軟骨細胞の低酸素適応におけるヘモグロビン体の赤血球外での役割

2023年10月29日 08:36

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出版：2023年10月04日
軟骨細胞の低酸素適応におけるヘモグロビン体の赤血球外での役割
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06611-6

フェン・ジャン、ボー・チャン、...チアン・サン著者一覧
Nature 622巻 834-841ページ (2023)この記事を引用する

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指標詳細

要旨
ヘモグロビンは、赤血球の酸素運搬体として知られ、酸素を長距離輸送する機能を持つが、赤血球以外でのその生理的役割はほとんど解明されていない1,2。ここで我々は、軟骨細胞が大量のヘモグロビンを産生し、細胞質内にエオシン陽性体を形成することを発見した。ヘモグロビン体（ヘディ）は、相分離を特徴とする膜のない凝縮体である。軟骨細胞におけるヘモグロビンの産生は低酸素によって制御され、HIF1/2α経路ではなくKLF1に依存している。軟骨細胞におけるヘモグロビンの欠失は、重度の低酸素症、糖分解の亢進、軟骨組織の中心部における広範な細胞死とともにヘディの喪失をもたらし、これは低酸素条件下でヘディが制御していた酸素供給が失われたことに起因する。これらの結果は、軟骨細胞におけるヘモグロビンの赤血球外での役割を示し、軟骨細胞がヘディを通して低酸素環境を生き延びるという、これまで認識されていなかったメカニズムを明らかにした。

メイン
酸素は多くの反応に不可欠な代謝基質であり、細胞の生存に必須である3,4,5。ほとんどの哺乳類細胞への酸素供給は、赤血球（RBC）中のヘモグロビンによる血管系を介したO2の連続供給に依存している。対照的に、軟骨組織は非血管性であり、軟骨内の軟骨細胞が必要とする酸素は、周囲の組織から拡散される6。胎生期には、胎児の成長板は血管がない状態で拡張するため、軟骨の中心部では低酸素状態が亢進する7,8。しかし、軟骨細胞が低酸素環境に適応するメカニズムは、まだほとんど解明されていない6。

酸素供給が制限されると、軟骨細胞は主にミトコンドリアの酸化的リン酸化よりも解糖に頼ってエネルギーを産生するが、これは低酸素誘導因子（HIF）シグナル伝達経路によって制御されている9,10。HIFシグナル伝達のキープレーヤーであるHIF1αをコードする遺伝子を欠損させると、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が解除され、酸素消費量が増加するため、重度の低酸素状態となり、軟骨細胞が大量に死滅する9,10。したがって、適切なレベルで低酸素シグナルを持続的に活性化することは、軟骨細胞の生存に不可欠である。しかしながら、軟骨細胞がどのようにして細胞内の酸素恒常性を維持しているのかは不明である。ここで我々は、低酸素に応答して軟骨細胞が大量のヘモグロビンを産生し、細胞質内に膜のない小体（本研究ではヘディと呼ぶ）を形成することを証明し、これが低酸素環境下の無血管胎児成長板における軟骨細胞の生存に必須であることを示した。

軟骨細胞内のエオシン陽性構造
新生児マウスの軟骨成長板を注意深く観察すると、肥大化した軟骨細胞に一種のエオシン陽性構造が観察された。その大きさと形は、走査型電子顕微鏡で確認したところ、骨髄中の赤血球と類似していた（図1a）。エオシン陽性構造は、マウスの肋骨や踵骨など、他の軟骨組織の肥大軟骨細胞にも検出された（図1b）。肥大軟骨細胞に加えて、これらの構造は、不規則ではあるが、マウスの軟骨の休止期および増殖期の軟骨細胞にも存在した（図1c）。さらに、ヒトの軟骨でも同様の構造が検出された（図1d）。したがって、エオシン陽性構造は、軟骨細胞の産地や種に関係なく、軟骨細胞に共通する特徴である可能性がある。

図1：軟骨組織におけるヘモグロビンからなるエオシン陽性構造。
図1
a, ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色により、P7マウスの軟骨成長板の肥大軟骨細胞中にエオシン陽性構造（黒矢印）を示し（上段中段と右段の拡大画像）、走査型電子顕微鏡（SEM）により確認された（下段白矢印）。青い矢印は骨髄中の赤血球を示す。b, E15.5マウスの肋骨（上段）と踵骨（下段）の肥大した軟骨細胞におけるエオシン陽性構造（黒矢印）。c, E18.5マウスの成長板の休止期、増殖期、肥大期の軟骨細胞における好酸球構造（黒矢印）の存在。青い矢印は核を示す。d,16歳の男性から採取した大腿骨関節軟骨の非肥大域における好酸球構造（黒矢印）の存在（上段中段と右段の拡大画像）。青い矢印は骨髄中の赤血球を示す。e,P3マウスの上腕骨軟骨におけるHBAおよびHBBの免疫組織化学染色（上のパネル）および免疫電子顕微鏡染色（iTEM；下のパネル）。f,免疫組織化学染色で検出したP7マウス上腕骨軟骨から単離した軟骨細胞におけるHBAとHBBの発現。黒い矢印はヘモグロビンを示す。スケールバー、50μm。

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軟骨中のヘモグロビン体
エオシン陽性構造の構成成分を決定するために、生後6日目（P6）マウスの軟骨から採取した肥大軟骨細胞に対してレーザーベースのマイクロダイセクションを行い、その後質量分析を行った（Extended Data Fig.）驚いたことに、トップヒットは主にヘモグロビンβサブユニット（HBB）であった（Extended Data Fig.1b）。これは、軟骨細胞が赤血球中のヘモグロビンと同様の速度でシフトするタンパク質をかなり含んでいることを示したSDS-PAGEの結果と一致していた（Extended Data Fig.）質量分析とウェスタンブロットにより、HBBとヘモグロビン-αサブユニット（HBA）の存在が確認された（Extended Data Fig.） RNA配列決定と定量的プロテオーム解析から、2つのヘモグロビン・サブユニットは等価に発現しているわけではなく、タンパク質レベルではHBBの方がHBAよりも多く発現している（HBA：HBB≒3：5）ことが示された（Extended Data Fig.1i-k）。次に、軟骨細胞におけるヘモグロビンの発現を、図1eに示すように、マウス上腕骨軟骨の免疫組織化学染色および免疫電子顕微鏡染色によってin situで調べたところ、HBAとHBBの両方について、細胞質染色の明確なパターンが示された。同様の結果が、マウス軟骨から単離した軟骨細胞でも得られた（図1f）。これらの結果から、軟骨組織の軟骨細胞は大量のヘモグロビン（主にHBB）を産生し、一種の細胞質エオシン陽性構造を形成していることが示された。

ヘモグロビンの相分離
ヘディの性質をさらに調べるために、透過型電子顕微鏡による分析を行った。図2aに示すように、ヘディ構造は明らかに軟骨細胞の細胞質に孤立した無膜凝縮体の一種であった。軟骨細胞を低浸透圧で破裂させると、エオシン陽性の構造体が孤立した個体として放出された（図2b）。次に、ヘディの形成が相分離によるタンパク質の凝縮の結果であるかどうかを調べることにした。Hbb単独、あるいはHbaとともに発現させると、さまざまな細胞株で細胞質凝縮体（fociとも呼ばれる）が生じた（図2c,dおよびExtended Data Fig.2a）。この病巣は、蛍光染色によって示されるように、脂質や核酸に濃縮されていなかった（Extended Data Fig.2b,c）。HBBを例にとって、細胞質病巣の特徴を調べた。タイムラプス顕微鏡で観察したところ、これらの病巣は互いに容易に融合し（図2e）、細胞内で光退色から速やかに回復した（図2f,g）ことから、病巣の動的性質は相分離によるタンパク質凝縮体に似ていることが示唆された。液滴形成の特徴は、精製したタグなしHBBタンパク質（Extended Data Fig. さらに、これらの細胞質凝縮体は、光電子顕微鏡と免疫電子透過顕微鏡の相関から、二葉膜で囲まれていなかった（図2hおよびExtended Data図4a-j）。配列解析の結果、HBBのN末端とC末端にはそれぞれ、相分離タンパク質11,12にしばしば濃縮される2つの短い本質的に無秩序な領域（IDR）が同定された。C末端のIDRまたは両方のIDRを切断すると、細胞質病巣の形成は著しく抑制されたが、N末端のIDRは切断しなかった。β-サラセミア13に関連する原因変異であるC末端IDRのA139P変異もまた、培養細胞での病巣形成を著しく阻害したが、タンパク質発現レベルには本質的に影響を及ぼさなかった（図2i-kおよび補足図2c）。これらの変異はin vitroでのHBBの凝縮を阻害したが、完全には阻害しなかった（Extended Data Fig.）したがって、HBBのC末端IDRは細胞質凝縮体の効果的な形成に必要であった。これらのデータを総合すると、ヘモグロビンの相分離がヘディの形成を促進するという考えによく合致する。

図2：相分離がヘディ形成を促進する。
図2
a, 透過電子顕微鏡で、E14.5マウスの成長板から採取した肥大軟骨細胞の細胞質に凝縮構造（黒矢印）を示した。b,ddH2Oインキュベーションによる低浸透圧破裂により、P7マウスの上腕骨軟骨細胞からエオシン陽性構造（黒矢印）が放出された。スケールバー、10μm。 c, 293T細胞で発現させたeGFPとHBB-eGFPの代表画像。赤のCAAXは細胞膜を示す。青色のヘキストは細胞核を示す。矢印はHBB-eGFPによって形成された病巣を示す。スケールバー、20μm。d, 異なる細胞株における病巣形成の定量化。e,一連の画像は、2つのHBB-eGFP病巣の融合の例を示す。スケールバー、10μm（原図）および2μm（拡大図）。 f, 一連の画像は、HBB-eGFP病巣の光漂白実験後の蛍光回復の例を示す。g, HBB-eGFP病巣のフォトブリーチ後の蛍光回復データの定量化（平均±s.e.m.; n = 10実験）。h, 相関光・電子顕微鏡によるHBB-eGFP凝縮体の蛍光（左）および電子透過顕微鏡像（右）。i,単一または複合障害モチーフ（灰色ボックス）の切断（ΔN、ΔC、ΔNとΔC）、またはA139Pの点変異（赤色バー）を持つHbb変異体の模式図。j,k,293T細胞における指定のHBB-eGFP変異体のフォーサイト形成の定量（j）および代表画像（k）。エラーバーはs.e.m.を表す。P値は両側Studentのt検定(j)を用いて計算した。*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.0001。スケールバー、200 μm。

出典データ

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軟骨におけるグロビンスイッチング
マウスのα-グロビン遺伝子座には、胚性ζ-グロビンと2つの胎児/成体α-グロビン遺伝子（Hba1とHba2）が存在する。マウスβ-グロビン遺伝子座には、5′-εy-グロビン-βh1グロビン（胚）-Hbb-bs（βmaj）-Hbb-bt（βmin）（胎児／成体）-3′の順に4つの遺伝子がある（図3i）。発生過程において、ζ-グロビン、εy-グロビン、βh1-グロビンは原始赤血球（胚7.5日目（E7.5）-E14.5）において胚性に発現し、胎児期および成体期においてα-グロビンとβ-グロビンを発現する定型赤血球において発現がサイレンシングされる14,15、これはグロビンスイッチングと呼ばれる過程である14,16,17。軟骨においてグロビンのスイッチングが起こるかどうかを調べるため、異なる発生段階の軟骨について逆転写による定量的PCR（RT-qPCR）を行った。その結果、初期胚（E14.5）の胎児成長板の軟骨細胞では、胚性ζ-グロビン、εy-グロビン、βh1-グロビンが高発現していたが（図3a）、後期胎児および成体成長板（E18.5およびP7）の軟骨細胞では、検出できないレベルまで急激に減少していた（図3a）。対照的に、胎児／成体のα-グロビンとβ-グロビンは、E14.5胎児成長板では最小発現量であったが、E18.5とP7マウスの成長板では高発現量であった（図3a）。したがって、グロビンのスイッチングは、赤血球の発生過程に似た形で、発生中の軟骨でも起こっていた。

図3：軟骨細胞におけるヘモグロビンのグロビンスイッチングと発現制御。
図3
a, RT-qPCRによる異なる発生段階のマウスの軟骨におけるヘモグロビンの発現。*b,c, 4日間in vitro培養した軟骨組織（b）および12時間培養した初代軟骨細胞（c）における示された遺伝子の発現レベル。パネルbでは、***P = 0.0003（Hba）、***P = 0.0007（Hbb）、**P = 0.0029（Hif1a）、P = 0.5285（Hif2a）、**P = 0.0042（Epo）、**P = 0.0030（Epor）。パネルcでは、***P = 0.0007 (Hba)、***P = 0.0008 (Hbb)、***P = 0.0016 (Hif1a)、P = 0.8062 (Hif2a)、***P = 0.0031 (Epo)、***P = 0.0002 (Epor)。d,e、Hif1aとHif2a（Hif1/2a）の両方をコンディショナルノックアウト（cKO）した初代培養軟骨細胞における、20％（d）または1％（e）のO2中で6時間培養した場合の表示遺伝子の発現。パネルdでは、**P = 0.0017（Hif1a）、***P = 0.0009（Hif2a）、**P = 0.0027（Hba）、**P = 0.0067（Hbb）、***P = 0.0001（Epo）、P = 0.1996（Epor）。パネルeでは、**P = 0.0065（Hif1a）、**P = 0.0018（Hif2a）、*P = 0.0236（Hba）、*P = 0.0198（Hbb）、*P = 0.0270（Epo）、P = 0.0671（Epor）。 fでは、20％または1％O2中で6時間培養した初代軟骨細胞における、示した遺伝子の発現。パネルgでは、**P = 0.0030（Klf1）、**P = 0.0030（Hba）、**P = 0.0031（Hbb）、P = 0.5240（Hif1a）、P = 0.0919（Hif2a）。パネルhでは、**P = 0.0030（Klf1）、**P = 0.0030（Hba）、**P = 0.0031（Hbb）、P = 0.5240（Hif1a）、P = 0.0919（Hif2a）。パネルhでは、**P = 0.0014（Klf1）、**P = 0.0031（Hba）、**P = 0.0031（Hbb）、P = 0.1152（Hif1a）、P = 0.5463（Hif2a）。βmajはβmajor、βminはβminor、Chr.は染色体、HSはDNase I過敏部位、LCRは遺伝子座制御領域、pro.はプロモーター。j,k, 軟骨細胞におけるα-グロビン（j）およびβ-グロビン（k）遺伝子座のLCRおよびプロモーターへのKLF1結合に関するChIP-qPCR結果。p = 0.0014 (HS26), 0.0052 (Hba1-pro), 0.0027 (HS-1), 0.0087 (HS-2), 0.0078 (HS-3), 0.0023 (Hbb-bs-Pro). n = 3生物学的に独立した実験(c-h,j,k)またはサンプル(a,b)。P値は、一元配置分散分析検定（a）または両側Studentのt検定（b-h,j,k）を用いて算出した。多重比較の調整は行わなかった。

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軟骨細胞におけるヘモグロビンの制御
低酸素はヘモグロビン発現の誘導因子として確立している。このメカニズムが軟骨細胞でも働くかどうかを調べるために、培養軟骨組織において低酸素環境下でのHbaとHbbの転写を調べた。予想通り、HbaとHbbのmRNAレベルは低酸素下で上昇し（図3b）、これは初代軟骨細胞でも確認された（図3c）。一方、Hif2aではなく、Hif1a、Epo、Eporの転写も誘導された（図3b,c）。ヘモグロビンの発現が低酸素によって活性化される主要な経路であるHIFシグナルによって制御されているかどうかを調べるために、Hif1a欠失軟骨細胞とHif2a欠失軟骨細胞におけるHbaとHbbのmRNAレベルを調べた。以前の報告18,19,20と一致して、軟骨細胞におけるHif1aのホモ接合体欠失は、Hif2aではなく、軟骨成長板の中心部に大量の細胞死をもたらした（Extended Data Fig.） Hif1aとHif2aを単独または組み合わせてノックアウトすると、初代培養軟骨細胞と胎児成長板において、正常酸素条件下と低酸素条件下の両方でEpoの発現が減少した（図3d,eおよびExtended Data Fig.5h-m）。しかし、HbaおよびHbbの発現は、Hif1aおよび/またはHif2aのノックアウトによって予想外に誘導された（図3d,eおよび拡張データ図5h-m）。このことは、GN44028によるHIF1αの化学的阻害およびPT2385またはPT2399によるHIF2αの化学的阻害、ならびにIOX2、roxadustatおよびDMOGによるHIF1αおよびHIF2αの化学的活性化の結果によってさらに確認された（拡張データ図6a-l）。これらの結果は、低酸素がHIF1/2αを介して軟骨細胞におけるヘモグロビン発現を促進する可能性は低いことを示唆している。

KLF1はヘモグロビン発現を仲介する
次に、赤血球造血に重要な転写因子21,22,23であるKLF1、RUNX1およびGATA1の低酸素ストレス下での発現を調べた。低酸素は、初代軟骨細胞においてKlf1の転写を有意に促進したが、Runx1やGata1の転写は促進しなかった（図3f）。KLF1はグロビンのスイッチングに必須であることが以前に報告されており24,25、その欠失はマウスのβ-サラセミアにつながった26,27。そこで我々は、ヘモグロビン発現に対するKLF1の制御機構を調べた。Klf1の条件付きノックアウトまたは短鎖干渉RNAを介したノックダウンは、初代軟骨細胞およびATDC5軟骨細胞におけるHbaとHbbの発現を有意に減少させた（図3g,h、拡張データ図7a-f、補足図3および4）。この結果と一致して、クロマチン免疫沈降（ChIP）-qPCRの結果、KLF1は軟骨細胞においてα-グロビン遺伝子座とβ-グロビン遺伝子座の両方の遺伝子座制御領域エンハンサーとプロモーター領域に直接結合していた（図3i-k）。したがって、これらの結果は、KLF1が軟骨細胞における低酸素誘導性のHbaおよびHbb発現を媒介する可能性を支持するものである。

低酸素による軟骨細胞のヘモグロビン制御におけるHIFシグナル伝達経路の非本質的な役割と一致して、Hif1aとHif2aのコンディショナルノックアウトは、単独でも組み合わせでも、Klf1の発現を低下させなかった。それどころか、正常酸素条件下でも低酸素条件下でも、Klf1の有意なアップレギュレーションをもたらした（Extended Data Fig.）最近の研究で、低酸素が介在するKDM5A（酸素依存性ジオキシゲナーゼで、JmjCヒストン脱メチル化酵素28を介してエピジェネティックに遺伝子発現を制御する）の不活性化が、ゲノムH3K4me3レベルを増加させることによってKlf10のアップレギュレーションを媒介することができたという、新規のHIF非依存性遺伝子制御が報告された29。偶然にも、バイオインフォマティクス解析により、Klf1の遺伝子内にH3K4me3修飾領域が同定されたが、HbaとHbbには同定されなかったことから（補足図5）、Klf1がKDM5Aを介して低酸素症の標的となる可能性が示唆された。この考えと一致するように、Kdm5aのノックダウンは、その近縁のファミリーメンバーであるKdm5bのノックダウンは行わず、正常酸素条件下でもKlf1の発現を有意に増加させた（Extended Data図8g-j）。このことは、ChIP-qPCR解析で示されたように、Kif1遺伝子座のH3K4me3修飾の増加と関連していたが、Bap1ネガティブコントロールのそれは関連していなかった（Extended Data図8k,l）。

軟骨細胞の生存にはヘディが必要
次に、遺伝子ノックアウトマウスを用いて、軟骨発生におけるヘモグロビンの役割を調べた。HbaまたはHbbをホモ接合性で欠失したE14.5マウス胚は、ヘテロ接合体または野生型（WT）同腹子よりも明らかに小さかった。骨格および組織学的アッセイから、ホモ接合体マウスでは、ヘテロ接合体またはWT同腹子に比べ、軟骨肥大が軽度遅れており、パターン欠損はほとんどないことが示された（補足図6a-h）。しかし、すべての胚がE16.5-E18.5で水腫を起こし死亡したのに対し、ヘテロ接合体マウスはE14.5あるいはE18.5で骨格の欠損はほとんどなく受胎可能であった（補足図7a-e）。さらに、P5では、組織学的検査とTUNELアッセイによって検出されたように、発育中の成長板の内側のゾーンで大量の細胞死が起こった（図4aおよび補足図7f）。これは、軟骨におけるHif1a欠失の表現型に似ていた9,10（拡張データ図5d）。

図4：ヘモグロビンは軟骨細胞の低酸素適応と胎児軟骨の生存に必須である。
図4
a, 遺伝子型の異なるP5マウスの上腕骨近位部軟骨の組織学的検査。矢印は死んだ軟骨細胞を示す。スケールバー、50μm。n = 6生物学的に独立したサンプル。 b, Hbb遺伝子をcKOした新生マウスの上腕骨近位部の組織像。コントロール：Hbb+/+/Col2a1-CreERT2マウス、Hbb-H-cKO：HbbF/+/Col2a1-CreERT2マウス（ヘテロ欠損）、Hbb-cKO：HbbF/F/Col2a1-CreERT2マウス。矢印は死んだ軟骨細胞を示す。スケールバーは50μm。n = 6生物学的に独立したサンプル。c, WTマウスとHbb-cKOマウスの軟骨におけるEF5陽性細胞の定量化。エラーバーはs.e.m. **P = 0.0080. d, 低酸素下（1％O2）で3日間in vitro培養したE18.5マウスの軟骨の組織学的検査。黒矢印は死んだ軟骨細胞を示す。e,赤血球、WTおよびHbb-cKO軟骨細胞の酸素解離曲線。Hbb-cKOの軟骨細胞は、ゆらぎのある曲線で示されるように、酸素結合能が低い。f,巣共培養実験の模式図。低酸素応答性細胞は内側のディッシュで培養し、赤血球またはヘモグロビン凝縮体は24時間密閉した外側のディッシュに入れて低酸素状態を作り出した。g,qPCRで調べた巣共培養の指示条件下でのHif1aの発現。データは3連実験の平均値±s.e.m.である。データ解析には両側スチューデントのt検定を用い、多重比較の調整は行わなかった。**P = 0.0019（リン酸緩衝生理食塩水）、P = 0.6454（HBA/HBB）、P = 0.4890（RBC）。NS、有意ではない

出典データ

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完全ノックアウトマウスから得られた知見を確認するため、Hbb遺伝子座を欠損させたマウスをPrx1-Creマウスと交配させた。Prx1プロモーターによってCreの発現が駆動されるため、間葉系細胞および軟骨細胞において条件付き遺伝子欠損が可能となる（補足図8および9a-c）。しかし、Hbbflox/flox（HbbF/F）/Prx1-CreマウスのE16.5成長板には、ほとんど欠損が見られなかった。HbbF/F/Prx1-Creマウスの軟骨の中心部では死細胞の増加が検出されたが、WTマウスのP1およびP5では検出されなかった（補足図9f-l）。貧血に関連した低酸素症が軟骨細胞の生存に及ぼす影響を除外するために、Col2a1-CreERT2マウスをHbbF/Fマウスと交配し、軟骨細胞特異的タモキシフェン誘導Hbbノックアウト（Hbb-cKO）マウスを作製したところ、肝臓や筋肉などの他の組織では貧血や低酸素症を示さず（Extended Data図9a-cおよび補足図10）、生後7日以内に死亡した（Extended Data図9d）。それでも、P1およびP5のHbb-cKOマウスの軟骨では、HbbF/F/Prx1-Creマウスと同様に軟骨細胞の死が起こった（図4bおよび補足図9f-l）。これは、時間的に誘導されたcKOアッセイにおけるHbbの発現の消失と関連していた（拡張データ図10a-c）。これらの結果は、軟骨内での軟骨細胞の生存にヘモグロビンが不可欠な役割を果たしていることを示している。

ヘディは低酸素適応に必要である
ヘモグロビンは酸素ベクターであることから、軟骨におけるヘモグロビンのノックアウトは、軟骨細胞の死滅に寄与する酸素不足をもたらすのではないかという仮説を立てた（図4a,b、Extended Data Figs.9と10、Supplementary Figs.7fと9f）。この考えを検証するために、ニトロイミダゾールEF5をE19.5で妊娠した雌マウスに注射し、その後、抗EF5抗体で免疫染色を行い、既述のように低酸素ストレス下にある細胞をその場で標識した9,10。Extended Data Fig.11a-eに示すように、Hbb-cKOでは軟骨成長板の軟骨細胞でHedyが欠損し、組織学および透過型電子顕微鏡分析で示されたように、これはEF5シグナルの増加とともに起こっており（図4cおよびExtended Data Fig.11f、トップパネル）、Hbbノックアウトによって軟骨の低酸素レベルが上昇したことを示している。同様に、Hbb-cKO軟骨ではHIF1aの発現量が増加した（Extended Data図11f、下パネル）。この低酸素効果は、運動時によく生じる刺激である圧力負荷の増加によってさらに増強され30、軟骨細胞のヘモグロビンに対する重要な生理学的意味を示唆した（拡大データ図11g-j）。さらに、メタボローム・プロファイルから、Hbb-cKO軟骨では、細胞内乳酸が有意に増加し（Extended Data図11k）、細胞内グルコースが有意に減少した（Extended Data図11l）。これらのデータを総合すると、Hbb-cKOの胎児成長板では、細胞内低酸素の亢進が軟骨細胞の解糖と死を促進したことが示唆される。しかし、Hbb欠失は細胞内ATPレベル、ATP対ADP比、pAMPK対AMPK比（補足図11a,b）を低下させず、総活性酸素種やミトコンドリア活性酸素種（補足図11c,d）を増加させなかったので、エネルギー供給障害や活性酸素種の産生亢進が、カスパーゼ3とは無関係と思われる軟骨細胞死を促進したとは考えにくい（補足図11a-gおよび12）。さらに、IOX2、roxadustat、DMOGなどのHIF1/2α活性化剤で処理すると、軟骨の死が促進されるどころか、ヘモグロビン欠乏によって誘導された死から軟骨が救済された（補足図13a-d）ので、軟骨細胞の死は持続的な低酸素によるHIFシグナルの活性化に起因するものではなかった。

軟骨細胞の低酸素耐性におけるヘモグロビンの重要な役割を調べるため、E18.5上腕骨軟骨成長板を低酸素環境（1％O2）で3日間培養する低酸素耐性実験を行った。その結果、HbaまたはHbbのどちらかを部分欠失させただけでも、軟骨成長板の低酸素による死に対して軟骨細胞が感作されることが示され（図4dおよびExtended Data Fig. 一貫して、ヘモグロビンがそのまま発現しているWT軟骨細胞は、P50（ヘモグロビンが酸素で50％飽和する酸素分圧）がはるかに低い（27.85mmHg対58.2mmHg）ことが示すように、赤血球よりも低酸素状態で酸素を放出する傾向があった（図4e）。低酸素時にヘディが酸素供給源として機能する可能性を確認するため、HBA-mCherryとHBB-GFPを共導入した239T細胞を低浸透圧破砕することでヘディを単離した（補足図14a）。単離されたHediesを低酸素感受性細胞であるPC12と24時間ネステッド共培養すると、上昇したHIF1α発現は、赤血球共培養およびノモキシア対照と同程度のレベルまで効果的に逆転した（図4f,g）。さらに、共培養実験では、ヘモグロビンを発現しているATDC細胞は、HIF1αの核局在によって決定されるように、隣接するヘモグロビン陰性細胞よりも低酸素に対する耐性が強かった（補足図14b,c）。従って、これらのデータは、細胞内ヘモグロビン（ヘディ）が軟骨の局所的な低酸素状態に対して軟骨細胞の生存を維持するための酸素を供給する局所的な酸素貯蔵器として機能しているという考えと一致する。

結論
組織内の細胞にとって、酸素の適時供給は必須条件である。赤血球は呼吸器系からさまざまな血管組織に酸素を長距離輸送するが、組織内の個々の細胞への酸素供給は拡散によってのみ達成される。これに対処するため、これらの組織内の細胞は、短距離で十分な酸素を得るための付加的なメカニズムを発達させる。例えば、筋肉細胞は酸素と結合して貯蔵できるミオグロビンを大量に発現しており、運動中に酸素を適時に長時間供給することができる31,32,33。神経細胞もまた、酸素を大量に必要とする細胞の一種であり、ニューログロビンを発現して酸素を貯蔵している34,35。しかしながら、軟骨の軟骨細胞など、酸素の利用可能性が限られている無血管組織の細胞が酸素を供給するための対応メカニズムは、ほとんど解明されていない。

本研究では、軟骨細胞が軟骨成長板の低酸素環境に適応するために、同様の戦略を用いることを報告する。逆に、軟骨細胞は組織特異的なグロビンを産生する代わりに、独自の組成のヘモグロビンを発現し、細胞質内に膜のないヘディを形成する。同じマウスの赤血球（58.2mmHg）に比べ、ヘディを含む軟骨細胞（27.58mmHg）のP50は著しく左シフトしている。P50が左にシフトすることで、軟骨細胞は低酸素環境から拡散してきた酸素と結合し、短距離供給のために貯蔵することができる。ヘモグロビンの枯渇、ひいてはヘディの喪失は、軟骨細胞の大量死と骨格形成の遅延をもたらした。われわれの知る限り、これはマウスモデルに基づく軟骨細胞におけるヘモグロビンの赤血球外での役割を証明した最初の研究である。

我々の発見は、ヘモグロビンは赤血球特異的であるという、通常よく受け入れられている見解を更新するものである。実際、赤血球以外の細胞におけるヘモグロビンの異所性発現は、過去数十年にわたって散発的に報告されてきた。標的細胞としては、肺胞上皮細胞（ATIIおよびクララ）36、マクロファージ37、メサンギウム細胞38、中脳ドーパミン作動性ニューロンおよびグリア細胞39、網膜色素上皮40、腫瘍細胞41などが挙げられる。それにもかかわらず、異所性発現の機能的な意味については、複数の文献があるにもかかわらず、in vivoでの証拠はほとんどなく、推測の域を出ていなかった。我々の研究では、マウスモデルにおいて、軟骨細胞におけるヘモグロビンの発現が低酸素に応答して誘導され、ヘモグロビンの枯渇が低酸素と解糖の増加をもたらし、HIFシグナル伝達経路を活性化することが示された。したがって、これらの結果は、ヘモグロビンの局所的貯蔵と酸素の適時供給における役割と一致している。これらの所見と一致するように、サラセミア症候群の患者には通常関節痛があることが報告されており42、貧血は関節リウマチ（約30～70％）43,44や軟骨毛低形成（約73％）45のような軟骨関連疾患のある人によくみられた。さらに、ヘモグロビン値が低い関節リウマチ患者は、より重篤な関節疾患を示し46、貧血治療により関節疾患はかなり緩和された47。

この研究のもう一つの興味深い発見は、ヘモグロビンが相分離の特徴を示す凝縮体を形成することである。この凝縮体は、異なる供給源の軟骨細胞で容易に検出され（図1）、切断分析によって、凝縮体の形成が実際に制御されたプロセスであることが示された（図2i-k）ので、これは実験的背景によるアーチファクトとは考えにくい。さらに、ヘモグロビンは網膜上皮40や緑内障細胞48内に顆粒状に分布しており、コンデンセートの形態と一致していることがわかった。これらの結果は、ヘモグロビンが決められた状況下で凝縮体を形成するという考えによく合致しているが、その制御についてはさらなる研究が必要である。この現象のもっともらしい説明としては、凝縮したヘモグロビンが限られたスペースにより多くの酸素を蓄え、酸素消費量の多い組織や血管のない組織からの細胞への酸素要求量を比較的長く維持するのに役立っているのではないかということである。

方法
マウス系統と遺伝子型決定
α-グロビン欠損対立遺伝子（Hba+/-、成体ヘモグロビン遺伝子α1とα2の両方、およびその間の領域を欠失させ、相同組換えによりネオマイシン耐性カセットに置換したもの）またはβ-グロビン欠損対立遺伝子（Hbb+/-、 Hbb-b1のすべてとHbb-b2の5′部分を包含するゲノム断片を、相同組換えによって挿入されたネオマイシンカセットで置換した）マウスを、Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg（HBA-HBBs）41Paz/J（No. 003342, Jackson Labs）49をWT C57BL/6Jマウスと交配することにより作製した。Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) 41Paz/Jマウスは鎌状赤血球マウス（バークレーモデル）と呼ばれ、α-グロビンとβ-グロビンの両ヌル対立遺伝子をホモ接合体で持ち、ヒト鎌状赤血球導入遺伝子（Hba0/0 Hbb0/0Tg (Hu-miniLCRα1GγAγδβS)）を持つ。HbaノックアウトまたはHbbノックアウト変異のホモ接合体マウスは、重度の貧血で子宮内で死亡する。Hif1aF/F（第007561号）50、Col2a1-CreERT2（第006774号）51、Prx1-Cre（第005584号）52マウスはJackson Labsから入手した。Hif2aF/F（NM-CKO-200163）マウスはShanghai Model Organisms Centerから入手した。軟骨細胞におけるHif1a遺伝子および/またはHif2a遺伝子を特異的にノックアウトするために、Hif1aF/Fマウスおよび/またはHif2aF/FマウスをCol2a1-CreERT2マウスと交配させた。タモキシフェン処理後、Hif1aF/F/Col2a1-CreERT2マウス、Hif2aF/F/Col2a1-CreERT2マウス、またはHif1aF/F/Hif2aF/F/Col2a1-CreERT2マウスは、Cre発現軟骨細胞中のHif1a遺伝子および/またはHif2aF/F遺伝子のセカンドエクソンを欠失させる。この研究には男女両方のマウスを使用した。ジェノタイピングはJackson Labsのウェブに記載されている方法で行った。

生体内におけるヘモグロビンの役割を調べるため、相同組換えによりC57BL/6JバックグラウンドのコンディショナルHbb欠損マウスを作製した。Hbb-bsの1-3エクソンとHbb-btの1-3エクソンの両方を置換するターゲティングベクターを設計した（HbbF/+またはHbbF/F；補足図8a）。胚性幹細胞の候補をスクリーニングし、さらにPCRで確認した。F1マウスはPCRで確認した。HbbF/Fマウスの遺伝子型決定には以下のプライマーを用いた： P1、5′-TGCATCTGCAGATCCCAAAA-3′およびP2、5′-GGAGGAGTGTACAAGGAGTTCAATAA-3′である。この2つのプライマーを用いると、特異的なWT（574bp）と変異体（766bp）のDNA断片を増幅することができる（補足図8b,c）。間葉系細胞や軟骨細胞におけるHbbを条件付きで欠損させるために、HbbF/FマウスをPrx1-CreマウスやCol2a1-CreERT2マウスと交配させた。

軟骨細胞におけるKLF1の役割を調べるため、相同組換えによりC57BL/6JバックグラウンドのコンディショナルKlf1欠損マウスを作製した。Klf1の第2エクソンを置換するターゲティングベクターをデザインした（補足図3a）。胚性幹細胞の候補をスクリーニングし、さらにPCRで確認した。F1マウスはPCRで確認した。Klf1/Fマウスの遺伝子型決定には以下のプライマーを用いた： P1、5′-AGGGGTCTGAGATCAAGGTGA-3′およびP2、5′-CGGTTCCCCTAACCCCTTTC-3′である。この2つのプライマーで、特異的なWT（317bp）と変異体（383bp）のDNA断片を増幅することが可能である（補足図3b,c）。軟骨細胞におけるKlf1を条件付きで欠損させるために、Klf1F/FマウスをCol2a1-CreERT2マウスと交配させた。

すべてのクローンは、第四軍医大学で病原体のない条件下で維持された。動物実験は、第四軍医大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。

in vivoでの新生マウスにおける組換えの解析
新生マウスまたは胚性マウスの成長板から軟骨を採取し、II型コラゲナーゼで消化した。次に、これらの消化された成長板からゲノムDNAを抽出した。Hba、Hbb、Hif1a、Hif2aまたはKlf1フロックス対立遺伝子の効率的な組換えは、対応するプライマーを用いたゲノムDNAのqPCRによって定量した。

組織学的解析
マウスを指定された年齢で安楽死させ、軟骨組織を採取し、4％パラホルムアルデヒドで一晩室温で固定した。出生後の骨格組織は0.5M EDTAで10日間脱灰した後、パラフィンに包埋した。4μmの厚さで連続切片をとり、標準プロトコールに従ってヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。マッソン・トリクローム染色は、キット（BA-4079A、Baso社製）を用い、メーカーの指示に従って行った。画像はすべて顕微鏡（BX51、オリンパス）で可視化し、付属のソフトウェアを用いてデジタルカメラ（DP71、オリンパス）で撮影した。

免疫組織化学染色および免疫蛍光染色
ジアミノベンジジンを基質として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（1:500; ab7090、Abcam）を用いて免疫組織化学染色を行った。HBAまたはHBBの発現は、HBA（MA5-32328、Invitrogen）またはHBB（PA5-60287、Invitrogen）に対する抗体を用いた免疫組織化学によって検出した。パラフィン切片を脱脂、再水和し、0.1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性は、切片を0.3% H2O2に30分間浸漬することでブロックした。非特異的結合は、切片をブロッキングバッファー（5%BSA、20%正常ヤギ血清、TBS中0.1%Triton X-100）中で30分間インキュベートすることによりブロックした。その後、切片をブロッキングバッファーで1:50に希釈したHBAまたはHBBに対する一次抗体とともに、4℃で一晩、加湿室でインキュベートした。その後、PBSで洗浄し、1:100希釈のHRP結合二次抗ウサギ抗体の混合液でインキュベートした。検出にはジアミノベンジジン基質を用い、対比染色にはヘマトキシリンを用いた。その後、サンプルを脱水し、可視化のためにマウントした。褐色の核を持つ細胞を陽性染色とした。抗HIF1α（ウサギポリクローナル；PA5-60287、Invitrogen）、HBA（MA5-32328、Invitrogen）またはHBB（PA5-60287、Invitrogen）抗体による免疫蛍光は、標準プロトコールに従ってパラフィン包埋切片で行った。

走査型電子顕微鏡
E14.5からP7までの、ペントバルビトン過量投与により死亡させた胚マウスまたは新生児マウスの上腕骨軟骨成長板近位端または大腿骨軟骨成長板遠位端を解剖し、関節包をステレオスコープ下で除去した。ヒトの膝関節軟骨は急性外傷患者のものであった。軟骨成長板または関節軟骨を0.1 M PBSで3回洗浄し、2.5％グルタルアルデヒド中4％パラホルムアルデヒドで24時間固定した。電子顕微鏡で観察する試料は、70％、80％、90％、100％のエタノールで順次脱水した（各回15分間）。乾燥後、試料を液体窒素で冷却して破砕し、密封した皿に4日間入れて、室温（24～26℃）下でさらに脱水した。試料は、高分解能スパッタコーター（Shinkku VD MSP 1S）を用いて白金でコーティングした。電子顕微鏡用試料は、走査型電子顕微鏡（S-4800、日立）を用いて画像化した。

軟骨組織における末梢血によるクロスコンタミネーションの可能性を排除するため、P6マウスのパラフィン包埋軟骨成長板を切片（4μm）に切り出した。切片をキシレン中で脱脂し（30分間）、続いて100％エタノール中で脱脂した（10分間）。切片を真空凍結乾燥機で 12 時間乾燥した後、スライド上の軟骨組織を含む領域（1 cm2）をガラスカッターで切断し、走査型電子顕微鏡（S-4800、日立）で観察した。

透過型電子顕微鏡
軟骨細胞内のヘダイの詳細を観察するために、標準的な手順に従って、骨端成長板の透過型電子顕微鏡（TEM）を行った。E14.5、E18.5またはP3マウスの骨端成長板を、ハサミとメスで関節包、靭帯、骨幹部骨を取り除き、素早く外科的に採取した。軟骨組織は、2.5％グルタルアルデヒド（pH7.3）中4％パラホルムアルデヒドで24時間固定した後、70％から100％まで濃度の高いエタノールで脱水し、SPI-PON812樹脂（SPI-CHEM）に浸潤包埋した。その後、5μmの厚さで切開し、1％トルイジンブルーで染色して光学顕微鏡で評価した。選択した部位の組織サンプルをウルトラミクロトーム（EM UC6、Leica）で切片に切断し、JEM-1230電子顕微鏡で研究用に準備した。超微細構造評価のために選択したブロックは、トリミングし、60 nmで切り出し、クエン酸鉛と酢酸ウラニルで染色し、透過型電子顕微鏡（日本電子）で観察した。電子顕微鏡写真は、Gatan社製デジタルカメラ（832 SC1000、Gatan社製）とそのアプリケーションソフトウェア（Gatan Digital Micrograph 3.0ソフトウェア）で撮影した。

HBB-eGFPを導入したHepG2細胞およびPLC/PR/F5細胞内のHediesの詳細を観察するために、標準的な手順に従ってTEMを行った。I型コラーゲンをプレコートした6ウェルプレートに約1×107個の細胞をプレーティングした。トランスフェクションから24時間後に細胞をペレット化し、リン酸緩衝液（0.1M、pH7.4）を加えた2.5%（v/v）グルタルアルデヒドで4℃、12時間固定した後、リン酸緩衝液を加えた1%（w/v）四酸化オスミウムで4℃、2時間固定した。その後、細胞を段階的エタノール系列（30％、50％、70％、80％、90％、100％、100％、各5分間、4℃）から純粋アセトン（2×5分間）まで脱水した。サンプルをアセトンとSPI-PON812樹脂の段階的混合物（3：1、1：1、1：3）に浸潤し（SPI-PON812 16.2ml、DDSA 10ml、NMA 8.9ml）、純樹脂に変えた。最後に、細胞を1.5%のBDMAを含む純樹脂に包埋し、45℃で12時間、次いで60℃で48時間重合した。超薄切片（70 nm）をミクロトーム（EMUC7、Leica）で切り出し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色し、透過型電子顕微鏡（FEI Tecnai Spirit 120 kV）で観察した。

免疫電子顕微鏡法
軟骨細胞内のヘダイにHBAとHBBが含まれているかどうかを調べるため、免疫金銀染色法によりHBAとHBBを検出する免疫電子顕微鏡検査を行った。P3マウスの骨端成長板を直径約0.5mmの小片に切断し、4％パラホルムアルデヒドと2.5％グルタルアルデヒド（pH7.3）で24時間固定した。非特異的結合をブロックするためにブロッキングバッファー（5％BSA、20％正常ヤギ血清、TBS中0.1％Triton X-100）で1時間インキュベートした後、軟骨組織の小片を、ブロッキングバッファーで1：50に希釈した一次抗体HBA（1：100；MA5-32328、Invitrogen）またはHBB（1：100；PA5-60287、Invitrogen）と、4℃で一晩、加湿チャンバー内でインキュベートした。その後、PBSで洗浄し、1.4nmの金球（Nanoprobes社製）に結合した抗ウサギIgG（1:100希釈）およびビオチン化抗モルモットIgG（1:200希釈）の混合二次抗体で一晩インキュベートした。洗浄後、切片をPBS中2％グルタルアルデヒドで45分間後固定した。HBAまたはHBBの免疫反応性を可視化するために、HQ Silver Kit（Nanoprobes社製）を用いて暗所で銀増感を行った。銀増強工程の前後に、切片を脱イオン水で数回洗浄した。その後、ABC溶液（Sigma）で4時間インキュベートし、グルコースオキシダーゼ-3, 3′-ジアミノベンジジン法で可視化した。免疫標識された軟骨組織は、0.1Mリン酸緩衝液中0.5％四酸化オスミウムで1時間固定し、段階的エタノール系列で脱水した後、プロピレンオキシドで脱水し、最後にSPI-PON812（SPI-CHEM）で平坦包埋した。重合後、軟骨組織を実体顕微鏡下でトリミングし、ブランク樹脂スタブにマウントした。超薄切片をウルトラミクロトーム（EM UC6、Leica）で切り出し、メッシュグリッドにマウントした（1グリッドあたり6-8切片）。その後、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で対染色し、電子顕微鏡（JEM-1230、日本電子）で観察した。電子顕微鏡写真は、Gatan社製デジタルカメラ（832 SC1000、Gatan社製）とそのアプリケーションソフトウェア（Gatan Digital Micrograph 3.0ソフトウェア）で撮影した。

軟骨組織のin vitro培養
軟骨細胞におけるHBAまたはHBBのin vitroでの役割を調べるために、軟骨組織の培養を行った。WT、Hba+/-、Hbb+/-、Hba-/-またはHbb-/-の遺伝子型を持つE14.5またはE18.5胚の同腹子の上腕骨または大腿骨全体を単離した。マウスには番号をつけ、遺伝子型に基づいてグループ分けした。各マウスについて、上腕骨または大腿骨をin vitro培養に用いた。上腕骨または大腿骨は、6ウェルプレート中で、0.25％トリプシンにより37℃で15分間消化した。軟骨成長板上の筋と腱が除去されるまで、サンプルを繰り返しピペットした。その後、軟骨成長板を鋭利なピンセットで静かに集め、12ウェルプレートで10％FCS、100ユニット/mlペニシリン、50μg ml-1ストレプトマイシン（Gibco）を添加したα-MEM培地で培養した。低酸素実験では、軟骨組織を10％FCS添加α-MEM中、1％O2で3-6日間培養した。低酸素実験後、これらの培養軟骨を回収し、組織学的検査とTUNEL検査のために準備した。

低酸素下での軟骨細胞の初代培養
軟骨細胞の初代培養は、P3マウスの成長板をハサミで小さく切り分け、α-MEM培地に溶解した0.1％コラゲナーゼII型（Gibco）で37℃、12時間消化した。この細胞を75μmのナイロンメッシュで濾過し、10％FCS添加α-MEM培地を用いた6ウェルプレートで培養した。初代軟骨細胞は6×105個/cm2の密度で播種した。培地は1日おきに交換した。低酸素実験では、一次軟骨細胞を10％FCS添加α-MEM中、1％O2で48-72時間培養した。

TUNELアッセイ
TUNELアッセイは、In Situ Apoptosis Detection kit (11684795910, Roche)を用い、メーカーの説明書に従って、前述53のように行った。

EF5染色
マウスの成長板における軟骨細胞の酸素化状態を調べるために、低酸素感受性薬剤であるEF5を用いた。EF5は、2-ニトロイミダゾールであるエタニダゾールの五フッ化誘導体であり、酸素阻害性ニトロレダクターゼによって代謝的に還元される。EF5染色は、マウスの成長板から採取した固定凍結切片を用いて行った。E19.5のHbbヘテロ接合体妊娠雌マウスに、体重の1%(v/w)の10 mM EF5 (Merck)を注射した。2～3時間後、マウスを冷PBS中で解剖した。骨端成長板は、関節包、靭帯および骨端骨をはさみで切断することにより外科的に迅速に分離し、冷アセトン中で4℃で10分間固定した後、風乾し、PBSで洗浄した。ブロッキングは、PBS中の5％マウス血清で室温で30分間行った。切片を、3% BSAとPBSで1:20に希釈したマウス抗EF5 Cy3結合抗体（EF5-30C3、Merck）で37℃で1時間染色した。スライドをPBSで5分間洗浄し、水性マウント液でマウントした。EF5とDNAの蛍光は、DAPIとCy3に適したフィルターを備えた蛍光顕微鏡とデジタルカメラを用いて記録した。

ウェスタンブロット分析
P1～P7マウスの軟骨成長板を、関節包、靭帯、骨幹部骨をハサミで素早く除去して採取した。成長板を0.1M冷PBSで3回洗浄した。次に、軟骨組織を剪断、粉砕し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含むRIPA（radio immunoprecipitation assay）緩衝液に溶解した。軟骨組織または軟骨細胞溶解物（50μg）を12％SDS-PAGEゲルで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（Millipore）に転写した。PVDF膜は、0.1%(v/v)Tween-20を加えたトリス緩衝生理食塩水中の5%(w/v)脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした。次に、膜をHBA（1:1,000; MA5-32328, Invitrogen）またはHBB（1:1,000; PA5-60287, Invitrogen）およびα-チューブリン（1:3,000; 2125, Cell Signaling Technology）抗体で4℃で一晩プローブした。二次検出は、抗ウサギ抗体（1:10,000; A0545, Millipore）または抗マウス抗体（1:10,000; M4155, Millipore）を用いて室温で1時間行った。

初代軟骨細胞またはATDC5軟骨細胞からのタンパク質をRIPA緩衝液で抽出した。各サンプル50μgのタンパク質を、あらかじめキャストした4-20％Trisゲルで電気泳動した。Bio-Rad Criterionシステムを用いてPVDF膜にゲル転写した後、ブロットを5％脱脂乳／1×TBSTで室温で1時間ブロッキングし、以下の一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした： HIF1α（20960-1-AP、Proteintech）1:1,000、HIF2α（Epas1としても知られる）（NB100-122、Novus）1:1,000、KLF1（EKLFとしても知られる）（PAB5859、Abnova）1:1,000、AMPK（A1229、ABclonal）1： 1000、pAMPK（AP1002、ABclonal）を1:1,000、カスパーゼ3（A19654、ABclonal）を1:1,000、KDM5A（A4755、ABclonal）を1:1,000、KDM5B（A15740、ABclonal）を1:1,000でインキュベートした。その後、膜をHRP標識抗ウサギ抗体（1:10,000; Millipore）または抗マウス抗体（Millipore）と1×TBST中、室温で1時間インキュベートした。シグナルは強化化学発光を用いて検出した。タンパク質分子量は、タンパク質マーカー（PM2610、SMOBIO）を用いて決定した。ウェスタンブロットの画像はBio-Rad Image Labシステムで取得、解析した。定量はImageJを用いて行った。α-チューブリンシグナルはタンパク質量の正規化に用いた。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
P3マウスの凍結上腕骨縦軟骨をクライオスタット（Leica Biosystems）で切片（10μm）に切り出した。切片をPEN膜フレームスライド（Leica Microsystems）に置き、95％エタノールで1分間固定した。スライドを蒸留水に1分間3回浸し、OTC試薬を除去した。その後、切片をH&E染色した：ハリスヘマトキシリン（BA-4041、Baso）、30秒；脱イオン水、3分；エオシン（BA-4042、Baso）、5秒；95％エタノール、15秒；および100％エタノール、15秒。切片は真空凍結乾燥機で室温（24-26℃）下で24時間乾燥させた。乾燥後、軟骨細胞をLMD6000（Leica Microsystems）を用いて、製造者の指示に従って1つずつ微小解剖した。約200個の軟骨細胞から分離したサンプルを0.5mlの微量遠心チューブのキャップにプールし、質量分析（装置：Orbitrap Ascend Tribrid MS）用に組織抽出バッファー（PicoPure RNA Isolation Kit, Applied Biosystems）に溶解した。

SDS-PAGEおよび質量分析
新生児マウスの成長板の軟骨細胞からのタンパク質を質量分析により測定した。溶解バッファーには、pH7.2のPBSバッファーに2％SDS、10％グリセロール、10mMジチオスレイトール（DTT）、1mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤混合液（Roche Applied Science）を加えたものを用いた。サンプル中の総タンパク質は、濃度既知の標準タンパク質マーカーに従って、クマシーブルー染色SDSゲルで推定した。質量分析用に、各サンプル中のタンパク質を12% SDSゲル（厚さ1.0 mm）で分離し、クマシーブルーG-250で染色した。レーン全体を15個に切断し、ゲル内でトリプシン消化を行った。タンパク質消化は、Wisniewskiら54. 簡単に言うと、タンパク質断片を30μlのSDTバッファー（4% SDS、100mM DTT、150mM Tris-HCl pH8.0）中、90℃で5分間可溶化した。200μlのUAバッファー（8M尿素、150mM Tris-HCl pH8.0）を用いて、限外ろ過（Microcon units, 30kDa）を繰り返し、洗浄剤、DTT、その他の低分子量成分を除去した。次に、還元システイン残基をブロックするために、UAバッファー中の100μlの0.05Mヨードアセトアミドを加え、暗所で20分間インキュベートした。フィルターを100μlのUAバッファーで3回、次に100μlの25mM NH4HCO3で2回洗浄した。最後に、タンパク質懸濁液を40μlの25mM NH4HCO3中2μgのトリプシン（Promega）で37℃で一晩消化し、得られたペプチドをろ液として回収した。

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）測定は、Q Exactive質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に連結したEasy-nano-LC（Thermo Fisher Scientific）で行った。ペプチドは、逆相カラム（15cm、内径75μm、3μmのReprosil樹脂）で、水-アセトニトリルの100分間のグラジエントを用いて分離した。MS測定はすべてポジティブイオンモードで行った。各スキャンサイクルは、1回のフルスキャンマススペクトル（m/z 300-1,800）に続き、次の動的排除設定（繰り返し回数2、繰り返し時間30秒、排除時間90秒）で最も強いイオンの20回のMS/MSイベントから構成された。試料は、まず10μl min-1の流速でトラップカラムにロードし、次に多次元液体クロマトグラフィー（MDLC）で0-50% Bの直線勾配を60分間かけて1,200nl min-1の流速で脱塩試料を溶出した。MS/MS実験にはQ Exactive質量分析計を使用し、イオン移動キャピラリーは160℃、ISpary電圧は3kVであった。正規化コリジョンエネルギーは35。

すべてのデータファイルはBioworks Browser rev. 3.1 (Thermo Electron)を使用し、プリカーサーの質量許容差は1.4 Da、閾値は100、最小イオンカウントは10で作成した。取得されたMS/MSスペクトルは、SEQUEST検索エンジン（Proteome Discoverer Software 2.3.0.523）を用いて、連結されたターゲット/リバースGlycine_maxデータベースに対して検索された。ターゲットデータベースには、NCBIデータベースから2010年5月20日にダウンロードされたGlycine_maxタンパク質配列（80,292エントリー）が含まれる。検索はソフトウェアのトリプシン酵素パラメータで行った。メチオニン酸化は差分修飾としてのみ指定し、シスチンカルバミドメチルは固定修飾とした。すべての出力結果は、build summaryという社内のソフトウェアを使って結合された。フィルターは偽発見率≦0.01に設定した。

LC-MSによる細胞内乳酸とグルコースの測定
新生児コントロールマウスとHbb-cKO変異マウスから単離した膝軟骨を液体窒素で急速凍結した。24時間後にサンプルを取り出し、水100μl/50mgを加え、組織ホモジナイザーで粉砕した。その後、組織ホモジネートを 30 秒間振盪し、400 μl のメタノール・アセトニトリル溶液（1:1, v/v）を加え、60 秒間振盪した。4 °C で 30 分間の超音波処理を 2 回行った後、-20 °C で 1 時間静置し、4 °C で 20 分間遠心（14,000 rcf）し、上清を回収して凍結乾燥した。抽出物は、液体クロマトグラフィーシステム（1290 Infinity、Agilent）とAB Sciex API 5500 Qtrap質量分析計（AB Sciex）を用いたLC-MSで分析した。高性能LCの詳細は以下の通り：サンプルは、カラム温度45 °C、流速300 µl/min-1、注入量2 µlで、4 °Cの自動サンプラーに入れた。5500 QTRAP ESIソースの条件は以下の通り：ソース温度450℃、イオン源ガス1（Gas1）： 45、イオン源ガス2（Gas2）： 45, カーテンガス(CUR): 30, ionSapary voltage floating (ISVF)：クロマトグラフィーのピーク面積とリテンションタイムはMultiquantで抽出した。リテンションタイムの補正と代謝物の同定には、エネルギー代謝の標準物質を用いた。

骨格の調製
アルシアンブルーおよびアリザリン S レッドによる骨格標本のホールマウント染色を行った。簡単に説明すると、胚の皮を剥いで内臓を除去した。95％エタノールで4日間固定した後、胚を一晩アルシアンブルー溶液で染色した。70％エタノールで洗浄後、アリザリンS赤溶液で一晩染色し、1％KOHに1週間移した。最後に、胚を1% KOH/20%グリセロールに2日間移し、50%エタノール/50%グリセロールで保存した。骨格の画像は、デジタルカメラ（DP71、オリンパス）を装着した実体顕微鏡（SZX16、オリンパス）を用いて撮影した。

RNA単離、逆転写およびリアルタイムPCR
マウスの軟骨組織または初代培養軟骨細胞を採取し、TRIzol（Invitrogen）で溶解し、メーカーの標準プロトコールに従ってRNA単離を行った。cDNAは1μgのRNA Maxima First Strand cDNA Synthesis kit（Takara）から合成した。リアルタイムPCRは、Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（タカラ製）を用いてABI Fast7500で行った。プライマーペアは以前に記載されており25,55,56,57,58、補足表3に含まれている。蛍光 qPCR はリアルタイム蛍光 qPCR 装置（qTOWER3G, Jena Bioscience）とそのアプリケーションソフトウェア（qPCRsoft 3.4）を用いて行った。リアルタイムPCRの結果はMicrosoft Excel (2306 Build 16.0.16529.20164)で解析した。

RNA-seq解析
P6マウスの膝関節軟骨組織をRNA-seq解析用に採取した。Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）を用いて、抽出・精製したRNAの完全性を確認した。TruSeq RNAサンプル調製キット（Illumina）を用いてライブラリーを作成した。ライブラリーはIllumina HiSEq 2500シーケンサーを用いて配列決定した。上記の工程はすべてShanghai Biotechnology Corporationが行った。

ChIP-qPCR
ChIP-qPCR実験にはマウスの軟骨を用いた。P3マウスの成長板をハサミで小さく切り分け、α-MEM培地に溶解した0.1％コラゲナーゼII型（Gibco）で37℃、1時間消化した。ChIP実験の手順の詳細は、以前に記述されている59。ChIP-qPCRには以下の抗体を用いた： KLF1（1:50；61233、Active motif）、H3K4me3（1:50；A2375、ABclonal）、H3（1:50；17168-1-AP、Proteintech）および非特異的IgG（ウサギ、1:50；30000-0-AP、Proteintech）。プライマーペアは以前に記載されており60,61、Supplementary Table 3に記載されている。

ヒト関節組織サンプル
急性外傷患者からのヒト健常関節軟骨標本は、インフォームド・コンセントと第四軍医科大学西京病院研究倫理委員会によるプロジェクトの承認を得て、西京病院病理部から採取した。軟骨標本は4％パラホルムアルデヒドで室温48時間固定し、0.5M EDTAで30～90日間脱灰した後、パラフィンに包埋した。4μmの厚さで連続切片を作成し、H&E染色またはマッソン・トリクローム染色を行った。

細胞培養と化合物
293T、HepG2およびHCT116細胞は、10％FBS（Kang Yuan Biol）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Macgene Tech）を添加したDMEM（Macgene Tech）で維持した。PLC/PR/F5細胞は、10％FBS（Kang Yuan Biol）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Macgene Tech）を添加したRPMI-1640（Macgene Tech）で培養した。PC12細胞は、10％ウマ血清（Kang Yuan Biol）、5％FBS（Kang Yuan Biol）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Macgene Tech）を添加したRPMI-1640（Macgene Tech）で培養した。細胞はすべて、5% CO2、37℃で培養した。

構築物
本研究では、HBBおよびHBAタンパク質をpQCXIP-eGFPまたはpQCXIP-mCherryで発現するプラスミドを構築した。HbbとHbaのcDNAはBeijing Genomics Institute（中国、北京）で合成した。WTのHbbとHba、およびそれらの変異体は、シームレスな相同組換えによってpQCXIP-eGFPまたはpQCXIP-mCherryにクローニングした。pBABE-CAAX-mCherryは研究室で維持している。構築の詳細を補足表4に示す。

プラスミド導入
プラスミドトランスフェクションのために、I型コラーゲン（354236, BD Bioscience）をプレコートした12ウェルプレートに1ウェルあたり約3×105個の細胞をプレーティングし、12時間培養した。その後、提供されたプロトコールに従って、Lipofectamine 2000試薬（11668019, Thermo Fisher Scientific）を用いてそれぞれの構築物で細胞をトランスフェクトした。

HBB-eGFP病巣の定量化
トランスフェクションから24時間後、グラスボトムプレート（Nest Biotechnology社製）にプレーティングした細胞を用いて、広視野イメージングを行った62。電動ステージと Neo Vacuum 冷却 Scientific CMOS Camera (Andor Technology) を備えた Nikon Ti-E 顕微鏡を使用した。画像は10倍または20倍のApo対物レンズを用い、微分干渉コントラストチャンネルでは15ms、FITCチャンネルでは150msの露光で収集した。緑色蛍光を発現している細胞の数を分母として数え、病巣陽性細胞の数を分子として数えた。

タイムラプスイメージング
細胞は15 mmのガラスボトムディッシュ（Nest）上で増殖させ、Ultraview Vox共焦点システム（Volocity 6.3.00、Perkin Elmer）システムで60倍のオイル対物レンズを使用して画像を撮影した。2つのHBB-eGFP病巣の融合実験では、トランスフェクション後24時間、5分ごとに細胞を撮像した。

フォトブリーチ後の蛍光回復
光退色後の蛍光回復（FRAP）アッセイは、Nikon共焦点顕微鏡システムのFRAPモジュールを用いて行った。HBB-eGFPを488nmのレーザービームで漂白した。漂白は100%のレーザー出力で円形の関心領域に焦点を当て、タイムラプス画像を収集した。蛍光強度はNikon共焦点顕微鏡システム（NIS Elements AR 4.50.00）を用いて測定した。値は、漂白前の時点に対する比として報告されている。FRAP 結果のプロットと解析には GraphPad Prism を使用した。

酸素解離曲線とP50の決定
眼窩後穿刺により血液を採血管（BD Vacutainer）に採取し、400gで15分間遠心して上清を除去し、WTおよびHbb-cKO軟骨細胞を得て、上述したようにした。3mgのヘモグロビンと1×107個の軟骨細胞を含む赤血球を4mlのBLOODOX-Solution緩衝液で希釈し、20μlのBSA（Thermo Fisher Scientific）と20μlの消泡剤（Sigma Aldrich）と混合した。酸素解離曲線測定には、酸素解離分析装置（BLOODOX-2018 Analyser、Softron Biotechnology）を使用した。サンプル緩衝液をキュベットに採取し、平衡化して37℃に保ち、同時に空気で酸素を100%にした。pO2（酸素分圧）値の調整後、試料を窒素で脱酸素した。クラーク酸素電極を用いて、脱酸素過程における酸素張力の変化をX-YレコーダーのX軸で検出し、同時に560nmと570nmの2波長分光光度計でデオキシヘモグロビン分画をモニターし、Y軸に表示した。最後に、酸素解離曲線（ODC）をグラフ用紙に自動記録し、O2飽和度が50％になる点としてP50値をx軸に外挿した。

BLOODOX-溶液緩衝液は、130 mM NaCl（Chinese Medicine Group Chemical Agent）、30 mM TES（Sigma Aldrich）、5 mM KCl（Chinese Medicine Group Chemical Agent）を含み、pH 7.4±0.01である。

HBAとHBBからなるヘディの抽出
約2×107個の293T細胞を、I型コラーゲン（354236, BD Bioscience）をプレコートした150mmディッシュにプレーティングし、12時間培養した。pQCXIP-HBA1-mCherryとpQCXIP-HBB-eGFPを1:8の割合で293T細胞に共導入した。トランスフェクションから48時間後に培地を除去し、その後細胞を消化し、10mlのddH2oで4℃で20分間破裂させた。次に、サンプルを3,000gで15分間遠心して上清を除去し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（CW2200S、CWBIO）を加えた4mlのPBSで再懸濁した。赤血球は上記のようにして得た。

ネステッド共培養による低酸素レスキュー
低酸素条件下でヘディが酸素源として機能するかどうかを調べるために、ネステッド共培養アッセイを開発した。簡単に説明すると、低酸素感受性PC12細胞を低酸素レポーター細胞として、I型コラーゲン（354236、BD Bioscience）をプレコートした15mmディッシュ（Nest）にプレーティングし、アセトンで35mmディッシュ（Nest）内に固定した。4mlまたは5×107個の赤血球のヘモグロビン凝縮液を35mmディッシュに加えた。その後、PC12細胞から全RNAを抽出し、2組のプライマー（β-アクチン-F：GATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA；β-アクチン-R： β-アクチン-F：GATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA；β-アクチン-R：CAGCTCAGTAACAGTCCGCC；HIF1α-F：CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA；HIF1α-R：GCTGTCCACATCAAAGCGTACTCA。

赤血球数とヘモグロビン分析
5日目（P5）に生まれた各マウスの末梢血（20μl）をルーチン検査に使用した。全血は後眼窩穿刺によりヘパリン化ガラスキャピラリーチューブに採取した。赤血球数とヘモグロビン濃度は、自動血液分析装置（XP-100、Sysmex Corporation）とそのアプリケーションソフトウェア（XT2000i1800i IPU）で行った。

総ROSの分析
プライマリー軟骨細胞を用いて、ROSアッセイキット（Cayman Chemicals社製）を用い、製造者の指示に従って総活性酸素種（ROS）蓄積量を定量した。トリプシン-EDTA（0.05％）を用いて37℃で短時間トリプシン処理した後、細胞を5mMジヒドロエチジウムプローブとともに暗所で37℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を活性酸素染色バッファーで2回洗浄した。フローサイトメトリーはフローサイトメーター（Coulter-XL）を用いて行った。解析にはEXPO32 ADCソフトウェアを用いた。

ミトコンドリア活性酸素の解析
製造者の指示に従って、ミトコンドリアROS蓄積をMitoSOXassayキット（Invitrogen）を用いて行った。簡単に説明すると、単離・培養した初代軟骨細胞を5 mM MitoSOXプローブとともに37℃、暗所で20分間インキュベートした。37℃でTrypsin-EDTA（0.05%）で短時間トリプシン処理した後、細胞をFACSバッファー（1×DPBS＋5％FBS）で2回洗浄し、フローサイトメーター（Coulter-XL）を用いてフローサイトメトリーを行った。解析にはEXPO32 ADCソフトウェアを用いた。

細胞内ATPおよびADPの測定
タモキシフェンを3日間投与した後、P5 HbbF/F（コントロール）またはHbbF/F/Col2a1- CreERT2（Hbb-cKO）の成長板から軟骨を採取し、直ちに液体窒素で急冷した。液体窒素を蒸発させた後、軟骨を-80℃で保存した。サンプルは上記のようにLC-MSで分析した。

in vitroにおける死細胞のカウント
P5 HbbF/Fマウス（コントロール）またはHbb-cKOマウスから単離した初代軟骨細胞をin vitroで培養した。Trypsin-EDTA（0.05%）で短時間トリプシン処理し、トリパンブルーで染色した後、生細胞と死細胞の数を数えた。

ヘモグロビンの細胞内発現による低酸素レスキュー
細胞内のヘディが低酸素条件下で酸素供給源として機能するかどうかをさらに調べるため、ヘモグロビンの細胞内発現と閉鎖空間での細胞培養が開発された。簡単に説明すると、1×105個のATDC5細胞（ECACC）を35mmディッシュ（Nest）にプレーティングし、12時間培養した。プラスミドpQCXIP-HBA1-mCherryとpQCXIP-HBB-eGFPをLipofectamine 2000試薬（11668019、Thermo Fisher Scientific）により1：8の割合で293T細胞に共導入した（合計900ng）。トランスフェクションの24時間後、増殖培地を1％O2で4時間前処理した新鮮な培養液に交換し、直後にディッシュをプラスチックフィルムとPARAFILM（Bemis）で2時間密封した。二次抗体を1時間塗布した後、PBSで10分間3回洗浄し、DAPI入りアンチフェード試薬（Invitrogen）でマウントした。HIF1αシグナルを検出するために、電動ステージおよびNeo Vacuum冷却Scientific CMOSカメラ（Andor Technology）を備えたNikon Ti-E 顕微鏡を使用した。画像は、DAPI、Cy3、Cy5、およびFITCチャンネルで、60倍のApo対物レンズを使用して収集した。核内のHIF1αシグナルの強度をすべて定量し、ヘモグロビン病巣陰性細胞の強度の平均値を分母としてカウントし、個々の値を正規化した。

マウス軟骨組織および細胞における脂質およびRNAの免疫蛍光法
マウスから摘出した軟骨組織を液体窒素中でスナップ凍結し、OCTコンパウンド（Sakura Finetechnical）に入れ、再度スナップ凍結した。ライカクライオスタット（Leica）を用いて凍結組織切片（厚さ6μm）を得た。

外来性ヘモグロビン体を検出するために、I型コラーゲン（354236、BD Bioscience）をプレコートした12ウェルプレートに、1ウェルあたり約3×105個のPLC/PR/F5細胞をプレーティングし、12時間培養した。その後、細胞をLipofectamine 2000試薬（11668019、Thermo Fisher Scientific）でpQCXIP-HBBをトランスフェクトし、6時間後に新鮮な培養液に交換した。トランスフェクションから24時間後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した。

全サンプルを4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、5%BSAで30分間ブロックした後、脂質標識抗体HBB（1:50; PA5-60287, Invitrogen）およびBODIPY（1:1,000; D3822, Thermo Fisher）、またはRNA標識抗体StrandBrite RNA Green（1:500; 23170, AAT Bioques）と加湿ボックス内で1時間インキュベートし、その後PBSで10分間3回洗浄した。二次抗体を1時間塗布し、その後PBSで10分間3回洗浄し、DAPI入りAntifade試薬（Invitrogen）でマウントした。電動ステージとNeo Vacuum cooled Scientific CMOS Camera（Andor Technology社製）を装備したNikon Ti-E 顕微鏡を使用した。画像は、DAPI、Cy3、FITCチャンネルを用い、60倍のApo対物レンズで収集した。

in vitro液液相分離アッセイ
相バッファー（150 mM KH2PO4/K2HPO4 (7778-77-0/7758-11-4, Solarbio) pH 7.35、PEG2000 (25322-68-3, Solarbio) 10%(w/v)）と組換えヘモグロビンα1 (RPD090Mu01, Cloud Clone)、組換えヘモグロビンβ (RPD098Mu01, Cloud Clone)を用いてin vitro液相分離アッセイを行った。

条件最適化のため、HBBタンパク質を1 mg μl-1の濃度になるようにddH2Oに溶解し、最終濃度に希釈した： 62.5、125、250、500 ng μl-1をddH2Oとバッファー（300 mM KH2PO4/K2HPO4、pH 7.35、PEG2000可変）で希釈した。混合物をスライドガラス上にスポットし、カバースリップで密封した。スライドをNikon Ti-E顕微鏡で撮像した。画像は60倍のApo対物レンズで収集した。

試験管内でのPEG滴定実験では、HBBタンパク質の濃度は1 mg μl-1とした。HBB および HBA タンパク質の濃度は、in vitro での液滴形成には 0.5 mg μl-1 であった。HBB IDR変異体の濃度は、in vitroでの液滴形成に対して1 mg μl-1であった。すべての組換えタンパク質はDetai Bioscienceから購入した。緩衝液（150 mM KH2PO4/K2HPO4、pH 7.35、PEG2000 10%）は、PEG滴定実験を除くすべての実験に使用した。

HBB-eGFP組換えタンパク質はSolarbio Cloneで精製し、粉末を1 mg μl-1の濃度になるようにH2Oに溶解し、最終濃度に希釈した： LLPSバッファー（300 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.35, PEG2000 20%）で500 ng μl-1に希釈し、FITCチャンネルで検出した。

外因性HBBおよびその変異体発現のウエスタン分析
プラスミドのトランスフェクションには、I型コラーゲン（354236、BD Bioscience）をプレコートした6ウェルプレートに、1ウェルあたり約6×105個の293T細胞をプレーティングし、12時間培養した後、Lipofectamine 2000試薬（11668019、Thermo Fisher Scientific）を用いて、同じ用量のコンストラクトを細胞にトランスフェクトし、6時間後に新鮮な培地に交換した。トランスフェクションから24時間後、細胞を0.1Mの冷PBSで3回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含むRIPA緩衝液で溶解し、超音波処理で断片化した。ウェスタンブロッティング法の詳細は前述の通りである。GFPに対する抗体（1:1,000; 2555, CST）は、eGFPタグ付きHBBとその変異体を認識するために使用した。

光電子顕微鏡観察
プラスミドのトランスフェクションには、I型コラーゲン（354236、BD Bioscience）をプレコートした12ウェルプレートに、1ウェルあたり約3×105個のHepG2細胞をプレーティングし、12時間培養した。トランスフェクションから12時間後、細胞をガラス底Grid-500ディッシュ（81168、ibidi）で培養した。トランスフェクションから36時間後、細胞を0.15M PBS緩衝液pH7.35中2％パラホルムアルデヒド（16005、シグマ）で室温で30分間固定した。凝集体を持つ細胞が見つかったら、蛍光モードから微分干渉コントラストモードに切り替えて、グリッド上の位置を記録した。蛍光イメージング後、電子顕微鏡の処理を容易にするため、陽性細胞のある選択した領域に印をつけた。共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 980）で観察し、付属ソフトウェア（ZEN 3.6095.01）で画像処理した後、0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中、2.5％グルタルアルデヒド（25％グルタルアルデヒドアンプル；111-30-8、SPI）で4℃、一晩後固定した。リン酸緩衝液で2回、ddH2Oで2回洗浄した後、1％OsO4（w/v）および1.5％（w/v）フェリシアン化カリウム水溶液で4℃、1.5時間固定し、ddH2Oで順次洗浄した（3回）。その後、サンプルを2% UAで1時間染色し、ddH2Oで3回洗浄した。その後、サンプルをエタノール（30、50、70、80、90、100％を2回）でインキュベートし、アセトンで2回インキュベートして脱水した。水和後、サンプルは浸潤および包埋ステップに供され、サンプルはSPI-PON812樹脂（SPI）で以下のように浸潤された： 3:1、1:1、1:3のアセトン:樹脂と100%樹脂を2回行い、その後試料を60℃で48時間樹脂で包埋重合した。最終的に、AutoCUTS（Zhenjiang Lehua Technology）装置付きウルトラミクロトーム（UC7、Leica）を用いて連続超薄切片（厚さ100 nm）を形成し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で二重染色した。連続切片は最終的に、Helios Nanolab 600i dual-beam SEM（Thermo Fisher）と自動画像処理ソフトウェア（AutoSEE 1.58）によって自動的に取得された。

統計解析
棒グラフで示した定量データは、平均値±s.e.m.および必要に応じて個々のデータポイントを示し、各ポイントは生物学的複製を表す。統計解析はGraphPad Prism 8.0.1を用いて行った。正規分布データの2群間の有意性の判定には、対応のない両側スチューデントのt検定を用いた。1つの固定因子を持つ複数群間の比較には、通常の一元配置分散分析（ANOVA）を使用し、その後にDunnettを使用した。一元配置分散分析に続いてBonferroniの多重比較検定が、複数のグループを単一のコントロール・グループと比較するために使用され、各セルの平均を使用し、コントロール・セルの平均と比較した。複数の比較が同じ統計範囲を持つ場合、値は対応するパネルの左から右に表示されるように列挙した。正確なサンプルサイズ、統計学的検定、P値は、図の凡例および/またはソースデータに記載されている。すべてのデータについて、P < 0.05の時、差は有意とみなされた。すべてのin vivo実験において、少なくとも3つの生物学的複製を行った。

非定量的データ（顕微鏡写真、ウェスタンブロットなど）については、実験の再現および／または直交するアプローチによる交差検証により、所見を少なくとも3回再現し、代表的な結果を示した。

統計と再現性
すべてのin vivo実験において少なくとも3回の生物学的反復を行い、ほとんどのin vitro実験では少なくとも3回の反復を行った。非定量的データ（顕微鏡写真、ウェスタンブロットなど）については、実験の再現および／または直交アプローチとの交差検証により、所見を少なくとも3回再現し、代表的な結果を示した。それぞれの正確な再現回数の詳細は、図の凡例に記載されている。

報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
本研究のRNA-seqデータは、NCBI Gene Expression OmnibusにアクセッションコードGSE182640で寄託されている。H3K4me3修飾領域のバイオインフォマティクス解析は、Cistrome Data Browser（http://cistrome.org/db/#/）で行った。ヒストンメチル化のデータは、Ohbaら（https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.06.013）によるものである。マイクロダイセクションサンプルの質量分析、SDS-PAGEサンプルの質量分析、オリゴヌクレオチド、コンストラクト情報のデータは補足表に掲載した。ソースデータは本論文に添付されている。

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参考文献のダウンロード

謝辞
中国科学院生物物理研究所（Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences）のJ. DingにはLLPSに関する助言を、X. LiとX. Tanには電子顕微鏡サンプルの前処理と走査型電子顕微鏡イメージングを、Y. TengとX. Jiaには中国科学院生物物理研究所生物イメージングセンター（Center for Biological Imaging, Institute of Biophysics, CBI）で蛍光イメージングを提供していただいた。本研究は、中国国家重点研究開発プログラム（Q.S.に2022YFC3600100、H.H.に2022YFA0912400）、中国国家自然科学基金（F.Z.に81572631および31000559、Q.S.に31970685、 81772865 to S.G. and 82273184 to H.H.), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-5-008 to Q.S.), Shaanxi Society Development Sci-Tech Research Project (2016SF-064 to F.Z.), and the State Key Laboratory of Cancer Biology, the Fourth Military Medical University (CBSKL2019ZZ28 and CBSKL2022ZZ29 to F.Z.).

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Feng Zhang、Bo Zhang

著者および所属
中国西安市第四軍医科大学空軍医療センター基礎医学部病理学科・西京病院・国家癌生物学重点実験室

張鳳、王玉英、劉金、顧玉、王哲、葉静、郭双平

中国医学科学院北京生物工学研究所フロンティアバイオテクノロジー研究室；中国医学科学院北京2021RU008細胞死メカニズム研究ユニット

張博、魏悦賢、高信悦、朱怡超、孫強

中国・北京市首都医科大学石潭病院腫瘍科

ボー・チャン & ホンヤン・ファン

中国・嘉興市南湖研究所

ボー・チャン、ユエシアン・ウェイ、シンエ・ガオ、イーチャオ・ズー、チアン・スン

中国西安市、第四軍医大学唐都病院胸部外科

姜倫民

中国西安市第四軍医科大学西京病院整形外科

王新里

中国・西安第四軍医大学生化学・分子生物学科

マオ・スン

中国・西安第四軍医大学神経生物学教室

カン・ジュンジュン、リウ・インイン

中国・北京軍医科学院医療サービス・輸血医学研究所

尤国興

中国・西安第四軍医大学がん生物学国家重点実験室分子医学国家トランスレーショナル・サイエンス・センター細胞生物学部門

丁偉

中国西安市第四軍医科大学西京病院輸血科

Jiajia Xin

中国西安市第四軍医大学航空宇宙衛生学部

鮑俊祥

中国西安第四軍医科大学口腔解剖生理学教室

王美青

寄稿
F.Z.とQ.S.がプロジェクトを発案した。F.Z.は、軟骨中のヘモグロビン構造の発見と表現型解析、成分の特性解析と低酸素による発現制御、低酸素ストレス下でのin vivoおよびin vitroでの機能評価など、ほとんどの実験を行った。Q.S.はHedyの相分離機能を発見し、そのコンセプトを作り上げた。B.Z.はX.G.とY.Weiの協力を得て、相分離と酸素レスキューアッセイに関する実験を行い、酸素解離曲線を測定した。走査型電子顕微鏡とTEMはF.Z.、J.K.、B.Z.、Y.L.が担当した。ウェスタンブロットとジェノタイピングはF.Z.とJ.L.が担当し、循環赤血球とヘモグロビン濃度検査はF.Z.、J.X.、J.L.が担当した。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションおよびLC-MS/MSはF.Z.が担当した、原稿はQ.S.とF.Z.が執筆し、J.B.、M.W.、Y.G.、H.H.、Z.W.、J.Y.およびS.G.の意見を参考にした。

対応する著者
Feng ZhangまたはQiang Sunにご連絡ください。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature誌は、本論文の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読者の報告書はこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

図表
Extended Data 図1 軟骨細胞におけるヘモグロビンの同定。
a,P6（生後6日）マウスの軟骨をレーザーでマイクロダイセクションする前（挿入部）と後の画像。黒い矢印はエオシン陽性構造を示す。スケールバー： b, 質量分析によって同定されたエオシン陽性構造中の主要タンパク質のリスト。c. レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで得られたサンプルの質量分析。約200個の軟骨細胞から分離されたサンプルは、0.5mLの微量遠心チューブのキャップにプールされ、質量分析のために組織抽出バッファーに溶解された。e, f, 赤血球（e）および軟骨（f）のタンパク質をSDS-PAGEゲル上で質量分析した。 g, h, 質量分析（g）およびウェスタンブロット（h）により、軟骨中のヘモグロビンβサブユニット（Hbb）およびαサブユニット（Hba）の存在が確認された。全データは補足表2を参照。i-k、軟骨組織におけるHbaとHbbの発現を定量化するためのRNA-seq（i）と定量的プロテオーム解析（j、k）。データは平均値±SEM、エラーバーはSEMを表す。(n = 3生物学的に独立したサンプル）。

Extended Data 図2 脂質、RNA、Hedyの空間的局在。
b, PLC/PR/F5細胞、脂肪組織、軟骨組織における脂質およびヘモグロビン染色の代表画像。核は青色、Hbbは赤色、脂質滴は緑色。c, PLC/PR/F5細胞および軟骨組織におけるRNAおよびヘモグロビン染色の代表画像。核は青、Hbbは赤、RNAは緑。スケールバーを示す。

Extended Data 図3 精製したタグなしHbbのin vitroでの液相分離。
a, 異なる条件下での精製タグなしHbbの液滴形成, バッファー（PBS： KH2PO4/K2HPO4, pH 7.35, PEG2000 10% (w/v)）。スケールバー：20 μm b, 相分離バッファー（150 Mm KH2PO4/K2HPO4, pH 7.35, PEG2000 variable (w/v)）中、PEG濃度を変えた精製タグなしHbbの液滴形成。スケールバー：20 μm。 c, 相分離バッファー（150 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.35, PEG2000 10% (w/v)）中における、精製したタグなしHba、Hbb、および同じタンパク質濃度でのそれらの混合物の液滴形成。スケールバー： 30μm。d, 精製したタグなしHbb液滴融合のタイムラプスイメージング。スケールバー：5μm： e, 相分離バッファー（150mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.35、PEG2000 10%(w/v)）中での精製HbbとそのIDR変異体の液滴形成。スケールバー：25μm, 10μm. f, 精製したHba, HbbおよびHbb変異体のクマシーブリリアントブルー染色ゲル。

Extended Data 図4 光・電子顕微鏡と免疫電子顕微鏡の相関によるHbb凝縮体の同定。
a,格子状ガラス底皿にプレーティングされた細胞の大視野観察。b, (a)の枠で囲まれた領域内の細胞の拡大図。c, (b)のHbb-EGFPを発現する細胞の共焦点顕微鏡によるZスタック合成図。スケールバー： d,走査型電子顕微鏡による(a)の領域内の細胞の超薄切片像。 e,d)の枠で囲まれた領域内の細胞の拡大像。スケールバー： f, (c)の注目細胞について、Zステップ0.15μmでボトムアップに並べた分割共焦点画像。赤枠内の画像は(e)の視野に相当する。Hbb-EGFP凝縮体をR1およびR2と示す。スケールバー： h. 共焦点像（g）に対応する走査型電子顕微鏡像（左）。スケールバー：10μm： 10 μm。R1およびR2領域は右側に拡大表示されている。スケールバー：500 nm： 500 nm. i, 免疫透過顕微鏡で同定されたHbb凝縮体。枠で囲まれた領域は右側に拡大表示されている。j,電子透過顕微鏡で検出された脂質液滴。枠で囲まれた領域は右側に拡大されている。スケールバーを示す。

Extended Data 図5 Hif-1αおよび/またはHif-2α欠失軟骨細胞におけるヘモグロビンの発現。
a, タモキシフェン（100 mg/kg）を4日間投与したP5マウスのHif-1αF/F（Ctrl）、Hif-1αF+/Col2a1-CreERT2（ヘテロ接合体欠失、Hif-1α-H-cKO）またはHif-1αF/F/Col2a1-CreERT2（Hif-1α-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのHif-1α-LoxP qPCRによるDNA組み換えの検出。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。 b, 20％または1％O2中で6時間培養した初代培養軟骨細胞におけるHif-1αタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。d,Hif-1aを条件付きでノックアウトすると、軟骨成長板の中心部で大量の細胞死が生じた。スケールバー： e, タモキシフェン（100 mg/kg）を4日間投与したP5マウスのHif-2αF/F（Ctrl）またはHif-2αF/F/Col2a1-CreERT2（Hif-2α-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのHif-2α-LoxP qPCR。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。f,Ctrl（Hif-2αF/F）、Hif-2α-H-cKO（ヘテロ接合体欠失、Hif-2αF/+/Col2a1-CreERT2）またはHif-2α-cKO（Hif-2αF/F/Col2a1-CreERT2）初代培養軟骨細胞から抽出した全タンパク質溶解液を20％または1％O2中で6時間培養したウェスタンブロット分析によるHif-2αタンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左側に示し、すべての生物学的複製の定量化を右側に示す。データはα-チューブリン（n = 3）で正規化した。g,Hif-2aの条件的ノックアウトは、P5 Hif-2α-cKO軟骨成長板の中央部において、大規模な細胞死をもたらさなかった。スケールバー： h, Hif-1αのコンディショナルノックアウトによるマウス胎児成長板の軟骨細胞における示された遺伝子の発現。 i, Hif-1αのコンディショナルノックアウトによるマウス胎児成長板の初代培養軟骨細胞における示された遺伝子の発現。j, k, Hif-2αを20％O2（j）または1％O2（k）で6時間コンディショナルノックアウトしたマウス胎児成長板の初代培養軟骨細胞における指示遺伝子の発現。l, タモキシフェン（100 mg/kg）を4日間投与したP5マウスのHif-1αF/F/Hif-2αF/F（Ctrl）またはHif-1αF/F/Hif-2αF/F/Col2a1-CreERT2（Hif-1/2α-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのHif-1αおよびHif-2α（Hif-1/2α）LoxP qPCR。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。 m, 20％または1％O2中で6時間培養したCtrlまたはHif-1/2α-cKO初代培養軟骨細胞から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるHif-1αおよびHif-2αタンパク質の定量。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。ゲルソースのデータは補足図1eを参照。エラーバーはSEMを表す。P値は、一元配置分散分析検定（a, c, f, h, i）または両側Studentのt検定（e, j, k, m, l）を用いて計算した。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

出典データ

Extended Data 図6 Hifs活性を制御する化合物のヘモグロビン発現への影響。
a-e、Hif-1αまたはHif-2αを標的とする化合物の投与量を増やし、20% O2中で6時間培養した初代培養軟骨細胞のHba、HbbおよびEpo mRNAの発現： GN44028。Hif-2αの阻害剤： PT2385またはPT2399。Hif-1αおよびHif-2αの活性化剤： f, g, Hif-1αまたはHif-2αを標的とする化合物を20％または1％O2中で6時間培養した初代培養軟骨細胞のHba、HbbおよびEpo mRNAの発現。h, i, Hif-1αまたはHif-2αのいずれかを標的とする化合物を添加した20％または1％O2中で6時間培養した初代培養軟骨細胞から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるHif-1αまたはHif-2αタンパク質の定量。すべての生物学的複製の定量を右側に示す。Hif-1αまたはHif-2αのデータはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立した実験）。j, k, Hif-1αおよびHif-2αの活性化因子である化合物DMOG（50μM）を添加した20％（j）または1％（k）のO2中で6時間培養した初代培養軟骨細胞のHba、HbbおよびEpo mRNAの発現。左は代表的なウェスタンブロットである。すべての生物学的複製の定量を右側に示す。Hif-1αまたはHif-2αのデータはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立した実験）。ゲルソースのデータは補足図1hを参照。エラーバーはSEMを表す。P値は、一元配置分散分析検定（a-i, l）または両側スチューデントのt検定（j, k）を用いて計算した。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

出典データ

Extended Data 図7 Klf1によるヘモグロビン発現の制御。
a, タモキシフェン（100 mg/kg）を4日間投与したP5マウスのKlf1F/F（Ctrl）またはKlf1F/F/Col2a1-CreERT2（Klf1-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのKlf1-LoxP qPCR。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。 b, CtrlまたはKlf1-cKO初代培養軟骨細胞から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるKlf1タンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左側に示し、すべての生物学的複製の定量を右側に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。ゲルソースのデータについては、補足図1i.c, d 20％（c）または1％（d）のO2中で、RNA干渉によってKlf1を枯渇させたときの初代軟骨細胞におけるKlf1、Hba、Hbb、Hif-1αおよびHif-2αの発現。n = 3生物学的に独立した実験。 e, 20%または1%のO2中でCtrlまたはRNA干渉によるKlf1枯渇初代培養軟骨細胞から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるKlf1タンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左に示し、すべての生物学的複製の定量を右に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立した実験）。f,定量的PCR法で調べた、Klf1ノックダウンによるATDC5軟骨細胞株におけるHba、Hbb、Hif-1αおよびHif-2αの発現。データは3連実験のSEM付き平均値である。エラーバーはSEMを表す。P値は、一元配置分散分析検定を用いて計算した（a-f）。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

ソースデータ

Extended Data 図8 Kdm5bではなくH3K4me3脱メチル化酵素Kdm5aがKlf1の発現を調節する。
a, b, Hif-1αを20％O2（a）または1％O2（b）で6時間コンディショナルノックアウトしたマウス胎児成長板の初代培養軟骨細胞における表示遺伝子の発現。e, f, Hif-1αとHif-2α（Hif-1/2α）の両方を20％O2（e）または1％O2（f）で6時間コンディショナルノックアウトしたマウス胎児成長板の初代培養軟骨細胞における指示遺伝子の発現。代表的なウェスタンブロットを左側に示し、すべての生物学的複製の定量を右側に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立した実験）。h,CtrlまたはSi-Kdm5b初代培養軟骨細胞から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるKdm5bタンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左側に示し、すべての生物学的複製の定量を右側に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立した実験）。i, j, Kdm5aまたはKdm5bを20％(i)または1％O2(j)中で6時間ノックダウンした初代培養軟骨細胞における指示遺伝子の発現。データは3連実験のSEM付き平均値である。P値は、両側Studentのt検定（a-f）または一元配置分散分析検定（g-l）を用いて計算した。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

出典データ

Extended Data 図9 Col2a1-CreによるHbbコンディショナルノックアウトマウスの表現型。
a, タモキシフェン（100mg/kg）を4日間投与したP5マウスのHbbF/F（Ctrl）、HbbF/+/Col2a1-CreERT2（ヘテロ欠損、Hbb-H-cKO）、またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2（Hbb-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのHbb-LoxP qPCR。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。 b, P5のHbbF/F（Ctrl）、Hbb-H-cKOまたはHbb-cKO成長板から抽出した全RNAのqRT-PCRによるHbb mRNAの定量。c, P5 HbbF/F（Ctrl）、Hbb-H-cKOまたはHbb-cKO成長プレートから抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるHbbタンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左に、すべての生物学的複製の定量を右に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。d,Hbb-cKOマウスでは、新生児6匹中2匹が死亡した（左パネル、黒矢印）。さらに1匹の新生児は、出生8時間後に皮膚が紫色に変色して死亡した（右図、黒矢印）。他の3匹の新生児は、出生後1-7日で皮膚が紫色に変色して死亡した（補足ビデオ1）。スケールバー： e. E16.5のHbbF/Fマウス（Ctrl）、Hbb-H-cKOマウス、Hbb-cKOマウスの上腕骨近位部軟骨の組織学的検査（上段2枚）またはTUNELアッセイ（下段2枚）。f, g P1 HbbF/Fマウス（Ctrl）、Hbb-H-cKOマウス、Hbb-cKOマウスの上腕骨近位軟骨の組織学的検査（上2枚）またはTUNELアッセイ（下2枚）。すべての生物学的複製の定量を示す（g）。矢印は死んだ軟骨細胞を示す。緑色蛍光が死細胞を示す。h, i, P5 Hbb-cKOマウスの上腕骨遠位部の組織像で、Hbb遺伝子のコンディショナルノックアウトにより、軟骨組織の中心部で軟骨細胞が大量に死滅していた。すべての生物学的複製の定量を示す(i)。矢印は死んだ軟骨細胞を示す。j, k P5マウスのHbbF/F（Ctrl）、Hbb-H-cKO、Hbb-cKO上腕骨近位部軟骨のTUNELアッセイ。矢印は死んだ軟骨細胞を示す。緑色蛍光が死細胞を示す。すべての生物学的複製の定量を示す（k）。n = 3生物学的に独立したサンプル。エラーバーはSEMを表す。P値は、一元配置分散分析検定を用いて計算した（a-c, g, i, k）。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

出典データ

Extended Data 図10 Col2a1-CreによるHbbコンディショナルノックアウトマウスの成長板の表現型。
a, タモキシフェン（100mg/kg）をP2に1回投与したP3、P4またはP5マウスのHbbF/F（Ctrl）またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2（Hbb-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのHbb-LoxP qPCR。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。 b, タモキシフェン（100 mg/kg）をP2に1回投与したP3、P4またはP5マウスのHbbF/F（Ctrl）またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2（Hbb-cKO）成長板から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるHbbタンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左に、すべての生物学的複製の定量を右に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。c、タモキシフェン（100mg/kg）をP2に1回投与したP3、P4またはP5マウスのHbbF/F（Ctrl）またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2（Hbb-cKO）成長板の上腕骨近位軟骨の組織学的検査（上の2つのパネル）またはTUNELアッセイ（下の2つのパネル）。すべての生物学的複製の定量を右側に示す。矢印は死んだ軟骨細胞を示す。緑色蛍光が死細胞を示す。n = 3生物学的に独立したサンプル。エラーバーはSEMを表す。P値は両側Studentのt検定を用いて計算した（a-c）。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

ソースデータ

Extended Data 図11 Hbbコンディショナルノックアウトが成長板の軟骨細胞におけるHedy、低酸素応答、代謝に及ぼす影響。
a, Hbbコンディショナルノックアウト(Hbb-cKO)により軟骨細胞におけるヘモグロビン体の形成が損なわれたことをTEMで示す。b, E18.5でタモキシフェン（50mg/kg）を投与したP3マウスのHbbF/F（Ctrl）またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2（Hbb-cKO）成長板から抽出したゲノムDNAのHbb-LoxP qPCR。データはβ2-ミクログロブリンで正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。 c, E18.5でタモキシフェン（50 mg/kg）投与したP3マウスのHbbF/F（Ctrl）またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2（Hbb-cKO）成長板から抽出した全RNAのqRT-PCRによるHbb mRNAの定量。d, E18.5でタモキシフェン(50 mg/kg)投与したP3マウスのHbbF/F(Ctrl)またはHbbF/F/Col2a1-CreERT2(Hbb-cKO)成長板から抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるHbbタンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左に、すべての生物学的複製の定量を右に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立したサンプル）。e,E18.5でタモキシフェン（50mg/kg）を投与したP3マウスのHbb-cKO軟骨におけるヘディの形成障害。黒矢印はヘディを示す。スケールバー： 10μm。n = 6生物学的に独立したサンプル。 f, WTおよびHbb-cKOマウスの軟骨のEF5（赤、上のパネル）およびHif-1α（緑、下のパネル）染色の代表画像。DAPIは青色で核を示す。スケールバー： 50μm。g, 0または100gで30分間、室温で遠心した遺伝子型を示した新生児成長板のEF5染色の代表画像。すべての生物学的複製の定量を右側に示す。スケールバー： 50 μm。h,0または100gで30分間、室温で遠心分離した遺伝子型を示した軟骨のHif-1α染色の代表画像。すべての生物学的複製の定量を右側に示す。スケールバー： 50 μm。i,新生児成長プレートから抽出した全タンパク質溶解液のウェスタンブロット分析によるHif-1αタンパク質の定量。代表的なウェスタンブロットを左に示し、すべての生物学的複製の定量を右に示す。データはα-チューブリンに対して正規化した（n = 3生物学的に独立した実験）。j, HbbF/Fマウス（Ctrl）とHbb-cKOマウスの軟骨におけるHif-1αとHif-2αの発現。k-m,質量分析によるメタボローム解析から、Hbb-cKOマウスの軟骨では細胞内の乳酸が多く（k）、細胞内のグルコースが少ない（l）ことが示され、グルコースに対する乳酸の比率が有意に増加した（m）。エラーバーはSEMを表す。P値は、両側Studentのt検定（b-d, j-m）または一元配置分散分析検定（g-i）を用いて計算した。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

出典データ

Extended Data 図12 ヘモグロビン欠乏による軟骨の低酸素耐性。
a, 低酸素下で3日間in vitro培養したE18.5マウスの軟骨のTUNELアッセイ。すべての生物学的複製の定量化を右側に示す。スケールバー： 50 μm。b, c, E14.5マウスの上腕骨軟骨成長板を低酸素環境下（酸素濃度1％）で6日間培養したところ、Hba（b）またはHbb（c）のホモ接合体ノックアウト軟骨の成長板で有意に多くの軟骨細胞が死滅した。死細胞領域は黒い実線で示した。スケールバー： n = 3生物学的に独立した実験。エラーバーはSEMを表す。P値は一元配置分散分析検定を用いて計算した。比較の正確なP値はそれぞれ図に示した。

出典データ

補足情報
補足図
このファイルには、補足図1-14が含まれている。

報告概要
査読ファイル
補足表1
マイクロダイセクションサンプルの質量分析。

補足表2
SDS-PAGEサンプルの質量分析。

補足表3
オリゴヌクレオチド

補足表4
コンストラクト情報。

補足動画1
Col2a1-Creによるホモ接合体Hbbコンディショナルノックアウトマウスの新生児。新生児Hbb-cKOマウスは出生後、皮膚が紫色に変色して死亡した。

補足データ
補足図4 このファイルには補足図4のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図6 このファイルには補足図6のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図7 このファイルには補足図7のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図9 このファイルには補足図9のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図10 このファイルには補足図10のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図11 このファイルには補足図11のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図13 このファイルには補足図13のソースデータが含まれています。

補足データ
補足図 14 このファイルには補足図 14 のソースデータが含まれています。

ソースデータ
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ拡張データ図6
ソースデータ拡張データ図7
ソースデータ拡張データ図8
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ図12
権利と許可
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軟骨細胞の低酸素適応におけるヘモグロビン体の赤血球外での役割。Nature 622, 834-841 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06611-6

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受領
2021年11月17日

受理
2023年9月05日

発行
2023年10月04日

発行日
2023年10月26日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-023-06611-6

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ネイチャー (Nature) ISSN 1476-4687 (online) ISSN 0028-0836 (print)

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