腸内コミュニティに対する予測を立てることができました（図3A-C）。このシステムでメタン生成菌を介した酪酸産生の減少を発見したことで、メタン生成菌の個体で糞便中の酪酸が低いという観察結果（Abellら（2009）[60]が8人の小さなコホートで以前に報告）を、単なる興味深い関連性ではなく、腸内メタン生成菌が予測した効果と一致するものと理解することができた（図3D-F）。注目すべきは、ヒトの大腸では乳酸が酪酸を含むSCFAに速やかに発酵するようであることから、E. rectaleで高H2環境下で観察された乳酸産生の増加は、糞便中の酪酸の増加も引き起こすと考えられることである [61,62,63] 。ヒトの腸内酪酸菌の中には、特にAnaerostipes caccaeとEubacterium halliiが、乳酸が利用できる場合にこの酪酸生産ルートに特化しているように見えるが、R. intestinalis, E. rectale, F. prausnitziiは乳酸を基質に大きく利用しないことが確認されている［64、65］。私たちの合成腸内細菌群にはA. caccaeが含まれているため、このプロセスのin vitroモデルが提供されました。
以前の研究では、M. smithiiとin vitroで共培養したヒト腸管酪酸菌Christensenella属で、酪酸が減少し、酢酸が増加することも報告されています [66]。報告された発酵のシフトは、R. intestinalisにおける我々の知見と同様であり、我々が記述したH2濃度とメタン生成の効果は、我々が調査した菌株以外の他のヒト腸内酪酸菌にも共通するものであることを示している。別の研究では、M. smithiiとの共培養がR. intestinalisの発酵に及ぼす影響を見つけることができず、水素栄養性酢酸菌Blautia hydrogenotrophicaとの共培養が実際に酪酸生成を増加させることがわかった [67]。しかし、これらの結果は、酢酸が培地に供給されず、高レベルの酪酸の生産には酢酸の純消費が必要であるため、酢酸の利用可能性によってもたらされた（図1）。これは、酢酸が豊富に存在するヒトの大腸の環境を反映していない可能性が高い[68]。M. smithiiが生体内で発酵を調節していることを示すこれまでの最も直接的な証拠は、酪酸菌ではなく、一般的に研究されているBacteroides thetaiotaomicronを用いたものである。gnotobioticマウスを用いた研究では、M. smithiiがin vivoでB. theta発酵産物を調節し、プロピオン酸を犠牲にして酢酸とギ酸の生産を増加させることが示され、著者らはM. smithiiによるH2やギ酸の消費によるものと解釈した［69］。
本研究では、単一種を用いたシンプルなin vitro実験により、H2除去がヒト腸内発酵に及ぼす影響について、全体としてヒト腸内発酵の効率を促進、増強、改善するという一般的に繰り返される広義の説明を超えて、より具体的に説明することができた [44, 52, 70, 71, 72, 73]。H2除去がヒト腸内のH2産生発酵を促進するという原則は十分に根拠があり、今回報告した合成群集実験における水素生成酪酸菌E. rectaleと（わずかに）R. intestinalisの競争力低下（図4）、および非常に高いH2下でのE. rectale成長速度と収量の障害（補足表3）を説明しています。しかし、このような観点からは、下水消化槽のようなよく研究されているシステムで見られるように、H2の蓄積によってヒト腸内の発酵が単純に停止するわけではないという事実が見えません。そこでは、酪酸とプロピオン酸を酢酸にエンドゴーニック酸化するために、発酵菌とメタン菌の密接な共栄関係が必要である [4, 31] 。我々の発見は、これらの義務的合成栄養生物とは異なり、ヒトの腸内酪酸菌であるE. rectaleとR. intestinalis [13, 35]は、代わりに酪酸と乳酸を経由して還元当量を処理することにより、H2上昇に対処できることを示しています。特にE. rectaleの場合、酪酸と酢酸の生産から乳酸発酵への劇的なシフトにより、グルコースあたりのATP形成の約半分を失うことになる。しかし、彼らは「バックアップ」代謝戦略を用いて成長を続けている。したがって、H2が蓄積されると発酵が停止するのではなく、発酵がシフトする「通性総合栄養細菌」[5]の一例である。直感に反して、これらの生物では、高いH2濃度が発酵生成物である酪酸と乳酸の生産を実際に促進する。様々な発酵バランスのギブス自由エネルギーの推定値から予測されるように（図1B）、高濃度のH2にさらされると、発酵産物がほぼ用量反応的にシフトし、シフトは進行性であり、固定したH2閾値に支配されていないことが示された（補足図2）。
メタン生成個体で報告された糞便中酪酸の減少は、RSPサプリメント摂取時にのみ現れ（図3F）、サプリメント摂取前の同じ個体では観察されない（補足図4A-C）。この結果について最も考えられるのは、RSPの摂取は、効率的に除去されない場合、熱力学的状況を変えるために結腸で十分なH2の生成を刺激するために、ほとんどの個体で必要であるということである。この可能性は、RSP摂取前と摂取中の平均H2が高いことからも裏付けられる（p = 0.005）。もう一つの説明は、最初の説明と相互に排他的ではないが、ヒト大腸におけるメタン菌の生物地理学に基づくものである。多くの報告が、メタン菌は近位結腸よりも遠位結腸および直腸に多く存在することを示している [43, 74,75,76]. 屈折性基質であるRSPは、補給前の食事に含まれる他の基質よりも多量に遠位結腸に到達すると考えられる。したがって、RSPの発酵は、遠位結腸に到達する前にほとんど分解される基質の発酵よりも、メタン菌の影響を受けやすいと考えられる。ヒト腸内水素栄養細菌の他のギルド（硫酸還元剤と還元性酢酸菌）は、これらの基質の発酵を調節する上で、より大きな役割を果たすかもしれない。腸内細菌叢の発酵を調節するH2の役割について理解するためには、これらの水素栄養細菌のギルドを含めるよう、さらなる研究を進める必要がある。
最後に、活発な腸内メタン生成とRSP補給による酪酸の刺激との間に負の相関があることを考察する。RSPの補給は一般に糞便中の酪酸を増加させるが[45]、メタン生成個体は平均して糞便中の酪酸の増加を示さなかった（補足図4D）。これは相関的な発見であるが、本研究は、効率的なH2除去によって酪酸産生を減少させるメタン生成の因果的な役割の理論的根拠を提供するものである。大腸の健康に対する酪酸の無数のポジティブな効果 [14] を考慮すると、酪酸産生を刺激することを目的としたサプリメント介入時に、メタン生成（およびおそらく一般的な水素栄養）を減らすことを考慮する必要がある。別のアプローチとして、酪酸産生を直接刺激するためにH2を投与することが考えられる。多くの研究が、抗酸化作用や抗がん作用を示すH2投与について研究しており、多くの場合、H2過飽和水を摂取することで行われている[77,78,79]。本研究で得られた知見は、これらの治療法が、特にサプリメントによる介入と組み合わせて、腸内細菌叢における酪酸産生を刺激する可能性を提起するものである。
結論
H2は、ヒトの腸内細菌叢における代謝プロセスの制御因子としてしばしば提案されている[44]が、複雑な腸内生態系におけるその具体的な役割に関する情報は不足している。本研究では、ヒトの腸内細菌叢の顕著な側面の1つである抗炎症性および抗発癌性の細菌代謝物である酪酸の生産に対するH2濃度の影響を調べた。in vitroのアプローチにより、3つの著名なヒト腸内酪酸菌に対するH2の影響を観察することができました： R. intestinalis、E. rectale、F. prausnitziiです。その結果、高濃度のH2がR. intestinalisの酪酸産生を上昇させたが、E. rectaleでは上昇せず、乳酸産生を上昇させた。F. prausnitziiはH2による影響を受けなかった。さらに、優勢な腸内メタン生成菌であるM. smithiiによるH2消費は、H2制御酪酸菌による酪酸産生を変化させるのに十分であることを見出した。発酵菌によるH2生産とメタン生成菌によるH2消費のバランスである腸内H2濃度が、腸内細菌叢による総酪酸産生に影響するというモデルを、大規模なヒトコホートからの知見で支持した。
データおよび資料の入手方法
本研究で培養した合成群集培養物から生成された16S V4アンプリコン配列は、バイオプロジェクトID PRJNA956530 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA956530) としてNCBI Sequence Read Archive (SRA) に寄託されました。16Sアンプリコンデータは、mothur v1.39.5 [47]を用いて解析した。使用したmothurスクリプトと生成されたログファイルは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6621661)に寄託されています。本研究の結論を裏付ける他のすべてのデータは、論文および補足資料で入手可能です。特に、本研究で使用した非識別化ヒトコホートデータは、補足表2に掲載されています。本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求に応じてリードコンタクトから入手可能である。
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謝辞
Kwi KimのHPLC分析およびビフィドバクテリウムの分離の協力、Robert Heinのヒトコホートデータの整理作業に感謝したい。また、原稿の文章についてコメントやアドバイスをいただいたClegg Waldron博士とEthan Hillman博士に感謝します。図1AはBioRender.comで作成しました。
資金提供
この研究は、米国国立衛生研究所（P01HL149633）、ミシガン大学マウス代謝フェノタイピングセンター（U2CDK110768）、Howard Hughes Medical Instituteの支援を受けています。
著者情報
著者および所属
ミシガン大学微生物学・免疫学教室、ミシガン州アナーバー、48109、米国
オースティン・キャンベル＆トーマス・M・シュミット
ミシガン州立大学植物・土壌・微生物科学部（ミシガン州イーストランシング、48824、USA
クリスティ・グダネッツ
ミシガン大学生態・進化生物学部（米国ミシガン州アナーバー、48109
トーマス・M・シュミット（Thomas M. Schmidt
ミシガン大学内科、感染症部門、MI、48109、Ann Arbor、USA
アレクサンダー・W・シュミット＆トーマス・M・シュミット
寄稿文
A.C.とT.S.が実験をデザインし、論文を執筆した。A.C.はin vitroの実験を行い、図を作成した。A.S.とK.G.は、ヒトのコホートからのデータを収集し、整理した。A.C.とK.G.は、ヒトのコホートデータを解析した。著者は最終原稿を読み、承認した。
対応する著者
Thomas M. Schmidtに対応する。
倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
本研究は、ミシガン大学医学部の施設審査委員会（HUM00094242およびHUM00118951）により承認され、ヘルシンキ宣言に準拠して実施されました。この研究で分析されたサンプルを提供するすべてのヒト対象者は、サンプル収集およびサンプルから生成されたデータを不特定多数の将来の研究で使用することについて、インフォームドコンセントを提供しました。
出版に関する同意
該当なし。
競合する利益
著者らは、競合する利害関係はないことを宣言している。
追加情報
発行者のコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権主張および所属機関に関して、中立を保っています。
補足情報
40168_2023_1565_MOESM1_ESM.pdf
追加ファイル1： 図S1 -図S4.
40168_2023_1565_MOESM2_ESM.xlsx
追加ファイル2: 表S1.
40168_2023_1565_MOESM3_ESM.xlsx
追加ファイル3: 表S2.
40168_2023_1565_MOESM4_ESM.pdf
追加ファイル4：表S3.
40168_2023_1565_MOESM5_ESM.xlsx
追加ファイル5：表S4.
権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えた場合にそれを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記がない限り、この記事で利用可能になったデータにも適用されます。
転載と許可
この記事について
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Campbell, A., Gdanetz, K., Schmidt, A.W. et al. Human gut microbiomeで発酵により生成されたH2が、腸内酪酸生産者の代謝と競争体力に影響する。Microbiome 11, 133 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01565-3
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2022年10月11日受領
2023年5月3日受理
2023年6月15日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-023-01565-3
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キーワード
腸内細菌叢
発酵
水素ガス
酪酸
メタン生成物質
レジスタントスターチ
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618
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投稿に関するお問い合わせ: lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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